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ESTRATTI DI ALOE, CURCUMA, ECHINACEA, GINSENG, LAVANDA, ORIGANO E RABARBARO MODULANO IL RILASCIO DI ROS E LA PROLIFERAZIONE DEI LEUCOCITI DI TROTA IRIDEA (ONCORHYNCHUS MYKISS)
No full textL'impiego di piante medicinali è oggetto di una crescente attenzione sia in medicina umana che
veterinaria per le loro proprietà antiossidanti e immunostimolanti. Anche in acquacoltura la possibile
applicazione di immunostimolanti naturali a base di erbe sta suscitando notevole interesse, allo scopo
di ridurre l'impiego di antibiotici nel trattamento delle malattie infettive, garantendo al tempo stesso
produzioni ecocompatibili e sicure per il consumatore. Peraltro la Comunità Europea ha vietato l’uso
di antibiotici di sintesi come promotori della crescita nell'alimentazione degli animali (1831/2003 CE),
quindi approcci alternativi vengono studiati anche in questo campo. Numerose prove sperimentali in
vivo sono state effettuate per indagare l’effetto della somministrazione di prodotti ottenuti da piante su
risposta immunitaria e resistenza alle malattie di diverse specie ittiche (Bulfon et al., 2014), mentre
sono limitati gli studi in vitro dedicati alla valutazione delle proprietà immunomodulanti di fitoestratti
o composti bioattivi sulle cellule immunitarie dei pesci. Le recenti linee guida comunitarie
(2010/63/UE) e nazionali (D.L. n. 26 del 4 marzo 2014) impongono di limitare l'uso di animali a fini
scientifici, di conseguenza un approccio preliminare in vitro viene sempre più raccomandato.
L'obiettivo di questo studio è stato quello di indagare in vitro gli effetti degli estratti di Aloe vera,
Curcuma longa, Echinacea purpurea, Lavandula officinalis, Origanum vulgare, Panax ginseng e
Rheum officinale (E.P.O. srl, Milano) sul rilascio di specie reattive dell’ossigeno (ROS) e sulla
proliferazione dei leucociti di trota iridea (Oncorhynchus mykiss).
Sei soggetti adulti sani sono stati selezionati e utilizzati per l’analisi di ciascun parametro. Le cellule
sono state purificate da rene anteriore e incubate a 18°C in terreno L-15 con dosi crescenti di estratto
per 2 h o 72 h, quindi è stata misurata l’attività di “burst respiratorio” dopo stimolazione con PMA,
mediante chemiluminescenza, e la proliferazione in presenza e assenza del mitogeno PHA, mediante
saggio con MTT. Gli estratti di L. officinalis, O. vulgare e R. officinale hanno fortemente ridotto il
rilascio di ROS dei leucociti PMA-stimolati, in modo dose-dipendente. Anche gli estratti di A. vera, C.
longa, E. purpurea e P. ginseng hanno mostrato effetti inibitori, ma meno evidenti e inversamente
proporzionali alla dose. La più alta concentrazione di estratto di ginseng ha invece stimolato il rilascio
di ROS dei leucociti. Le proprietà antiossidanti dimostrate da origano, lavanda e rabarbaro sono
dovute probabilmente al loro contenuto di composti fenolici, che penetrano nelle cellule e
interferiscono con l'attivazione di molecole coinvolte nella trasduzione del segnale o alternativamente
esplicano un’azione di “scavenging” intra-cellulare. Gli estratti di aloe, curcuma, echinacea e ginseng
contengono una varietà di composti chimici bioattivi, che plausibilmente interferiscono in modi
diversi sull'attività di “burst respiratorio”. Gli estratti di C. longa, E. purpurea, P. ginseng, L.
officinalis e R. officinale hanno mostrato, inoltre, un evidente effetto stimolante, dose-dipendente, la
proliferazione dei leucociti. Tale proprietà potrebbe essere attribuita a componenti di tipo
polisaccaridico, la cui presenza è nota in alcune delle specie vegetali utilizzate.
I risultati suggeriscono che queste piante medicinali sono in grado di modulare alcune attività dei
leucociti di trota iridea e rappresentano la base conoscitiva per ulterior
Rilievi istopatologici in corso di infezione spontanea da Enteromyxum leei in sarago pizzuto (Diplodus puntazzo, Cetti 1777).
No full textEnteromyxum leei è un parassita intestinale responsabile di severi episodi di malattia in sarago pizzuto (Diplodus puntazzo). Questo mixosporidio ha determinato una notevole riduzione dell’allevamento di questa specie mediterranea, che rappresentava una valida alternativa zootecnica per la diversificazione della produzione in maricoltura. In quest’ottica, recentemente è stato ultimato un progetto per studiare i fattori limitanti la produzione del sarago pizzuto, con particolare riferimento alle epizoozie causate da questo mixosporidio. Tra
le finalità del progetto era compresa la descrizione dei quadri anatomopatologici enterici, con la descrizione
dettagliata delle diverse enteriti, osservate durante infezioni spontanee da E. leei in sarago pizzuto, verificatesi in
due allevamenti italiani (A e B, rispettivamente sud e nord Italia). A ogni campionamento (7 in totale), 10 soggetti sono stati sacrificati tramite dose letale di anestetico e, durante la necroscopia, sono stati prelevati porzioni di organi viscerali, rene, cuore e branchie. In particolare dal tratto gastroenterico, isolato dal resto degli organi viscerali, sono stati prelevati la porzione pilorica dello stomaco e tratti di intestino corrispondenti al 5, 50 e
95% della lunghezza totale. I campioni sono stati fissati in formaldeide tamponata al 4% o in soluzione di Bouin e
processati secondo le comuni tecniche istologiche. Sezioni seriali in paraffina sono state colorate con
ematossilina-eosina e, alternativamente, caratterizzate istochimicamente. Allo scopo di standardizzare
l’interpretazione dei preparati e confrontare i campioni è stato messo a punto un sistema di valutazione a parametri punteggiati. I quadri infiammatori prevalenti erano enterite proliferativa e enterite diffusa linfocitaria cronica
Expression of infection-related immune response in European sea bass (Dicentrarchus labrax) during a natural outbreak from a unique dinoflagellate Amyloodinium ocellatum
No full textIn the Mediterranean area, amyloodiniosis represents a major hindrance for marine aquaculture, causing high mortalities in lagoon-type based rearing sites during warm seasons. Amyloodinium ocellatum (AO) is the most common and important dinoflagellate parasitizing fish, and is one of the few fish parasites that can infest several fish species living within its ecological range. In the present study, A. ocellatum was recorded and collected from infected European sea bass (Dicentrarchus labrax) during a summer 2017 outbreak in north east Italy. Histological observation of infected ESB gill samples emphasized the presence of round or pear-shaped trophonts anchored to the oro-pharingeal cavity. Molecular analysis for small subunit (SSU) rDNA of A. ocellatum from gill genomic DNA amplified consistently and yielded 248 bp specific amplicon of A. ocellatum, that was also confirmed using sequencing and NCBI Blast analysis. Histological sections of ESB gill samples were addressed to immunohistochemical procedure for the labelling of ESB igm, inos, tlr2, tlr4, pcna and cytokeratin. Infected gills resulted positive for igm, inos, pcna and cytokeratin but negative to tlr-2 and tlr-4. Furthermore, ESB immune related gene response (innate immunity, adaptive immunity, and stress) in the course of A. ocellatum infection using quantitative polymerase chain reaction (qpcr) for infected gills and head kidney was analysed. Among the twenty three immune related gene molecules tested, cc1, il-8, il-10, hep, cox-2, cla, cat, casp9, and igt were significantly expressed in diseased fish. Altogether, these data on parasite identification and expression of host immune-related genes will allow for a better understanding of immune response in European sea bass against A. ocellatum and could promote the development of effective control measures
Intestinal morpho-physiology and innate immune status of European sea bass (Dicentrarchus labrax) in response to diets including a blend of two marine microalgae, Tisochrysis lutea and Tetraselmis suecica
Full text linkThe aim of this study was to investigate the effects of replacing graded levels of dietary fish meal by a blend of two marine microalgae Tisochrysis lutea and Tetraselmis suecica on intestinal morpho-physiology and innate immune response in European sea bass. Two complete diets were formulated to be iso-nitrogenous and isolipidic and prepared by including a blend of the two microalgae, to replace approximately 15 and 45% fish meal protein of the control diet. A fourth diet, where the microalgae mix was substituted by soybean meal, was also prepared. Each diet was offered until visual satiety over 105 days to triplicated groups of European sea bass (204 ± 12.7 g), kept in a recirculating marine water system. The humoral and cellular innate immune parameters of E. sea bass were affected by the dietary treatment. Fish fed the microalgae-containing or the soybean rich diets, showed a significantly greater villi height, while the thickness of intestinal epithelium was significantly reduced in fish fed the soybean meal-rich diet. The activity of the brush border membrane enzymes, maltase, sucrase-isomaltase, γ-glutamil transferase and alkaline phosphatase was not affected by dietary treatment but changed in different intestinal tracts. The genes sucrase-isomaltase, peptide transporter 1, sodium/potassium-transporting ATPase and aminopeptidase N were overexpressed in the pyloric and proximal region of the intestine of fish fed the microalgae-including diets. In conclusion, a blend of dried marine microalgae Tisochrysis lutea and Tetraselmis suecica as alternative ingredients to dietary fish meal did not hamper gut digestive-absorptive functions of E. sea bass. Moreover, it resulted in enhanced non-specific immune response, suggesting an effective role as an immunostimulant ingredien
IMMUNE-GENES EXPRESSION ANALYSIS DURING TIME COURSE AND RECOVERY PROCESS INDICATES THE MECHANISM FOR INNATE IMMUNE RESPONSE AND REPAIR AFTER AMYLOODINIOSISIN EUROPEAN SEA BASS (DICENTRARCHUS LABRAX)
No full textCurrently, there are no effective preventive measures to control Amyloodinium ocellatum(AO) dinospores/trophonts infection in Europeansea bass (ESB). A vaccine against AO is not available because specific immunogenic antigens have not been identified yet. Moreover, there is a lack of information about basic molecular mechanisms of host immune responses following AO infection.In order to investigate the innate immune response and repair mechanism during the recovery from amyloodiniosis, 26 ESB (mean weight 14g) per tank in triplicate were bath challenged for 2h with AO (3.5×106/tank; 70 dinospores/ml) under controlled conditions (26-28°Cand 34‰ salinity). As a control group (non-infected), 26 ESB per tank in triplicate were also used. The time-course of infection was determined by fresh microscopical examination of gills and histopathological evaluations. After 2 hour, fish were already infected, and at 2 days post infection (dpi) the AO trophonts burden was discrete with light clinical symptoms. During the infection, the maximum AO burden was observed at 10-12 dpi, thereafter fish started to recover even if positive to amyloodiniosis. Throughout this period the total mortality was 18 %. In control group, fish were not infected and no mortality was registered. Expression changes of innate immune genes in gills and head kidney at 2, 3, 5, 7 and 23 dpi were analysed using real-time PCR. Theresults indicated that the expression of cytokines (CC1, IL-8) and antimicrobial peptide (Hep) were strongly stimulatedand reached the peak at 5 dpi in the early infection stage, followed by a gradual reduction in the recovery stage (23 dpi), during which the levels were even lower at 23 dpi. Noticeably, the immunoglobulin (IgM) expressions were higher at 23 dpi compared to 7 dpi. These results indicated the strong correlation between igm, hepcidin and chemokine expression level. The hepcidin and chemokine CC1 might play a role in the inflammatory response during early and recovery stages. Altogether, our observations represent the first step towards understanding the molecular mechanism of theamyloodiniosispathogenesisin European sea bass
Going Beyond Counting First Authors in Author Co-citation Analysis
Full text linkThe present study examines one of the fundamental aspects of author co-citation analysis (ACA) - the way co-citation
counts are defined. Co-citation counting provides the data on which all subsequent statistical analyses and mappings
are based, and we compare ACA results based on two different types of co-citation counting - the traditional type that
only counts the first one among a cited work's authors on the one hand and a non-traditional type that takes into
account the first 5 authors of a cited work on the other hand. Results indicate that the picture produced through this non-traditional author co-citation counting contains more coherent author groups and is therefore considerably clearer. However, this picture represents fewer specialties in the research field being studied than that produced through the traditional first-author co-citation counting when the same number of top-ranked authors is selected and analyzed. Reasons for these effects are discussed
IMPACT OF WATER TEMPERATURE ON THE SEA BASS (D. LABRAX) RESPONSIVENESS TO IN FIELD VACCINATION AGAINST VIBRIOSIS/PHOTOBACTERIOSIS
No full textRoutinely sea bass vaccination programs against Vibriosis/Photobacteriosis include the immersion of fish at 1–2 g in aqueous vaccine prior to transportation to floating cages, followed by an intraperitoneal (ip) administration of water-oil based vaccine at 20–25 g, which usually coincides with fish sizing. The most suitable period for the latter treatment would range from spring to summer, considering that the best antibody response both in terms of level and rapidity is detectable in sea bass immunized at 24°C (Cecchini & Saroglia, 2002). Still the time required to vaccinate all the farmed stocks sometimes exceeds the optimal period, and vaccination has to be carried even during winter season. For this reason, the objective of the present investigation was to explore the opportunity to get effective immune responses after a vaccination at sub-optimal temperatures (14°-16°C). The efficacy of the bivalent (Vibrio-Photobacterium) commercial vaccine AlphaJect 2000TM (Pharmaq AS) was assessed in the field (CROMARIS, Mala Lamjana Croatia), by submitting cage reared sea bass (size range 80-145 g) to sedation and ip vaccination (0.1 ml/fish) at different temperature ranges during autumn/winter/summer 2017-2018. Serum sampling was performed in each cage at T0 (intended as pre-vaccination control) and at 500° day post vaccination (this could vary between 32 and 38 days post vaccination, depending on the water T°). Parallel samplings were performed also in cages not submitted to vaccination. In detail, 30 randomly selected individuals/cage/sampling time were submitted to sedation and then sampled in order to obtain the serum. The specific antibodies (IgM) raised against one of the two target antigens (V. anguillarum O1), being part of the formulation, were determined by E.L.I.S.A. accordingly to the protocol of Galeotti et al., (2013). As far as we know there are not information on the vaccination effectiveness in sea bass against bacterial diseases (such as Vibriosis or Photobacteriosis) at different temperatures, and the present investigation represented a preliminary approach to this issue. The specific IgM titration performed on pre-vaccination samples showed their negativity (O.D. values often lower than those recorded in the “blank” wells, or negligible). The i.p. vaccination performed in winter months at temperatures near to 14-16°C triggered a synthesis of specific IgM to V. anguillarum O1 only in a limited number of individuals among those vaccinated, highlighting that there is an evident individual variability in terms of response to vaccination. If we exclude the limited role ascribable to non-appropriate vaccine provision, based on our findings we can assert that there is a relevant difference in the individual “immune efficiency” at low temperatures, possibly limiting the uniformity of fish batches responsiveness after the treatment. On the contrary the ip vaccination performed in summer, at temperatures ranging between 21,4-23,8 (average 22,6) promoted a remarkable synthesis of specific IgM to V. anguillarum O1 in almost all the fish under study, suggesting the requirement of specific (optimal) temperatures enabling fish to benefit from the immunization treatment
Messa a punto di un metodo di quantificazione assoluta dell’mRNA di un panel citochinico e sua applicazione in corso di infezione da Photobacterium damselae subsp. piscicida.
No full textUn metodo di quantificazione assoluta in Real Time PCR per l’analisi dell’espressione genica di 3 citochine del branzino (Dicentrarchus labrax) è stato sviluppato e applicato in corso di infezione sperimentale con Photobacterium damselae subsp. piscicida (Phdp). Al fine di effettuare una quantificazione assoluta è stato utilizzato il metodo della curva standard; questo metodo permette di esprimere i risultati della quantificazione come copie di cDNA per l.
Per ogni citochina del branzino IL-1, IL-6 e IL-8 è stato selezionato un frammento specifico, così come per l’RNA 18S del branzino da utilizzare come housekeeping per la normalizzazione dei risultati. Le curve standard sono state allestite utilizzando del DNA plasmidico ottenuto inserendo il frammento specifico in un vettore plasmidico (pCR 4-TOPO Vector). I plasmidi ottenuti sono stati linearizzati e quantificati al fine di creare standard di riferimento robusti e stabili per studi a lungo termine. La Real Time PCR è stata allestita con la chimica SYBR Green I utilizzando il sistema 7300 Real Time PCR (Applied Biosystem). Dopo ogni reazione è stata analizzata la curva di dissociazione del prodotto per verificarne la specificità. La sensibilità della metodica è stata valutata testando diluizioni seriali del plasmide. Al fine di applicare la metodica allo studio della risposta immunitaria in corso di infezione sperimentale da Phdp branzini di 5 g sono stati acclimatati e quindi campionati ad intervalli di tempo per verificare il livello basale di espressione citochinica dei soggetti in condizioni normo-fisiologiche. Successivamente i soggetti sono stati sottoposti a challenge con il ceppo 213/ITT di Phdp gentilmente fornito dal Dr. Manfrin dell’IZS delle Venezie. L’infezione sperimentale è stata effettuata su soggetti di circa 50 g tramite iniezione intraperitoneale di 100 l di una sospensione contenente 1,9x107ufc/ml. Il rene e la milza di 3 soggetti sono stati prelevati 24 e 72 ore post-infezione e conservati per l’estrazione dell’RNA.
Per ciascuna citochina è stato ottenuto un plasmide con un numero di copie/μl compreso fra 0,3 e 2,4x109. L’analisi della curva di dissociazione ha confermato la specificità di reazione mostrando la presenza di un singolo picco. Il limite di sensibilità per il rilevamento dei geni citochinici è risultato rispettivamente di 2,4 x101, 1,8 x101, 1,6 x101 e 0,3 x101 copie/μl per IL-1, IL-6, IL-8 e 18S. Tutte le corse effettuate hanno dato valori di R2≥0,99 e una efficienza di 1.00  0.20. Le prove di ripetibilità intra-assay hanno dato valori compresi fra ≤0,5 e ≤0,9 Std Dev Ct per tutte le citochine mostrando una elevate riproducibilità della prova. Il metodo messo a punto si è quindi mostrato sensibile, riproducibile ed accurato per la quantificazione dei livelli di mRNA delle 3 citochine analizzate nel branzino. I soggetti in condizioni normo-fisiologiche hanno mostrato valori assoluti medi di 2,4 x102, 7,4 x101 e 1,2 x103 copie/μl nella milza e di 6,4x101, 1,5x101 e 4x102 copie/μl nel rene rispettivamente per IL-1β, IL-6 e IL-8. I valori citochinici sono stati monitorati attraverso 5 campionamenti effettuati durante 39 giorni di osservazione, tali valori non hanno mostrato differenze statisticamente significative durante tale periodo, evidenziando una elevata stabilità dei valori citochinici che indica l’assenza di fattori interferenti nel processo di stabulazione. Nei soggetti sottoposti a challenge è stata invece evidenziata una elevata sovra espressione dei livelli di tutte 3 le citochine con un incremento minimo di 1 logaritmo sia nel rene che nella milza 24h post infezione. I dati a 72h p.i. mostrato un lieve decremento dei valori di tutte e tre le citochine anche se con differente cinetica. Lo studio effettuato ha permesso quindi di monitorare l’andamento di 3 importanti citochine pro-infiammatorie in corso di infezione da Phdp, apportando importanti informazioni pro..
IMMUNOHISTOCHEMICAL DEMONSTRATION OF CD35 AND CD16 RECEPTORS IN DEVELOPMENTAL STAGES OF SEA BASS (D. LABRAX)
No full textThe study of teleosts immune system is useful to better understand its involvement inthe prevention of infectious diseases. Additionally, such studies are important from aphylogenetic point of view, since fish are the first animals that, in the evolutionaryprocess, show aspects of innate and adaptive immune response comparable to thosepresent in higher vertebrates. In mammals, phagocytosis is a prerogative ofmacrophages and neutrophil granulocytes. At the moment, some fish cell populationsinvolved in this activity are still under investigation, due to the evident morphologicalheterogeneity of leucocytes among different species and to the lack of specific surfacemarkers for fish phagocytes. A crucial role in the phagocytosis activation can beattributed to the membrane receptors for complement and immunoglobulin Fc. Inmammals four types of receptors for C3 have been identified, namely CR1, CR2, CR3and CR4. CR1 (CD35) is expressed by neutrophils, eosinophils and some B and Tsub-populations. It promotes the link to and phagocytosis of particles opsonised byC3b and C4b fractions. FcR" (CD16) is expressed by several hemopoietic cells(macrophages and lymphocytes) and its role is fundamental for the cellular immuneresponse mediated by immunoglobulins (removing of immune-complexes oropsonised particles by phagocytosis). Investigations dealing with the identification ofthese receptors in teleosts are recent and concern a limited number of species:rainbow trout, catfish, carp, zebrafish. These studies have mainly focused on aspectsof CR1 and FcR phylogenesis, as well as structural/functional homologies withmammalians. From the literature there is no evidence of investigations dedicated tothe identification of CR1 and FcR in marine teleosts, and also there are no dataregarding the immunohistochemical localization of cells presenting these CDs. Thepresent paper is aimed to the demonstrations of CD16 and CD35 immune-receptors intissues of sea bass (Dicentrarchus labrax) at different developmental stages.Histological sections obtained from tissue specimens collected from sea bassfingerlings were submitted to immunohistochemical analysis by use of the followingantibodies: goat polyclonal to CD35 (CR1); rabbit polyclonal to CD16 (FcR). Thereaction was developed by ABComplex peroxidase and DAB. As a result of theantibodies employed, even if specific for mammalian receptors, allowed the detectionof cell populations in different tissues, and also the chronology of appearance wasdescribed. In synthesis, CD16 was detectable in thymus, gills and skin starting from50dph, and in the digestive system starting from 90 dph. CD35 was detectable inseveral organs (thymus, gills, pancreas, skin, stomach, gut) starting from 47 dph, andlater in spleen and pyloric caeca. Moreover, the morphology of CD16+ and CD35+cells colonizing various tissues was described, allowing the discrimination of at leastthree different cell populations: CD16+ cells, morphologically similar to macrophagesor dendritic cells (APCs), with non granular cytoplasm; CD35+ cells,morphologically similar to macrophages or dendritic cells (APCs), with non granularcytoplasm; CD35+ cells, morphologically similar to eosinophilic granulocytes orEGCs, with granular cytoplasm. These populations were particularly consistent inthymus (among the primary lymphoid organs), skin and digestive tract (mucosaeassociate lymphoid tissue). Based on their morphology and specific localization, ahypothesis concerning their role as phagocytes and antigen presenting cells will bediscussed.[...
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