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Funktionelle Analyse der Rolle des Enzyms Succinyl Coenzym A-Ligase im photosynthetischen Metabolismus der Tomate
No full textTitle page,Acknowledgements, Abstract, Zusammenfassung, Table of Contents,
List of Figures, List of Tables, List of Abbreviations
1\. General introduction 1
2\. Materials and Methods 24
2.1. Chemicals 25
2.2. Bacterial and yeast strains 25
2.3. Expression vectors 25
2.4. Transformation and cultivation of bacteria 26
2.5. Complementation, transformation and cultivation of yeast 26
2.6. Yeast mitochondria isolation 27
2.7. DNA manipulation 27
2.8. Plant material 27
2.9. Screening of putative full-length cDNA from the tomato EST collection
28
2.10. Subcloning of selected cDNA from tomato into pENTR vector 29
2.11. Subcellular localisation experiments 30
2.12. Phylogenetic analysis tomato SCoAL α1, α2 and β subunits 32
2.13. Expression analysis tomato SCoAL α1, α2 and β subunits 32
2.14. Analysis of enzyme activities 33
2.14.1. Succinyl CoA ligase enzyme assay 33
2.14.2 Glutamate decarboxylase enzyme assay 34
2.14.3 Glutamate dehydrogenase enzyme assay 34
2.15. Oxygen consumption measurements in yeast 35
2.16. Determination of metabolite levels in tomato leaves 35
2.17. Measurements of photosynthetic parameters 36
2.18. Measurement of respiratory parameters 36
2.19. Microarray 36
2.20. Statistical analysis 37
3\. Molecular cloning of tomato TCA cycle full-length cDNAs and
characterisation of succinyl CoA ligase α and β subunits 38
4\. Phenotypic and metabolic effects in tomato plants with reduced activity
of succinyl CoA ligase 60
5\. General Discussion 92
6\. Bibliography 100Despite the central importance of the TCA cycle in plant metabolism not all of
the genes encoding its constituent enzymes have been functionally identified.
In this work I report the isolation of tomato cDNAs coding for α1- and α2 and
one coding for the β-subunit of succinyl CoA ligase, for E2- and E3-subunits
of 2-oxoglutarate dehydrogenase complex, for iron sulphur-subunit of succinate
dehydrogenase, for E1α and β-subunits of pyruvate dehydrogenase complex, and
for chloroplastic-, cytosolic-, mitochondrial- and glyoxysomal-subunits of
malate dehydrogenase. Emphasis was given to the cDNAs coding for α1- and α2-
and for the β-subunit of succinyl CoA ligase. These three cDNAs were used to
complement the respective Saccharomyces cerevisiae mutants deficient in the
α\- and β-subunit, demonstrating that they encode functionally active
polypeptides. The genes encoding for the subunits were expressed in all plant
organs, but most strongly in flowers and leaves, with the two α-subunit genes
being expressed to equivalent levels in all plant organs. In all instances GFP
fusion expression studies confirmed an expected mitochondrial location of the
proteins encoded. Following the development of a novel assay to measure
succinyl CoA ligase activity, in the direction of succinate formation, the
evaluation of the maximal catalytic activities of the enzyme in a range of
plant organs revealed that these paralleled those of mRNA levels. I also
utilized this assay to perform a preliminary characterisation of the
regulatory properties of the enzyme suggesting allosteric control of this
enzyme may regulate flux through the TCA cycle in a manner consistent with its
position therein. Transgenic tomato (Solanum lycopersicum) plants expressing
the complete coding region of α1- and β-subunit of succinyl CoA ligase
separately in antisense orientation and using the RNAi approach were produced.
Transformants were screened for reduced succinyl CoA ligase activity and
selected lines were used for molecular, biochemical and physiological
characterisation. Transgenic tomato plants harbouring the β-subunit of
succinyl CoA ligase showed an increase in plant high, and a decrease in fruit
production and leaf dry matter, but no change in photosynthetic parameters
(for example CO2 assimilation rate) and about 30% decrease in the respiration
rate. Accumulation of glutamate and γ-aminobutyric acid amino acids in leaves,
and a higher activity of glutamate dehydrogenase and glutamate decarboxylase
in the transformants suggest an alternative route, the GABA shunt which
bypasses the succinyl CoA ligase deficiency and supplies the mitochondria with
succinate to support the respiratory processes. Further analysis of other
steady-state metabolite levels suggests a link between succinyl CoA ligase
activity with other metabolic pathways such as the shikimate and isoprenoid
pathways. It was observed that end products of the shikimate pathway, such as
aromatic amino acids, were increased, as well as tocopherols, chlorophylls and
carotenoids, which are end products of the isoprenoid pathways. Analysis of
transgenic tomato plants displaying reduced expression of α1-subunit of
succinyl CoA ligase performed in parallel with the tomato plants described
above surprisingly did not show similar phenotype as the first plants, most
likely because the selected lines showed not strongly enough decrease in
activity.Trotz der bedeutenden Rolle des Citratzyklus im Stoffwechsel der Pflanze,
wurden bisher nur wenige Enzyme innerhalb dieses Stoffwechselweges näher
charakterisiert. Das Ziel der vorliegenden Arbeit war es daher eben diese
Lücke zu schliessen und die Aktivitäten einiger der relevanten Citratzyklus-
Enzyme genauer zu analysieren. Zu diesem Zweck wurden zunächst die cDNAs, die
fur folgende Enzyme kodieren, aus Tomate isoliert: die α1-, α2 und
β-Untereinheiten des Enzyms Succinyl Coenzym A-Ligase, die E2- und
E3-Untereinheiten des 2-Oxoglutarat Dehydrogenase Komplexes, die Eisen-
Schwefel-Untereinheit der Succinat Dehydrogenase, die E1α-und β-Untereinheiten
des Pyruvat Dehydrogenase Komplexes, und die chloroplastidare-, cytosolische-,
mitochondriale- and glyoxysomale-Untereinheiten der Malat Dehydrogenase. Der
Schwerpunkt der Arbeit lag dann auf der Untersuchung der Funktionen der α1-,
α2 und β-Untereinheiten der Succinyl Coenzym A-Ligase. Diese drei cDNAs wurden
zunächst zur Komplementation von Hefe-Mutanten (Saccharomyces cerevisiae) mit
einem entsprechenden Defekt in der jeweiligen Untereinheit verwendet. Es
konnte somit gezeigt werden, dass die isolierten cDNAs funktionsfähige
Polypeptide kodieren. Hybridisierungexperimente haben im Weiteren ergeben,
dass die Untereinheiten der Succinyl Coenzym A-Ligase in allen pflanzlichen
Organen exprimiert werden. Besonders starke Expression fand man in Blüten und
Blättern, wohingegen die beiden α-Untereinheiten in allen Organen zu gleichen
Teilen exprimiert wurden. Durch die Analyse der Expression der GFP-
fusionierten Untereinheiten konnte weiterhin die erwartete mitochondriale
Lokalisierung der Proteine bestätigt werden. Zur Aktivitätbestimmung des
Enzyms Succinyl Coenzym A-Ligase wurde ein neues Protokoll in Richtung der
Bildung von Succinat entwickelt. Die Auswertung der gemessenen
Enzymeaktivitäten in verschiedenen pflanzlichen Organe ergab, dass diese mit
den Transkriptgehalten der Gene korrelierten. Eine umfassende
Charakterisierung der regulatorischen Eigenschaften des Enzyms konnte
ebenfalls mithilfe des neu entwickelten Enzymassays durchgeführt werden. Dabei
ergaben sich Hinweise auf eine allosterische Kontrolle des Enzyms das den
Fluss durch den Zyklus übereinstimmend mit seiner Position kontrolliert.
Anschliessend wurden verschiedene, genetisch modifizierte Tomatenpflanzen
(Solanum lycopersicum) hergestellt, die die vollständige Kodierungsregion der
α1- und β-Untereinheiten von Succinyl Coenzym A-Ligase einzeln in antisense
Orientierung und als RNAi exprimieren. Einzelne Transformanden dieser Pflanzen
wurden nach ihrer verminderten Enzymaktivität ausgewählt und dann fur
molekulare, biochemische und physiologische Analysen verwendet. Hierbei
zeigten die fur das Gen der β-Untereinheit der Succinyl Coenzym A-Ligase
reprimierten Tomatenpflanzen ein gesteigertes Pflanzenwachstum, eine
verminderte Fruchtproduktion, ein verringertes Trockengewicht der Blätter und
eine ungefähr 30%ige Verminderung der zellulären Atmungsrate. Sie zeigten
jedoch keine Änderung der photosynthetischen Parameter (zum Beispiel CO2
Assimilationsrate). Die Anreicherung an Glutamat und γ-Aminobuttersäure (GABA)
in Blättern, und die Erhöhung der Enzymaktivitäten der Glutamat Dehydrogenase
und der Glutamat Decarboxylase in diesen Pflanzen, weisen somit darauf hin,
dass der "GABA-shunt", als ein alternativer Weg, den Mangel an Succinyl
Coenzym A-Ligase überbrückt und die Mitochondrien mit Succinat beliefert, um
somit die Atmungsprozesse zu sichern. Weiterhin durchgeführte Metaboliten-
Analysen in Blättern, weisen auf eine Verbindung zwischen der Succinyl Coenzym
A-Ligase Enzymaktivität und anderen Stoffwechselwege, wie zum Beispiel dem
Shikimat- und dem Isoprenoidweg, hin. So konnte beobachtet werden, dass
Endprodukte des Shikimatwegs, wie aromatische Aminosäure, als auch
Tocopherol-, Chlorophyll- und Karotenoidemengen des
Isoprenoidstoffwechselweges, erhöht waren. Die Analysen der Tomatenpflanzen
mit verminderter Expression der Succinyl Coenzym A-Ligase α1-Untereinheit, die
parallel durchgeführt wurden, wiesen überraschenderweise, nicht dieselben
Eigenschaften wie die zuvor beschriebenen Transformanden der β-Untereinheit
auf. Es besteht hierbei die Möglichkeit, dass die Verminderung der
Enzymaktivität der ausgewählten Pflanzen nicht stark genug ausgeprägt war
Seneszenz-assoziierte P4-Typ ATPasen im Modellorganismus Arabidopsis thaliana
No full textFoliar senescence is an essential aspect within the development of plant
leaves. During the past years, scientific research has been focusing on the
understanding of the molecular mechanisms underlying senescence. Membrane
localized transporters are thought to be necessary items during this highly
regulated developmental program. Expression profiling of genes coding for
membrane proteins revealed increased transcript amounts of three ALA genes
(ALA1, ALA10 and ALA11) during leaf senescence of Arabidopsis thaliana. The
genes represent P4-type ATPases that are supposed to translocate
aminophospholipids between the two leaflets of biological membranes and, thus,
generating asymmetric membranes and inducing vesiculation. In order to
characterize ALA1, ALA10 and ALA11, a reverse genetic approach was applied
using T-DNA insertional mutants. In this work, the corresponding insertion
lines were isolated and identified (ala1, ala10 and ala11) and, to recognize
functional redundancy among the ALA members, multiple mutant lines were
generated (ala10/11 and ala1/10/11). The mutant lines were phenotypically
analyzed regarding their development with a special focus on the nature and
progression of senescence. Surprisingly, all investigated mutants displayed
premature senescence symptoms at a genetical, physiological and molecular
level revealing an important role of the three ALA members for a controlled
and unimpaired progression of the senescence process. The premature senescence
was accompanied by reduced growth at the plant and cellular level most
probably due to deregulated membrane asymmetry. ALA1 localized to plastids and
confirming this finding, ala1 displayed an altered plastid morphology lacking
grana stacks. It is assumed that the protein is an essential component for
proper plastid development. Mutants of ala10 and ala11 displayed abnormal
membrane structures within mesophyll cells hinting for an important role of
these P4-type ATPases in the maintenance of proper membrane function.
Experiments indicated that the proteins might localize to the plasma membrane
or the tonoplast, possibly oscillating between the two membrane systems. Lipid
analysis indicated that ALA proteins have no specificity for lipids with
certain acyl chains. Moreover, the investigations revealed that the proteins
play a role in cold tolerance and plant growth via the distribution of lipid-
bound fatty acids within cellular membranes. In summary, the investigation of
ALA1, ALA10 and ALA11 gave new indications for processes in which P4-type
ATPases are involved most probably via regulations of the membrane lipid
asymmetry and, thus, contribute to the actual limited knowledge of this
protein family in plants.Die Seneszenz stellt eine wesentliche Entwicklungsphase von pflanzlichen
Blättern dar. In den vergangenen Jahren begann sich die wissenschaftliche
Forschung auf das Verständnis der molekularen Mechanismen zu konzentrieren,
die diesem hoch regulierten Prozess zugrunde liegen. Hierbei wird
membranassoziierten Transportern eine besondere Rolle zugeschrieben. Durch die
Untersuchung von Genen, die für Transmembranproteine kodieren, stellte sich
heraus, dass drei Gene der ALA Familie (ALA1, ALA10 und ALA11) während der
Blattseneszenz von Arabidopsis thaliana besonders erhöhte Transkriptmengen
aufweisen. Die Gene stellen P4-Typ ATPasen dar, welche vermutlich für die
Translokation von Aminophospholipiden innerhalb der beiden Hälften von
biologischen Membranen verantwortlich sind und somit asymmetrische Membranen
generieren und vesikuläre Prozesse induzieren. Um ALA1, 10 und 11 näher zu
charakterisieren, wurde ein revers-genetischer Ansatz basierend auf T-DNA
Insertionsmutanten gewählt. In dieser Arbeit wurden die entsprechenden
Insertionslinien isoliert, identifiziert (ala1, 10 und 11) und, um
funktionelle Redundanzen unter den ALA Mitgliedern aufzuzeigen,
Mehrfachmutanten (ala10/11 und ala1/10/11) erzeugt. Die Mutanten wurden
bezüglich ihres Phänotyps untersucht, wobei ein besonderes Augenmerk auf die
Art und Weise sowie den Verlauf der Seneszenz gelegt wurde.
Überraschenderweise zeigten die untersuchten Mutanten eine verfrüht
einsetzende Seneszenz, welche auf genetischer, molekularer und physiologischer
Ebene nachgewiesen werden konnte. Dies lässt auf eine wichtige Rolle der drei
ALA Mitglieder für einen kontrollierten und ungestörten Ablauf der Seneszenz
schließen. Die verfrühte Seneszenz der Mutanten wurde von einer
Wachstumsreduktion begleitet, welche auch auf zellulärer Ebene zu verzeichnen
war und vermutlich durch deregulierte Membranasymmetrie hervorgerufen wird.
ALA1 konnte plastidär lokalisiert werden und es liegt nahe, dass das Protein
eine essentielle Komponente für eine ungestörte Plastidentwicklung darstellt.
Fehlende Granastapel in Plastiden von ala1 Mutanten sowie weitere Störungen in
der Plastidmorphologie stützen diesen Befund. ala10 und ala11 Mutanten wiesen
abnormale Membranstrukturen in Mesophyllzellen auf, was auf eine wichtige
Rolle von P4-Typ ATPasen in der Aufrechterhaltung der normalen Membranfunktion
schließen lässt. Die Untersuchungen deuten darauf hin, dass die Proteine in
der Plasmamembran oder im Tonoplasten lokalisieren und möglicherweise zwischen
beiden Membransystemen oszillieren. Lipidanalysen ergaben, dass ALA Proteine
keine Spezifität für Lipide mit bestimmten Acylketten aufweisen. Weiterhin
konnte gezeigt werden, dass die Proteine in Kältetoleranz und Pflanzenwachstum
involviert sind, indem sie die Verteilung von lipidgebundenen Fettsäuren in
zellulären Membranen steuern. Zusammenfassend ergaben die Untersuchungen an
ALA1, 10 und 11 neue Einsichten in Prozesse, an welchen P4-Typ ATPasen
beteiligt sind, was mit großer Wahrscheinlichkeit über die Regulation der
Membranlipidasymmetrie erfolgt, wodurch das aktuell verfügbare Wissen über
diese Proteinfamilie erweitert werden konnte
Going Beyond Counting First Authors in Author Co-citation Analysis
Full text linkThe present study examines one of the fundamental aspects of author co-citation analysis (ACA) - the way co-citation
counts are defined. Co-citation counting provides the data on which all subsequent statistical analyses and mappings
are based, and we compare ACA results based on two different types of co-citation counting - the traditional type that
only counts the first one among a cited work's authors on the one hand and a non-traditional type that takes into
account the first 5 authors of a cited work on the other hand. Results indicate that the picture produced through this non-traditional author co-citation counting contains more coherent author groups and is therefore considerably clearer. However, this picture represents fewer specialties in the research field being studied than that produced through the traditional first-author co-citation counting when the same number of top-ranked authors is selected and analyzed. Reasons for these effects are discussed
Variations on the Author
Full text link“Variations on the Author” discusses two of Eduardo Coutinho’s recent films (Um Dia na Vida, from 2010, and Últimas Conversas, posthumously released in 2015) and their contribution to the general question of documentary authorship. The director’s filmography is characterized by a consistent yet self-effacing form of authorial self-inscription: Coutinho often features as an interviewer that rather than express opinions propels discourses; an interviewer that is good at listening. This mode of self-inscription characterizes him as an author who is not expressive but who is nonetheless markedly present on the screen. In Um Dia na Vida, however, Coutinho is completely absent form the image, while Últimas Conversas, on the contrary, includes a confessional prologue that moves the director from the margins to the center of his films. This article examines the ways in which these works stand out in the filmography of a director who offers new insights into the notion of cinematic authorship
Appropriate Similarity Measures for Author Cocitation Analysis
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Dispelling the Myths Behind First-author Citation Counts
Full text linkWe conducted a full-scale evaluative citation analysis study of scholars in the XML research field to explore just how different from each other author rankings resulting from different citation counting methods actually are, and to demonstrate the capability of emerging data and tools on the Web in supporting more realistic citation counting methods. Our results contest some common arguments for the continued
use of first-author citation counts in the evaluation of scholars, such as high correlations between author rankings by first-author citation counts and other citation
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koamabayili/VECTRON-author-checklist: VECTRON author checklist
No full textWe have done our best to complete the author checklist relating to the use of animals in the hut study. Note that the objective for the hut study was to evaluate the IRS treatment applications for residual efficacy against Anopheles mosquitoes, including the local An. coluzzii mosquito population. Cows were only used to attract mosquitoes into the huts and no tests were carried out directly on the cows. The author checklist is intended for use with studies where experiments are carried out on animals, which is why we have had such difficulty in completing this for the hut study, as many of the questions do not relate to how the cows were used
- …
