1,720,959 research outputs found
El polifosfat és un element clau durant la replicació del DNA.
Get PDFThroughout its lifespan, eukaryotic cells steadily consume free cytoplasmic orthophosphate to produce phospholipids and mRNA. However, during DNA synthesis, in a matter of minutes, cells require large amount of phosphate molecules to be incorporated in dNTPs. It is not known whether this high consumption produces a sharp variation in cellular orthophosphate levels, or alternatively, a homeostatic system exists to prevent any variation. Polyphosphate (polyP) is a linear chain made of hundreds of Pi residues present in all living organisms, with a still unclear molecular function. In the present study we show that degradation of polyP is cell cycle regulated and, also, an important process to sustain the synthesis of dNTPs in S. cerevisiae. Mutants that cannot synthesise polyP (vtc4) or cannot hydrolyse it (ppn1 ppx1) present a lower rate of dNTP synthesis and it takes longer time to duplicate DNA. Recovery after UV stress also requires high levels of dNTPs, and here we show that mutants bearing low levels of polyP are more sensitive to UV, while cells overexpressing VTC4 are more resistant. Finally, we demonstrate that human dermal fibroblasts with reduced levels of polyP are also more sensitive to UV damage, suggesting that the protective role of polyP against UV damage might be conserved. In conclusion, this work identifies a new and important player during the synthesis of the building blocks of DNA
Going Beyond Counting First Authors in Author Co-citation Analysis
Get PDFThe present study examines one of the fundamental aspects of author co-citation analysis (ACA) - the way co-citation
counts are defined. Co-citation counting provides the data on which all subsequent statistical analyses and mappings
are based, and we compare ACA results based on two different types of co-citation counting - the traditional type that
only counts the first one among a cited work's authors on the one hand and a non-traditional type that takes into
account the first 5 authors of a cited work on the other hand. Results indicate that the picture produced through this non-traditional author co-citation counting contains more coherent author groups and is therefore considerably clearer. However, this picture represents fewer specialties in the research field being studied than that produced through the traditional first-author co-citation counting when the same number of top-ranked authors is selected and analyzed. Reasons for these effects are discussed
Desarrollo de nuevos métodos para el análisis del polifosfato en células humanas
Get PDFNombre / Nom / Name
Ana
Apellidos / Cognoms / Surname
Sarrias Giménez
Dirección de correo electrónico / Adreça de correu electrònic / email address (opcional / optional)
[email protected]
Departamento / Departament / Department
Ciencias Básicas
Área de conocimiento / Àrea de coneixement / Field of knowledge
Ciencias biomédicas
Director/s de Tesis / Thesis supervisor/s
Samuel Bru Rullo
Dirección de correo electrónico director / Adreça de correu electrònic director / Supervisor/s' email address (opcional / optional)
[email protected]
Fecha de defensa / Data de defensa / Defense date
(dd/mm/yyyy)
19/07/2023
Título / Títol / Title
Desarrollo de nuevos métodos para el análisis del polifosfato en células humanas
Lengua / Llengua / Language
Castellano
Palabras clave / Paraules clau / Key words (máx. 10)
Polifosfato, PolyP, células humanas, NUDT3, purificación bioquímica, inmunofluorescencia, microscopía.
Acepto la publicación del fichero de mi tesis en Internet / Accepto la publicació del fitxer de la meva tesi a Internet / I accept that my thesis file is published on the Internet (indicar sí o no / write yes or no)
En el cas d’indicar NO, l’embargament serà per un màxim de 24 mesos / En caso de indicar NO, el embargo será por un máximo de 24 meses / If you indicate NO, the attachment will be for a maximum of 24 months.
Si
Resumen / Resum / Abstract
Dar el resumen en la lengua del documento. / Escriu el resum en la llengua del document / Write the abstract in the language of the document
Si la lengua del documento no es el catalán, darlo opcionalmente también en esta lengua./ Si la llengua del document no és el català, escriure opcionalment també en català / If the language of the document is not Catalan, optionally write it in Catalan as well).
El polifosfato (polyP) es una molécula lineal compuesta por cientos de residuos de fosfato unidos por enlaces fosfoanhídrido. Se encuentra presente en un amplio rango de organismos, y, en humanos, posee gran variedad de funciones relacionadas con la coagulación sanguínea, la osteogénesis, el Alzheimer o el cáncer. A pesar de su importancia biológica, el estudio del polyP en humanos se enfrenta a varias barreras. En primer lugar, su concentración en mamíferos es considerablemente baja, aproximadamente mil veces inferior que en organismos unicelulares. Además, la falta de información acerca de las enzimas implicadas en la síntesis y degradación de esta molécula en células humanas dificulta su estudio. Por último, se desconoce la cantidad y localización del polyP en células humanas y los pocos estudios que hay a menudo son contradictorios, mostrando diferentes localizaciones del polyP dentro de la célula. Para poder estudiar y analizar el metabolismo del polyP en células humanas es necesario desarrollar nuevas técnicas que permitan su estudio y cuantificación. En esta tesis doctoral se presentan 3 métodos de detección: la visualización por inmunofluorescencia, la visualización in vivo mediante live cell imaging y la purificación bioquímica de la molécula. La detección por inmunofluorescencia se realizó mediante el uso del PPBD y se pudo validar la señal tanto in vitro, mediante la incubación con Ppx1, como in vivo, mediante la sobreexpresión de NUDT3. La visualización in vivo se intentó validar con la misma estrategia, pero no se pudo probar que la señal obtenida fuera específica de polyP. Por último, se procedió a la validación de todos los pasos necesarios para la purificación bioquímica, y se realizó un estudio minucioso de varios factores que podrían influir en la cuantificación del polyP purificado. A través de esta técnica, se lograron obtener niveles de polyP celular más elevados que los descritos hasta ahora en la literatura científica. Siguiendo este protocolo, se logró purificar polyP de varias líneas celulares humanas de diferentes tejidos (pulmón, cerebro, colon y mama) y se llevó a cabo un estudio de las diferentes cantidades de polyP en cada línea celular. Además, se pudo localizar el polyP mediante inmunofluorescencia, encontrando diferencias tanto en la concentración como en localización del polyP entre las diferentes líneas. Se observó que dichas diferencias correlacionan con los patrones de expresión de las polifosfatasas PRUNE1 y NUDT3. Tras esto, y para investigar las variaciones del polyP en diferentes condiciones adversas para la célula, se realizaron estudios en condiciones de privación de nutrientes, utilizando medios de cultivo con diferentes cantidades de glucosa, fosfato, y en hipoxia. Los resultados demostraron que la cantidad de polyP celular disminuye en condiciones de privación de nutrientes. Asimismo, se estudió la dinámica del polyP frente al daño al ADN, realizando estudios de viabilidad tras modificar los niveles de polyP celular y tratar las células con cisplatino. Se observó que cuando la célula tiene sus niveles de polyP reducidos, su supervivencia frente al daño al ADN se ve afectada. Finalmente, se intentó purificar polyP de tejidos de ratón mediante el protocolo previamente descrito en esta tesis, pero sin éxito. En conclusión, esta tesis presenta dos métodos para la detección de polyP en células humanas y aporta nueva información sobre el metabolismo de esta molécula en diferentes líneas celulares y diversas condiciones metabólicas
Desarrollo de nuevos métodos para el análisis del polifosfato en células humanas
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Ana
Apellidos / Cognoms / Surname
Sarrias Giménez
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Ciencias Básicas
Área de conocimiento / Àrea de coneixement / Field of knowledge
Ciencias biomédicas
Director/s de Tesis / Thesis supervisor/s
Samuel Bru Rullo
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Fecha de defensa / Data de defensa / Defense date
(dd/mm/yyyy)
19/07/2023
Título / Títol / Title
Desarrollo de nuevos métodos para el análisis del polifosfato en células humanas
Lengua / Llengua / Language
Castellano
Palabras clave / Paraules clau / Key words (máx. 10)
Polifosfato, PolyP, células humanas, NUDT3, purificación bioquímica, inmunofluorescencia, microscopía.
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El polifosfato (polyP) es una molécula lineal compuesta por cientos de residuos de fosfato unidos por enlaces fosfoanhídrido. Se encuentra presente en un amplio rango de organismos, y, en humanos, posee gran variedad de funciones relacionadas con la coagulación sanguínea, la osteogénesis, el Alzheimer o el cáncer. A pesar de su importancia biológica, el estudio del polyP en humanos se enfrenta a varias barreras. En primer lugar, su concentración en mamíferos es considerablemente baja, aproximadamente mil veces inferior que en organismos unicelulares. Además, la falta de información acerca de las enzimas implicadas en la síntesis y degradación de esta molécula en células humanas dificulta su estudio. Por último, se desconoce la cantidad y localización del polyP en células humanas y los pocos estudios que hay a menudo son contradictorios, mostrando diferentes localizaciones del polyP dentro de la célula. Para poder estudiar y analizar el metabolismo del polyP en células humanas es necesario desarrollar nuevas técnicas que permitan su estudio y cuantificación. En esta tesis doctoral se presentan 3 métodos de detección: la visualización por inmunofluorescencia, la visualización in vivo mediante live cell imaging y la purificación bioquímica de la molécula. La detección por inmunofluorescencia se realizó mediante el uso del PPBD y se pudo validar la señal tanto in vitro, mediante la incubación con Ppx1, como in vivo, mediante la sobreexpresión de NUDT3. La visualización in vivo se intentó validar con la misma estrategia, pero no se pudo probar que la señal obtenida fuera específica de polyP. Por último, se procedió a la validación de todos los pasos necesarios para la purificación bioquímica, y se realizó un estudio minucioso de varios factores que podrían influir en la cuantificación del polyP purificado. A través de esta técnica, se lograron obtener niveles de polyP celular más elevados que los descritos hasta ahora en la literatura científica. Siguiendo este protocolo, se logró purificar polyP de varias líneas celulares humanas de diferentes tejidos (pulmón, cerebro, colon y mama) y se llevó a cabo un estudio de las diferentes cantidades de polyP en cada línea celular. Además, se pudo localizar el polyP mediante inmunofluorescencia, encontrando diferencias tanto en la concentración como en localización del polyP entre las diferentes líneas. Se observó que dichas diferencias correlacionan con los patrones de expresión de las polifosfatasas PRUNE1 y NUDT3. Tras esto, y para investigar las variaciones del polyP en diferentes condiciones adversas para la célula, se realizaron estudios en condiciones de privación de nutrientes, utilizando medios de cultivo con diferentes cantidades de glucosa, fosfato, y en hipoxia. Los resultados demostraron que la cantidad de polyP celular disminuye en condiciones de privación de nutrientes. Asimismo, se estudió la dinámica del polyP frente al daño al ADN, realizando estudios de viabilidad tras modificar los niveles de polyP celular y tratar las células con cisplatino. Se observó que cuando la célula tiene sus niveles de polyP reducidos, su supervivencia frente al daño al ADN se ve afectada. Finalmente, se intentó purificar polyP de tejidos de ratón mediante el protocolo previamente descrito en esta tesis, pero sin éxito. En conclusión, esta tesis presenta dos métodos para la detección de polyP en células humanas y aporta nueva información sobre el metabolismo de esta molécula en diferentes líneas celulares y diversas condiciones metabólicas
Nudt3. La primera endopolifosfatasa humana
Get PDFEl polifosfato inorgánico (polyP) es un polímero compuesto por cientos de residuos de fosfato (Pi) unidos por enlaces fosfoanhidro de alta energía. Esta molécula se encuentra en todos los organismos desde bacteria a mamíferos y se encuentra relacionada con una gran variedad de procesos celulares. Sin embargo, su metabolismo en mamíferos aún no ha sido caracterizado. En esta tesis doctoral, se ha purificado una actividad endopolifosfatasa dependiente de Zn2+presente en extracto de cerebro de rata hasta su máxima homogeneidad mediante un método de purificación bioquímico acoplado a un zimograma, una nueva aproximación que permite detectar la actividad enzimática sobre un sustrato, en este caso, el polyP. Un análisis proteómico reveló a Nudt3, una difosfoinositol polifosfato fosfohidrolasa (DIPP) como enzima responsable de la actividad endopolifosfatasa del extracto. Nudt3, descrita previamente como una fosfohidrolasa de inositoles pirofosfato (Ins-P7 y Ins-P8) y dinucleosidos oligofosfato (Ap5A y Ap6A) in vitro, confiere especificidad de sustrato dependiendo del ion divalente presente en la reacción mostrando actividad endopolifosfatasa exclusivamente en presencia de Zn2+ en condiciones fisiológicas (pH 6.8; 36ᵒC). Además, en esta tesis se demuestra que Nudt3 tiene actividad endopolifosfatasa in vivo dependiendo de la concentración de Zn2+ intracelular, hecho que puede variar en función del estado metabólico de la célula. Finalmente, la célula cuando es sometida a un estrés oxidativo genera un aumento de la concentración de Zn2+ intracelular y promueve una disminución de los niveles de polyP celular. En conclusión, esta tesis identifica la primera enzima que controla la degradación del polyP en humanos
Variations on the Author
Get PDF“Variations on the Author” discusses two of Eduardo Coutinho’s recent films (Um Dia na Vida, from 2010, and Últimas Conversas, posthumously released in 2015) and their contribution to the general question of documentary authorship. The director’s filmography is characterized by a consistent yet self-effacing form of authorial self-inscription: Coutinho often features as an interviewer that rather than express opinions propels discourses; an interviewer that is good at listening. This mode of self-inscription characterizes him as an author who is not expressive but who is nonetheless markedly present on the screen. In Um Dia na Vida, however, Coutinho is completely absent form the image, while Últimas Conversas, on the contrary, includes a confessional prologue that moves the director from the margins to the center of his films. This article examines the ways in which these works stand out in the filmography of a director who offers new insights into the notion of cinematic authorship
El polifosfato como regulador de la estructura y función de los speckles nucleares.
Get PDFEl polifosfat (polyP) és un polianió inorgànic altament conservat, format per cadenes lineals de residus de fosfat, que exerceix múltiples funcions a les cèl·lules de mamífer. Aquesta tesi se centra a explorar el paper del polyP en l’organització nuclear i la regulació de l’splicing alternatiu, amb especial atenció a la seva relació amb els specklesnuclears (SN), orgànuls sense membrana rics en proteïnes de processament d’ARN.
Mitjançant un enfocament multidisciplinari, es demostra que la depleció de polyP provoca una desorganització dels SN i altera l’splicing alternatiu, amb una predominança d’esdeveniments d’exclusió d’exons. Aquests esdeveniments afecten majoritàriament transcrits amb múltiples
isoformes, i s’associen a exons curts, rics en GC, flanquejats per introns igualment curts i amb llocs d’splicing dèbils.
Pel que fa al mecanisme d’acció del polyP, es demostra que aquest es localitza als SN i pot inhibir directament l’activitat de les quinases CLK, en particular CLK3, conegudes per fosforilar seqüències RS de proteïnes centrals dels SN. La inhibició d’aquestes quinases pel polyP evitaria la dispersió d’aquests factors clau fora dels SN, contribuint així al manteniment de la seva organització funcional.
En conjunt, aquests resultats situen el polyP com un regulador clau de l’arquitectura nuclear i del processament del pre-ARNm, i suggereixen que alteracions en els seus nivells o en la dinàmica dels SN podrien tenir implicacions rellevants en diferents contextos fisiològics i en malalties relacionades amb l’splicing.El polifosfato (polyP) es un polianión inorgánico altamente conservado, formado por cadenas lineales de residuos de fosfato, que desempeña múltiples funciones en células de mamífero. Esta tesis se centra en explorar el papel del polyP en la organización nuclear y la regulación del splicing alternativo, con especial atención a su relación con los speckles nucleares (SN), orgánulos sin membrana ricos en proteínas de procesamiento de ARN.
Mediante un enfoque multidisciplinar, se demuestra que la depleción de polyP provoca una desorganización de los SN y altera el splicing alternativo, con una predominancia de eventos de exclusión de exones. Estos eventos afectan mayoritariamente a transcritos con múltiples isoformas, y se asocian a exones cortos, ricos en GC, flanqueados por intrones igualmente cortos y con sitios de empalme débiles.
En cuanto al mecanismo de acción del polyP, se demuestra que este se localiza en los SN y puede inhibir directamente la actividad de quinasas CLK, en particular CLK3, conocidas por fosforilar secuencias RS de proteínas centrales de los SN. La inhibición de estas quinasas por el polyP evitaría la dispersión de estos factores clave fuera de los SN, contribuyendo al mantenimiento de su organización funcional.
En conjunto, estos resultados sitúan al polyP como un regulador clave de la arquitectura nuclear y del procesamiento del pre-ARNm, y sugieren que alteraciones en sus niveles o en la dinámica de los SN podrían tener implicaciones relevantes en distintos contextos fisiológicos y enfermedades relacionadas con el splicing.Ciencias de la Salud (RD 99/2011
Appropriate Similarity Measures for Author Cocitation Analysis
Get PDFWe provide a number of new insights into the methodological discussion about author cocitation analysis. We first argue that the use of the Pearson correlation for measuring the similarity between authors’ cocitation profiles is not very satisfactory. We then discuss what kind of similarity measures may be used as an alternative to the Pearson correlation. We consider three similarity measures in particular. One is the well-known cosine. The other two similarity measures have not been used before in the bibliometric literature. Finally, we show by means of an example that our findings have a high practical relevance.information science;Pearson correlation;cosine;similarity measure;author cocitation analysis
Polifosfato nuclear en células humanas: regulación enzimática, proteoma asociado y funciones emergentes
Get PDFEl polifosfat és una biomolècula, majoritàriament lineal, composta per desenes fins a milers d’unitats de fosfat
inorgànic unides per enllaços fosfoanhidre. A pH fisiològic presenta una elevada càrrega negativa. Està
conservat al llarg de tota l’escala evolutiva i els estudis han revelat que té nombroses funcions fisiològiques,
com la regulació de la transcripció, la reserva d’energia, la resposta a l’estrès oxidatiu... així com patològiques,
com l’ELA o el càncer. Malgrat aquests descobriments, manca molt coneixement sobre les enzims implicades
en el seu metabolisme en humans i sobre les proteïnes amb les quals es troba associat.
En el nostre grup, mitjançant un estudi exhaustiu es va caracteritzar la primera endopolifosfatasa humana,
NUDT3. Ara, en aquesta tesi, un dels objectius és desentranyar les particularitats de PRUNE1, un enzim
homòleg a l’exopolifosfatasa Ppx1. En el present treball, a través de diferents tècniques, s’ha demostrat que
PRUNE1 és una exopolifosfatasa nuclear capaç de degradar el polifosfat de les cèl·lules HEK293T. El seu domini
C-terminal presenta senyals d’interacció i fosforilació que podrien modificar-ne l’activitat, denotant una
regulació complexa que dificulta la determinació dels seus paràmetres cinètics in vitro. S’ha demostrat que la
seva activitat exopolifosfatasa està lligada a la seva capacitat d’augmentar la proliferació cel·lular.
El segon objectiu del present treball, amb la finalitat de dilucidar noves funcionalitats del polifosfat, ha estat
determinar una llista del proteoma associat al polyP. Per a això s’han utilitzat tècniques de proximity labeling
associades a un pèptid que interacciona de forma específica amb el polyP. Aquesta llista està altament
enriquida en factors d’splicing i diferents proteïnes relacionades amb els speckles. El polifosfat té una funció
important en aquestes estructures a través de la seva interacció amb SRRM2 i SON. També s’ha estudiat la
relació directa que té el polifosfat sobre diferents vies de reparació de l’ADN, així com en la replicació d’aquest
mitjançant la seva interacció amb el complex helicasa.
En conjunt, aquest treball posa sobre la taula funcionalitats del polifosfat, fins ara poc analitzades, que obren
nous fronts relacionats amb aquesta antiga i desconeguda biomolècula.El polifosfato es una biomolécula, mayoritariamente lineal, compuesta por decenas hasta miles de unidades
de fosfato inorgánico unidos por enlaces fosfoanhidro. A pH fisiológico presenta una elevada carga negativa.
Está conservado a lo largo de toda la escala evolutiva y los estudios han revelado que tiene numerosas
funciones fisiológicas, como la regulación de la transcripción, la reserva de energía, la respuesta a estrés
oxidativo... así como patológicas, como la ELA o el cáncer. A pesar de estos estos descubrimientos, falta mucho
conocimiento sobre las enzimas implicadas en su metabolismo en humanos y de las proteínas con las que se
encuentra asociado. En nuestro grupo, a través de estudio exhaustivo se caracterizó la primera
endopolifosfatasa humana, NUDT3. Ahora, en esta tesis, se tiene como uno de los objetivos desentrañar las
particularidades de PRUNE1, enzima homóloga a la exopolifosfatasa Ppx1. En el presente trabajo, a través de
diferentes técnicas se ha demostrado que PRUNE1 es una exopolifosfatasa nuclear capaz de degradar el
polifosfato de las células HEK293T. Su dominio Cterminal tiene señales de interacción y fosforilación que
podrían modificar su actividad, denotando una regulación compleja que hace difícil determinar sus
parámetros cinéticos in vitro. Se ha demostrado que su actividad exopolifosfatasa está ligada a su capacidad
de aumentar la proliferación de las células. El segundo objetivo del presente trabajo, con el fin de dilucidar
nuevas funcionalidades del polifosfato ha sido determinar una lista del proteoma asociado al polyP. Para ello
se han usado técnicas de proximity labeling asociadas a un péptido que interacciona de forma específica con
el polyP. Esta lista está altamente enriquecida en factores de splicing y diferentes proteínas relacionadas con
los speckles. El polifosfato tiene una función importante en estas estructuras a través de su interacción con
SRRM2 y SON. También se ha estudiado la relación directa que tiene el polifosfato sobre diferentes vías de
reparación del ADN, así como en la replicación de este a través de su interacción con el complejo helicasa. En
conjunto, este trabajo pone sobre la mesa funcionalidades del polifosfato, hasta ahora pobremente
analizadas, que abren nuevos frentes relacionados con esta antigua y desconocida biomolécula.Ciencias de la Salud (RD 99/2011
- …
