1,720,996 research outputs found
implication for human diseases
Full text linkMacroautophagy/autophagy is a self-degradative process necessary for cells to maintain their energy balance during development and in response to nutrient deprivation. Autophagic processes are tightly regulated and have been found to be dysfunctional in several pathologies. Increasing experimental evidence points to the existence of an interplay between autophagy and cilia. Cilia are microtubule-based organelles protruding from the cell surface of mammalian cells that perform a variety of motile and sensory functions and, when dysfunctional, result in disorders known as ciliopathies. Indeed, selective autophagic degradation of ciliary proteins has been shown to control ciliogenesis and, conversely, cilia have been reported to control autophagy. Moreover, a growing number of players such as lysosomal and mitochondrial proteins are emerging as actors of the cilia-autophagy interplay. However, some of the published data on the cilia-autophagy axis are contradictory and indicate that we are just starting to understand the underlying molecular mechanisms. In this review, the current knowledge about this axis and challenges are discussed, as well as the implication for ciliopathies and autophagy-associated disorders.publishersversionpublishe
Going Beyond Counting First Authors in Author Co-citation Analysis
Full text linkThe present study examines one of the fundamental aspects of author co-citation analysis (ACA) - the way co-citation
counts are defined. Co-citation counting provides the data on which all subsequent statistical analyses and mappings
are based, and we compare ACA results based on two different types of co-citation counting - the traditional type that
only counts the first one among a cited work's authors on the one hand and a non-traditional type that takes into
account the first 5 authors of a cited work on the other hand. Results indicate that the picture produced through this non-traditional author co-citation counting contains more coherent author groups and is therefore considerably clearer. However, this picture represents fewer specialties in the research field being studied than that produced through the traditional first-author co-citation counting when the same number of top-ranked authors is selected and analyzed. Reasons for these effects are discussed
Molecular mechanisms of melanin transfer and processing by keratinocytes
Full text linkThe skin protects the human body against external aggressions, such as ultraviolet
radiation (UVR) and microbial infections. Melanocytes and keratinocytes are the cell
types most present in the skin epidermis and are essential to sustain skin
pigmentation. Melanocytes synthesize the pigment melanin and are present at the
basal layer of the epidermis. Keratinocytes are present in all the layers and are the
final recipients of melanin, where it accumulates above the nuclei. Melanin sustains
skin pigmentation and protects skin cells against UVR-induced damage, which can
lead to the onset of skin cancer. Melanogenesis occurs in melanosomes, which share
several features with lysosomes like low pH, the presence of lysosomal membrane
proteins and catalytic enzymes and are thus considered lysosome-related organelles.
Melanosome biogenesis is initiated at the perinuclear region, while mature
melanosomes tend to accumulate at the tips of melanocyte dendrites. Once fully
mature and located at the tips of melanocyte dendrites, melanosomes are transferred
to keratinocytes. We found evidence that the predominant model of melanin transfer
is coupled exo/endocytosis, where melanocytes exocytose the melanin core in a
process dependent on the small GTPase Rab11b and the exocyst tethering complex
and then internalized by keratinocytes. We also establish for the first time that
melanocore internalization occurs through phagocytosis in a PAR-2-dependent
manner. We conclude that the form of melanin presentation directly influences the
internalization route followed by the pigment during internalization.
Additionally, we determine that melanocores are stored within keratinocytes in
maturation-arrested compartments that are not highly acid or highly degradative,
allowing melanin to persist within the cell for long periods. Moreover, we observed that
the capacity of the pigment to be recognized by PAR-2 might influence the way it is
processed and if it can escape the degradative pathway. According to our data,
melanocores but not melanosomes can avoid degradation within keratinocytes by
modulating the autophagic flux. Thus, this study proposes a comprehensive model
that links internalization and recognition of melanin at the plasma membrane with the
determination of its fate and processing within keratinocytes in a PAR-2-regulated
manner. Pigmentation disorders cause a significant reduction in the quality of life of those
affected due to their social impact. Also, with the modern lifestyle, photoprotection has
become a significant public health issue. Thus, this work has the potential to provide
entirely new concepts in the field of skin pigmentation that can lead to the identification
of novel regulators that can become drug targets for the pharma, biotech and cosmetic
industries.A pele é responsável por proteger o corpo humano das agressões externas, como a
radiação ultravioleta (UVR) e as infeções por microrganismos. Melanócitos e
queratinócitos são os tipos de células presentes em maior número na epiderme da
pele e são essenciais para a pigmentação da mesma. Os melanócitos sintetizam o
pigmento melanina e estão assentes na membrana basal da epiderme. Os
queratinócitos estão presentes em todas as camadas e são os destinatários finais da
melanina, onde esta se acumula por cima do núcleo. A melanina permite a
pigmentação da pele e protege as células da mesma contra os danos induzidos pela
UVR, que podem levar ao aparecimento de cancro de pele. A melanogenese ocorre
em melanossomas, que partilham várias características com lisossomos como pH
baixo, presença de proteínas da membrana lisossomal e enzimas catalíticas e, são
por isso considerados organelos relacionados com lisossomas. A biogenese do
melanossoma inicia-se na região perinuclear dos melanócitos, enquanto os
melanossomas maduros tendem a acumular-se nas pontas das dendrites dos
melanócitos. Uma vez totalmente maduros e localizados nas pontas das dendrites,
os melanossomas são transferidos para os queratinócitos. O nosso grupo descobrio
evidências que o modelo predominante de transferência de melanina é a
exo/endocitose, em que os melanócitos secretam o núcleo de melanina num processo
dependente da GTPase Rab11b e do complexo exocisto, que depois é internalizado
pelos queratinócitos. Nesta fase estabelecemos pela primeira vez que a
internalização dos melanocores (núcleo da melanina) ocorre através da fagocitose
dependente do recetor PAR-2. Concluímos assim que a forma como a melanina se
apresenta aos queratinócitos influencia diretamente a via de internalização seguida
pelo pigmento.
Além disso, determinámos que o armazenamento de melanocores ocorre em
compartimentos que não são muito acídicos nem muito degradativos, para permitir
que a melanina persista dentro da célula por longos períodos. Além disso, observouse
que a capacidade do pigmento ser reconhecido pelo PAR-2 pode influenciar a
maneira como é processado e se consegue ou não escapar à via degradativa. De
acordo com nossos dados, os melanocores, mas não os melanossomas, evitam a degradação nos queratinócitos, modulando o fluxo autofágico. Assim este estudo
propõe um modelo que liga a internalização e o reconhecimento da melanina na
membrana plasmática à determinação do seu destino e processamento dentro dos
queratinócitos, de uma forma regulada pelo PAR-2.
Os distúrbios da pigmentação causam uma redução na qualidade de vida das
pessoas afetadas devido ao seu impacto social. Além disso, com o estilo de vida
moderno, a fotoproteção tornou-se um problema de saúde pública. Assim, este
trabalho tem o potencial de fornecer conceitos inteiramente novos no campo da
pigmentação da pele que podem levar à identificação de novos reguladores vitais que
se tornarão alvos para as indústrias farmacêutica, biotecnológica e cosmética
Variations on the Author
Full text link“Variations on the Author” discusses two of Eduardo Coutinho’s recent films (Um Dia na Vida, from 2010, and Últimas Conversas, posthumously released in 2015) and their contribution to the general question of documentary authorship. The director’s filmography is characterized by a consistent yet self-effacing form of authorial self-inscription: Coutinho often features as an interviewer that rather than express opinions propels discourses; an interviewer that is good at listening. This mode of self-inscription characterizes him as an author who is not expressive but who is nonetheless markedly present on the screen. In Um Dia na Vida, however, Coutinho is completely absent form the image, while Últimas Conversas, on the contrary, includes a confessional prologue that moves the director from the margins to the center of his films. This article examines the ways in which these works stand out in the filmography of a director who offers new insights into the notion of cinematic authorship
Appropriate Similarity Measures for Author Cocitation Analysis
Full text linkWe provide a number of new insights into the methodological discussion about author cocitation analysis. We first argue that the use of the Pearson correlation for measuring the similarity between authors’ cocitation profiles is not very satisfactory. We then discuss what kind of similarity measures may be used as an alternative to the Pearson correlation. We consider three similarity measures in particular. One is the well-known cosine. The other two similarity measures have not been used before in the bibliometric literature. Finally, we show by means of an example that our findings have a high practical relevance.information science;Pearson correlation;cosine;similarity measure;author cocitation analysis
Molecular mechanisms of melanosome exocytosis
No full textSkin pigmentation relies on the pigment melanin and ensures photoprotection against ultraviolet
(UV) radiation, avoiding the onset of skin cancers. Melanin is synthesized by melanocytes and stored
within organelles designated melanosomes, which are tethered to actin in melanocyte dendrites
through Rab27a, and finally transferred to keratinocytes. While the molecular players involved in
melanogenesis have been extensively studied, those underlying melanosome exocytosis and
melanin transfer remain unclear. Previously, our group found that Rab11b regulates melanin
secretion and transfer in human skin. Here, we demonstrated that soluble factors, but not
extracellular vesicles, present in keratinocyte-conditioned medium (KCM) stimulate melanin
secretion from melanocytes, and transfer to keratinocytes. Moreover, we found that these factors
are released by differentiated keratinocytes, but not by undifferentiated ones. Importantly, we
ruled out the possibility that KCM increases melanin secretion and transfer as a consequence of
increased melanin synthesis. For this, we quantified intracellular melanin levels in melanocytes
cultured with or without KCM. Additionally, we confirmed that KCM does not increase the
expression of microphthalmia-associated transcription factor (MITF) and its downstream transcript
which encodes for tyrosinase in melanocytes, both required for melanogenesis. We also
demonstrated that Rab3a, but not Rab11b, regulates KCM-stimulated melanin secretion and
transfer, and shows enhanced colocalization with melanosomes in melanocyte dendrites upon
incubation with KCM. Therefore, our results suggest that soluble factors released by differentiated
keratinocytes control skin pigmentation by promoting the accumulation of Rab3a-positive
melanosomes in melanocyte dendrites, and their release and subsequent transfer to keratinocytes.
Furthermore, we found that Rab27a and the Rab3a guanine nucleotide exchange factor (Rab3il1)
regulate KCM-stimulated melanin secretion. We also observed that Ca2+
-dependent signaling
enhances KCM-induced melanin secretion, which raises a possible role for the Ca2+
-dependent
Munc13-2 and Munc18-3 priming proteins in this process. Interestingly, immunoprecipitation and
immunofluorescence assays suggested that Rab3a interacts with Rab27a on melanosome
membranes, in the dendrites of KCM-stimulated melanocytes. Besides the characterization of the
molecular machinery regulating KCM-induced melanin secretion, we identified a soluble factor
present in KCM responsible for the stimulatory effect. Indeed, our results showed that KCM soluble
factor(s) with a molecular weight lower than 3 KDa (< 3 KDa) is (are) the main stimulatory molecules
in melanin secretion. Curiously, NMS-23-01 was abundantly detected in KCM < 3 KDa fraction by
ultra-high performance liquid chromatography-tandem mass spectrometry (UHPLC-MS/MS)
analysis. Moreover, melanocytes cultured with NMS-23-01 demonstrated a dose-dependent
increase in secreted melanin levels and a decrease in intracellular melanin content. Furthermore,
the incubation of NMS-23-01 in both two-dimensional melanocyte/keratinocyte co-cultures and
three-dimensional reconstructed human pigmented epidermises enhanced melanin transfer and
augmented epidermal pigmentation. Thus, our results identified NMS-23-01 as the first molecule
that increases skin pigmentation by specifically enhancing melanin secretion and subsequent
transfer to keratinocytes. Importantly, NMS-24-01 (a specific antagonist of NMS-23-01) impaired
both NMS-23-01 and KCM-stimulated melanin secretion levels. Additionally, we found that NMS 23-01 and KCM share the same molecular pathway of stimulated melanin secretion, independent
of Rab11b and dependent of Rab27a, Rab3a and Rab3il1. Overall, our results suggest that NMS-23-
01 is at least one of the KCM soluble factors that stimulate melanin secretion. Furthermore, our
studies indicate that two distinct pathways of melanosome exocytosis exist in melanocytes: a basal
pathway controlled by Rab11b and another route controlled by the Rab27a-Rab3il1-Rab3a cascade,
and triggered upon stimulation with NMS-23-01 (and possibly other small keratinocyte-derived
soluble factors). Thus, this study contributed to a better understanding of fundamental processes
of skin pigmentation, namely the molecular players involved in the stimulation of melanin secretion.
Moreover, NMS-23-01 and its antagonist NMS-24-01 were identified in our work as novel and
specific compounds to target melanin secretion and transfer. Therefore, they exhibit the potential
to modulate skin color and serve as the basis of novel therapeutic strategies for
hypo/hyperpigmentation disorders, potentially also with cosmetic applications. Importantly, the
knowledge about NMS-23-01 and the molecular mechanisms stimulating melanin secretion and
transfer can also be applied to stimulate skin tanning and photoprotection against UV-induced DNA
damage.A pigmentação da pele depende do pigmento melanina, que assegura a fotoproteção contra a
radiação ultravioleta (UV), evitando o desenvolvimento de cancros de pele. A melanina é sintetizada
por melanócitos e armazenada em organelos designados melanossomas, que se ligam ao
citoesqueleto de actina nas dendrites dos melanócitos através de Rab27a, sendo posteriormente
transferidos para os queratinócitos. Embora os intervenientes moleculares envolvidos na
melanogénese tenham sido extensivamente estudados, os mecanismos subjacentes à exocitose dos
melanossomas e à transferência de melanina permanecem pouco claros. Anteriormente, o nosso
grupo descobriu que Rab11b regula a secreção e a transferência de melanina na pele humana. Aqui,
demonstramos que fatores solúveis, mas não vesículas extracelulares, presentes no meio
condicionado por queratinócitos (KCM) estimulam a secreção de melanina a partir dos melanócitos
e a sua transferência para os queratinócitos. Além disso, descobrimos que esses fatores são
libertados por queratinócitos diferenciados, mas não pelos não diferenciados. Importa salientar que
descartámos que o KCM aumenta a secreção e a transferência de melanina como consequência de
um aumento da síntese deste pigmento. Para esse propósito, quantificámos os níveis de melanina
intracelular em melanócitos cultivados com ou sem KCM. Confirmámos ainda que o KCM não
aumenta a expressão do fator de transcrição associado à microftalmia (MITF), nem do seu transcrito
que codifica para a tirosinase nos melanócitos, ambos necessários para a melanogénese.
Demonstrámos também que Rab3a, mas não Rab11b, regula a secreção e transferência de melanina
estimulada por KCM, apresentando um aumento da colocalização com os melanossomas nas
dendrites dos melanócitos após incubação com KCM. Portanto, os nossos resultados sugerem que
fatores solúveis libertados por queratinócitos diferenciados controlam a pigmentação da pele,
promovendo a acumulação de melanossomas positivos para Rab3a nas dendrites dos melanócitos,
bem como a sua libertação e subsequente transferência para os queratinócitos. Além disso,
descobrimos que a Rab27a e o fator de troca de nucleotídeos de guanina da Rab3a (Rab3il1),
também regulam a secreção de melanina estimulada por KCM. Observámos igualmente que a
sinalização de Ca2+ potencia a secreção de melanina induzida por KCM e sugerimos uma possível
função neste processo para as proteínas de priming dependentes de Ca2+
, nomeadamente Munc13-
2 e Munc18-3. Curiosamente, os nossos ensaios de imunoprecipitação e imunofluorescência
sugerem que Rab3a e Rab27a interagem na membrana do melanossoma, nas dendrites dos
melanócitos estimulados com KCM. Para além da caracterização da maquinaria molecular que
regula a secreção de melanina induzida por KCM, identificámos um fator solúvel presente neste
meio condicionado responsável por esse efeito estimulatório. Os nossos resultados demonstraram
que o(s) fator(es) solúvel(is) do KCM com um peso molecular inferior a 3 KDa (< 3 KDa) estimula(m)
a secreção de melanina. Curiosamente, a molécula NMS-23-01 foi detetada em abundância no KCM
< 3 KDa através de análise por cromatografia líquida de ultra-alta performance acoplada a
espectrometria de massa tandem (UHPLC-MS/MS). Melanócitos cultivados com NMS-23-01
demonstraram um aumento dependente da dose nos níveis de melanina secretada e uma
diminuição no conteúdo de melanina intracelular. Além disso, a incubação de NMS-23-01 tanto em
coculturas de melanócitos/queratinócitos como em epiderme humana pigmentada reconstruída
aumentou a transferência de melanina e a pigmentação da epiderme. Assim, os nossos resultados
identificaram NMS-23-01 como a primeira molécula que aumenta a pigmentação da pele
especificamente através de um aumento na secreção de melanina e a sua subsequente
transferência para os queratinócitos. Importa salientar que NMS-24-01 (um antagonista específico
de NMS-23-01) inibiu os níveis de secreção de melanina estimulados tanto pela NMS-23-01, como
pelo KCM. Adicionalmente, descobrimos que a NMS-23-01 e o KCM partilham a mesma via
molecular de secreção de melanina, independente de Rab11b e dependente de Rab27a, Rab3a e
Rab3il1. No geral, os nossos resultados sugerem que a NMS-23-01 é, pelo menos, um dos fatores
solúveis presentes no KCM que estimulam a secreção de melanina. Os nossos resultados também
indicam que existem duas vias distintas de exocitose de melanossomas nos melanócitos: uma via
basal controlada por Rab11b e outra via controlada pela cascata Rab27a-Rab3il1-Rab3a, que é
desencadeada sob estimulação com NMS-23-01 (e possivelmente por outros pequenos fatores
solúveis derivados dos queratinócitos). Assim, este estudo contribuiu para uma melhor
compreensão dos processos fundamentais da pigmentação cutânea, nomeadamente dos
intervenientes moleculares envolvidos na estimulação da secreção de melanina. Além disso, NMS 23-01 e o seu antagonista NMS-24-01 foram identificados no nosso trabalho como compostos
inovadores e específicos para regular a secreção e transferência de melanina. Portanto, podem
eventualmente ser utilizados para modular a cor da pele e servir como base para novas estratégias
terapêuticas para doenças de hipo/hiperpigmentação, tendo também possíveis aplicações
cosméticas. É importante destacar que o conhecimento sobre NMS-23-01 e os mecanismos
moleculares que estimulam a secreção e transferência de melanina pode ser também aplicado para
promover o bronzeamento da pele e a fotoproteção contra danos no DNA induzidos pela radiação
U
Testing the role of extracellular vesicles in early left right patterning
Full text linkAbstract
Bilaterian animals, such as humans, are characterized by an external roughly mirror symmetry
along the left – right axis that covers a pronounced internal asymmetric arrangement of the
thoracic and abdominal organs. While external symmetry has been associated with health and
beauty standards, the internal asymmetry may rely more on efficiency and functionality of the
different physiological systems. The left – right asymmetry of visceral organs is established
early on during embryonic development within a transient and specialized structure, commonly
referred to as the left – right organizer (LRO).
The LROs appear in many shapes and sizes, depending on the species, but a common feature
in some vertebrates is the requirement of motile cilia. The movement of these tiny hair-like
protrusions generate a directional fluid flow, that scales with the cube of cilia length, in order
to become capable of triggering a differentiated response on the left side of the LRO. Such
flow-dependent response involves Pkd2 channel activation and calcium signaling that
subsequently drive the left sided expression of the Nodal signaling cascade.
Nodal is a secreted protein that translates the asymmetries established at the LRO to the rest
of the embryo, through the lateral plate mesoderm. As embryonic development evolves, at
specific time points and locations along the anterior – posterior axis, Nodal induces the
expression of genes involved in the formation of the heart, brain, gut and its derivatives,
modulating the lateralization of these organs.
With this work, we dedicated our efforts to understanding a few molecular and cellular steps
missing in the establishment of the left – right axis within the LRO. In the Chapter 2, we
explored how the fluid flow is sensed by the LRO cells. Between the two hypotheses in the
field, one based on mechanosensing and other on chemosensing properties of the flow, we
found that the number of extracellular vesicles is too low and variable to transport sufficient
and efficiently a sidedness molecular signal towards the left sided LRO cells. Moreover,
pharmacological impairment of distinct endocytic pathways did not impact on heart laterality
arrangement.
We also found out an upstream regulator of Notch signaling, syntenin-a, involved in the cell
fate decision between motile and immotile cilia. We showed that syntenin-a loss-of-function
severely affected the left – right axis development. By downregulating the levels of syntenin a, Notch signaling is activated increasing the expression of her12 and resulting in a higher
number of immotile cilia, in concordance with our previous published data. We next described
a potential molecular switch, downstream of Notch signaling, composed by the Rabconnectin
complex. As this complex is known to promote V-ATPase assembly and consequently its
activity, we inhibited the V-ATPase activity and we observed an increase in the number of
motile cilia. Thus, suggesting that the link between Notch signaling and motile – immotile cilia
ratio is through the modulation of pH.
Lastly, in Chapter 3, we focused on the impact of ciliary dysfunction in the epithelial respiratory
cells. We characterized the distribution pattern of several ciliary proteins in two siblings
harboring a primary ciliary dyskinesia causing mutation on Zmynd10 gene. Recent studies
showed that ZMYND10 is one of the cytoplasmatic factors responsible for stabilizing and
driving axonemal dynein arm assembly. We showed here that outer and inner axonemal
dyneins, that become mostly absent from the ciliary axoneme in Zmynd10 mutant respiratory
ciliated cells, can sometimes enter the proximal part of the cilium. These results suggest that to a low extent the dynein arms can still assemble and be transported into the cilium in the
absence of ZMYND10, thus opening an opportunity for small-molecule therapies that promote
protein stability in primary ciliary dyskinesia disease management.Resumo
Os animais bilaterais, como os humanos, são caracterizados por uma simetria externa ao
longo do eixo esquerda – direita que cobre um arranjo interno pronunciadamente assimétrico
dos órgãos torácicos e abdominais. Enquanto a simetria externa tem sido associada a
padrões de saúde e beleza, a assimetria interna pode depender maioritariamente da
eficiência e funcionalidade da montagem dos diferentes sistemas fisiológicos. Esta assimetria
esquerda – direita dos órgãos viscerais é estabelecida durante o desenvolvimento
embrionário dentro de uma estrutura transiente e especializada, normalmente conhecida por
organizador esquerda – direita.
Os organizadores esquerda – direita aparecem em várias formas e tamanhos, dependendo
da espécie, mas uma característica comum em alguns dos vertebrados é a existência de
cílios. Os cílios são organelos compostos por microtúbulos que são projetados da superfície
da célula. E estes podem ser móveis ou imóveis dependendo da presença ou ausência de
proteínas motoras, as dineínas do axonema, que geram energia suficiente para mover o cílio.
No caso do organizador esquerda – direita, os dois tipos de cílios estão presentes e
desempenham funções distintas: os cílios móveis promovem um fluxo direcional do fluido
existente no lúmen dos organizadores, cuja velocidade é proporcional ao cubo do
comprimento ciliar, e os cílios imóveis são potencialmente responsáveis por detetar esse
mesmo fluxo. Por conseguinte, a deteção do fluxo desencadeia uma resposta assimétrica nas
células do lado esquerdo do organizador esquerda – direita, que é dependente do canal de
cálcio Pkd2 localizado nos cílios. Assim, os iões de cálcio entram pelo cílio e ativam a
libertação de mais iões dos organelos internos, o que resulta numa onda de cálcio propagada
pela célula que, por sua vez, é necessária para iniciar uma cascada molecular de sinalização
composta por Nodal e os seus inibidores.
Nodal é um factor secretado da família TGF-β inicialmente expresso em redor do organizador
esquerda-direita de forma simétrica. Um dos seus antagonistas expresso no organizador,
Dand5, impede a propagação precoce e simétrica de Nodal para a placa lateral da
mesoderme. Contudo, a onda de cálcio que se forma nas células do organizador promove a
degradação de dand5, tornando-se assim o primeiro gene assimetricamente expresso e
libertando Nodal da sua repressão especificamente no lado esquerdo do organizador.
Consequentemente, Nodal é capaz de ativar a sua própria expressão na placa lateral da
mesoderme do lado esquerdo e a expressão de um segundo inibidor, lefty1, na linha mediana,
de forma a impedir que Nodal ative a sua expressão no lado direito.
À medida que o desenvolvimento embrionário evolui, Nodal propaga-se pela mesoderme ao
longo do eixo anterior - posterior, que em estadios e regiões específicas, leva à expressão de
genes envolvidos na formação do coração, cérebro, fígado, pâncreas, entre outros,
modulando a lateralização destes órgãos.
Este campo da biologia do desenvolvimento tem evoluído bastante ao longo dos últimos anos,
contudo algumas questões continuam em aberto. A forma como o fluxo é detetado pelas
células do organizador esquerda – direita é uma delas. Historicamente, o campo está dividido
em torno de duas hipóteses principais – o modelo quimiossensor e o modelo mecanossensor.
Por um lado, o modelo quimiossensor propõe que o fluxo serve para transportar vesículas e
moléculas sinalizadoras para o lado esquerdo, onde serão internalizadas pelas células do
organizador. Por outro lado, o modelo mecanossensor baseia-se na força hidrodinâmica que o fluxo exerce sobre os cílios imóveis. Com este projeto de doutoramento pretendemos
fornecer novos dados do mecanismo biofísico impulsionado pelo fluxo usando o organizador
esquerda – direita do peixe-zebra como modelo animal. Inicialmente, dedicámo-nos a
inspecionar as características moleculares das células do organizador e o conteúdo de fluído
para inferir sobre as possíveis contribuições do modelo quimiosensor na deteção do fluxo de
fluidos pelo canal Pkd2. Para tal, gerámos uma linha transgénica para quantificar e permitir o
rastreamento de vesículas extracelulares dentro do lúmen do organizador e usámos uma
nova configuração de micromanipulação para modificar o conteúdo do fluido do organizador.
Os nossos resultados mostram que o número de vesículas extracelulares detetadas é muito
baixo e variável para transportar um sinal molecular de lateralidade de forma eficiente para
as células do organizador do lado esquerdo. Adicionalmente, a inibição farmacológica de vias
endocíticas distintas não teve impacto na lateralidade do coração.
De seguida, analisámos a regulação do número de cílios móveis e imóveis no organizador
esquerda – direita. No peixe zebra, todos os cílios têm a ultra estrutura necessária para se
moverem, contudo, apenas alguns cílios se tornam móveis. O nosso grupo tinha
anteriormente descoberto que a decisão entre móvel e imóvel é feita pela via de sinalização
de Notch. Com este trabalho, nós identificámos novos moduladores a montante e efetores a
jusante da sinalização de Notch envolvidos neste processo. Mostrámos que a perda de
função da syntenin-a afeta severamente o desenvolvimento do eixo esquerda – direita, uma
vez que ativa a sinalização de Notch e a expressão do seu gene alvo, her12, o que resulta
num número maior de cílios imóveis e por conseguinte num fluxo do fluído menor. Também
descrevemos um potencial botão molecular, a jusante da sinalização de Notch, composto
pelo complexo Rabconnectin. Uma vez que este complexo é conhecido por promover a
montagem da V-ATPase e consequentemente sua atividade, inibimos a atividade da V ATPase e observámos um aumento do número de cílios móveis. Assim, sugerimos que a
ligação entre a sinalização de Notch e a proporção de cílios móveis – imóveis se dá através
da modulação do pH.
Por fim, no Capítulo 3, focámo-nos no impacto da disfunção ciliar nas células epiteliais
respiratórias. Caracterizámos o padrão de distribuição de várias proteínas ciliares em dois
irmãos portadores de discinésia ciliar primária causada por uma mutação no gene Zmynd10.
Estudos recentes mostram que ZMYND10 é um dos fatores citoplasmáticos responsáveis por
estabilizar e conduzir a montagem do braço de dineína que constituí o axonema do cílio
móvel. Mostrámos aqui que as dineínas externas e internas do axonema, que se tornam
principalmente ausentes do cílio em células respiratórias mutadas no gene Zmynd10, podem,
no entanto, entrar na parte proximal do cílio. Estes resultados sugerem que uma pequena
porção dos braços de dineína conseguem ser montados e transportados para o cílio na
ausência de ZMYND10, abrindo assim uma oportunidade para terapias com pequenas
moléculas que promovam a estabilidade de proteínas na gestão do tratamento da doença de
discinésia ciliar primária
Role of arl13b in breast cancer cell migration and invasion
Full text linkRESUMO: O cancro da mama é a principal causa de morte, associada a cancro, na população
mundial feminina, maioritariamente devido à formação de metástases. A
disseminação das células cancerígenas resulta da sua capacidade em migrar a
partir do tumor primário e invadir o tecido circundante até chegar à corrente
sanguínea ou linfática, onde podem chegar a outros órgãos. Desta forma, a
capacidade de migração e invasão celular é essencial para a formação de
metástases e é controlada pela regulação das adesões célula-célula e célulamatriz extracelular, pela capacidade de degradar a matriz extracelular e pelo
rearranjo do citoesqueleto de actina. Assim, a identificação das proteínas
envolvidas na regulação da migração e invasão de células do cancro da mama
poderá contribuir para o estabelecimento de novas estratégias de prognóstico,
diagnóstico e de tratamento.
A família de fatores de ribosilação do ADP (Arf) é principalmente conhecida pela
sua função na regulação do tráfego vesicular. Curiosamente, vários estudos
mostram que células cancerígenas possuem uma expressão alterada e recrutam
membros desta família para migrar e invadir eficazmente. A proteína Arl13b
pertence a uma subfamília da família de proteínas Arf e foi primeiramente
identificada como sendo uma proteína ciliar. No entanto, vários estudos têm
demonstrado que a Arl13b pode ser encontrada e exercer funções fora do cílio. O
nosso grupo descobriu que a Arl13b regula o tráfego endocítico de reciclagem e a
migração celular em condições não-patológicas através da actina e da miosina
não muscular IIA (NMIIA), identificada como efector da Arl13b. Para além disso,
dados recentes do nosso laboratório sugerem uma correlação positiva entre a
expressão de Arl13b e a capacidade invasiva de células do cancro da mama.
Consequentemente, o principal objetivo desta tese foi avaliar o papel da Arl13b na
migração e invasão de células do cancro da mama e determinar os mecanismos
envolvidos.
Os resultados obtidos durante este trabalho mostram que a Arl13b regula
positivamente a migração e invasão de células de cancro da mama, in vitro. Para
além disso, estes resultados são corroborados por dados do nosso grupo que
mostram que a Arl13b regula o tamanho do tumor primário e o número de metástases pulmonares, in vivo. Curiosamente, o cancro da mama é o terceiro
tipo de cancro em que foi relatada uma função da Arl13b como regulador positivo
da formação e progressão tumoral. Nos outros dois modelos tumorais,
nomeadamente meduloblastoma e cancro gástrico, foi proposto um mecanismo
mediado pela via de sinalização “Sonic Hedgehog” canónica, que é dependente
do cílio. Em cancro da mama, nós propomos um mecanismo alternativo para a
regulação da migração e invasão celular por Arl13b, independente do cílio. Em
células de cancro da mama, observámos que a Arl13b está localizada e regula
negativamente as interações célula-célula. Adicionalmente, detetámos que a
Arl13b interage com a β3-integrina e colocaliza com outros dois componentes das
adesões focais (AF) com a matriz extracelular, nomeadamente Vinculina e
Paxilina. Quando a Arl13b é silenciada em células de cancro da mama, verificase um aumento do tamanho das AFs. Nós sugerimos que este aumento de
tamanho das AFs resulta de um aumento do crescimento destas estruturas,
mediado pela tensão gerada pela NMIIA, uma vez que nós observámos um
aumento dos níveis de NMIIA em células onde foi silenciada a Arl13b. Para além
disso, as AFs maiores podem resultar de uma redução da taxa de desmontagem,
que pode ser explicada pelos menores níveis de ativação da via de sinalização
mediada pelas integrinas, que se sabe estar envolvida na desmontagem de AFs.
Por fim, detetámos a presença de Arl13b em estruturas envolvidas na degradação
da matriz extracelular, designadas por invadopodia. No futuro, deverá ser avaliado
se a Arl13b regula a formação de invadopodia, já que isso poderia explicar a
função de Arl13b na regulação da invasão de células de cancro da mama.
Curiosamente, a desregulação das interações célula-matriz extracelular e do
rearranjo de actina são dois eventos observados nas fases iniciais da progressão
do cancro da mama. Dessa forma, seria interessante avaliar se um aumento de
expressão da Arl13b também é observado nas fases iniciais da progressão da
doença. De qualquer forma, como nós observámos que a Arl13b regula o rearranjo
de actina e a dinâmica das AFs e que a sua expressão está positivamente
correlacionada com a capacidade invasiva das células, nós propomos Arl13b
como um possível marcador prognóstico ou mesmo como um alvo terapêutico em
cancro da mama. Num cenário em que uma expressão aumentada de Arl13b é
detetada em lesões iniciais do cancro da mama e é preditiva de progressão tumoral, a inibição da Arl13b poderia bloquear a transição de lesões pré-malignas
para invasivas por afetar o rearranjo de actina e a desmontagem das AFs e desta
forma a migração e invasão celular.ABSTRACT: Breast cancer is the leading cause of cancer-associated deaths in women
worldwide, mainly due to metastasis. To disseminate, cancer cells migrate from
the primary tumor and invade surrounding tissues, until they reach the blood and
lymphatic vessels, whereby they travel to a new organ. Therefore, cell migration
and invasion are two essential cellular processes required for cancer metastasis
and involve coordinated regulation of cell-cell and cell-extracellular matrix (ECM)
adhesion, ECM degradation, and actin cytoskeletal remodeling. Importantly, the
identification of molecular regulators of breast cancer cell migration and invasion
can contribute to the establishment of new prognosis, diagnosis and therapeutic
strategies.
ADP-ribosylation factor (Arf) family of proteins are mainly known as regulators of
vesicular trafficking. Interestingly, various reports show that cancer cells
abnormally express and hijack members of this family to migrate and invade
efficiently. Arl13b belongs to the Arf-like (Arl) subfamily and was first described as
a ciliary protein. Nevertheless, it has been shown that Arl13b is also found and
exert functions outside cilia. Our group has shown that Arl13b regulates endocytic
recycling traffic and cell migration in non-pathological conditions through its effector
non-muscle myosin heavy chain IIA (NMIIA). Moreover, recent data from our lab
suggests that Arl13b expression levels positively correlate with the invasive
capacity of breast cancer cells. Consequently, the main aim of this PhD thesis was
to determine the role of Arl13b in breast cancer cell migration and invasion and
identify the underlying molecular mechanisms.
The results obtained in this work show that Arl13b positively regulates breast
cancer cell migration and invasion in vitro. Corroborating these results, additional
data from our lab shows that Arl13b regulates primary tumor size and the formation
of lung metastases, in vivo. Interestingly, breast cancer is the third type of cancer
where a function for Arl13b as a positive regulator of tumor formation and/or
progression has been reported. In the other two types, namely medulloblastoma
and gastric cancer, a mechanism mediated by ciliary canonical Sonic hedgehog
(Shh) signaling was proposed. In breast cancer, we have evidence for an
alternative mechanism of cancer cell migration and invasion regulation by Arl13b,independent of cilia. Indeed, we observed that Arl13b localizes to and negatively
regulates cell-cell contacts. Moreover, we found that Arl13b interacts with β3-
integrin and colocalizes with Vinculin and Paxillin, two focal adhesion (FA)
components. Furthermore, when Arl13b is silenced in breast cancer cells, we found
an increase in the size of FAs. Thus, we propose that the larger FAs in Arl13bsilenced cells results from increased FA growth through NMIIA-mediated tension,
since we observed elevated NMIIA levels, and decreased FA disassembly, due to
defective integrin-mediated signaling involved in FA disassembly. Finally, we
observed that Arl13b localizes to structures involved in ECM degradation named
invadopodia. In the future, a function of Arl13b in the formation of invadopodia,
which could explain the role of Arl13b in breast cancer cell invasion, should be
assessed.
Interestingly, it has been observed that dysregulated cell-ECM interactions and
abnormal actin cytoskeleton remodeling are two early events in breast cancer
progression. Therefore, it would be interesting to evaluate if the altered expression
of Arl13b is also an early event in breast cancer. Even tough, as we have found
that Arl13b regulates actin cytoskeleton remodeling and FA dynamics and its
expression is positively correlated with breast cancer cell invasive capacity, we
propose Arl13b as a potential prognostic marker or even a therapeutic target. In a
scenario where abnormal Arl13b expression is detected in early breast cancer
lesions and predictive of tumor progression, targeting of Arl13b could block the
transition of pre-malignant lesions to invasive cancer by impairing actin
cytoskeleton remodeling, FA turnover and subsequently cell migration and
invasion
Role of lysosome exocytosis in breast cancer progression
No full textAbstract
Breast cancer (BC) is the most frequent type of cancer worldwide and the most common cause of cancer-related deaths in women. Among the subtypes, triplenegative BC (TNBC) displays the worst prognosis, a higher risk of relapse and metastasis formation, and limited treatment options. Therefore, it is crucial to unravel the mechanisms underlying TNBC cell invasion and metastasis formation to develop new therapies that block BC progression.
Cancer cells subvert several pathways, including lysosome exocytosis, allowing
them to acquire an aggressive phenotype. Lysosome exocytosis is important for
plasma membrane repair, drug efflux, extracellular matrix degradation/remodeling,
facilitating cell migration and invasion. Unpublished results from our group
demonstrate an association between BC aggressiveness and lysosome exocytosis.
Thus, this project aims to modulate lysosome exocytosis in TNBC cells, using
different approaches, to impair BC progression.
We found that the silencing of RAB11A/B in MDA-MB-231 cells impairs lysosome exocytosis, as previously shown by our group in HeLa cells. Additionally, RAB11A/B silencing lead to impaired cell invasion in MDA-MB-231 cells. However, only RAB11A depletion seems to inhibit cell migration, suggesting a dual role for RAB11A and RAB11B. In addition, RAB11 effector Sec15a/b and the interacting partner MyoH9 also seem to be involved in lysosome exocytosis. Furthermore, to confirm that lysosome exocytosis affects cell invasion, other regulators were investigated. Our results suggest that RAB3A and synaptotagmin VII might have a role in lysosome exocytosis in MDA-MB-231 cells. Finally, lysosome exocytosis inhibitors vacuolin-1 and verapamil were also tested. Interestingly, these compounds do not impair lysosome exocytosis in TNBC cells, contrary to what was observed in HeLa cells. Thus, other regulators and compounds that inhibit lysosome exocytosis, should be tested to confirm that lysosome exocytosis can indeed be targeted to impair TNBC progression. The knowledge obtained could be used to reduce or block of metastasis formation, increasing overall patient survival
- …
