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Alterations of arginine in Lysinuric Protein Intolerance (LPI) macrophages
No full textLysinuric Protein Intolerance (LPI) is an inherited transport defect of cationic amino acids (arginine, lysine and ornithine) transport at the basolateral membrane of intestinal and renal tubular cells caused by mutations in SLC7A7 encoding for System y+L-related y+LAT1 protein. The severe clinical course of this disorder suggests that LPI should be considered a severe multisystem disease with features proper of 'metabolic' disorders. In particular, immune dysfunction could be attributed to an altered metabolism of nitric oxide (NO) secondary to abnormal arginine intracellular metabolism. To address this hypothesis we measured arginine transport/metabolism in monocyte-derived macrophages (MDM), obtained from peripheral blood monocytes isolated from 5 LPI patients. In these cells the efflux of 3H-arginine through System y+L was markedly lower than in normal MDM, with a decrease that ranged from 60 to 75%. Moreover, SLC7A7 silencing in a human monocytic cell line (THP-1 cells) caused a significant increase of intracellular arginine content. These results indicate that arginine entrapping takes place in LPI monocytes-macrophages, supporting the hypothesis that NO overproduction observed in vivo may be due to an abnormal intracellular metabolism of arginine.
Supported by CLIMB (Children living with inherited metabolic diseases, Crewe, UK
Macrophages from patients affected by Lysinuric Protein Intolerance exhibit an impaired phagocytosis
No full textEffetto della rapamicina sull’aumento di trasporto di Arginina indotto da TNFalpha in HSVEC
No full textIntroduzione. Nelle cellule endoteliali umane di vena safena (HSVECs) il trasporto di arginina è riconducibile all’attività dei sistemi di trasporto y+, riferibile all’espressione dei geni SLC7A1/CAT1 e SLC7A2/CAT2, e del sistema y+L (inibibile da leucina in presenza di Na+) riferibile all’espressione dei geni SLC7A6/y+LAT2 e SLC7A7/y+LAT1. Studi condotti nel nostro laboratorio hanno dimostrato che il TNFalpha stimola il trasporto di L-arginina attraverso il sistema y+ e che tale effetto è riconducibile ad un aumento dell’espressione di SLC7A2/CAT2 mentre SLC7A1/CAT1 non subisce apprezzabili variazioni. L’effetto della citochina è mediato dall’attivazione del fattore di trascrizione NF-kB. In questo studio dimostriamo che il trattamento di HSVECs con rapamicina, un potente inibitore specifico della chinasi mTOR utilizzato come immunosoppressore, potenzia l’effetto del TNFalpha sull’attività di trasporto del sistema y+, aumentando fortemente l’espressione di SLC7A2/CAT2.
Materiali e Metodi. Le cellule, coltivate in medium M199 contentente il 20% di siero bovino fetale, 50 ug/ml di Endothelial Cell Growth Supplement e 75 U/ml di eparina, sono state incubate per 8 o 18h in presenza o in assenza di TNFalpha (10ng/ml) con l’aggiunta, un’ora prima del trattamento, di rapamicina 100 nM. L’attività di trasporto del sistema y+ è stata misurata come uptake di 3H-arginina (0.1 mM; 4uCi/ml) determinato in presenza di leucina 2 mM. L’espressione dei geni SLC7A1/CAT1 e SLC7A2/CAT2 è stata analizzata in RT-qPCR. L’analisi del recettore TNFR-1 e della molecola di adesione ICAM-1 è stata effettuata mediante Western Blotting dopo biotinilazione delle proteine di membrana.
Risultati e Discussione. In HSVECs il TNFalpha induce un aumento (+100%) dell’attività del sistema y+. L’aumento è visibile già dopo 9 ore di trattamento e persiste anche dopo 24 ore. La stimolazione del trasporto di arginina è associata ad un forte incremento dell’espressione degli mRNA per CAT2A e CAT2B, ottenuti dallo splicing alternativo del trascritto di SLC7A2, mentre variazioni non significative si osservano per SLC7A1. In presenza di TNFalpha, il trattamento con rapamicina induce un forte aumento del trasporto di arginina, 3-4 volte superiore rispetto ai valori di controllo, associato ad una sovraespressione dei geni codificanti CAT2A e CAT2B. In assenza di TNFalpha la rapamicina non produce apprezzabili cambiamenti nè dell’attività del sistema y+, nè dell’espressione dei geni relativi. Il potenziamento degli effetti della citochina da parte di rapamicina non è limitato all’espressione di CAT2, in quanto anche l’espressione della molecola di adesione ICAM-1 è aumentata notevolmente dal trattamento combinato con TNFalpha e rapamicina. Il meccanismo responsabile di questi effetti sembra coinvolgere l’up-regulation di TNFR-1: l’analisi Western mostra infatti un aumento del recettore in presenza di TNFalpha, rapamicina o di entrambi. Questi risultati indicano che l’inibizione della protein-chinasi mTOR produce, in cellule endoteliali da macrocircolo, effetti pro-infiammatori sinergici con quelli del TNFalpha
Gliadin activates arginase pathway in RAW264.7 cells and in human monocytes
No full textAbstractCeliac disease (CD) is an autoimmune enteropathy triggered in susceptible individuals by the ingestion of gliadin-containing grains. Recent studies have demonstrated that macrophages play a key role in the pathogenesis of CD through the release of inflammatory mediators such as cytokines and nitric oxide (NO). Since arginine is the obliged substrate of iNOS (inducible nitric oxide synthase), the enzyme that produces large amount of NO, the aim of this work is to investigate arginine metabolic pathways in RAW264.7 murine macrophages after treatment with PT-gliadin (PTG) in the absence and in the presence of IFNγ. Our results demonstrate that, besides strengthening the IFNγ-dependent activation of iNOS, gliadin is also an inducer of arginase, the enzyme that transforms arginine into ornithine and urea. Gliadin treatment increases, indeed, the expression and the activity of arginase, leading to the production of polyamines through the subsequent induction of ornithine decarboxylase. This effect is strengthened by IFNγ. The activation of these pathways takes advantage of the increased availability of arginine due to a decreased system y+l-mediated efflux, likely ascribable to a reduced expression of Slc7a6 transporter. A significant induction of arginase expression is also observed in human monocytes from healthy subject upon treatment with gliadin, thus demonstrating that gluten components trigger changes in arginine metabolism in monocyte/macrophage cells
Espressione di SLC7A7y+LAT1, il gene mutato nella LPI, in monociti e cellule dell’epitelio respiratorio
No full textHigh ASCT2 activity as a marker of extracellular glutamine dependence in ammoniagenic multiple myeloma cell lines
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Arginine transport in human monocytic leukemia THP-1 cells during macrophage differentiation
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