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CD81 in acute myeloid leukemia : phenotypic, clinical and biological aspects
No full textLe CD81 est une molécule de surface appartenant à la superfamille des tetraspanines. Son rôle pronostique a été précédemment étudié dans les pathologies lymphoïdes, dont le myélome multiple où son expression est associée à un pronostic péjoratif. A ce jour, ce marqueur n'a pas été étudié dans les leucémies aiguës myéloïdes (LAM). Nous avons étudié l'expression membranaire du CD81 sur les blastes de LAM au diagnostic, son association aux autres caractéristiques des LAM et sa potentielle influence sur la survie des patients sur une cohorte de 134 patients traités par chimiothérapie intensive.Le CD81 a été retrouvé chez 92 patients sur 134 (69%). Les patients exprimant ce marqueur avaient une leucocytose initiale plus élevée (p=0.02) et présentaient une cytogénétique intermédiaire ou défavorable (p<0.001). L'expression du CD81 avait un impact négatif sur la survie des patients (survie sans évènements (EFS), survie globale (OS), survie sans rechute (RFS)) en analyse uni- (p<0.001) et multivariées (p=0.003, 0.002 and <0.001 respectivement).De plus, le CD81 avait un impact négatif sur l'OS des patients avec une mutation de NPM1 (p=0.01) et chez les patients du groupe cytogénétique favorable (p=0.002) selon la classification ELN.Les anomalies du cycle cellulaire étant associées à la chimiorésistance, la croissance tumorale et l'agressivité de la pathologie, nous avons étudié l'expression du Ki67 sur les blastes de LAM au diagnostic. Ainsi, 10 prélèvements médullaires de patients avec une faible expression du CD81 par les blastes (moins de 20% de positivité) et 10 prélèvements avec une forte expression du marqueur ont été étudiés. Nous avons pu démontrer une expression significativement inférieure du Ki67 sur les blastes CD81 positifs par rapport aux blastes CD81 négatifs (p<0.001), suggérant ainsi un rôle potentiel du CD81 dans le contrôle du cycle cellulaire. De plus, nous nous sommes intéressés au rôle du CD81 dans la chimiorésistance et sur les différentes voies de signalisation cellulaire en étudiant le profil d'expression génique.En conclusion, le CD81 semble être un nouveau marqueur pronostique des LAM ainsi qu'une cible potentielle de traitement de ces pathologies.CD81 is a cell surface protein which belongs to the tetraspanin family. While in multiple myeloma its expression on plasma cells is associated with worse prognosis, this has not yet been explored in acute myeloid leukemia (AML). We measured membrane expression of CD81 on AML cells at diagnosis, evaluated its association with AML characteristics and its influence on patient outcome after intensive chemotherapy in a cohort of 134 patients. CD81 was detected in 92/134 (69%) patients. Patients with AML expressing CD81 had elevated leukocyte count (p=0.02) and were more likely classified as intermediate or adverse-risk by cytogenetics (p<0.001). CD81 expression had a negative impact on survival (event-free [EFS], overall [OS] and relapse-free survival [RFS]) in univariate (p<0.001) and in multivariate analyses (p=0.003, 0.002 and <0.001, respectively). CD81 has a negative impact on OS in patients with NPM1 mutation (p=0.01) and in favorable risk patients by European Leukemia Net (ELN) classification (p=0.002).Since aberrations in cell cycle signaling can cause drug resistance, tumor growth and aggressiveness we measured Ki67 on primary blast cells from AML patients. We considered 10 bone marrow samples from AML patients with either weak CD81 expression (less than 20% of blast cells) or 10 bone marrow samples with strong CD81 expression on blasts. We found a significant lower ki67 expression on blast cells from CD81 positive patients compared with those from CD81 negative patients (p<0.001), indicating a potential role of CD81 in cell cycle control. Furthermore, we investigated the role of CD81 in chemotherapy resistance and investigated potentially implicated signaling pathways by gene expression profiling.In conclusion, the cell surface marker CD81 may be a new prognostic marker for diagnostic risk classification and a new potential therapeutic target for drug development in AML
Functional study of the prognostic markers CD81 and ABCB1 in acute myeloid leukaemia
No full textLa leucémie aiguë myéloïde (LAM) est une hémopathie hétérogène. La stratification thérapeutique repose sur les anomalies cytogénétiques et moléculaires. Les rechutes, probablement liées aux cellules souches leucémiques (CSL) sont dans la majorité des cas difficiles à prédire. Mon travail de thèse a consisté en l’étude de deux marqueurs de mauvais pronostic, liés aux CSL :1/ ABCB1, membre de la famille des transporteurs ATP Binding Cassette, connu pour son implication dans la chimiorésistance et2/ CD81, une tétraspanine, pour laquelle nous avons démontré l’impact pronostique dans les LAM. Méthodes1/ ABCB1 : nous avons évalué la relation entre l’activité d’ABCB1 et les caractéristiques cliniques, ainsi que la réponse aux chimiothérapies dans une cohorte de 321 patients atteints de LAM. Nous avons exploré l’association entre l’activité d’ABCB1 et la chimiorésistance ex vivo, l’expression génique et évalué l’effet d’un inhibiteur d’ABCB1.2/ CD81 : l’élaboration de lignées cellulaires ayant une expression différentielle de CD81, soit par surexpression de l’ADNc ; soit par sous-expression via des shARN nous a permis d’étudier la chimiorésistance, la prolifération, l’adhésion, la migration et l’invasion cellulaires. Par microscopie confocale, nous avons étudié la morphologie cellulaire.Des souris NSG ont été injectées avec ces modèles pour étudier la prise de greffe, le homing et l’invasion tumorale.D’autre part, nous avons xénogreffé des cellules de patients (PDX) pour étudier l’association entre l’expression de CD81 sur les blastes et la prise de greffe.Résultats1/ L’activité d’ABCB1, observée dans 58% des LAM était associée à une moindre leucocytose, une plus forte expression de CD34, une absence de mutations FLT3-ITD ou NPM1 et à une moindre survie globale et sans événement. Néanmoins, l’activité ABCB1 n’aboutissait pas directement à une chimiorésistance aux anthracyclines ex vivo. La corrélation entre l’expression d’ABCB1 et celle des gènes de BAALC, CD34, CD200 et CD7, suggère que l’expression d’ABCB1 pourrait être un indicateur indirect des LAM de haut risque. De plus, l’expression d’ABCB1 était inversement corrélée à celle des gènes de cluster HOX et à CD33.2/ Dans les PDX, la prise de greffe était associée à une plus forte expression de CD81 et le temps de prise de greffe était corrélé négativement au niveau d’expression de CD81.Les PDX avec les lignées modifiées avaient une invasion tumorale augmentée lorsque CD81 était surexprimé.Aussi, une forte expression de CD81 induisait in vitro une plus forte 1) adhésion à la fibronectine et aux fibroblastes, 2) migration et 3) invasion tumorale dans une matrice de gel semi-liquide.En microscopie confocale, les cellules exprimant plus le CD81 avaient plus de lamellipodes, impliqués dans la migration cellulaire. La chimiorésistance à la daunorubicine était corrélée positivement à l’expression de CD81.Conclusions1/ Nous avons démontré l’impact pronostique de l’expression génique, protéique et de l’activité d’ABCB1. De plus, ABCB1 ne serait pas directement impliqué dans la chimiorésistance, son inhibition n’améliorant pas la survie des patients mais plutôt un reflet indirect des formes de LAM de haut risque. Enfin, les patients avec faible expression d’ABCB1 pourraient bénéficier d’un traitement anti-CD33 par gemtuzumab ozogamicin associé à la chimiothérapie conventionnelle.2/ Une forte expression de CD81 est associée à un moins bon pronostic chez les patients atteints de LAM et dans notre modèle PDX. L’expression de CD81 sur les blastes au diagnostic est associée à une prise de greffe chez les souris NSG, suggérant qu’il pourrait être un marqueur souche. A présent, nous testons un anticorps anti-CD81 comme traitement dans un modèle murin. Une forte expression de CD81 augmente les capacités d’adhésion, de migration et d’invasion, médiées par la formation de lamellipodes et nous nous intéressons à l’implication des voies de signalisation Rac-RhoGTPase.Acute myeloid leukemia (AML) is a heterogeneous disease. Currently, therapeutic stratification relies on cytogenetics and molecular markers. In the majority of cases, relapses, probably due to leukemic stem cells (LSC), are challenging to predict.My thesis encompasses the clinical and functional study of two poor prognostic factors related to LSC:1/ ABCB1, a member of the ATP binding cassette transporter family, known for its implication in drug resistance, although the mechanism remains unclear and2/ CD81, a protein belonging to the tetraspanin family, for which we were the first to uncover its prognostic role in adult AML and for which the underlying mechanisms are presently unknown.Methods1/ For ABCB1, we evaluated its activity in relation to clinical parameters and treatment response to standard chemotherapy in 321 patients with AML. We assessed multiple clinical relationships of ABCB1 activity—ex vivo drug resistance, gene expression, and evaluated an ABCB1 inhibitor.2/ For CD81, we established AML cell lines with varying degrees of CD81 expression, either by cDNA over-expression or by shRNA mediated knock-down. On these models, we tested chemotherapy resistance, cellular proliferation, adhesion, migration and invasion. We performed confocal microscopy to study morphologic cell features.We injected NSG mice with different modified AML cells to study engraftment, homing and tumor invasion. We performed patient-derived-xenografts (PDX) to study the association between blasts CD81 expression and AML engraftment.Results1/ ABCB1 activity was observed in 58% of AML and was linked to low white blood cell count, high expression of CD34, absence of FLT3-ITD and absence of mutant NPM1. Moreover, ABCB1 activity was associated with worse overall- and event-free survival. However, ABCB1 activity did not directly lead to ex vivo drug resistance to anthracyclines. We found that ABCB1 expression was highly correlated with gene expressions of BAALC, CD34, CD200, and CD7, indicating that ABCB1 expression may be a passenger characteristic of high-risk AML. Furthermore, ABCB1 expression was inversely correlated to HOX cluster genes and CD33.2/ In PDX, engraftment rate was associated with higher CD81 expression and time-to engraftment was inversely correlated to the level of CD81 expression. The PDX with modified cell lines revealed increased tumor invasion in association with higher CD81 expression.Furthermore, we showed that high CD81 expression induced in vitro 1) adhesion to fibronectin and fibroblasts cells, 2) migration towards fibroblasts and 3) tumor invasion into a semisolid gel matrix. Using confocal microscopy, we observed that high CD81 cells form lamellipods implicated in cellular motility. We also established an association between CD81 expression and chemotherapy resistance, notably to daunorubicin.Conclusions1/ We showed prognostic importance of ABCB1 gene expression, protein expression, and activity. Furthermore, ABCB1 was not directly linked to drug resistance, as ABCB1 inhibition did not improve outcome of high ABCB1 AML patients. High ABCB1 may represent a passenger characteristic of high-risk AML. Finally, low ABCB1 AML patients could benefit specifically from anti-CD33 treatment by gemtuzumab ozogamicin in addition to standard chemotherapy.2/ High CD81 expression is linked to dismal prognosis in AML patients and in our PDX model. CD81 expression on blasts at diagnosis promotes engraftment in NSG mice; which may thus be a marker of stemness. Currently, we are testing CD81 antibody as a potential treatment using a murine xenograft model. Higher CD81 leads to enhanced capacity of adhesion, migration and invasion mediated by the formation of lamellipods and we are now investigating the implication of the Rac-RhoGTPases signaling pathways as an underlying mechanism
Thiopurine pathway
No full textThe thiopurine drugs are purine antimetabolites widely used in the treatment of acute lymphoblastic leukemia, autoimmune disorders (e.g. Crohn’s disease and rheumatoid arthritis) and of organ transplant recipients. As inactive prodrugs, 6-mercaptopurine (6-MP), 6-thioguanine (6-TG) and azathioprine require intracellular activation, catalyzed by multiple enzymes, to exert cytotoxicity. The first step in azathioprine activation is the release of 6-MP, which involves glutathione transferases and nonenzy-matic conversion. Transport of 6-MP into the cell involves SLC28A2, SLC28A3, SLC29A1 and SLC29A2. After the uptake, 6-MP is converted into thioinosine mono-phosphate by hypoxanthine guanine phosphoribosyl transferase, with 5-phospho-D-ribose-1-pyrophosphate as the phosphoribosyl donor. In a similar way, 6-TG can be converted into thioguanosine monophosphate (TGMP). Thioinosine monophosphate can be converted into TGMP in two steps: first, thioxanthosine monophosphate is formed by inositol monophosphate dehydrogenase; second, TGMP is formed by guanosine monophosphate synthetase. Subsequently, TGMP can be converted into TG nucleotide diphosphates and triphosphates. Cyto-toxic effects of thiopurine drugs are achieved through incorporation of thio-deoxyguanosine triphosphate into DNA and of thioguanosine triphosphate into RNA, by inhibition of de novo purine synthesis by methylmercap-topurine nucleotides and by inhibition of Rac1 (this inhibition induces apoptosis in activated T-cells). The thio-deoxyguanosine triphosphate incorporation inhibits the function of several enzymes involved in DNA replication and repair, and induces DNA damage such as single strand-breaks, DNA–protein cross-links and chromatid exchanges. The pathway that leads to synthesis of active metabolites is in competition with inactivation pathways catalyzed by xanthine oxidase or the polymorphic thiopurine methyltransferase
Erratum: Acute lymphoblastic leukaemia: a model for the pharmacogenomics of cancer therapy
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Targeting RUNX1 in acute myeloid leukemia : preclinical innovations and therapeutic implications
No full textIntroduction: RUNX1 is an essential transcription factor for normal and malignant hematopoiesis. RUNX1 forms a heterodimeric complex with CBFB. Germline mutations and somatic alterations (i.e. translocations, mutations and abnormal expression) are frequently associated with acute myeloid leukemia (AML) with RUNX1 mutations conferring unfavorable prognosis. Therefore, RUNX1 constitutes a potential innovative and interesting therapeutic target. In this review, we discuss recent therapeutic advances of RUNX1 targeting in AML.Areas covered: Firstly, we cover the clinical basis for RUNX1 targeting. We have subdivided recent therapeutic approaches either by common biochemical pathways or by similar pharmacological targets. Genome editing of RUNX1 induces anti-leukemic effects; however, off-target events prohibit clinical use. Several molecules inhibit the interaction between RUNX1/CBFB and control AML development and progression. BET protein antagonists target RUNX1 (i.e. specific BET inhibitors, BRD4 shRNRA, proteolysis targeting chimeras (PROTAC) or expression-mimickers). All these molecules improve survival in mutant RUNX1 AML preclinical models.Expert opinion: Some of these novel molecules have shown encouraging anti-leukemic potency at the preclinical stage. A better understanding of RUNX1 function in AML development and progression and its key downstream pathways, may result in more precise and more efficient RUNX1 targeting therapies
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