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Charakterisierung der physiologischen Rolle der neuronalen Regulatoren SOX21 und alpha-Synuclein in der melanozytären Entwicklung
Full text linkMelanozyten sind die pigmentgebenden Zellen der Haut. Sie sitzen in der Basalzellschicht und synthetisieren Melanin innerhalb vesikulärer Strukturen, den sogenannten Melanosomen, die an die umliegenden Keratinozyten abgegeben werden können. Dadurch wird die Haut natürlich vor UV-Strahlung und der Ausbildung eines Melanoms geschützt. Von embryologischer Seite betrachtet, entwickeln sich Melanozyten ähnlich wie neuronale Zellen aus der Neuralleiste. Für die spezifische Entwicklung wandern sie auf definierten Wegen aus der Neuralleiste aus. Neben der Migration über den dorsolateralen Weg, der zur Bildung von unpigmentierten Vorläufer-zellen, den Melanoblasten, führt, können sich Melanozyten, wie auch die peripheren Glia-Vorläuferzellen, über den ventralen Migrationsweg aus Schwannzell-Vorläuferzellen entwickeln. Damit sind neuronale Zellen und Melanozyten in ihrer Abstammungslinie bereits in der frühen Entwicklung miteinander verbunden. Bei der Auswertung von Genexpressions-analysen mit Fokus auf Differenzierungsfaktoren, kristallisierten sich SOX21 und alpha-Synuclein, überschneidend in neuronalen und epidermalen Zellen, als differentiell regulierte Gene heraus, weshalb ihre Rolle im epidermalen System weiterführend charakterisiert wurde.
Zu Beginn der Dissertation wurde SOX21 zunächst als Modellgen verwendet, um einen methodischen Vergleich verschiedener Transkriptom-Analysen (cDNA Microarray, RNA Sequenzierung und quantitativer Echtzeit-PCR) durchzuführen. In der dazugehörigen Publikation wurden eigene und von anderen Arbeitsgruppen publizierte Datensätze zu cDNA Microarrays und RNA-Seq Analysen verwendet und die Genexpression von SOX21 und der zugehörigen Familie der SOX-Transkriptionsfaktoren miteinander verglichen. Die Ergebnisse wurden zusätzlich mit den Expressionsdaten aus der quantitativen Echtzeit-PCR von Melanom-Zelllinien abgeglichen. Dabei konnte deutlich gemacht werden, dass es trotz der vielen Vorteile, die neuartige Methoden wie die RNA-Seq bieten, wichtig ist, die experimentellen Settings genau zu kennen. Diese können gerade für die Detektion von gering exprimierten Genen, wie hier anhand von SOX21 veranschaulicht wurde, von besonderer Bedeutung sein. Als wichtige Einflussfaktoren wurden hier neben der Sequenzierungstiefe auch die Zugänglichkeit der RNA basierend auf der Faltung und der damit in Verbindung stehenden freien Energie der Sekundärstruktur identifiziert.
Weiterführend wurde die Bedeutung von SOX21 auf molekularer Ebene untersucht. Während für den Transkriptionsfaktor bereits eine wichtige Rolle in der neuronalen Differenzierung und als Tumorsuppressor im Glioblastom beschrieben wurde, konnte in dieser Forschungsarbeit erstmalig die Rolle von SOX21 im melanozytären System charakterisiert werden. SOX21 folgt hier ebenfalls dem zellulären Differenzierungsstatus und wird durch den zentralen Transkriptionsfaktor MITF, der die Differenzierung von Melanozyten reguliert, beeinflusst. Zudem konnte anhand von viralen Transduktionen von SOX21 eine duale Rolle in Melanozyten und Melanomzellen aufgezeigt werden. Während die Induktion von SOX21 in seneszenten Melanozyten zur Aufhebung der Onkogen-induzierten Seneszenz führt und somit eine pro-tumorigene Eigenschaft besitzt, konnte in Melanomzellen eine negative Regulation der Zellproliferation und damit eine anti-tumorigene Wirkung nachgewiesen werden. Somit ähnelt die Funktion von SOX21 im Melanom der Funktion, die im Glioblastom beschrieben wurde. Zudem konnte gezeigt werden, dass die SOX21 Expression in Melanomzellen durch die epigenetischen Modifikationen der Methylierung und Acetylierung unterdrückt wird, was die vorherigen Daten der anti-tumorigenen Wirkung und tumor-supprimierende Rolle von SOX21 unterstützt. Insgesamt konnte in dieser Arbeit für SOX21 eine wichtige Rolle im Verlauf der melanozytären Differenzierung nachgewiesen und eine duale Funktion von SOX21 im epidermalen System identifiziert werden.
Neben SOX21 wurde auch alpha-Synuclein als differenziell reguliertes Gen in der neuronalen Differenzierung beschrieben und folglich in dieser Arbeit im melanozytären System charakterisiert. Hier konnte eine Kongruenz der alpha-Synuclein Expression mit der zellulären Differenzierung, der MITF Expression und der BRAFV600E-induzierten Seneszenz nachgewiesen werden. Des Weiteren konnte mittels Immunfluoreszenzfärbungen in der vorliegenden Dissertation gezeigt werden, dass der Knockdown von alpha-Synuclein zu einer maßgeblichen Veränderung der Morphologie der Melanozyten führt und zudem den Transport von reifen Melanosomen in die dendritischen Ausläufer der Primärzellen reguliert. Anhand weiterführender Analysen der Lichtstreuungsmessung, durchflusszytometrischer Analysen und Co-Kulturen aus Melanozyten und Keratinozyten konnte deutlich gemacht werden, dass neben dem Transport auch der Transfer von Melanosomen zu umliegenden Keratinozyten durch den alpha-Synuclein Knockdown herunterreguliert wird. Zusammenfassend konnte mit der dazugehörigen Publikation erstmals die Rolle von alpha-Synuclein beim Transport und Transfer von Melanosomen beschrieben werden, womit offensichtlich ist, dass alpha-Synuclein eine essentielle Funktion im natürlichen Schutz gegen die UV-Strahlung und bei der Melanom-Entstehung einnimmt.
In einer abschließenden komparativen Analyse von SOX21 und alpha-Synuclein konnte weiterführend gezeigt werden, dass beide Moleküle nicht nur in vielen melanozytären Prozessen ähnlich reguliert sind, sondern auch eine Regulation von alpha-Synuclein durch SOX21 vorliegt. Zusammenfassend konnten in dieser Dissertation durch die molekulare Charakterisierung von SOX21 und alpha-Synuclein zwei bislang unbeachtete Moleküle im epidermalen System identifiziert werden, die in melanozytären Prozessen wie beispielsweise der Differenzierung und Seneszenz und auch bei der Entstehung des malignen Melanoms eine zentrale Rolle einnehmen
Identification of novel sense and antisense transcription at the TRPM2 locus in cancer
No full textIt has been proposed that in cancer, where the bulk of the genome becomes hypomethylated, there is an increase in transcriptional noise that might lead to the generation of antisense transcripts that could affect the function of key oncosuppressor genes, ultimately leading to malignant transformation. Here, we describe the computational identification of a melanoma-enriched antisense transcript, TRPM2-AS, mapped within the locus of TRPM2, an ion channel capable of mediating susceptibility to cell death. Analysis of the TRPM2-AS genomic region indicated the presence in the same region of another tumor-enriched TRPM2 transcript, TRPM2-TE, located across a CpG island shared with TRPM2-AS. Quantitative PCR experiments confirmed that TRPM2-AS and TRPM2-TE transcripts were up-regulated in melanoma, and their activation was consistent with the methylation status of the shared CpG island. Functional knock-out of TRPM2-TE, as well as over-expression of wild-type TRPM2, increased melanoma susceptibility to apoptosis and necrosis. Finally, expression analysis in other cancer types indicated that TRPM2-AS and TRPM2-TE over-expression might have an even wider role than anticipated, reinforcing the relevance of our computational approach in identifying new potential therapeutic targets
Spezifische Zielgene des Transkriptionsfaktors c-Jun im malignen Melanom
Full text linkBackground and aims:
The incidence of malignant melanoma showed an increase in the past decades. Due to its high risk of metastasis the therapy of advanced melanoma is still challenging. The deregulation of different signalling pathways and transcription factors is crucial for the malignant degeneration of melanocytes. The AP-1 transcription factor family plays a significant role in the pathogenesis of melanoma. Specifically, the AP-1 transcriptions factor c-Jun was of particular interest. Through regulation of specific target genes, c-Jun may influence many biological processes, e.g. proliferation and growth. The aim of this study was to identify specific target genes of c-Jun in melanoma and to analyse its influence on the expression of these target genes.
Methods:
In-silico-analyses were performed to identify possible target genes of the transcription factor c-Jun, using ENCODE (Encyclopedia of DNA Elements), STRING (Search Tool for the Retrieval of Interacting Genes/Proteins), DAVID (Database for Annotation, Visualization and Integrated Discovery) and MEME (Multiple Em for Motif Elicitation).
After establishing the nuclear extraction and DNA fragmentation of the human melanoma cell line Mel Juso, chromatin-immunoprecipitation (ChIP) with a c-Jun antibody (sc-1694) was performed. The precipitated DNA was further amplified via specific primer-pairs and PCR. The successful amplification was validated via agarose gel electrophoresis. By qRT-PCR using the LightCycler® 480 systems (Roche Diagnostics, Mannheim) mRNA-expression analyses of the c-Jun target genes were performed. To this, cDNA samples of different melanoma cells (Mel Juso, A375, Mel Ei, Mel Ju) and normal human melanocytes (NHEMs) were used. Additional mRNA-expression analyses were performed using cDNA samples of a c-Jun knockdown construct (Mel Juso + si c-Jun) and a c-Jun overexpression construct (Hmb2-5 + HAJunMut1).
Results and observations:
By In-silico-analyses 44 potential target genes of the transcription factor c-Jun were identified, screened for known and possible associations among each other and categorized in seven groups of different biological processes. Six out of 44 target genes, which are known to be cancer-relevant, were selected for further analyses: WEE1, PVR, LGALS3, MAP1LC3B, NFATc2 and FosB. A classical AP-1 binding sequence (5‘-TGA (C/G) TCA-3‘) was identified in the via ENCODE enriched promoter/enhancer region for WEE1, PVR, LGALS3 and FosB. The promoter/enhancer region for MAP1LC3B and NFATc2 contained an AP-1 binding sequence with one base pair changed (MAP1LC3B: 5‘-TGA T TCA-3‘; NFATc2: 5‘-TGA C ACA-3‘). A direct binding of c-Jun to the promoter/enhancer region of the six target genes was confirmed by PCR.
A differential expression of the six target genes in various melanoma cell lines and normal human melanocytes was detected performing mRNA-expression analyses. Here, WEE1, PVR, NFATc2 and FosB showed an upregulation whereas MAP1LC3B and LGALS3 showed a downregulation in all analysed melanoma cell lines. Finally, the regulation of the 6 target genes through the transcription factor c-Jun was investigated. An upregulation of MAP1LC3B and LGALS3 was shown after c-Jun knockdown, indicating a negative regulation through c-Jun. In contrast, an overexpression of c-Jun led to an upregulation of WEE1, PVR, NFATc2 and FosB, which might point to a positive regulation through c-Jun.
Conclusion:
Identifying specific target genes of the transcription factor c-Jun in melanoma helps to understand the regulatory impact on various biological processes. Many of the known c-Jun target genes show oncogene characteristics. Therefore, a targeted inhibition of c-Jun and subsequently its regulatory impact on specific target genes could present a new approach in the therapy of malignant melanoma.Hintergrund und Ziele:
Das Melanom zeigte in den letzten Jahrzehnten eine steigende Inzidenzrate. Durch sein hohes Metastasierungspotenzial gestaltet sich die Therapie des fortgeschrittenen Melanoms weiterhin als schwierig. Die Fehlregulation unterschiedlicher Signalwege und Transkriptionsfaktoren ist an der malignen Entartung von Melanozyten wesentlich beteiligt. Unter den Transkriptionsfaktoren spielt die AP-1-Transkriptionsfaktorfamilie eine wichtige Rolle bei der Pathogenese des Melanoms. Von besonderem Interesse dieser Arbeit war dabei der Transkriptionsfaktor c-Jun. Durch die Regulation spezifischer Zielgene kann c-Jun unterschiedliche biologische Prozesse, wie z. B. Proliferation und Wachstum beeinflussen. Ziel dieser Arbeit war es, spezifische c-Jun-Zielgene im Melanom zu identifizieren und dessen Einfluss auf das Expressionsmuster dieser Zielgene zu analysieren.
Methoden:
Zur Identifikation möglicher Zielgene des Transkriptionsfaktors c-Jun wurden In-silico-Analysen mittels ENCODE (Encyclopedia of DNA Elements), STRING (Search Tool for the Retrieval of Interacting Genes/Proteins), DAVID (Database for Annotation, Visualization and Integrated Discovery) und MEME (Multiple Em for Motif Elicitation) durchgeführt.
Nach Etablierung der Kernextraktion und DNA-Fragmentierung der humanen Melanom-Zelllinie Mel Juso folgte die Chromatin-Immunopräzipitation (ChIP) mit einem c-Jun-Antikörper (sc-1694). Die präzipitierte DNA wurde anschließend mit spezifischen Primer-Pärchen durch eine PCR amplifiziert und die DNA-Amplifikation mittels Agarose-Gelelektrophorese bestätigt. Zur mRNA-Expressionsanalyse der c-Jun-Zielgene wurde eine qRT-PCR mithilfe des LightCycler® 480Systems (Roche Diagnostics, Mannheim) durchgeführt. Hierzu wurden cDNA-Proben unterschiedlicher Melanom-Zelllinien (Mel Juso, A375, Mel Ei, Mel Ju) und normaler humaner Melanozyten (NHEMs) verwendet. Weitere mRNA-Expressionsanalysen wurden mit cDNA-Proben eines c-Jun-Knockdown-Konstruktes (Mel Juso + si c-Jun) und eines Konstruktes mit c-Jun-Überexpression (Hmb2-5 + HAJunMut1) durchgeführt.
Ergebnisse und Beobachtungen:
Mittels In-silico-Analysen konnten 44 potenzielle Zielgene des Transkriptionsfaktors c-Jun identifiziert, auf bekannte und mögliche Assoziationen zueinander untersucht und in sieben Gruppen unterschiedlicher biologischer Prozesse kategorisiert werden. Für die folgenden Analysen wurde eine Auswahl von sechs Zielgenen getroffen, die unter anderem bereits als tumorrelevante Gene beschrieben wurden: WEE1, PVR, LGALS3, MAP1LC3B, NFATc2 und FosB. In den mittels ENCODE angereichterten Promotor- bzw. Enhancer-Regionen der jeweiligen Zielgene konnte für WEE1, PVR, LGALS3 und FosB eine klassische AP-1-Bindungssequenz (5‘-TGA (C/G) TCA-3‘) detektiert werden. Für MAP1LC3B und NFATc2 wurde eine mögliche AP-1-Bindungssequenz mit jeweils einem unterschiedlichen Basenpaar identifiziert (MAP1LC3B: 5‘-TGA T TCA-3‘; NFATc2: 5‘-TGA C ACA-3‘). Mittels PCR wurde anschließend eine direkte Bindung von c-Jun an die Promotor- bzw. Enhancer-Region der sechs Zielgene bestätigt. Mithilfe von Expressionsanalysen in verschiedenen humanen Melanom-Zelllinien und normalen humanen Melanozyten konnte eine unterschiedliche Expression der sechs Zielgene nachgewiesen werden. Dabei lagen WEE1, PVR, NFATc2 und FosB in den untersuchten humanen Melanom-Zelllinien erhöht exprimiert vor, wohingegen MAP1LC3B und LGALS3 eine verminderte Expression aufwiesen. Abschließend wurde die direkte Regulation der sechs Zielgene durch den Transkriptionsfaktor c-Jun untersucht. Der Knockdown von c-Jun führte zu einer vermehrten Expression von MAP1LC3B und LGALS3 und deutet auf eine negative Regulation durch c-Jun hin. Demgegenüber führte eine Überexpression von c-Jun zu einer vermehrten Expression von WEE1, PVR, NFATc2 und FosB, was auf eine positive Regulation hinweist.
Schlussfolgerung:
Die Identifikation spezifischer Zielgene des Transkriptionsfaktors c-Jun im Melanom lässt Rückschlüsse auf dessen regulatorische Einflüsse auf unterschiedliche biologische Prozesse ziehen. Die durch c-Jun regulierten Zielgene zeigen unter anderem onkogene Eigenschaften auf. Eine gezielte Inhibition von c-Jun und somit auch dessen regulatorischer Einflüsse auf spezifische Zielgene könnte einen neuen Ansatz in der Therapie des Melanoms darstellen
Proteomische Identifizierung und Charakterisierung Tumor-spezifischer Biomarker
Full text linkIn der vorliegenden kumulativen Habilitationsschrift wurde durch den Einsatz einer technischen Triade, die Gewebemikrodissektion, SELDI-Massenspektrometrie und Immunhistochemie beinhaltet, die Identifizierung potentielle Tumormarker-Kandidaten aus verschiedenen Tumorentitäten beschrieben. Das Auftreten dieser Biomarker wurde anschließend in Seren evaluiert. Zusätzlich wurden Interaktionspartner dieser Biomarker unter in vivo Bedingungen ermittelt und die biologische Bedeutung dieser Proteinkomplexe aufgeklärt
Funktionelle Untersuchungen zur Beteiligung von S100A11 an der DNA-Schadensreparatur und Zellzyklusregulation
No full textS100A11, ein Mitglied der S100-Proteinfamilie, ist an der räumlichen und zeitlichen Verteilung von Ca2+ sowie an der Weiterleitung des intrazellulären Ca2+-Signals beteiligt. Zahlreiche Studien weisen auf eine wichtige Rolle im Prozess des Zellwachstums, der Differenzierung und Zellbeweglichkeit sowie der Zellzykluskontrolle hin. Die genaue biologische Funktion von S100A11 ist aber nach wie vor unklar. In eigener Vorarbeit konnte eine physikalische Interaktion zwischen S100A11 und RAD54B identifiziert werden. RAD54B ist eine DNA-abhängige ATPase, die eine spezifische Funktion bei der RAD51-vermittelten Stranginvasion innerhalb der homologen Rekombinationreparatur (HRR) besitzt. Das Ziel dieser Arbeit war es, diese Interaktion im Detail funktionell zu analysieren und eine mögliche Beteiligung von S100A11 bei der Reparatur von DNA-Schäden zu klären. In der vorliegenden Arbeit konnte gezeigt werden, dass die Proteine S100A11 und RAD54B spezifisch miteinander interagieren. Die Induktion von DNA-Schäden mit Hilfe von Bleomycin stimuliert die Komplexbildung zwischen S100A11 und RAD54B. Während eine Beteiligung von S100A11 und RAD54B bei der nichthomologen Verknüpfung von DNA-Enden (NHEJ) oder der Reparatur von kollabierten Replikationsgabeln ausgeschlossen werden konnte, ist eine Beteiligung von S100A11 an der HRR von DNA-Doppelstrangbrüchen sehr wahrscheinlich. S100A11 ist neben der Schadensantwort an der p21-vermittelten Zellzyklusregulation beteiligt. Die Induktion von DNA-Schäden führt zur Akkumulation von S100A11 im Zellkern und damit verbunden zu einer Aktivierung von p21WAF1/CIP1. Die Depletion von S100A11 führte zu einer signifikanten Reduktion von p21WAF1/CIP1 und damit möglicherweise zu einem Versagen in der Aktivierung der Zellzyklus-Kontrollpunkte in einer p53 unabhängigen Art und Weise. S100A11-depletierte Zellen sind sensitiv gegenüber Bleomycin und zeichnen sich durch eine eingeschränkte Proliferationskapazität aus. Zusammenfassend konnte in dieser Arbeit eine neue Funktion für S100A11 im Prozess der homologen Rekombinationsreparatur von DNA-Doppelstrangbrüchen beschrieben werden. Zusätzlich ist S100A11 an der p21-vermittelten Zellzyklusregulation beteiligt und könnte somit an der zellulären Stress-Antwort involviert sein
Melanoma inhibitory activity (MIA): an important molecule in melanoma development and progression
No full textCutaneous malignant melanoma is the leading cause of skin cancer death in industrialized countries. Melanoma development and progression are well defined by clinical and histopathological aspects; however, detailed analysis of molecular changes is still ongoing. The protein MIA, which is strongly expressed in melanoma cells but not in melanocytes, is likely to represent a key molecule regulating melanoma progression. Consistent with this, several in vitro and in vivo model systems indicate a direct involvement of MIA in melanoma migration and invasion, with recent studies suggesting a central role for MIA in early melanoma development by regulating important melanoma-related pathways and molecules. The latest developments in MIA research are summarized in this review, which describes recently published data related to the MIA protein structure and function, the role of MIA in melanoma development and progression, and the regulation of MIA expression. Furthermore, newly discovered MIA-homologous genes are discussed
Integrins as targets in therapy
No full textCell adhesion and migration are essential for embryonic development, tissue regeneration and homeostasis. Deregulation results in several kinds of diseases, for example, in tumour development. The physical link between the extracellular matrix (ECM) and the actin cytoskeleton is mainly mediated by receptors of the integrin family. This family of proteins plays key roles in cellular processes through signals transduced upon integrin ligation to ECM proteins. During disease development, changes in integrin expression, intracellular control of integrin functions and signals perceived from integrin ligand-binding impact upon the ability of cells to interact with their environment. Antagonists of several integrins are now under evaluation in clinical trials to determine their potential as therapeutics for several kinds of diseases including cancer. Newly characterised and patented inhibitors of integrins are summarised in this review
Influence of melanoma inhibitory activity on transforming growth factor-beta signaling in malignant melanoma
No full textMelanoma cells escape transforming growth factor-P (TGF beta)-mediated growth inhibition by expressing the Smad (mothers against decapentaplegic homolog, Drosophila) inhibitors Ski and Sno. Here, we demonstrate that melanoma inhibitory activity (MIA) influences the expression of these inhibitors. A Smad responsive reporter construct was activated after TGF beta 1 treatment in the MIA-deficient cell clones but not in the parental cell line. According to this finding, the TGF beta target genes JunB and Id-1 showed a strong induction of expression. Additional analyses revealed that Ski and Sno, repressors of TGF beta/ SMAD signaling, are not expressed in the MIA-deficient cells but in the parental cell line HMB2 and the mock control. Further investigation showed that Ski and Sno expression might be regulated via the mitogen-activated protein kinase (MAPK)/extracellular signal-regulated kinase (ERK) signaling cascade. Treatment of HMB2 cells with a MEK inhibitor revealed a reduction of Ski and Sno expression, which leads to the conclusion that, in our melanoma cell model, Ski and Sno expression is regulated via MAPK/ERK signaling
Functional implication of truncated P-cadherin expression in malignant melanoma
No full textCadherins comprise Ca2+-dependent homophilic cell-cell adhesion molecules which are responsible for correct location of cells and for tissue integrity. They are crucial factors for the development and maintenance of epithelial architecture. Aberrantly expressed cadherins are known to be involved in malignant transformation of different types of tissues. In a previous study, we determined the expression of a short truncated 50 kDa form of P-cadherin only consisting of the N-terminal part in malignant melanoma. Further analysis revealed that this short 50 kDa form of P-cadherin representing the N-terminal, extracellular region, is secreted by melanoma cells in contrast to the membrane bound form in melanocytes. In order to define the functional relevance of expression of the 50 kDa P-cadherin variant in malignant melanoma, antisense P-cadherin cell clones were generated. The clones in which P-cadherin expression is reduced show no changes in proliferation or in attachment-independent growth when compared to controls. However, a strong reduction of migratory and invasive properties was observed in these cells, suggesting that truncated P-cadherin promotes melanoma cell invasion and migration and therefore has an important role in the progression of malignant melanoma. Functionally, the secreted form of P-cadherin could play a role as regulator of the homophilic interaction between P-cadherin molecules by antagonizing their biological role acting as a dominant negative form to interrupt cell-cell attachment. (c) 2006 Elsevier Inc. All rights reserved
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