1,720,982 research outputs found
Mitotic and pheromone-specific intrinsic polarization cues interfere with gradient sensing in Saccharomyces cerevisiae
Full text linkPolarity decisions are central to many processes, including mitosis and chemotropism. In Saccharomyces cerevisiae, budding and mating projection (MP) formation use an overlapping system of cortical landmarks that converges on the small G protein Cdc42. However, pheromone-gradient sensing must override the Rsr1-dependent internal polarity cues used for budding. Using this model system, we asked what happens when intrinsic and extrinsic spatial cues are not aligned. Is there competition, or collaboration? By live-cell microscopy and microfluidics techniques, we uncovered three previously overlooked features of this signaling system. First, the cytokinesisassociated polarization patch serves as a polarity landmark independently of all known cues. Second, the Rax1-Rax2 complex functions as a pheromone-promoted polarity cue in the distal pole of the cells. Third, internal cues remain active during pheromone-gradient tracking and can interfere with this process, biasing the location of MPs. Yeast defective in internal-cue utilization align significantly better than wild type with artificially generated pheromone gradients.Fil: Vasen, Gustavo. Consejo Nacional de Investigaciones Científicas y Técnicas. Oficina de Coordinación Administrativa Ciudad Universitaria. Instituto de Fisiología, Biología Molecular y Neurociencias. Universidad de Buenos Aires. Facultad de Ciencias Exactas y Naturales. Instituto de Fisiología, Biología Molecular y Neurociencias; Argentina. Universidad de Buenos Aires. Facultad de Ciencias Exactas y Naturales. Departamento de Fisiología, Biología Molecular y Celular; ArgentinaFil: Dunayevich, Paula. Consejo Nacional de Investigaciones Científicas y Técnicas. Oficina de Coordinación Administrativa Ciudad Universitaria. Instituto de Fisiología, Biología Molecular y Neurociencias. Universidad de Buenos Aires. Facultad de Ciencias Exactas y Naturales. Instituto de Fisiología, Biología Molecular y Neurociencias; ArgentinaFil: Colman Lerner, Alejandro Ariel. Universidad de Buenos Aires. Facultad de Ciencias Exactas y Naturales. Departamento de Fisiología, Biología Molecular y Celular; Argentina. Consejo Nacional de Investigaciones Científicas y Técnicas. Oficina de Coordinación Administrativa Ciudad Universitaria. Instituto de Fisiología, Biología Molecular y Neurociencias. Universidad de Buenos Aires. Facultad de Ciencias Exactas y Naturales. Instituto de Fisiología, Biología Molecular y Neurociencias; Argentin
Push-Pull and Feedback Mechanisms Can Align Signaling System Outputs with Inputs
Full text linkMany cell signaling systems, including the yeast pheromone response system, exhibit “dose-response alignment” (DoRA), in which output of one or more downstream steps closely matches the fraction of occupied receptors. DoRA can improve the fidelity of transmitted dose information. Here, we searched systematically for biochemical network topologies that produced DoRA. Most networks, including many containing feedback and feedforward loops, could not produce DoRA. However, networks including “push-pull” mechanisms, in which the active form of a signaling species stimulates downstream activity and the nominally inactive form reduces downstream activity, enabled perfect DoRA. Networks containing feedbacks enabled DoRA, but only if they also compared feedback to input and adjusted output to match. Our results establish push-pull as a non-feedback mechanism to align output with variable input and maximize information transfer in signaling systems. They also suggest genetic approaches to determine whether particular signaling systems use feedback or push-pull control.Fil: Andrews, Steven S.. Fred Hutchinson Cancer Research Center; Estados Unidos. The Molecular Sciences Institute; Estados UnidosFil: Peria, William J.. Fred Hutchinson Cancer Research Center; Estados UnidosFil: Yu, Richard C.. The Molecular Sciences Institute; Estados UnidosFil: Colman Lerner, Alejandro Ariel. Consejo Nacional de Investigaciones Científicas y Técnicas. Oficina de Coordinación Administrativa Ciudad Universitaria. Instituto de Fisiología, Biología Molecular y Neurociencias. Universidad de Buenos Aires. Facultad de Ciencias Exactas y Naturales. Instituto de Fisiología, Biología Molecular y Neurociencias; ArgentinaFil: Brent, Roger. The Molecular Sciences Institute; Estados Unidos. Fred Hutchinson Cancer Research Center; Estados Unido
Procesamiento de información extracelular por sistemas de transducción de señales: determinación de concentración absoluta y dirección de gradientes de feromona sexual en Saccharomyces cerevisiae
Full text linkLas vías de señalización celulares son las encargadas de transmitir la información sobre el estado del ambiente intra y extracelular. En el sistema de respuesta a feromona sexual (SRF), las células de levadura Saccharomyces cerevisiae convierten señales externas en medidas cuantitativas para tomar decisiones sobre su destino. Para aparearse, las levaduras deben evaluar la proximidad y la dirección de la compañera. Para ello, se comunican mediante la secreción y detección de feromonas sexuales. La concentración externa de feromona codifica la cercanía entre las células: sólo a altas concentraciones de la señal se produce el arresto del ciclo celular y la activación del programa de apareamiento. En el tipo sexual ?a? la molécula que sensa la feromona es un receptor acoplado a proteína G, Ste2. Una característica notable de este sistema es que, a pesar de existir una elevada variabilidad en la cantidad de receptor en las distintas células, la respuesta de la población es uniforme. Resultados previos de nuestro laboratorio, basados en modelado matemático, indicaban que el SRF era capaz de medir la fracción de receptor ocupado en lugar de la cantidad total de complejo ligando-receptor y, así, responder de forma independiente al número de receptores Esta propiedad radica en que el receptor presenta actividades antagónicas: cuando está ocupado activa la respuesta mientras que cuando está desocupado la inhibe. En esta tesis, se demuestra que la medición fraccional depende la unión al receptor de una proteína inhibitoria (Sst2). Mutantes en que esta asociación se encuentra bloqueada pierden tanto la medición fraccional como la robustez al cambio en la cantidad de receptores.Por otro lado, dado que las levaduras son sésiles, la detección de la concentración externa de feromona no es suficiente para lograr el apareamiento: las células deben crecer en dirección a su compañera. En la determinación de la dirección del gradiente, el receptor unido a ligando recluta a la maquinaria de polarización para dirigir el crecimiento celular hacia la fuente de feromona. Sin embargo, esta maquinaria es compartida con el proceso de gemación que polariza utilizando marcas internas. Para estudiar la competencia entre el gradiente de feromona y estas marcas internas, se expuso a células a gradientes artificiales generados mediante microfluídica. Los resultados revelaron una compleja interacción entre las marcas internas y el gradiente externo donde algunas proteínas de posicionamiento orientan la polarización de forma dependiente de feromona (Rax1/2, Rsr1) y otras de forma independiente de la señal (Bud8, Bud9, Axl2). Se pudo comprobar que estas marcas interfieren con la detección de la dirección del gradiente.En conclusión, en esta tesis se describen dos aspectos fundamentales del procesamiento de la información extracelular: la medición fraccional de la concentración externa de una señal y su competencia con información proveniente del medio interno a la hora de polarizar en la dirección de un gradiente. Ambos aspectos resultan claves para comprender el proceso de apareamiento celular.Fil: Vasen, Gustavo. Consejo Nacional de Investigaciones Científicas y Técnicas. Oficina de Coordinación Administrativa Ciudad Universitaria. Instituto de Fisiología, Biología Molecular y Neurociencias. Universidad de Buenos Aires. Facultad de Ciencias Exactas y Naturales. Instituto de Fisiología, Biología Molecular y Neurociencias; Argentin
GPCR receptor phosphorylation and endocytosis are not necessary to switch polarized growth between internal cues during pheromone response in S. cerevisiae
Full text linkChemotactic/chemotropic cells follow accurately the direction of gradients of regulatory molecules. Many G-protein-coupled receptors (GPCR) function as chemoattractant receptors to guide polarized responses. In “a” mating type yeast, the GPCR Ste2 senses the α-cell’s pheromone. Previously, phosphorylation and trafficking of this receptor have been implicated in the process of gradient sensing, where cells dynamically correct growth. Correction is often necessary since yeast have intrinsic polarity sites that interfere with a correct initial gradient decoding. We have recently showed that when actively dividing (not in G1) yeast are exposed to a uniform pheromone concentration, they initiate a pheromone-induced polarization next to the mother–daughter cytokinesis site. Then, they reorient their growth to the intrinsic polarity site. Here, to study if Ste2 phosphorylation and internalization are involved in this process, we generated receptor variants combining three types of mutated signals for the first time: phosphorylation, ubiquitylation and the NPFX1,2D Sla1-binding motif. We first characterized their effect on endocytosis and found that these processes regulate internalization in a more complex manner than previously shown. Interestingly, we showed that receptor phosphorylation can drive internalization independently of ubiquitylation and the NPFX1,2D motif. When tested in our assays, cells expressing either phosphorylation or endocytosis-deficient receptors were able to switch away from the cytokinesis site to find the intrinsic polarity site as efficiently as their WT counterparts. Thus, we conclude that these processes are not necessary for the reorientation of polarization.Fil: Vasen, Gustavo. Consejo Nacional de Investigaciones Científicas y Técnicas. Oficina de Coordinación Administrativa Ciudad Universitaria. Instituto de Fisiología, Biología Molecular y Neurociencias. Universidad de Buenos Aires. Facultad de Ciencias Exactas y Naturales. Instituto de Fisiología, Biología Molecular y Neurociencias; ArgentinaFil: Dunayevich, Paula. Consejo Nacional de Investigaciones Científicas y Técnicas. Oficina de Coordinación Administrativa Ciudad Universitaria. Instituto de Fisiología, Biología Molecular y Neurociencias. Universidad de Buenos Aires. Facultad de Ciencias Exactas y Naturales. Instituto de Fisiología, Biología Molecular y Neurociencias; ArgentinaFil: Constantinou, Andreas. Consejo Nacional de Investigaciones Científicas y Técnicas. Oficina de Coordinación Administrativa Ciudad Universitaria. Instituto de Fisiología, Biología Molecular y Neurociencias. Universidad de Buenos Aires. Facultad de Ciencias Exactas y Naturales. Instituto de Fisiología, Biología Molecular y Neurociencias; ArgentinaFil: Colman Lerner, Alejandro Ariel. Consejo Nacional de Investigaciones Científicas y Técnicas. Oficina de Coordinación Administrativa Ciudad Universitaria. Instituto de Fisiología, Biología Molecular y Neurociencias. Universidad de Buenos Aires. Facultad de Ciencias Exactas y Naturales. Instituto de Fisiología, Biología Molecular y Neurociencias; Argentin
Modulation of transcription factor dynamics allows versatile information transmission
Full text linkCells detect changes in their environment and generate responses, often involving changes in gene expression. In this paper we use information theory and a simple transcription model to analyze whether the resulting gene expression serves to identify extracellular stimuli and assess their intensity when they are encoded in the amplitude, duration or frequency of pulses of a transcription factor’s nuclear concentration (or activation state). We find, for all cases, that about three ranges of input strengths can be distinguished and that maximum information transmission occurs for fast and high activation threshold promoters. The three input modulation modes differ in the sensitivity to changes in the promoters parameters. Frequency modulation is the most sensitive and duration modulation, the least. This is key for signal identification: there are promoter parameters that yield a relatively high information transmission for duration or amplitude modulation and a much smaller value for frequency modulation. The reverse situation cannot be found with a single promoter transcription model. Thus, pulses of transcription factors can selectively activate the “frequency-tuned” promoter while prolonged nuclear accumulation would activate promoters of all three modes simultaneously. Frequency modulation is therefore highly selective and better suited than the other encoding modes for signal identification without requiring other mediators of the transduction process.Fil: Givré, Alan Matías. Consejo Nacional de Investigaciones Científicas y Técnicas. Oficina de Coordinación Administrativa Ciudad Universitaria. Instituto de Física de Buenos Aires. Universidad de Buenos Aires. Facultad de Ciencias Exactas y Naturales. Instituto de Física de Buenos Aires; ArgentinaFil: Colman Lerner, Alejandro Ariel. Consejo Nacional de Investigaciones Científicas y Técnicas. Oficina de Coordinación Administrativa Ciudad Universitaria. Instituto de Fisiología, Biología Molecular y Neurociencias. Universidad de Buenos Aires. Facultad de Ciencias Exactas y Naturales. Instituto de Fisiología, Biología Molecular y Neurociencias; ArgentinaFil: Ponce Dawson, Silvina Martha. Consejo Nacional de Investigaciones Científicas y Técnicas. Oficina de Coordinación Administrativa Ciudad Universitaria. Instituto de Física de Buenos Aires. Universidad de Buenos Aires. Facultad de Ciencias Exactas y Naturales. Instituto de Física de Buenos Aires; Argentin
Properties of cell signaling pathways and gene expression systems operating far from steady-state
Full text linkLigand-receptor systems, covalent modification cycles, and transcriptional networks are basic units of signaling systems and their steady-state properties are well understood. However, the behavior of such systems before steady-state is poorly characterized. Here, we analyzed the properties of input-output curves for each of these systems as they approach steady-state. In ligand-receptor systems, the EC50 (concentration of the ligand that occupies 50% of the receptors) is higher before the system reaches steady-state. Based on this behavior, we have previously defined PRESS (for pre-equilibrium sensing and signaling), a general “systems level” mechanism cells may use to overcome input saturation. Originally, we showed that, given a step stimulation, PRESS operates when the kinetics of ligand-receptor binding are slower than the downstream signaling steps. Now, we show that, provided the input increases slowly, it is not essential for the ligand binding reaction itself to be slow. In addition, we demonstrate that covalent modification cycles and gene expression systems may also operate in PRESS mode. Thus, nearly all biochemical processes may operate in PRESS mode, suggesting that this mechanism may be ubiquitous in cell signaling systems.Fil: Di Bella, Juan Pablo. Consejo Nacional de Investigaciones Científicas y Técnicas. Oficina de Coordinación Administrativa Ciudad Universitaria. Instituto de Fisiología, Biología Molecular y Neurociencias. Universidad de Buenos Aires. Facultad de Ciencias Exactas y Naturales. Instituto de Fisiología, Biología Molecular y Neurociencias; ArgentinaFil: Colman Lerner, Alejandro Ariel. Consejo Nacional de Investigaciones Científicas y Técnicas. Oficina de Coordinación Administrativa Ciudad Universitaria. Instituto de Fisiología, Biología Molecular y Neurociencias. Universidad de Buenos Aires. Facultad de Ciencias Exactas y Naturales. Instituto de Fisiología, Biología Molecular y Neurociencias; ArgentinaFil: Ventura, Alejandra. Consejo Nacional de Investigaciones Científicas y Técnicas. Oficina de Coordinación Administrativa Ciudad Universitaria. Instituto de Fisiología, Biología Molecular y Neurociencias. Universidad de Buenos Aires. Facultad de Ciencias Exactas y Naturales. Instituto de Fisiología, Biología Molecular y Neurociencias; Argentin
Impact of upstream and downstream constraints on a signaling module's ultrasensitivity
Full text linkMuch work has been done on the study of the biochemical mechanisms that result in ultrasensitive behavior of simple biochemical modules. However, in a living cell, such modules are embedded in a bigger network that constrains the range of inputs that the module will receive as well as the range of the module’s outputs that network will be able to detect. Here, we studied how the effective ultrasensitivity of a modular system is affected by these restrictions. We use a simple setup to explore to what extent the dynamic range spanned by upstream and downstream components of an ultrasensitive module impact on the effective sensitivity of the system. Interestingly, we found for some ultrasensitive motifs that dynamic range limitations imposed by downstream components can produce effective sensitivities much larger than that of the original module when considered in isolation.Fil: Altszyler Lemcovich, Edgar Jaim. Consejo Nacional de Investigaciones Científicas y Técnicas. Oficina de Coordinación Administrativa Ciudad Universitaria. Instituto de Fisiología, Biología Molecular y Neurociencias. Universidad de Buenos Aires. Facultad de Ciencias Exactas y Naturales. Instituto de Fisiología, Biología Molecular y Neurociencias; Argentina. Consejo Nacional de Investigaciones Científicas y Técnicas. Oficina de Coordinación Administrativa Ciudad Universitaria. Instituto de Física de Buenos Aires. Universidad de Buenos Aires. Facultad de Ciencias Exactas y Naturales. Instituto de Física de Buenos Aires; ArgentinaFil: Ventura, Alejandra. Consejo Nacional de Investigaciones Científicas y Técnicas. Oficina de Coordinación Administrativa Ciudad Universitaria. Instituto de Fisiología, Biología Molecular y Neurociencias. Universidad de Buenos Aires. Facultad de Ciencias Exactas y Naturales. Instituto de Fisiología, Biología Molecular y Neurociencias; ArgentinaFil: Colman Lerner, Alejandro Ariel. Consejo Nacional de Investigaciones Científicas y Técnicas. Oficina de Coordinación Administrativa Ciudad Universitaria. Instituto de Fisiología, Biología Molecular y Neurociencias. Universidad de Buenos Aires. Facultad de Ciencias Exactas y Naturales. Instituto de Fisiología, Biología Molecular y Neurociencias; ArgentinaFil: Chernomoretz, Ariel. Consejo Nacional de Investigaciones Científicas y Técnicas. Oficina de Coordinación Administrativa Ciudad Universitaria. Instituto de Física de Buenos Aires. Universidad de Buenos Aires. Facultad de Ciencias Exactas y Naturales. Instituto de Física de Buenos Aires; Argentina. Fundación Instituto Leloir; Argentina. Universidad de Buenos Aires. Facultad de Ciencias Exactas y Naturales. Departamento de Física; Argentin
Transduction mechanisms of extracellular conditions into quantitative measurements/representations
No full textLos seres vivos reaccionan y responden a cambios en su entorno. Para generar respuestas específicas la “información” contenida en los estímulos debe ser decodificada. Diversas observaciones han llevado a la conclusión de que, dependiendo de la función específica de cada sistema, la información se puede procesar y representar en dos amplias formas: las señales pueden estar codificadas en la amplitud de la concentración de algún intermediario de la transducción o bien en la frecuencia con la que algunas moléculas “señalizadoras” pasan de un estado activo a otro inactivo. Los mecanismos de señalización suelen involucrar reacciones químicas de las que participa un pequeño número de moléculas. El ruido ineludible en este tipo de procesos limita la capacidad de las v ́ıas de señalización. Sin embargo, en muchas ocasiones las respuestas son generadas con gran precisión. ¿De qué manera las células mejoran la relación señal-ruido para lograr esta precisión? ¿Cómo se comparan en este sentido las vías de señalización que codifican por amplitud con las que lo hacen por frecuencia? En esta Tesis se utilizó la teoría de la información de Shannon para intentar responder a estas preguntas. En esta Tesis, se trabajó en tres aspectos relacionados entre sí que están desarrollados en los Capítulos 2–5. En primer lugar, se trabajóen la descripción mecanística del paso de codificación que va del estímulo externo a un intermediario cuando éste muestra un comportamiento pulsátil estocástico. Para tal fin el trabajo se basó en las numerosas observaciones y modelos en los que el intermediario es el calcio (Ca2+) intracelular. Combinando modelos derivados de observaciones que muestran características comunes a las de sistemas excitables impulsados por ruido se obtuvieron resultados analíticos y numéricos que muestran cómo la información transmitida depende del valor medio del intervalo de tiempo entre pulsos y cómo esta información aumenta dependiendo del peso relativo entre las tasas de disparo (estocástico) y de recuperación de la inhibición luego de un disparo (determinista). En particular, se encontró que en presencia de inhibición, la información transmitida puede exceder en 1bit (y así duplicar) a la del caso puramente estocástico descrito por una estadística Poissoniana. Este resultado fue obtenido tanto estudiando un par de pulsos como en el límite de muchos pulsos. En segundo lugar, se estudiaron las diferencias y similitudes del procesamiento de información cuando la intensidad de los estímulos extracelulares está codificada en la amplitud, la duración o la frecuencia entre pulsos de la fracción nuclear de un factor de transcripción (FT). Para ello, se analizó la información que puede transmitir el paso asociado a la transcripción usando un modelo sencillo basado en observaciones experimentales del FT Msn2 de la levadura S. cerevisiae, y calculando numéricamente la información mutua (MI) entre el FT y la cantidad de ARN mensajero producido, tomando a esta última como un indicador de la cantidad de proteína sintetizada. Explorando exhaustivamente el espacio de parámetros, se determinó que la MI es máxima en las mismas condiciones para las tres formas de codificación (el umbral de activación del promotor debe ser alto y empinado y la dinámica de todo el proceso debe ser rápida) y que en todos los casos la MI fue de ∼ 1−2bits. Se encontró, sin embargo, que no todas las formas de codificación tienen la misma sensibilidad frente a variaciones de los parámetros que caracterizan a la transcripción. Debido a esta diferente sensibilidad, es posible encontrar promotores relativamente “ciegos” a las entradas moduladas por frecuencia pero que actúan como “switches” ruidosos para las moduladas por duración o amplitud. La situación contraria no puede ser encontrada: los pulsos cortos activan selectivamente un subconjunto de promotores, mientras que pulsos prolongados de FT activan varias vías simultáneamente. Este resultado no solo ayuda a explicar observaciones experimentales en células de levadura sino que puede establecer límites para la “multiplexación” de información (el proceso que ocurre cuando se usa el mismo FT para inducir diferentes respuestas finales dependiendo de su dinámica). El trabajo contenido en el Capítulo 4 combina el proceso dinámico “río arriba” del FT con el modelo de transcripción explorado en el Capítulo 3. El objetivo acá fue comparar diferencias y similitudes entre modulación por amplitud y por frecuencia cuando ambas etapas de la codificación (desde el estímulo externo hasta la transcripción) son tenidas en cuenta. Para tal fin se modeló el proceso río arriba suponiendo que en el caso de codificación por amplitud, la fracción nuclear del FT es una función de Hill del estímulo externo mientras que, en el caso de codificación por frecuencia, la frecuencia media entre pulsos sucesivos depende exponencialmente de dicho estímulo (como se hizo en el primer trabajo derivado de esta Tesis). Esta dependencia exponencial fue observada en pulsos intracelulares de Ca2+ mediados por canales-receptores de IP3, y fue también encontrada al analizar los pulsos de localización nuclear del FT, Crz1, en células de levadura. Como mostramos en el Capítulo 5, esta dependencia puede explicarse suponiendo que la dinámica deriva de un sistema excitable donde los pulsos se asocian a las largas excursiones en el espacio de fases que ocurren en estos sistemas cuando se supera un umbral. Utilizando una distribución de soporte compacto para la intensidad del estímulo externo, los resultados del Capítulo 4 muestran que la codificación por amplitud solo funciona de modo óptimo cuando la distribución del estímulo está centrada alrededor de valores para los que la derivada de la función de Hill es máxima. La transmisión por frecuencia, por otro lado, es mucho menos sensible a variaciones en la mediana de la distribución del estímulo externo y puede mejorar al aumentar las intensidades de dicho estímulo (dentro de ciertos límites). Podemos decir entonces que estos dos modos de codificación dotan a las células de una “lente” distinta con la que percibir su entorno. En particular, el hecho de que distintas estrategias de transducción de un mismo estímulo sean óptimas en distintos rangos de intensidades del estímulo podría explicar por qué algunas células, como las de levadura, son capaces de detectar gradientes de un efector externo (feromona en el caso de la levadura) para un rango muy amplio de concentraciones medias distintas. El Capítulo 5 brinda el marco teórico para el uso de la dependencia exponencial entre el tiempo medio entre pulsos del agente señalizador y la intensidad del estímulo externo cuyo uso en el Capítulo 4 fue principalmente justificado en términos de las numerosas observaciones experimentales existentes. Más específicamente, en este Capítulo usamos un modelo sencillo de la dinámica del Ca2+ intracelular promediado sobre toda la célula en el que el factor principal que impulsa dicha dinámica es la liberación de Ca2+ desde el retículo endoplasmático a través de canales-receptores de IP3. Englobando en un término de ruido aditivo los efectos de las inhomogeneidades espaciales y de los muchos procesos estocásticos que afectan la dinámica del Ca2+ intracelular, estudiamos el comportamiento del modelo para parámetros en los que el sistema es excitable. En los sistemas excitables el ruido puede provocar largas excursiones en el espacio de fases que, en el modelo acá analizado, corresponden a pulsos de Ca2+. Usando el modelo con ruido determinamos entonces el tiempo medio entre los pulsos de Ca2+ como función de uno de los parámetros del modelo (la fracción β de receptores con IP3 ligado pasibles de abrirse al ligar Ca2+). Utilizando observaciones de señales espacio-temporales de Ca2+ intracelular y un modelo sencillo de los receptores de IP3, en este Capítulo pudimos cuantificar el ruido y vincular β con la concentración de IP3. Usando estimaciones de la relación entre esta concentración y la intensidad del estímulo externo para distintas células pudimos mostrar que el tiempo medio entre pulsos depende exponencialmente de dicha intensidad para un rango tal que el valor de los tiempos correspondientes varía sobre un intervalo igual o mayor a los observados experimentalmente en distintos tipos celulares. Si bien este resultado fue formalmente derivado para los pulsos intracelulares de Ca2+, la generalidad y sencillez del modelo utilizado permite suponer que es posible aplicar un enfoque similar a otros casos, en particular, al comportamiento pulsátil de FTs, para el que existe abundante evidencia de que, en muchos casos, se rige por una dinámica excitable. En conclusión, en esta Tesis, exploramos distintos aspectos en que la dinámica temporal en la señalización celular otorga a las células capacidades que en caso contrario no tendrían. Es importante notar que la capacidad de transmitir información es un fenotipo y, por tanto, la selección natural puede actuar sobre ella. En primer lugar, mostramos cómo una dinámica temporal con estadística no Poissoniana (mediante un Feedback Negativo Global) puede aumentar la información transmitida respecto del caso puramente Poissoniano. En segundo lugar, mostramos que la dinámica temporal de un Factor de Transcripción puede activar selectivamente promotores mediante el fenómeno de multiplexación dinámica. En tercer lugar, mostramos cómo la distinta forma en que los estímulos externos se codifican en los intermediarios de la señalización dependiendo de su dinámica expande el rango de intensidades del estímulo para los cuales puede transmitirse información de forma fidedigna. Este último resultado derivado inicialmente en base a observaciones experimentales fue finalmente validado a partir de un modelo teórico. Todos estos aspectos de la señalización se manifiestan en fenómenos biológicamente relevantes como se discute en la Tesis.Living beings react and respond to changes in their environment. The “information” contained in the stimuli must be decoded to generate specific responses. Various observations have led to the conclusion that, depending on the particular function of each system, information can be processed and represented in two broad ways: signals can be encoded in the amplitude of the concentration of some transduction intermediate, or in the frequency with which some “signaling” molecules switch from an active to an inactive state. Signaling mechanisms frequently use chemical reactions involving a small number of molecules. The unavoidable noise in this type of process limits the capacity of the signaling pathways. However, on many occasions, the answers are generated with great precision. How do cells improve the signal-to-noise ratio to achieve this precision? How do signaling pathways that use amplitude encoding compare with those that encode by frequency? In this Thesis Shannon’s information theory is used to try to answer these questions. In this Thesis, we worked on three interrelated aspects that are developed in Chapters 2–5. First, we worked on the mechanistic description of the coding step that goes from the external stimulus to an intermediary that shows a stochastic pulsatile behavior. To this end, the work was based on numerous observations and models in which the intermediary is intracellular calcium (Ca2+). By combining models derived from observations that show characteristics common to those of noise-driven excitable systems, analytical and numerical results were obtained that show how the information transmitted depends on the average value of the time interval between pulses and how this information increases depending on the relative weight between the rates of firing (stochastic) and the recovery from inhibition after firing (deterministic). In particular, it was found that in the presence of inhibition, the information transmitted can exceed by 1 bit (and thus double) that of the purely stochastic (Poissonian) case. This result was obtained both by studying a pair of pulses and in the limit of many pulses. Second, we studied the differences and similarities of information processing when the intensity of extracellular stimuli is encoded in the amplitude, duration, or frequency between pulses of the nuclear fraction of a transcription factor (TF). To do this, we analyzed the information that the transcription-associated step can convey using a simple model based on experimental observations of the TF, Msn2 of the yeast S. cerevisiae, and numerically calculating the mutual information (MI) between the TF and the amount of messenger RNA produced, taking the latter as an indicator of the amount of protein synthesized. Exploring exhaustively the parameter space, it was determined that the MI is maximal under the same conditions for the three forms of coding (the promoter activation threshold must be high and steep and the dynamics of the whole process must be fast) and that in all cases MI∼ 1 − 2bits. It was found, however, that not all coding forms have the same sensitivity to variations in the parameters that characterize transcription. Due to this different sensitivity, it is possible to find promoters that are relatively “blind” to frequency-modulated inputs but act as noisy switches for duration or amplitude-modulated ones. The reverse situation cannot be found: short pulses selectively activate a subset of promoters, while prolonged FT pulses activate several pathways simultaneously. This result not only helps to explain experimental observations in yeast cells but may set limits for information “multiplexing” (the process that occurs when the same FT is used to induce different final responses depending on its dynamics). The work contained in Chapter 4 combines the process upstream the nuclear localization of the FT with the transcription model explored in Chapter 3. The objective here was to compare differences and similarities between modulation by amplitude and by frequency when both stages of the coding (from the external stimulus to the transcription) are taken into account. For this purpose, the upstream process was modeled assuming that in the case of amplitude coding, the nuclear fraction of the FT is a Hill function of the external stimulus while, in the case of frequency coding, the average frequency between successive pulses depends exponentially of said stimulus (as was done in the first work derived from this Thesis). This exponential dependence was observed for intracellular Ca2+ pulses. We also found it when analyzing the pulses of the FT, Crz1, in yeast cells. As shown in Chapter 5, this dependence can be explained assuming that the underlying dynamics is excitable and that the pulses are associated with the long excursions in phase space that occur in these systems when a threshold is surpassed. Using a compact support distribution for the intensity of the external stimulus, the results of Chapter 4 show that amplitude coding only works optimally when the stimulus distribution is centered around values for which the derivative of the Hill function is maximum. Transmission by frequency, on the other hand, is much less sensitive to variations in the median distribution of the external stimulus and improves with increasing intensities of said stimulus (within certain limits). We can then say that these two encoding modes provide cells with a different “lens” through which to perceive their environment. In particular, the fact that different transduction strategies for the same stimulus are optimal in different ranges of stimulus intensities could explain why some cells, such as yeast cells, are capable of detecting gradients of an external effector (pheromone in the case of yeast) for a very wide range of different mean concentrations. Chapter 5 provides the theoretical framework for the use of the exponential dependence between the mean interpulse time of the signaling agent and the intensity of the external stimulus which use in Chapter 4 was mainly justified in terms of the numerous existing experimental observations. More specifically, in this Chapter we use a simple model of the intracellular Ca2+ dynamics averaged over the entire cell in which the main factor driving the dynamics is the release of Ca2+ from the endoplasmic reticulum through IP3-receptor-channels. Encompassing in a single additive noise term the effects of the spatial inhomogeneities and of the many stochastic processes that affect the dynamics of intracellular Ca2+, we study the behavior of the model for parameters for which the system is excitable. In excitable systems, noise can cause long excursions in phase space that, in the model analyzed here, correspond to pulses of Ca2+. Using the noisy model we then determined the average time between Ca2+ pulses as a function of one of the model parameters (the fraction, β, of receptors with IP3 bound ready to become open upon Ca2+ binding). Using spatio-temporal observations of intracellular Ca2+ and a simple kinetic model of the IP3 receptors, in this Chapter we were able to quantify the noise and relate β to the IP3 concentration. Using estimates of the relationship between this concentration and the intensity of the external stimulus for different cells we showed that the average time between pulses depends exponentially on said intensity for a range such that the value of the corresponding times varies over an interval equal to or greater than those observed experimentally in different cell types. Although this result was formally derived for intracellular Ca2+ pulses, the generality and simplicity of the model allows us to assume that it is possible to apply a similar approach to other cases, in particular, to the pulsatile behavior of FTs, for which there is abundant evidence that, in many cases, it is governed by excitable dynamics. In conclusion, in this Thesis, we explored different aspects in which temporal dynamics in cell signaling give cells capabilities that they would not otherwise have. It is important to note that the ability to transmit information is a phenotype and, therefore, natural selection can act on it. First, we showed how a dynamics with non-Poissonian statistics (through Global Negative Feedback) can increase the transmitted information with respect to the purely Poissonian case. Secondly, we showed that the temporal dynamics of a Transcription Factor can selectively activate promoters through the phenomenon of dynamic multiplexing. Third, we showed how the different way in which external stimuli are encoded in signaling intermediaries depending on their dynamics expands the range of stimulus intensities for which information can be transmitted reliably. This last result initially derived based on experimental observations was finally validated based on a theoretical model. All these aspects of signaling are manifested in biologically relevant phenomena that are discussed in the Thesis.Fil: Givré, Alan Matías. Universidad de Buenos Aires. Facultad de Ciencias Exactas y Naturales; Argentina
Characterization of cell-to-cell variation in nuclear transport rates and identification of its sources
Full text linkNuclear transport is an essential part of eukaryotic cell function. Here, we present scFRAP, a model-assisted fluorescent recovery after photobleaching (FRAP)- based method to determine nuclear import and export rates independently in individual live cells. To overcome the inherent noise of single-cell measurements, we performed sequential FRAPs on the same cell. We found large cell-to-cell variation in transport rates within isogenic yeast populations. For passive transport, the variability in NPC number might explain most of the variability. Using this approach, we studied mother-daughter cell asymmetry in the active nuclear shuttling of the transcription factor Ace2, which is specifically concentrated in daughter cell nuclei in early G1. Rather than reduced export in the daughter cell, as previously hypothesized, we found that this asymmetry is mainly due to an increased import in daughters. These results shed light on cell-to-cell variation in cellular dynamics and its sources.Fil: Durrieu, Lucía. Consejo Nacional de Investigaciones Científicas y Técnicas. Oficina de Coordinación Administrativa Ciudad Universitaria. Instituto de Fisiología, Biología Molecular y Neurociencias. Universidad de Buenos Aires. Facultad de Ciencias Exactas y Naturales. Instituto de Fisiología, Biología Molecular y Neurociencias; ArgentinaFil: Bush, Alan. Consejo Nacional de Investigaciones Científicas y Técnicas. Oficina de Coordinación Administrativa Ciudad Universitaria. Instituto de Fisiología, Biología Molecular y Neurociencias. Universidad de Buenos Aires. Facultad de Ciencias Exactas y Naturales. Instituto de Fisiología, Biología Molecular y Neurociencias; ArgentinaFil: Grande, Alicia Viviana. Consejo Nacional de Investigaciones Científicas y Técnicas. Oficina de Coordinación Administrativa Ciudad Universitaria. Instituto de Fisiología, Biología Molecular y Neurociencias. Universidad de Buenos Aires. Facultad de Ciencias Exactas y Naturales. Instituto de Fisiología, Biología Molecular y Neurociencias; ArgentinaFil: Rikard, Johansson. Linköping University; SueciaFil: David, Janzén. Linköping University; SueciaFil: Katz, Andrea. Universidad de Buenos Aires; ArgentinaFil: Cedersund, Gunnar. Linköping University; SueciaFil: Colman Lerner, Alejandro Ariel. Consejo Nacional de Investigaciones Científicas y Técnicas. Oficina de Coordinación Administrativa Ciudad Universitaria. Instituto de Fisiología, Biología Molecular y Neurociencias. Universidad de Buenos Aires. Facultad de Ciencias Exactas y Naturales. Instituto de Fisiología, Biología Molecular y Neurociencias; Argentin
Participación de factores de crecimiento y fibronectina en la regulación del desarrollo folicular en mamíferos
No full textEsta tesis está dirigida al estudio de factores regulatorios, de producción y acción local, que controlan el desarrollo del folículo ovárico en mamíferos. El modelo que se escogió es el bovino, del cual se obtuvo fluido folicular de folículos en diversos estadios de desarrollo así como también células de la granulosa con las que se establecieron cultivos primarios. Alternativamente se utilizó la línea celular BGC-1, obtenida a partir de cultivos primarios de granulosa bovina, la cual fue validada en términos de su respuesta proliferativa y productos de secreción característicos de los estadios inmaduros de desarrollo folicular. Se determinó que la actividad mitogénica presente en medios condicionados de células BGC-1 es debida a la presencia de fibronectina (FN). La expresión de ésta fue estimulada por la acción del factor de crecimiento transformante β (TGF-β), el cual a su vez alteró el patrón de “splicing” del ARNm de FN, estimulando la inclusión del exón ED-I (FN-ED-I+). Posteriormente, se determinó por Western blot que existen importantes cambios en la expresión de FN-ED-I+ a lo largo del desarrollo folicular, los cuales están correlacionados inversamente con la actividad gonadotrófica en cada folículo, evaluada a través de los niveles de estradiol en fluído folicular. Asimismo, el tratamiento de cultivos primarios con AMPc, mediador de la acción de gonadotrofinas, reduce sensiblemente la expresión de FN-ED-I+. Finalmente se determinó que el dominio ED-I confiere propiedades de factor de crecimiento a la FN, ya que un péptido recombinante de esta región promovió la proliferación de cultivos de células BGC-1. Estos resultados indican que la FN juega un papel importante en el desarrollo folicular, regulando la proliferación dc las células de la granulosa en las primeras etapas del desarrollo folicular
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