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Combiner la MST à la CE : une stratégie d'intérêt pour l'évaluation des interactions enzyme/ligand de petite taille dans des lysats cellulaires
No full textThis thesis project aimed to develop an analytical strategy using MicroScale Thermophoresis (MST) and Capillary Electrophoresis (CE) to quantitatively assess enzyme/small molecule interactions directly in cell lysates, without purification or the use of radioactivity. As a proof of concept, we studied the inhibition of LIM kinases (LIMK1 and LIMK2), promising therapeutic targets for neurofibromatosis type 1, certain cancers, and neurological diseases. Hundreds of LIMK inhibitor with dissociation constants (Kd) in the nanomolar range in vitro have been reported, but only the molecule LX7101 has reached clinical phase I/IIa, with no published results. The MST technique we used requires one of the interaction partners to be fluorescent. To work in cell lysates, red fluorescence is optimal in terms of selectivity and sensitivity. We produced LIMK1, LIMK2 proteins, as well as their catalytic domains Kin1 and Kin2, fluorescent in HEK293 cells by fusing them with miRFP670 (λₑₓ/λₑₘ = 650/670 nm). Before the MST assays, the production of labeled proteins was confirmed by Western blot and their catalytic activities by CE. This work demonstrates for the first time that miRFP670 can be used as a fluorescent fusion protein for MST assays, thereby eliminating the purification steps of the target from cell lysates. The MST methodology was optimized and validated by evaluating the binding affinity of the inhibitors LX7101, BMS-5, T56-LIMKi, and TH-257. We also used MST to evaluate the thermodynamic parameters (ΔH, ΔS, and ΔG) of the interactions between LIMKs and their inhibitors in cell lysates. The results show that entropy (ΔS) opposes the interaction, while enthalpy (ΔH) favors it. To develop LIMK inhibitors able to pass clinical trials, it would be beneficial to improve the entropic term by developing more hydrophobic compounds. The advantage of MST in measuring thermodynamic and binding parameters of target/ligand binding under near in vivo conditions makes it a valuable tool in medicinal chemistry and health science. Additionally, coupling catalytic activity and binding affinity assays through the combined use of CE and MST constitutes an interesting approach for screening drug candidates, understanding their binding mechanisms, and their modulatory effects in a cellular environment. The developed approach is reagent-efficient, reliable, simple, robust, fast, and perfectly suited for complex biological environments.Ce projet de thèse visait à développer une stratégie analytique utilisant la thermophorèse à micro-échelle (MST) et l'électrophorèse capillaire (CE) pour évaluer quantitativement les interactions enzyme/petite molécule directement dans des lysats cellulaires, sans purification ni utilisation de radioactivité. Comme preuve de concept, nous avons étudié l'inhibition des LIM kinases (LIMK1 et LIMK2), des cibles thérapeutiques prometteuses pour la neurofibromatose de type 1, certains cancers et maladies neurologiques. Des centaines de molécules inhibitrices des LIMKs avec des constantes de dissociation (Kd) de l'ordre du nanomolaires in vitro ont été rapportées, mais seule la molécule LX7101 a atteint la phase clinique I/IIa, sans résultats publiés. La MST utilisée nécessite que l'un des partenaires de l'interaction soit fluorescent. Pour travailler dans des lysats cellulaires, la fluorescence rouge est optimale en termes de sélectivité et de sensibilité. Nous avons produit les protéines LIMK1, LIMK2, ainsi que leurs domaines catalytiques Kin1 et Kin2, fluorescentes dans les cellules HEK293 en les fusionnant avec la miRFP670 (λₑₓ/λₑₘ = 650/670 nm). Avant les essais MST, la production des protéines étiquetées a été confirmée par Western blot et leurs activités catalytiques par CE. Ce travail montre pour la première fois que la miRFP670 peut être utilisée comme protéine de fusion fluorescente pour des essais en MST, éliminant ainsi les étapes de purification de la cible à partir du lysat cellulaire. La méthodologie MST a été développée et validée en évaluant l'affinité de liaison des inhibiteurs LX7101, BMS-5, T56-LIMKi et TH-257. Nous avons également utilisé la MST pour évaluer les paramètres thermodynamiques (ΔH, ΔS et ΔG) des interactions entre les LIMKs et leurs inhibiteurs dans des lysats cellulaires. Les résultats montrent que l'entropie (ΔS) s'oppose à l'interaction, tandis que l'enthalpie (ΔH) la favorise. Pour développer des inhibiteurs de LIMKs capables de passer les essais cliniques, il serait alors bénéfique d'améliorer le terme entropique en développant des actifs plus hydrophobes. Les avantages de la MST pour mesurer les paramètres thermodynamiques et d'affinité de la liaison cible/ligand dans des conditions proches du in vivo en font un outil précieux en chimie médicinale et en santé. De plus, le couplage des essais d'activité catalytique et d'affinité via l'utilisation combinée de la CE et de la MST constitue une approche intéressante pour cribler des candidats médicamenteux, comprendre leurs mécanismes de liaison et leurs effets modulateurs dans un milieu cellulaire. L'approche développée est économe en réactifs, fiable, simple, robuste, rapide et parfaitement adaptée aux milieux biologiques complexes
Combiner la MST à la CE : une stratégie d'intérêt pour l'évaluation des interactions enzyme/ligand de petite taille dans des lysats cellulaires
No full textThis thesis project aimed to develop an analytical strategy using MicroScale Thermophoresis (MST) and Capillary Electrophoresis (CE) to quantitatively assess enzyme/small molecule interactions directly in cell lysates, without purification or the use of radioactivity. As a proof of concept, we studied the inhibition of LIM kinases (LIMK1 and LIMK2), promising therapeutic targets for neurofibromatosis type 1, certain cancers, and neurological diseases. Hundreds of LIMK inhibitor with dissociation constants (Kd) in the nanomolar range in vitro have been reported, but only the molecule LX7101 has reached clinical phase I/IIa, with no published results. The MST technique we used requires one of the interaction partners to be fluorescent. To work in cell lysates, red fluorescence is optimal in terms of selectivity and sensitivity. We produced LIMK1, LIMK2 proteins, as well as their catalytic domains Kin1 and Kin2, fluorescent in HEK293 cells by fusing them with miRFP670 (λₑₓ/λₑₘ = 650/670 nm). Before the MST assays, the production of labeled proteins was confirmed by Western blot and their catalytic activities by CE. This work demonstrates for the first time that miRFP670 can be used as a fluorescent fusion protein for MST assays, thereby eliminating the purification steps of the target from cell lysates. The MST methodology was optimized and validated by evaluating the binding affinity of the inhibitors LX7101, BMS-5, T56-LIMKi, and TH-257. We also used MST to evaluate the thermodynamic parameters (ΔH, ΔS, and ΔG) of the interactions between LIMKs and their inhibitors in cell lysates. The results show that entropy (ΔS) opposes the interaction, while enthalpy (ΔH) favors it. To develop LIMK inhibitors able to pass clinical trials, it would be beneficial to improve the entropic term by developing more hydrophobic compounds. The advantage of MST in measuring thermodynamic and binding parameters of target/ligand binding under near in vivo conditions makes it a valuable tool in medicinal chemistry and health science. Additionally, coupling catalytic activity and binding affinity assays through the combined use of CE and MST constitutes an interesting approach for screening drug candidates, understanding their binding mechanisms, and their modulatory effects in a cellular environment. The developed approach is reagent-efficient, reliable, simple, robust, fast, and perfectly suited for complex biological environments.Ce projet de thèse visait à développer une stratégie analytique utilisant la thermophorèse à micro-échelle (MST) et l'électrophorèse capillaire (CE) pour évaluer quantitativement les interactions enzyme/petite molécule directement dans des lysats cellulaires, sans purification ni utilisation de radioactivité. Comme preuve de concept, nous avons étudié l'inhibition des LIM kinases (LIMK1 et LIMK2), des cibles thérapeutiques prometteuses pour la neurofibromatose de type 1, certains cancers et maladies neurologiques. Des centaines de molécules inhibitrices des LIMKs avec des constantes de dissociation (Kd) de l'ordre du nanomolaires in vitro ont été rapportées, mais seule la molécule LX7101 a atteint la phase clinique I/IIa, sans résultats publiés. La MST utilisée nécessite que l'un des partenaires de l'interaction soit fluorescent. Pour travailler dans des lysats cellulaires, la fluorescence rouge est optimale en termes de sélectivité et de sensibilité. Nous avons produit les protéines LIMK1, LIMK2, ainsi que leurs domaines catalytiques Kin1 et Kin2, fluorescentes dans les cellules HEK293 en les fusionnant avec la miRFP670 (λₑₓ/λₑₘ = 650/670 nm). Avant les essais MST, la production des protéines étiquetées a été confirmée par Western blot et leurs activités catalytiques par CE. Ce travail montre pour la première fois que la miRFP670 peut être utilisée comme protéine de fusion fluorescente pour des essais en MST, éliminant ainsi les étapes de purification de la cible à partir du lysat cellulaire. La méthodologie MST a été développée et validée en évaluant l'affinité de liaison des inhibiteurs LX7101, BMS-5, T56-LIMKi et TH-257. Nous avons également utilisé la MST pour évaluer les paramètres thermodynamiques (ΔH, ΔS et ΔG) des interactions entre les LIMKs et leurs inhibiteurs dans des lysats cellulaires. Les résultats montrent que l'entropie (ΔS) s'oppose à l'interaction, tandis que l'enthalpie (ΔH) la favorise. Pour développer des inhibiteurs de LIMKs capables de passer les essais cliniques, il serait alors bénéfique d'améliorer le terme entropique en développant des actifs plus hydrophobes. Les avantages de la MST pour mesurer les paramètres thermodynamiques et d'affinité de la liaison cible/ligand dans des conditions proches du in vivo en font un outil précieux en chimie médicinale et en santé. De plus, le couplage des essais d'activité catalytique et d'affinité via l'utilisation combinée de la CE et de la MST constitue une approche intéressante pour cribler des candidats médicamenteux, comprendre leurs mécanismes de liaison et leurs effets modulateurs dans un milieu cellulaire. L'approche développée est économe en réactifs, fiable, simple, robuste, rapide et parfaitement adaptée aux milieux biologiques complexes
Combining MST and CE : a strategy of interest for assessing enzyme/small ligand interactions in cell lysates
No full textCe projet de thèse visait à développer une stratégie analytique utilisant la thermophorèse à micro-échelle (MST) et l'électrophorèse capillaire (CE) pour évaluer quantitativement les interactions enzyme/petite molécule directement dans des lysats cellulaires, sans purification ni utilisation de radioactivité. Comme preuve de concept, nous avons étudié l'inhibition des LIM kinases (LIMK1 et LIMK2), des cibles thérapeutiques prometteuses pour la neurofibromatose de type 1, certains cancers et maladies neurologiques. Des centaines de molécules inhibitrices des LIMKs avec des constantes de dissociation (Kd) de l'ordre du nanomolaires in vitro ont été rapportées, mais seule la molécule LX7101 a atteint la phase clinique I/IIa, sans résultats publiés. La MST utilisée nécessite que l'un des partenaires de l'interaction soit fluorescent. Pour travailler dans des lysats cellulaires, la fluorescence rouge est optimale en termes de sélectivité et de sensibilité. Nous avons produit les protéines LIMK1, LIMK2, ainsi que leurs domaines catalytiques Kin1 et Kin2, fluorescentes dans les cellules HEK293 en les fusionnant avec la miRFP670 (λₑₓ/λₑₘ = 650/670 nm). Avant les essais MST, la production des protéines étiquetées a été confirmée par Western blot et leurs activités catalytiques par CE. Ce travail montre pour la première fois que la miRFP670 peut être utilisée comme protéine de fusion fluorescente pour des essais en MST, éliminant ainsi les étapes de purification de la cible à partir du lysat cellulaire. La méthodologie MST a été développée et validée en évaluant l'affinité de liaison des inhibiteurs LX7101, BMS-5, T56-LIMKi et TH-257. Nous avons également utilisé la MST pour évaluer les paramètres thermodynamiques (ΔH, ΔS et ΔG) des interactions entre les LIMKs et leurs inhibiteurs dans des lysats cellulaires. Les résultats montrent que l'entropie (ΔS) s'oppose à l'interaction, tandis que l'enthalpie (ΔH) la favorise. Pour développer des inhibiteurs de LIMKs capables de passer les essais cliniques, il serait alors bénéfique d'améliorer le terme entropique en développant des actifs plus hydrophobes. Les avantages de la MST pour mesurer les paramètres thermodynamiques et d'affinité de la liaison cible/ligand dans des conditions proches du in vivo en font un outil précieux en chimie médicinale et en santé. De plus, le couplage des essais d'activité catalytique et d'affinité via l'utilisation combinée de la CE et de la MST constitue une approche intéressante pour cribler des candidats médicamenteux, comprendre leurs mécanismes de liaison et leurs effets modulateurs dans un milieu cellulaire. L'approche développée est économe en réactifs, fiable, simple, robuste, rapide et parfaitement adaptée aux milieux biologiques complexes.This thesis project aimed to develop an analytical strategy using MicroScale Thermophoresis (MST) and Capillary Electrophoresis (CE) to quantitatively assess enzyme/small molecule interactions directly in cell lysates, without purification or the use of radioactivity. As a proof of concept, we studied the inhibition of LIM kinases (LIMK1 and LIMK2), promising therapeutic targets for neurofibromatosis type 1, certain cancers, and neurological diseases. Hundreds of LIMK inhibitor with dissociation constants (Kd) in the nanomolar range in vitro have been reported, but only the molecule LX7101 has reached clinical phase I/IIa, with no published results. The MST technique we used requires one of the interaction partners to be fluorescent. To work in cell lysates, red fluorescence is optimal in terms of selectivity and sensitivity. We produced LIMK1, LIMK2 proteins, as well as their catalytic domains Kin1 and Kin2, fluorescent in HEK293 cells by fusing them with miRFP670 (λₑₓ/λₑₘ = 650/670 nm). Before the MST assays, the production of labeled proteins was confirmed by Western blot and their catalytic activities by CE. This work demonstrates for the first time that miRFP670 can be used as a fluorescent fusion protein for MST assays, thereby eliminating the purification steps of the target from cell lysates. The MST methodology was optimized and validated by evaluating the binding affinity of the inhibitors LX7101, BMS-5, T56-LIMKi, and TH-257. We also used MST to evaluate the thermodynamic parameters (ΔH, ΔS, and ΔG) of the interactions between LIMKs and their inhibitors in cell lysates. The results show that entropy (ΔS) opposes the interaction, while enthalpy (ΔH) favors it. To develop LIMK inhibitors able to pass clinical trials, it would be beneficial to improve the entropic term by developing more hydrophobic compounds. The advantage of MST in measuring thermodynamic and binding parameters of target/ligand binding under near in vivo conditions makes it a valuable tool in medicinal chemistry and health science. Additionally, coupling catalytic activity and binding affinity assays through the combined use of CE and MST constitutes an interesting approach for screening drug candidates, understanding their binding mechanisms, and their modulatory effects in a cellular environment. The developed approach is reagent-efficient, reliable, simple, robust, fast, and perfectly suited for complex biological environments
Combiner la MST à la CE : une stratégie d'intérêt pour l'évaluation des interactions enzyme/ligand de petite taille dans des lysats cellulaires
No full textThis thesis project aimed to develop an analytical strategy using MicroScale Thermophoresis (MST) and Capillary Electrophoresis (CE) to quantitatively assess enzyme/small molecule interactions directly in cell lysates, without purification or the use of radioactivity. As a proof of concept, we studied the inhibition of LIM kinases (LIMK1 and LIMK2), promising therapeutic targets for neurofibromatosis type 1, certain cancers, and neurological diseases. Hundreds of LIMK inhibitor with dissociation constants (Kd) in the nanomolar range in vitro have been reported, but only the molecule LX7101 has reached clinical phase I/IIa, with no published results. The MST technique we used requires one of the interaction partners to be fluorescent. To work in cell lysates, red fluorescence is optimal in terms of selectivity and sensitivity. We produced LIMK1, LIMK2 proteins, as well as their catalytic domains Kin1 and Kin2, fluorescent in HEK293 cells by fusing them with miRFP670 (λₑₓ/λₑₘ = 650/670 nm). Before the MST assays, the production of labeled proteins was confirmed by Western blot and their catalytic activities by CE. This work demonstrates for the first time that miRFP670 can be used as a fluorescent fusion protein for MST assays, thereby eliminating the purification steps of the target from cell lysates. The MST methodology was optimized and validated by evaluating the binding affinity of the inhibitors LX7101, BMS-5, T56-LIMKi, and TH-257. We also used MST to evaluate the thermodynamic parameters (ΔH, ΔS, and ΔG) of the interactions between LIMKs and their inhibitors in cell lysates. The results show that entropy (ΔS) opposes the interaction, while enthalpy (ΔH) favors it. To develop LIMK inhibitors able to pass clinical trials, it would be beneficial to improve the entropic term by developing more hydrophobic compounds. The advantage of MST in measuring thermodynamic and binding parameters of target/ligand binding under near in vivo conditions makes it a valuable tool in medicinal chemistry and health science. Additionally, coupling catalytic activity and binding affinity assays through the combined use of CE and MST constitutes an interesting approach for screening drug candidates, understanding their binding mechanisms, and their modulatory effects in a cellular environment. The developed approach is reagent-efficient, reliable, simple, robust, fast, and perfectly suited for complex biological environments.Ce projet de thèse visait à développer une stratégie analytique utilisant la thermophorèse à micro-échelle (MST) et l'électrophorèse capillaire (CE) pour évaluer quantitativement les interactions enzyme/petite molécule directement dans des lysats cellulaires, sans purification ni utilisation de radioactivité. Comme preuve de concept, nous avons étudié l'inhibition des LIM kinases (LIMK1 et LIMK2), des cibles thérapeutiques prometteuses pour la neurofibromatose de type 1, certains cancers et maladies neurologiques. Des centaines de molécules inhibitrices des LIMKs avec des constantes de dissociation (Kd) de l'ordre du nanomolaires in vitro ont été rapportées, mais seule la molécule LX7101 a atteint la phase clinique I/IIa, sans résultats publiés. La MST utilisée nécessite que l'un des partenaires de l'interaction soit fluorescent. Pour travailler dans des lysats cellulaires, la fluorescence rouge est optimale en termes de sélectivité et de sensibilité. Nous avons produit les protéines LIMK1, LIMK2, ainsi que leurs domaines catalytiques Kin1 et Kin2, fluorescentes dans les cellules HEK293 en les fusionnant avec la miRFP670 (λₑₓ/λₑₘ = 650/670 nm). Avant les essais MST, la production des protéines étiquetées a été confirmée par Western blot et leurs activités catalytiques par CE. Ce travail montre pour la première fois que la miRFP670 peut être utilisée comme protéine de fusion fluorescente pour des essais en MST, éliminant ainsi les étapes de purification de la cible à partir du lysat cellulaire. La méthodologie MST a été développée et validée en évaluant l'affinité de liaison des inhibiteurs LX7101, BMS-5, T56-LIMKi et TH-257. Nous avons également utilisé la MST pour évaluer les paramètres thermodynamiques (ΔH, ΔS et ΔG) des interactions entre les LIMKs et leurs inhibiteurs dans des lysats cellulaires. Les résultats montrent que l'entropie (ΔS) s'oppose à l'interaction, tandis que l'enthalpie (ΔH) la favorise. Pour développer des inhibiteurs de LIMKs capables de passer les essais cliniques, il serait alors bénéfique d'améliorer le terme entropique en développant des actifs plus hydrophobes. Les avantages de la MST pour mesurer les paramètres thermodynamiques et d'affinité de la liaison cible/ligand dans des conditions proches du in vivo en font un outil précieux en chimie médicinale et en santé. De plus, le couplage des essais d'activité catalytique et d'affinité via l'utilisation combinée de la CE et de la MST constitue une approche intéressante pour cribler des candidats médicamenteux, comprendre leurs mécanismes de liaison et leurs effets modulateurs dans un milieu cellulaire. L'approche développée est économe en réactifs, fiable, simple, robuste, rapide et parfaitement adaptée aux milieux biologiques complexes
Going Beyond Counting First Authors in Author Co-citation Analysis
Full text linkThe present study examines one of the fundamental aspects of author co-citation analysis (ACA) - the way co-citation
counts are defined. Co-citation counting provides the data on which all subsequent statistical analyses and mappings
are based, and we compare ACA results based on two different types of co-citation counting - the traditional type that
only counts the first one among a cited work's authors on the one hand and a non-traditional type that takes into
account the first 5 authors of a cited work on the other hand. Results indicate that the picture produced through this non-traditional author co-citation counting contains more coherent author groups and is therefore considerably clearer. However, this picture represents fewer specialties in the research field being studied than that produced through the traditional first-author co-citation counting when the same number of top-ranked authors is selected and analyzed. Reasons for these effects are discussed
Variations on the Author
Full text link“Variations on the Author” discusses two of Eduardo Coutinho’s recent films (Um Dia na Vida, from 2010, and Últimas Conversas, posthumously released in 2015) and their contribution to the general question of documentary authorship. The director’s filmography is characterized by a consistent yet self-effacing form of authorial self-inscription: Coutinho often features as an interviewer that rather than express opinions propels discourses; an interviewer that is good at listening. This mode of self-inscription characterizes him as an author who is not expressive but who is nonetheless markedly present on the screen. In Um Dia na Vida, however, Coutinho is completely absent form the image, while Últimas Conversas, on the contrary, includes a confessional prologue that moves the director from the margins to the center of his films. This article examines the ways in which these works stand out in the filmography of a director who offers new insights into the notion of cinematic authorship
Appropriate Similarity Measures for Author Cocitation Analysis
Full text linkWe provide a number of new insights into the methodological discussion about author cocitation analysis. We first argue that the use of the Pearson correlation for measuring the similarity between authors’ cocitation profiles is not very satisfactory. We then discuss what kind of similarity measures may be used as an alternative to the Pearson correlation. We consider three similarity measures in particular. One is the well-known cosine. The other two similarity measures have not been used before in the bibliometric literature. Finally, we show by means of an example that our findings have a high practical relevance.information science;Pearson correlation;cosine;similarity measure;author cocitation analysis
Dispelling the Myths Behind First-author Citation Counts
Full text linkWe conducted a full-scale evaluative citation analysis study of scholars in the XML research field to explore just how different from each other author rankings resulting from different citation counting methods actually are, and to demonstrate the capability of emerging data and tools on the Web in supporting more realistic citation counting methods. Our results contest some common arguments for the continued
use of first-author citation counts in the evaluation of scholars, such as high correlations between author rankings by first-author citation counts and other citation
counting methods, and high costs of using more realistic citation counting methods that are not well-supported by the ISI databases. It is argued that increasingly available digital full text research papers make it possible for citation analysis studies to go beyond what the ISI databases have directly supported and to employ more
sophisticated methods
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