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Study of ORAI protein remodeling with CRISPR and quantitative microscopy
No full textL’entrée capacitive de calcium (Ca2+), appelée SOCE en anglais (store operated Ca2+ entry) représente une entrée d’ions Ca2+ dans la cellule consécutive à la vidange des stocks calcique réticulaires. Ce processus constitue l’un des mécanismes d’entré majeure de Ca2+ dans les cellules non-excitables. L’importance physiologique de ce processus est soulignée par la gravité des syndromes induits par des mutations des canaux responsables du SOCE : le syndrome sévère d’immunodéficience combinée induit par des mutations de types perte de fonction du SOCE et les syndromes d’agrégation tubulaire myopathique (TAM) et de Stormorken induit pas des mutations de type gain de fonction du SOCE. Le SOCE résulte de l’interaction de deux familles de protéines appelées STIM (Stromal interaction protein, 1,2) localisées dans la membrane du réticulum endoplasmique (RE) et ORAI (1-3) situées dans la membrane plasmique. Le processus classique d’apparition du SOCE dans les cellules peut être décrit de la sorte : La protéine STIM1, qui possède des motifs EF-hand sensible au Ca2+ dans la lumière du RE, détecte une diminution de la concentration en Ca2+. En réponse, la protéine STIM subit un changement conformationnel qui conduit à son oligomérisation et sa translocation au niveau des jonctions membrane plasmique – RE. Les protéines STIM vont ensuite interagir, regrouper et activer les protéines ORAI1 qui forment le canal appelé Ca2+-release activated Ca2+ (CRAC) aboutissant à la production du SOCE. Cependant, de nombreuses publications ont démontré l’implication des autres isoformes des protéines STIM et ORAI dans ce processus. De manière intéressante, l’intervention des protéines STIM2 et ORAI2/3 dans le mécanisme du SOCE permet de moduler le signal produit et ainsi de réguler finement les effets physiologiques de l’entrée de Ca2+ dans les cellules. En particulier, notre laboratoire a démontré que les canaux hétéromériques formés par les protéines ORAI1 et ORAI3 définissent un "interrupteur" oncogénique dans les cellules cancéreuses prostatiques permettant l’apparition d’un phénotype plus agressif. L’étude des mécanismes amenant à la formation de ces canaux hétéromériques est complexe en raison des limites des techniques à disposition. Par exemple, la plupart des moyens d’études reposent sur des systèmes de surexpression ou de sous expression, qui ne permettent pas de supprimer totalement l’expression des protéines endogènes. La présence de ces protéines endogènes rend difficile l’interprétation des résultats obtenus. Le but de cette thèse était donc d’utiliser des techniques de pointe pour étudier les mécanismes d’association des protéines ORAI. Ainsi, nous avons utilisé la technique CRISPR/Cas9 afin de générer des cellules doubles knockout (KO) pour les protéines ORAI1 et ORAI3. Ces cellules, KO pour ORAI1 et ORAI3 ont été utilisées pour réaliser des expériences de microscopie quantitative. Nous avons notamment ré-exprimé des versions fluorescentes des protéines ORAI1 et ORAI3 dans ces cellules avant de réaliser des expériences de mesure de temps de vie de fluorescence via la technique de FLIM-FRET (fluorescence lifetime imaging microscopy - Förster resonance energy transfer). Cette technique nous a permis de suivre l’évolution des interactions entre les protéines ORAI1 et ORAI3 lors de différentes stimulations cellulaires. De la sorte nous avons pu montrer que l’interaction entre les protéines ORAI1 et ORAI3 est dynamique en fonction de la stimulation appliquée. De plus, nous avons tiré profit des cellules KO générées afin d’étudier le rôle des protéines ORAI1/3 et du SOCE dans les lignées HEK-293 et PC3. Nous avons ainsi démontré que, dans les cellules HEK, la protéine ORAI1 et le SOCE jouent un rôle limité dans le maintien de leur physiologie, alors que dans les cellules PC3, ORAI1 et ORAI3 sont importantes pour le maintien du phénotype migratoire de ces cellules.The store operated calcium (Ca2+) entry (SOCE) represents the entry of Ca2+ through the cell’s plasma membrane consecutive to an endoplasmic reticulum (ER) Ca2+ store depletion. This process is described as one of the main calcium (Ca2+) pathway in the cells. Its importance is highlighted by the severe syndromes induced by loss or gain of function mutation of its constituent named severe combined immunodeficiency (SCID) and tubular aggregate myopathy (TAM)/Stormorken syndrome (STRMK) respectively. SOCE is the result of interaction between two families of proteins, the ER residing protein family Stromal interaction molecule (STIM 1&2) and the plasmalemmal proteins called ORAI (1-3). The classic molecular choreography of SOCE activation is described as follow: a drop in ER-Ca2+ content is detected by the EF-hand domain present in the STIM protein. Following ER Ca2+ depletion, STIM protein oligomerize and translocate to ER- plasma membrane (PM) junctions where they bind and activate ORAI1 composed channel called Ca2+ release activated Ca2+ channel providing SOCE. Interestingly, it appears that this choreography is much more complex than initially thought with the involvement of other STIM and ORAI isoforms (STIM2 and ORAI2,3). The involvement of these isoforms affects the properties of SOCE by modulating its Ca2+ signature resulting in different cellular answers. Especially, it was shown that heteromeric channels composed of ORAI1 and ORAI3 protein are defining an oncogenic switch in prostate cancer cell lines that lead to the more aggressive phenotype. However, the study of the mechanisms leading to the creation of ORAI1/3 channels at the expanse of ORAI1-only channels is problematic due to technical limitations. For example, most of investigations are performed in overexpression or downregulation system where endogenous protein are still present and might blur the results of experiments. The goal of this PhD was to use high end techniques in order to study the mechanisms of ORAI1/3 interactions without facing the limitations mentioned above. Specifically, we implemented and used CRISPR/Cas9 technique to generate double knockout (KO) cell lines for ORAI1 and 3 proteins. We used these “ORAI1/3 free cells” to perform quantitative microscopy experiments. Specifically, we expressed fluorescently tagged ORAI1 and ORAI3 proteins and performed FLIM-FRET (fluorescence lifetime imaging microscopy - Förster resonance energy transfer) experiments enabling us to follow their association process in answer to different stimulations. We thus demonstrated that the association between ORAI1 and ORAI3 is a dynamic process in the cells. Additionally, we took advantage of these KO cell lines to study the role of ORAI1/3 protein and SOCE in HEK-293 and PC3 cells physiology. We thus demonstrated that ORAI1 protein and SOCE only presented a limited role in the maintenance of HEK-293 physiology, while ORAI1 and ORAI3 are important to maintain migrative properties of the cancerous PC3 cells
Going Beyond Counting First Authors in Author Co-citation Analysis
Full text linkThe present study examines one of the fundamental aspects of author co-citation analysis (ACA) - the way co-citation
counts are defined. Co-citation counting provides the data on which all subsequent statistical analyses and mappings
are based, and we compare ACA results based on two different types of co-citation counting - the traditional type that
only counts the first one among a cited work's authors on the one hand and a non-traditional type that takes into
account the first 5 authors of a cited work on the other hand. Results indicate that the picture produced through this non-traditional author co-citation counting contains more coherent author groups and is therefore considerably clearer. However, this picture represents fewer specialties in the research field being studied than that produced through the traditional first-author co-citation counting when the same number of top-ranked authors is selected and analyzed. Reasons for these effects are discussed
Variations on the Author
Full text link“Variations on the Author” discusses two of Eduardo Coutinho’s recent films (Um Dia na Vida, from 2010, and Últimas Conversas, posthumously released in 2015) and their contribution to the general question of documentary authorship. The director’s filmography is characterized by a consistent yet self-effacing form of authorial self-inscription: Coutinho often features as an interviewer that rather than express opinions propels discourses; an interviewer that is good at listening. This mode of self-inscription characterizes him as an author who is not expressive but who is nonetheless markedly present on the screen. In Um Dia na Vida, however, Coutinho is completely absent form the image, while Últimas Conversas, on the contrary, includes a confessional prologue that moves the director from the margins to the center of his films. This article examines the ways in which these works stand out in the filmography of a director who offers new insights into the notion of cinematic authorship
Etude du remodelage des protéines ORAI grâce à l'utilisation de la technique CRISPR/Cas9 et de la microscopie quantitative
No full textThe store operated calcium (Ca2+) entry (SOCE) represents the entry of Ca2+ through the cell’s plasma membrane consecutive to an endoplasmic reticulum (ER) Ca2+ store depletion. This process is described as one of the main calcium (Ca2+) pathway in the cells. Its importance is highlighted by the severe syndromes induced by loss or gain of function mutation of its constituent named severe combined immunodeficiency (SCID) and tubular aggregate myopathy (TAM)/Stormorken syndrome (STRMK) respectively. SOCE is the result of interaction between two families of proteins, the ER residing protein family Stromal interaction molecule (STIM 1&2) and the plasmalemmal proteins called ORAI (1-3). The classic molecular choreography of SOCE activation is described as follow: a drop in ER-Ca2+ content is detected by the EF-hand domain present in the STIM protein. Following ER Ca2+ depletion, STIM protein oligomerize and translocate to ER- plasma membrane (PM) junctions where they bind and activate ORAI1 composed channel called Ca2+ release activated Ca2+ channel providing SOCE. Interestingly, it appears that this choreography is much more complex than initially thought with the involvement of other STIM and ORAI isoforms (STIM2 and ORAI2,3). The involvement of these isoforms affects the properties of SOCE by modulating its Ca2+ signature resulting in different cellular answers. Especially, it was shown that heteromeric channels composed of ORAI1 and ORAI3 protein are defining an oncogenic switch in prostate cancer cell lines that lead to the more aggressive phenotype. However, the study of the mechanisms leading to the creation of ORAI1/3 channels at the expanse of ORAI1-only channels is problematic due to technical limitations. For example, most of investigations are performed in overexpression or downregulation system where endogenous protein are still present and might blur the results of experiments. The goal of this PhD was to use high end techniques in order to study the mechanisms of ORAI1/3 interactions without facing the limitations mentioned above. Specifically, we implemented and used CRISPR/Cas9 technique to generate double knockout (KO) cell lines for ORAI1 and 3 proteins. We used these “ORAI1/3 free cells” to perform quantitative microscopy experiments. Specifically, we expressed fluorescently tagged ORAI1 and ORAI3 proteins and performed FLIM-FRET (fluorescence lifetime imaging microscopy - Förster resonance energy transfer) experiments enabling us to follow their association process in answer to different stimulations. We thus demonstrated that the association between ORAI1 and ORAI3 is a dynamic process in the cells. Additionally, we took advantage of these KO cell lines to study the role of ORAI1/3 protein and SOCE in HEK-293 and PC3 cells physiology. We thus demonstrated that ORAI1 protein and SOCE only presented a limited role in the maintenance of HEK-293 physiology, while ORAI1 and ORAI3 are important to maintain migrative properties of the cancerous PC3 cells.L’entrée capacitive de calcium (Ca2+), appelée SOCE en anglais (store operated Ca2+ entry) représente une entrée d’ions Ca2+ dans la cellule consécutive à la vidange des stocks calcique réticulaires. Ce processus constitue l’un des mécanismes d’entré majeure de Ca2+ dans les cellules non-excitables. L’importance physiologique de ce processus est soulignée par la gravité des syndromes induits par des mutations des canaux responsables du SOCE : le syndrome sévère d’immunodéficience combinée induit par des mutations de types perte de fonction du SOCE et les syndromes d’agrégation tubulaire myopathique (TAM) et de Stormorken induit pas des mutations de type gain de fonction du SOCE. Le SOCE résulte de l’interaction de deux familles de protéines appelées STIM (Stromal interaction protein, 1,2) localisées dans la membrane du réticulum endoplasmique (RE) et ORAI (1-3) situées dans la membrane plasmique. Le processus classique d’apparition du SOCE dans les cellules peut être décrit de la sorte : La protéine STIM1, qui possède des motifs EF-hand sensible au Ca2+ dans la lumière du RE, détecte une diminution de la concentration en Ca2+. En réponse, la protéine STIM subit un changement conformationnel qui conduit à son oligomérisation et sa translocation au niveau des jonctions membrane plasmique – RE. Les protéines STIM vont ensuite interagir, regrouper et activer les protéines ORAI1 qui forment le canal appelé Ca2+-release activated Ca2+ (CRAC) aboutissant à la production du SOCE. Cependant, de nombreuses publications ont démontré l’implication des autres isoformes des protéines STIM et ORAI dans ce processus. De manière intéressante, l’intervention des protéines STIM2 et ORAI2/3 dans le mécanisme du SOCE permet de moduler le signal produit et ainsi de réguler finement les effets physiologiques de l’entrée de Ca2+ dans les cellules. En particulier, notre laboratoire a démontré que les canaux hétéromériques formés par les protéines ORAI1 et ORAI3 définissent un "interrupteur" oncogénique dans les cellules cancéreuses prostatiques permettant l’apparition d’un phénotype plus agressif. L’étude des mécanismes amenant à la formation de ces canaux hétéromériques est complexe en raison des limites des techniques à disposition. Par exemple, la plupart des moyens d’études reposent sur des systèmes de surexpression ou de sous expression, qui ne permettent pas de supprimer totalement l’expression des protéines endogènes. La présence de ces protéines endogènes rend difficile l’interprétation des résultats obtenus. Le but de cette thèse était donc d’utiliser des techniques de pointe pour étudier les mécanismes d’association des protéines ORAI. Ainsi, nous avons utilisé la technique CRISPR/Cas9 afin de générer des cellules doubles knockout (KO) pour les protéines ORAI1 et ORAI3. Ces cellules, KO pour ORAI1 et ORAI3 ont été utilisées pour réaliser des expériences de microscopie quantitative. Nous avons notamment ré-exprimé des versions fluorescentes des protéines ORAI1 et ORAI3 dans ces cellules avant de réaliser des expériences de mesure de temps de vie de fluorescence via la technique de FLIM-FRET (fluorescence lifetime imaging microscopy - Förster resonance energy transfer). Cette technique nous a permis de suivre l’évolution des interactions entre les protéines ORAI1 et ORAI3 lors de différentes stimulations cellulaires. De la sorte nous avons pu montrer que l’interaction entre les protéines ORAI1 et ORAI3 est dynamique en fonction de la stimulation appliquée. De plus, nous avons tiré profit des cellules KO générées afin d’étudier le rôle des protéines ORAI1/3 et du SOCE dans les lignées HEK-293 et PC3. Nous avons ainsi démontré que, dans les cellules HEK, la protéine ORAI1 et le SOCE jouent un rôle limité dans le maintien de leur physiologie, alors que dans les cellules PC3, ORAI1 et ORAI3 sont importantes pour le maintien du phénotype migratoire de ces cellules
Appropriate Similarity Measures for Author Cocitation Analysis
Full text linkWe provide a number of new insights into the methodological discussion about author cocitation analysis. We first argue that the use of the Pearson correlation for measuring the similarity between authors’ cocitation profiles is not very satisfactory. We then discuss what kind of similarity measures may be used as an alternative to the Pearson correlation. We consider three similarity measures in particular. One is the well-known cosine. The other two similarity measures have not been used before in the bibliometric literature. Finally, we show by means of an example that our findings have a high practical relevance.information science;Pearson correlation;cosine;similarity measure;author cocitation analysis
Dispelling the Myths Behind First-author Citation Counts
Full text linkWe conducted a full-scale evaluative citation analysis study of scholars in the XML research field to explore just how different from each other author rankings resulting from different citation counting methods actually are, and to demonstrate the capability of emerging data and tools on the Web in supporting more realistic citation counting methods. Our results contest some common arguments for the continued
use of first-author citation counts in the evaluation of scholars, such as high correlations between author rankings by first-author citation counts and other citation
counting methods, and high costs of using more realistic citation counting methods that are not well-supported by the ISI databases. It is argued that increasingly available digital full text research papers make it possible for citation analysis studies to go beyond what the ISI databases have directly supported and to employ more
sophisticated methods
koamabayili/VECTRON-author-checklist: VECTRON author checklist
No full textWe have done our best to complete the author checklist relating to the use of animals in the hut study. Note that the objective for the hut study was to evaluate the IRS treatment applications for residual efficacy against Anopheles mosquitoes, including the local An. coluzzii mosquito population. Cows were only used to attract mosquitoes into the huts and no tests were carried out directly on the cows. The author checklist is intended for use with studies where experiments are carried out on animals, which is why we have had such difficulty in completing this for the hut study, as many of the questions do not relate to how the cows were used
Author-wise bibliometric analysis based on entropy.
No full textAuthor-wise bibliometric analysis based on entropy.</p
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