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The nongenomic effect of mineralocorticoid aldosterone of the transport systems on the erythrocyte membrane
No full textAldosteron spielt eine wichtige Rolle in der Elektrolyt- und Fluidhomeostase und reguliert darüber den Blutdruck. Die nicht-genomischen Wirkungen von Aldosteron sind unabhängig von Transkription und Translation. Die nicht-genomischen Effekte werden durch einen Rezeptor vermittelt, der insensitiv für die Inhibitoren der klassischen Mineralokortikoid-Rezeptoren ist.
In der vorliegenden Arbeit wurde der nicht-genomische Effekt von Aldosteron auf die drei Transportsysteme: Na+/K+-Pumpe, Na+,K+,2Cl--Symporter und K+(Na+)/H+-Austauscher mit Hilfe der Tracerkinetik untersucht. Die Untersuchungen zeigen, dass Aldosteron keinen signifikanten Effekt auf diese Transportsysteme an normalen Erythrozyten hat. An Retikulozyten wurde jedoch eine signifikante Inhibierung des Na+,K+,2Cl--Symporters durch Aldosteron gefunden.
Die Untersuchungen wurden auch mit Hilfe der Fluoreszenzanalyse an einzelnen Erythrozyten und in Zellsuspension von Human- und Hühnererythrozyten, sowie an Erythrozyten aus Nabelschnurblut durchgeführt. Der Einfluss von Aldosteron auf den Ca2+-Gehalt wurde mit dem Ca2+-sensitiven Farbstoff Fluo-4 untersucht. Einige Effekte von Aldosteron (in unterschiedlicher Konzentration) auf den Ca2+-Transport von Human- und Hühnererytrozyten konnten nachgewiesen werden. Zusätzlich wurde der Einfluss von Aldosteron auf den Na+/H+-Austauscher und den intrazellulären pH-Wert mit Hilfe des pH-sensitiven Fluoreszenzfarbstoffes BCECF untersucht. Die Anwesenheit von Aldosteron resultierte in einem erhöhten intrazellulären pH-Wert. Die Untersuchung des Na+/Li+-Austauschers in Anwesenheit von Aldosteron mit Hilfe der Atomabsorptionsspektrometrie zeigten keinen Einfluss von Aldosteron auf diesen Transporter. Einige Studien zum Ca2+-Gehalt von Erythrozyten, die in Kontakt mit verschiedenen artifiziellen Oberflächen sind, wurden in die Untersuchungen einbezogen. Auf Oberflächen, die mit Polymeren oder mit perfluorierten Gruppen beschichtet sind, kommt es zu Fluktuationen des Ca2+-Gehalts im Untersuchungszeitraum (30 min).Aldosterone plays an essential role in electrolyte and fluid homeostasis and thus control of blood pressure. The nongenomic actions are rapid actions of aldosterone that are independent of transcription and translation. The nongenomic actions are mediated by a distinct receptor that is insensitive to inhibitors of the classical mineralocorticoid receptor. Investigations of a direct influence of aldosterone on erythrocyte transport systems Na+/K+ pump, Na+,K+,2Cl- symporter, and K+(Na+)/H+ exchanger have been carried out with tracer kinetic measurements. The investigations have shown that aldosterone does not have a significant effect on the mentioned transport systems in normal erythrocyte. However, in reticulocytes a significant inhibition of the Na+,K+,2Cl- symporter by aldosterone has been found.
The investigations also include fluorescence measurements on single erythrocytes as well as in cell suspensions of human and chicken erythrocytes as well as of cord blood. The influence of aldosterone on the Ca2+ content has been investigated with fluo-4, a Ca2+-sensitive dye. Some effects of Aldosterone (at different concentrations) on Ca2+ transport have been found in human and chicken erythrocytes. In addition, the influence of aldosterone on the Na+/H+ exchanger and on the intracellular pH has been investigated using the pH-sensitive fluorescent dye BCECF. The presence of aldosterone resulted in a small increase of the intracellular pH. The investigation of the Na+/Li+ exchanger in the presence of aldosterone using the method of atom absorption spectroscopy did not show any effect of aldosterone on this transporter. Some studies of the Ca2+ content in red blood cells, which are in contact with different artificial surfaces, are included in the present investigations. On surfaces covered with polymers or with perflouriertel organic groups, the Ca2+ content fluctuates within the time period of the investigation (30 min)
Intracellular Ca2+ content and phosphatidylserine exposure in human red blood cells
Full text linkCa2+ uptake as well as PS exposure in RBCs has been activated with different substances: lysophosphatidic acid (LPA), phorbol-12 myristate-13 acetate (PMA, activator of the PKC), and A23187 (Ca2+ ionophore, used as positive control). Measurement techniques included flow cytometry and live cell imaging (fluorescence or confocal microscopy).
PS exposure is not solely based on the increased intracellular Ca2+ content. Ca2+ activates the scramblase. In addition, we were able to show that the PKC as well as Ca2+-activated K+ channel play substantial role in the process of PS exposure.
Ca2+ uptake and PS exposure do not depend on the cell age. Quantitative discrepancies with respect to results obtained by different investigators and also with respect to the LPA batches used have been observed. In addition, we realized differences comparing the results of single and double labelling experiments (for Ca2+ and PS). The results are also affected by the fluorescent dye used.
The reason for existing RBCs showing PS exposure but without increased Ca2+ content is do to cell membrane damage and loss of Ca2+ and/or Ca2+ with fluorescent dye shortly before eryptosis. RBCs with increased Ca2+ content but without PS exposure is probably depending on the cell shape (echinocytes show significantly less PS exposure than discocytes or stomatocytes). This result suggests that the shape of the RBCs plays a substantial role for the PS exposure.Die Ca2+-Aufnahme und die PS-Exposition in humanen roten Blutzellen (RBCs) wurde durch verschiedene Substanzen aktiviert: Lysophosphatidsäure (LPA), Phorbol-12 myristat-13 acetat (PMA, Aktivator der PKC) und A23187 (Ca2+-Ionophor, Positivkontrolle). Die Messmethoden beinhalteten Durchflusszytometrie und Fluoreszenz- bzw. Konfokal-Mikroskopie.
Die PS-Exposition basiert nicht nur auf einer erhöhten intrazellulären Ca2+-Konzentration. Ca2+ aktiviert die Scramblase. Zusätzlich konnten wir zeigen, dass sowohl die PKC als auch der Ca2+-aktivierte K+ Kanal eine substanzielle Rolle im Prozess der PS-Exposition spielen. Die Ca2+-Aufnahme und die PS-Exposition hängen nicht vom Zellalter ab.
Quantitative Unterschiede von Messdaten, die von unterschiedlichen Experimentatoren und mit unterschiedlichen LPA-Chargen erzielt wurden, konnten erklärt werden. Zusätzlich konnten Unterschiede der Ergebnisse, die auf der Basis von Einzelfärbungs- und Doppelfärbungs-Experimenten (für Ca2+ und PS) erzielt wurden, aufgeklärt werden. Die Resultate werden auch durch die verwendeten Fluoreszenzfarbstoffe beeinflusst. Der Grund dafür, dass es einige RBCs gibt, die eine PS-Exposition aber keinen erhöhten Ca2+-Gehalt aufweisen, basiert wahrscheinlich auf einer beginnenden Schädigung der Membran unmittelbar vor der Eryptose, was zu einem Verlust an Ca2+ und/oder Ca2+ mit Fluoreszenzfarbstoff führt. Die Existenz von RBCs mit erhöhtem Ca2+-Gehalt, aber ohne PS-Exposition, basiert wahrscheinlich auf der Zellform (Echinozyten haben eine geringere PS-Exposition als Discozyten oder Stomatozyten). Dieses Ergebnis deutet darauf hin, dass die Form der RBCs eine substanzielle Rolle für die PS-Exposition spielt
Phosphatidylserine exposure in the cell membrane of human erythrocytes : influencing factors and regulatory mechanisms
No full textDie vorliegende Arbeit untermauert die Hypothese, dass es in Erythrozyten zwei unterschiedliche Wege zur PS-Exposition geben muss. Durch Vergleich verschiedener Methoden (Anregung zur PS-Exposition und Erhöhung des intrazellulären Ca2+-Gehaltes durch A23187, LPA und PMA sowie Inhibierung von Scramblase, PKC und Gardos-Kanal) war es möglich, Unterschiede im Reaktionsverhalten der Zellen zu analysieren. Es wurde deutlich, dass sich das Reaktionsverhalten der Zellen klar unterscheidet, wenn verschiedene Mechanismen aktiviert werden. Hierbei steht der durch A23187 und LPA aktivierte Signalweg dem durch PMA aktivierten Signalweg gegenüber.
Weiter wurden Parameter, die in der Literatur als mögliche Trigger für die PSExposition diskutiert werden, analysiert. Der Efflux von K+-Ionen konnte, zumindest im durch A23187 und LPA induzierten Signalweg, als für die PS-Exposition mitverantwortlicher Faktor identifiziert werden. Im PMA-induzierten Signalweg hingegen spielt er keine Rolle. Eine Änderung des Zellvolumens sowie eine Alkalisierung des intrazellulären pH-Wertes konnten als Trigger für die PS-Exposition ausgeschlossen werden.
Es wurde der Nachweis erbracht, dass die Auftrennung der Erythrozyten in unterschiedliche Altersklassen mittels Percoll-Separation verlässliche Ergebnisse liefert. Dass die Unterschiede im Reaktionsverhalten der Erythrozyten einer Population im unterschiedlichen Zellalter begründet sein könnte, kann jedoch ausgeschlossen werden und muss andere Ursachen haben.It is known that erythrocytes have 2 different pathways leading to PS exposure. The presented work strongly supports this hypothesis. To analyse differences in their reactions behavior cells were treated under different experimental conditions (PS exposure and influx of extracellular Ca2+ were stimulated using A23187, LPA and PMA. Furthermore, Scramblase, PKC and Gardos channel were inhibited). The results show that activation of the different pathways leads to diverse cellular responses: the signal pathway activated by A23187 and LPA is different from the pathway activated by PMA. In literature, different parameters are taken into consideration for PS exposure (K+ efflux, changes in cell volume and alkalization of intracellular pH). These parameters were analysed in the presented work, too. The results show that an efflux of K+ is involved in the mechanism of PS exposure in the case of the A23187- and LPAactivated pathway. However, K+ efflux does not play a role in the PMA-activated pathway. Changes in cell volume and alkalization of intracellular pH can be excluded as possible causes for PS exposure.
Separation of erythrocytes into fractions of different cell age was performed. It was proven that the method gives reliable results. The presented data clearly show that the cell age is not responsible for these differences. In addition, erythrocytes from one donor react different after stimulation for PS exposure
Die Wirkung von Transmembranpotential auf die Diffusion von Na⁺/H⁺-Austauscher der menschlichen roten Blutzelle
No full textThe RBC membrane differs from a simple bilayer membrane by its mechanical properties, shear viscoelasticity and by the long range mobility of integral membrane proteins. The influence of transmembrane potential of human RBCs on the lateral diffusion of Na⁺/H⁺ exchanger and membrane lipid analogue Bodipy-HPC has been studied using fluorescence correlation spectroscopy (FCS). Variable changes in the diffusion constants of Na+/H+ exchanger at different transmembrane potentials and corresponding cytoskeleton interactions have been explained. The role of volume changes of RBCs on the diffusion constant of Na⁺/H⁺ has been studied. The obtained data suggest that the transmembrane potential has no significant influence on the lateral diffusion of lipid analogue Bodipy-HPC. Additionally, the mechanism behind the Ca²⁺ loss of a single Caco-2 cell in physiological conditions has been studied in detail. The mechanism behind such loss and the suitable inhibitor to block this loss has been studied. Different inhibitors for Ca²⁺ channels and pumps have been used to understand the responsible mechanism has been found out. It has been demonstrated, that the detached single Caco-2 cell, from the epithelium, loses Ca²⁺ through L-type channels. Moreover, the influence of nano-structured surfaces and nano-particles on the physiological processes like Ca²⁺ transport and intracellular pH of RBCs and Caco-2 cells has been studied. Changes in the intracellular pH and Ca²⁺ transport on living cells have impact on the cell metabolism and physiology. It has been shown that most of the surfaces with various patterns and textures on the glass surface do not influence the Ca²⁺ transport and intracellular pH. Polymer surfaces with different precursor material other than glass (borosilicate) have shown to exert significant influence on both Ca²⁺ transport and pH of RBCs and Caco-2 cells.Die Membran der roten Blutzelle (RBC) unterscheidet sich von einer einfachen Bilayer-Membran durch ihre mechanischen Eigenschaften, viskoelastische Scherkräfte und durch die große Beweglichkeit von integralen Membranproteinen. Der Einfluss des Membranpotentials von menschlichen RBCs auf die laterale Diffusion des Na⁺/H⁺-Austauschers und des Membranlipid-Analogons bodipy-HPC wurde mittels Fluoreszenz-Korrelations-Spektroskopie (FCS) untersucht. Die Variation der Diffusionskonstante des Na⁺/H⁺-Austauschers bei verschiedenen Transmembranpotentialen und den korrespondierenden Cytoskelett-Interaktionen wurde erklärt. Die Rolle von Volumenänderungen bei RBCs auf die Diffusionskonstante von Na⁺/H⁺ wurde studiert. Die gewonnenen Daten deuten darauf hin, dass das Transmembranpotential keinen signifikanten Einfluss auf die laterale Diffusion des Lipid-Analogons bodipy-HPC hat. Zusätzlich wurde im Detail der Mechanismus hinter dem Ca²⁺-Verlust einer Caco-2-Zelle in physiologischen Bedingungen und einem geeigneten Inhibitor, um diesen Verlust zu blocken, untersucht. Verschiedene Inhibitoren für Ca²⁺-Kanäle und Pumpen wurden benutzt, um den verantwortlichen Mechanismus zu verstehen. Es wurde gezeigt, dass eine einzelne, aus Epithel isolierte, Caco-2-Zelle durch L-Typ-Kanäle Ca²⁺ verliert.Darüber hinaus wurde der Einfluss von nanostrukturierten Oberflächen und Nanopartikeln auf physiologische Prozesse wie den Ca²⁺-Transport und den intrazellulären pH von RBCs und Caco-2-Zellen betrachtet. Veränderungen im intrazellulären pH und dem Ca²⁺-Transport in lebenden Zellen haben einen Einfluss auf den Stoffwechsel und die Physiologie von Zellen. Es wurde gezeigt, dass die meisten nanostrukturierten Oberflächen mit verschiedenen Mustern und Texturen in der Glasoberflösche keinen Einfluss auf den Ca²⁺-Transport und den intrazellulären pH haben. Polymeroberflächen mit verschiedenen Rohstoffen als Glas (Borosilikat) zeigen einen signifikanten Einfluss sowohl auf den Ca²⁺-Transport als auch auf den pH von RBCs und Caco-2-Zellen
Influence of nanoparticles on physiological parameters of cells
No full textNanomaterialien haben das Potential, in vielfältigen biomedizinischen Applikationen eingesetzt zu werden. Die vorliegenden Ergebnisse zeigen jedoch deutlich auf, dass verschiedene Nanopartikel und Materialien neben ihrem gewünschten Effekt auch unspezifische Effekte an Erythrozyten und anderen Zelltypen auslösen können. Bei der Analyse der verschiedenen Nanopartikel wurden bei SiO2- und Au-Nanopartikeln keine Effekte gefunden, jedoch beeinflussen nackte Fe3O4-Nanopartikel den pH-Wert von Erythrozyten. Die Fe3O4-Nanopartikel, welche im Rahmen des EU-Projektes NanoMagDye hergestellt wurden und in der medizinischen Applikation eingesetzt werden sollen, zeigten keine Toxizität und Beeinflussung der untersuchten Zelltypen. Somit sollten diese Nanopartikel in der humanen Anwendung unbedenklich sein, da sie keine toxischen Nebeneffekte auslösen. Im Gegensatz dazu wurde bei fluoroalkylierten Phosphaten, welche zur Synthese von Mikrobläschen verwendet werden, ein deutlicher Anstieg der Hämolyse gefunden. Da die Mikrobläschen selbst aus Stabilitätsgründen nicht untersucht werden konnten, muss gewährleistet werden, dass diese bis zur fertigen Anwendung eine ausreichende Beständigkeit besitzen. Nanopartikel sind innovative Werkzeuge zur biomedizinischen Verwendung, jedoch muss bei potentiellen Anwendungen eine genauere Betrachtung von Nebeneffekten und toxischen Auswirkungen durchgeführt werden.Nanomaterials have a high potential of usage in many different biomedical applications. The presented results show clearly that different nanoparticles and materials show unspecific effects on erythrocytes and other cell types. The analysis of different nanoparticles presents no effects for SiO2 and Au nanoparticles. In contrast naked Fe3O4 nanoparticles affect the intracellular pH for erythrocytes. The nanoparticles produced in the EC project NanoMagDye which are planned to be used in the medical application show now toxicity and influence on the investigated cell types. Therefore these nanoparticles should be harmless in the human application. On the other side we found a significant increase in the rate of haemolysis after the incubation with fluoroalkylated phosphates (used for synthesis of microbubbles). For stability reasons, we could not analyse the microbubbles themselves. Therefore it must be ensured that the microbubbles have a adequate stability before used in the application. Nanoparticles are innovative tools for biomedical applications, but we have to ensure for potential applications, which toxic side effects can occur
Phosphatidylserin-Exposition in roten Blutzellen : ein Vorschlag für die aktive Beteiligung roter Blutzellen an der Thrombusentstehung
No full textIn the presented work the question about the role of Ca2+ in PS exposure process in RBCs has been clarified. Treatment of RBCs with LPA, A23187 and PMA in the presence of extracellular Ca2+ leads to an increase of the intracellular Ca2+ level, PS on the outer leaflet of the membrane, membrane blebbing, and microvesicle formation. These effects are influenced by the function of the phospholipid scramblase, flippase, protein kinase C and Gardos channel. It is also demonstrated that the exposure of PS does not only depend on the increase of the intracellular Ca2+ content but also on the function of protein kinase C. A model has been developed to contribute to our understanding of the mechanisms of this process.
The RBCs showing PS exposure can adhere together. This may explain why RBCs adhere together during blood clot formation. It seems likely that the interaction of PS with its receptors and PS-PS in the presence of Ca2+ play a substantial role. A model to explain the process of cell-cell adhesion is presented.
The hypothesis of the blood clot formation cascade developed by Kaestner and Bernhardt is also supported by experiments. The PS exposure on the outer leaflet of RBCs is an important factor for propagation the signal in clot formation process. A model in which the RBCs play an active role in blood clot formation is developed.
The question about the Ca2+ content in RBCs is also answered. There is no significant difference of the free Ca2+ content in young and old RBCs.In der vorliegenden Arbeit wurde die Rolle, die Ca2+ bei der PS-Exposition spielt, geklärt. Die Behandlung roter Blutzellen mit LPA, A23187 und PMA in Gegenwart von extrazellulärem Ca2+ führt zu einem Anstieg des intrazellulären Ca2+, PS-Exposition, "Membrane Blebbing" und der Bildung von Mikrovesikeln. Diese Effekte werden beeinflusst durch die Funktion der Phospholipid Scramblase, der Flippase, der Proteinkinase C und des Gardos Kanal. Auch wurde gezeigt, dass die PS-Exposition nicht nur vom Anstieg des intrazellulären Ca2+ abhängig ist sondern auch von der Funktion der Proteinkinase C.
Rote Blutzellen mit PS-Exposition können aneinander haften. Dies kann eine Erklärung dafür sein, weshalb rote Blutzellen bei der Bildung eines Gerinnsels adhärieren. Die Interaktion von PS mit seinen Rezeptoren und eine PS-PS-Interaktion in Gegenwart von Ca2+ übernehmen hierbei wahrscheinlich eine wichtige Rolle.
Die vorgeschlagene Kaskade von Kaestner und Bernhardt, die eine aktive Beteiligung roter Blutzellen an der Thrombusentstehung beschreibt, wird durch Experimente gestützt. Die Exposition von PS an die Außenseite der Membran ist hierbei ein wichtiger Faktor, welcher der Signalweiterleitung während der Thrombusentstehung dient.
Die Frage bezüglich des intrazellulären Ca2+-Gehalts in roten Blutzellen wurde beantwortet. Es gibt keinen signifikanten Unterschied im Gehalt an freiem intrazellulärem Ca2+ zwischen jungen und alten roten Blutzellen
Going Beyond Counting First Authors in Author Co-citation Analysis
Full text linkThe present study examines one of the fundamental aspects of author co-citation analysis (ACA) - the way co-citation
counts are defined. Co-citation counting provides the data on which all subsequent statistical analyses and mappings
are based, and we compare ACA results based on two different types of co-citation counting - the traditional type that
only counts the first one among a cited work's authors on the one hand and a non-traditional type that takes into
account the first 5 authors of a cited work on the other hand. Results indicate that the picture produced through this non-traditional author co-citation counting contains more coherent author groups and is therefore considerably clearer. However, this picture represents fewer specialties in the research field being studied than that produced through the traditional first-author co-citation counting when the same number of top-ranked authors is selected and analyzed. Reasons for these effects are discussed
Variations on the Author
Full text link“Variations on the Author” discusses two of Eduardo Coutinho’s recent films (Um Dia na Vida, from 2010, and Últimas Conversas, posthumously released in 2015) and their contribution to the general question of documentary authorship. The director’s filmography is characterized by a consistent yet self-effacing form of authorial self-inscription: Coutinho often features as an interviewer that rather than express opinions propels discourses; an interviewer that is good at listening. This mode of self-inscription characterizes him as an author who is not expressive but who is nonetheless markedly present on the screen. In Um Dia na Vida, however, Coutinho is completely absent form the image, while Últimas Conversas, on the contrary, includes a confessional prologue that moves the director from the margins to the center of his films. This article examines the ways in which these works stand out in the filmography of a director who offers new insights into the notion of cinematic authorship
Appropriate Similarity Measures for Author Cocitation Analysis
Full text linkWe provide a number of new insights into the methodological discussion about author cocitation analysis. We first argue that the use of the Pearson correlation for measuring the similarity between authors’ cocitation profiles is not very satisfactory. We then discuss what kind of similarity measures may be used as an alternative to the Pearson correlation. We consider three similarity measures in particular. One is the well-known cosine. The other two similarity measures have not been used before in the bibliometric literature. Finally, we show by means of an example that our findings have a high practical relevance.information science;Pearson correlation;cosine;similarity measure;author cocitation analysis
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