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The NAMPT-mediated NAD salvage pathway in cancer cell metabolism and its regulation by resveratrol
Full text linkNicotinamide adenine dinucleotide (NAD) is a key regulator of several metabolic and signaling pathways that are relevant in cancer cell survival. Cancer cells have an increased energy demand associated with an increased NAD turnover. Nicotinamide phosphoribosyltransferase (NAMPT), a key enzyme of the NAD salvage pathway, plays a crucial role in maintaining the intracellular NAD levels and in regulating the activity of NAD-dependent enzymes, such as sirtuins (SIRTs). The inhibition of NAMPT activity and the use of phytochemicals, such as resveratrol, represent novel therapeutic approaches in cancer therapy. Based on these facts, this thesis aimed to investigate (1) the chemotherapeutic potential and molecular mechanisms of FK866, a specific NAMPT inhibitor, and resveratrol on hepatocarcinoma cells and to find out whether there are differences compared to primary human hepatocytes; (2) to address the impact of NAMPT inhibition on the energy metabolism in cancer cells; and (3) to investigate the roles of NAMPT and SIRT1 in resveratrol´s mode of action and chemotherapeutic effects. This work demonstrates that FK866 and resveratrol possess potent chemotherapeutic effects in hepatocarcinoma cells which were absent in human hepatocytes. Hepatocarcinoma cells display a dysregulation in the AMP-activated kinase (AMPK)/mammalian target of rapamycin (mTOR) signaling as well as in the NAMPT-mediated NAD salvage pathway compared to human hepatocytes. FK866-induced NAMPT inhibition induces ATP depletion associated with AMPK activation and mTOR inhibition whereas resveratrol induces caspase3-mediated apoptosis that is not dependent on NAMPT and SIRT1 function. NAMPT and SIRT1 are differentially regulated by resveratrol in hepatocarcinoma cells and human hepatocytes. This work also reveals that resveratrol activates p53-induced cell cycle arrest in hepatocarcinoma cells which is partly mediated by SIRT1 inhibition. In summary, this thesis provides new insight into the role of the NAMPT-mediated NAD salvage pathway in energy metabolism and characterized FK866 and resveratrol as promising potential chemotherapeutic agents for treatment of hepatocellular carcinoma
Role of lipid-derived second messengers in the oxidative activity of human polymorphonuclear leukocytes
Full text linkBei Entzündungen mobilisiert der Körper seine Abwehr gegen Krankheitskeime. An den Orten des Entzündungsgeschehens werden eine Vielzahl Immunzellen gesammelt und es kommt zur Bereitstellung immunmodulatorisch wirksamer Substanzen. Neutrophile oder polymorphkernige Leukozyten (PMNs) wirken an vorderster Entzündungsfront. Sie sind mit einer Reihe wirksamer bakterizider Agenzien wie z.B. Enzyme und reaktive Sauerstoffverbindungen (ROS) ausgestattet, die bei Stimulation von den Zellen abgegeben werden. Diese Agenzien können jedoch auch zur Gewebeschädigung beitragen. Die Signalwege, die zur Aktivierung der PMNs führen sind komplex und unterliegen einer genauen Kontrolle. Lipid second messenger spielen eine sehr wichtige Rolle bei diesen Signalwegen. So beeinflussen z.B. Lipide, die von unterschiedlichen Zellen generiert werden, wie auch Phospholipase A2 (PLA2) die Aktivität der PMNs. Insbesondere Lysophospholipide (LPL), Phosphatidsäuren (PA) und PLA2 fördern das Entzündungsgeschehen.
In der vorliegenden Arbeit wurden die Effekte von extern zugesetzten LPLs und PAs auf die oxidative Aktivität menschlicher Neutrophile untersucht. Darüber hinaus wurde die Aktivität von aus den Neutrophilen freigesetzter PLA2 sowie ihre Substrat-Spezifität bestimmt. Die oxidative Aktivität der Neutrophilen wurde mittels Luminol-verstärkter Chemolumineszenz (CL) untersucht. Zusätzlich wurde das Verfahren der „Matrix-assisted laser desorption & ionization Massenspektrometrie“ (MALDI-TOF MS) zum Nachweis von Phospholipiden (PL) eingesetzt. Da es sich dabei um ein erst kürzlich entwickeltes Verfahren handelt, wurden außerdem Untersuchungen zur Nachweisempfindlichkeit an isolierten PL durchgeführt.
Alle PL-Klassen wie auch PL biologischen Ursprungs können – wenn auch mit unterschiedlicher Empfindlichkeit mittels MALDI-TOF MS nachgewiesen werden. Die Gegenwart größerer Mengen leicht nachweisbarer Verbindungen wie z.B. Phosphatidylcholin (PC) kann jedoch die Detektierbarkeit anderer Lipide im Gemisch unterdrücken. LPLs können gleichermaßen mittels MALDI-TOF MS analysiert werden. Der besondere Vorteil dieses Verfahrens liegt in seiner einfachen Durchführbarkeit und dass sämtliche Informationen bereits aus einem einzelnen Spektrum gewonnen werden können.
Änderungen in der LPL-Zusammensetzung isolierter neutrophiler Granuloyzten in Abhängigkeit von der jeweiligen Stimulation konnten ebenfalls mittels MALDI-TOF MS nachgewiesen und mit den Ergebnissen der CL korreliert werden. Aus diesen Experimenten kann gefolgert werden, dass Enzyme mit PLA2-Aktivität in den Neutrophilen durch unterschiedliche Mechanismen reguliert werden und dass auch das Enzym Phosphatidylinositol-3-kinase (PI 3K) in die Regulation der Aktivität der zytosolischen PLA2 involviert ist.
Von außen zugesetzte Lyso-Phosphatidsäure (LPA) und Lyso-Phosphatidylcholin (LPC) zeigten signifikante Wirkungen auf die oxidative Aktivität der Neutrophilen. LPA erhöhte die CL-Ausbeute, während LPC den zeitlichen Verlauf der CL-Generierung veränderte, wenn ein chemotaktisches Tripeptid zur Stimulation eingesetzt wurde. Wurde jedoch mit Phorbolestern stimuliert, so zeigte LPA keinen Effekt, während LPC das Ausmaß der CL verminderte.
Von außen zugesetzte PA verändert die oxidative Aktivität über Signalwege, die auf der intrazellulären Produktion von PAs (als Folge der Phospholipase D-Aktivierung) sowie auf der Aktivierung von Phospholipase C und PI 3-K beruhen. In Abhängigkeit von der Fettsäurezusammensetzung der PAs ist zusätzlich auch die Aktivierung der Proteinkinase C notwendig. Schließlich hängt das maximale Ausmaß der ROS-Produktion der Neutrophilen von der gleichzeitigen Verfügbarkeit von PAs wie auch von Diacylglycerolen ab.
Ein Enzym mit PLA2-Aktivität konnte weiterhin aus den Neutrophilen isoliert werden und seine Aktivität mittels MALDI-TOF MS bestimmt werden. Dieses Enzym bevorzugt PC und PA als Substrat. Die von den Neutrophilen abgegebene PLA2 nutzt hingegen bevorzugt PA und besitzt nur sehr geringe Aktivität gegen andere Phospholipid-Klassen. Sogar diese Aktivität sinkt jedoch nach Stimulation der Zellen noch weiter ab. Dies impliziert, dass noch weitere Faktoren in die Regulation der PLA2-Aktivität involviert sein müssen
Selection of an artificial binding protein against the ectodomain of PTH1R
Full text linkIn der vorliegenden Arbeit wurde eine naїve scaffold Bibliothek, basierend auf dem humanen γB-Kristallin (hγBC), gegen die N-terminale, extrazelluläre Domäne des Parathyroidhormon-1-Rezeptors (nPTH1R), einem Vertreter der Klasse B GPCRs, selektiert. Vier Selektionsrunden (biopanning) wurden durchgeführt, wobei eine Variante (2G4) wiederholt isoliert werden konnte. Der Rezeptor wird von ihr in einer 1:1 Stöchiometrie mit niedrig mikromolarer Affinität gebunden. Zwei Phenylalanine an den Randomizierungspositionen 2 und 17 scheinen den größten Anteil am Bindungsereigniss zu haben, zumal die restlichen 7 umliegenden Aminosäuren ebenfalls ihren Teil zur Interaktion der beiden Moleküle beitragen. Eine Kompetition der Bindung von PTH an nPTH1R durch 2G4 und umgekehrt konnte nicht nachgewiesen werden, was auf unterschiedliche Epitope beider nPTH1R-Interaktionspartner schließen lässt. Potentielle Anwendungen für diesen vielversprechenden Binder könnten zum einen in Ko-Kristallisationsexperimenten, oder aber auch in der Affinitätschromatographie zur verbesserten Homogenität des Rezeptors aus Zellextraktionen liegen.In this thesis, a naive scaffold library, based on human γB crystallin (hγBC), was selected against the N-terminal extracellular domain of parathyroid hormone 1 receptor (nPTH1R), a class B GPCR. Four rounds of a biopanning process were performed and one hγBC binding variant, called 2G4, was repeatedly isolated. It binds the nPTH1R with low micromolar affinity in a 1:1 stochiometry. Two phenylalanines on randomization positions 2 and 17 were found to contribute the most to the binding interaction and the surrounding seven residues also participate in the binding event. There is no competition binding of 2G4 and PTH to nPTH1R via identical or overlapping binding sites. This promising binder could have several potential applications, such as in co-crystallization experiments or in affinity chromatography to increase the homogeneity of the receptor.von Qi Zhan
Neuropeptide Y stimulates neuronal precursor proliferation in the post-natal and adult dentate gyrus
No full textAdult dentate neurogenesis is important for certain types of hippocampal-dependent learning and also appears to be important for the maintenance of normal mood and the behavioural effects of antidepressants. Neuropeptide Y (NPY), a peptide neurotransmitter released by interneurons in the dentate gyrus, has important effects on mood, anxiety-related behaviour and learning and memory. We report that adult NPY
receptor knock-out mice have significantly reduced cell proliferation and significantly fewer immature doublecortin-positive neurons in the dentate gyrus. We also show that the neuroproliferative effect of NPY is dentate specific, is Y1-/-receptor mediated and involves extracellular signal-regulated kinase (ERK)1/2 activation. NPY did not exhibit any effect on cell survival in vitro but constitutive loss of the Y1 receptor in vivo resulted in greater survival of newly generated neurons and an unchanged total number of dentate granule cells. These results show that NPY stimulates neuronal precursor proliferation in the dentate gyrus and suggest that NPY-releasing interneurons may modulate dentate neurogenesis
Illuminating the life of GPCRs
Full text linkAbstract The investigation of biological systems highly depends on the possibilities that allow scientists to visualize and quantify biomolecules and their related activities in real-time and non-invasively. G-protein coupled receptors represent a family of very dynamic and highly regulated transmembrane proteins that are involved in various important physiological processes. Since their localization is not confined to the cell surface they have been a very attractive "moving target" and the understanding of their intracellular pathways as well as the identified protein-protein-interactions has had implications for therapeutic interventions. Recent and ongoing advances in both the establishment of a variety of labeling methods and the improvement of measuring and analyzing instrumentation, have made fluorescence techniques to an indispensable tool for GPCR imaging. The illumination of their complex life cycle, which includes receptor biosynthesis, membrane targeting, ligand binding, signaling, internalization, recycling and degradation, will provide new insights into the relationship between spatial receptor distribution and function. This review covers the existing technologies to track GPCRs in living cells. Fluorescent ligands, antibodies, auto-fluorescent proteins as well as the evolving technologies for chemical labeling with peptide- and protein-tags are described and their major applications concerning the GPCR life cycle are presented.</p
Receptor-Mediated Shuttling of a D\u2011Amino Acid Peptide Achieves High Nanomolar Cytosolic Concentrations
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Going Beyond Counting First Authors in Author Co-citation Analysis
Full text linkThe present study examines one of the fundamental aspects of author co-citation analysis (ACA) - the way co-citation
counts are defined. Co-citation counting provides the data on which all subsequent statistical analyses and mappings
are based, and we compare ACA results based on two different types of co-citation counting - the traditional type that
only counts the first one among a cited work's authors on the one hand and a non-traditional type that takes into
account the first 5 authors of a cited work on the other hand. Results indicate that the picture produced through this non-traditional author co-citation counting contains more coherent author groups and is therefore considerably clearer. However, this picture represents fewer specialties in the research field being studied than that produced through the traditional first-author co-citation counting when the same number of top-ranked authors is selected and analyzed. Reasons for these effects are discussed
Variations on the Author
Full text link“Variations on the Author” discusses two of Eduardo Coutinho’s recent films (Um Dia na Vida, from 2010, and Últimas Conversas, posthumously released in 2015) and their contribution to the general question of documentary authorship. The director’s filmography is characterized by a consistent yet self-effacing form of authorial self-inscription: Coutinho often features as an interviewer that rather than express opinions propels discourses; an interviewer that is good at listening. This mode of self-inscription characterizes him as an author who is not expressive but who is nonetheless markedly present on the screen. In Um Dia na Vida, however, Coutinho is completely absent form the image, while Últimas Conversas, on the contrary, includes a confessional prologue that moves the director from the margins to the center of his films. This article examines the ways in which these works stand out in the filmography of a director who offers new insights into the notion of cinematic authorship
Appropriate Similarity Measures for Author Cocitation Analysis
Full text linkWe provide a number of new insights into the methodological discussion about author cocitation analysis. We first argue that the use of the Pearson correlation for measuring the similarity between authors’ cocitation profiles is not very satisfactory. We then discuss what kind of similarity measures may be used as an alternative to the Pearson correlation. We consider three similarity measures in particular. One is the well-known cosine. The other two similarity measures have not been used before in the bibliometric literature. Finally, we show by means of an example that our findings have a high practical relevance.information science;Pearson correlation;cosine;similarity measure;author cocitation analysis
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