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Coinvolgimento della proteinchinasi CK2 nella resistenza all’imatinib in cellule di leucemia mieloide cronica
No full textLa leucemia mieloide cronica (CML) è una malattia mieloproliferativa delle cellule ematopoietiche staminali, caratterizzata da un’espansione clonale di cellule staminali pluripotenti progenitrici con il conseguente incremento dei granulociti nel sangue. Un marcatore della CML è il cromosoma Philadelphia (Ph+), originato dalla traslocazione reciproca t(9;22)(q34;q11), che dà origine al gene di fusione BCR/ABL1, codificante per l’oncoproteina Bcr/Abl, una tirosin-chinasi costitutivamente attiva.
L’imatinib (STI-571) colpisce selettivamente l’oncoproteina Bcr/Abl e rappresenta la terapia standard d’inizio per questa patologia. Nonostante la sua grande efficacia, la resistenza all’imatinib è emersa come un significativo problema clinico. La linea cellulare LAMA84 è un modello della CML. In questa tesi, abbiamo usato due varianti di cellule LAMA84: una è incapace di sopravvivere e crescere in presenza di imatinib (LAMA84-S), mentre l’altra può crescere in presenza di 1,5 μM imatinib (LAMA84-R).
Lo scopo di questo lavoro è stato l’analisi della proteinchinasi CK2 nelle cellule LAMA84-S/R. La proteinchinasi CK2 è un Ser/Thr-chinasi ubiquitaria e costitutivamente attiva, che fosforila svariati substrati implicati in processi chiave della vita cellulare. CK2 presenta generalmente una struttura eterotetramerica composta da due subunità catalitiche (44 kDa) e/o (38 kDa) e due subunità regolatrici (25 kDa).
L’analisi mediante western blot dei livelli proteici di Bcr/Abl in diversi lisati cellulari di cellule LAMA84-S e LAMA84-R mostra che la resistenza all’imatinib in queste cellule è associata all’amplificazione del gene BCR/ABL1 e alla sovraespressione di Bcr/Abl. Inoltre, l’analisi dei livelli proteici intracellulari di CK2 evidenzia, inaspettatamente, un’espressione della chinasi di circa due volte maggiore nelle cellule resistenti all’imatinib rispetto a quelle sensibili. Entrambe le subunità CK2 e CK2, ma non CK2’, sono sovraespresse.
L’attività dell’oloenzima CK2 è stata saggiata sul substrato -caseina o sul peptide specifico sintetico R3AD2SD5, mentre quella di CK2 monomerica è stata rilevata mediante un in-gel kinase assay. Coerentemente con il livello proteico di CK2, l’attività sia dell’oloenzima che di CK2 monomerica è maggiore nelle cellule LAMA84-R rispetto alle cellule LAMA84-S.
L’immunoprecipitazione di Bcr/Abl da lisati cellulari di cellule LAMA84-S/R mostra che CK2 immunoprecipita con Bcr/abl solo nelle cellule resistenti all’imatinib. Questo dato è supportato anche dalla presenza di Bcr/Abl negli immunoprecipitati di CK2 ottenuti dai medesimi lisati e analizzati mediante western blot e spettrometria di massa.
Dato che la relazione fra CK2e Bcr/Abl suggerisce una potenziale fosforilazione di CK2 da parte della tirosin-chinasi, si è realizzata un’immunoprecipitazione con l’anticorpo anti-fosfo-tirosina (p-Tyr) da lisati di cellule LAMA84-S/R e l’analisi tramite western blot degli immunoprecipitati rileva la presenza di CK2 solo nei campioni delle LAMA84-R. La Tyr-fosforilazione di CK2aumenta se le cellule sono trattate con l’inibitore delle tirosin-fosfatasi, pervanadato.
Per provare se la Tyr-fosforilazione di CK2 è mediata dall’autofosforilazione di CK2, come descritto altrove, o è catalizzata da Bcr/Abl, le cellule LAMA84-R sono state trattate per 24 h con inibitori specifici per CK2 o Bcr/Abl. CK2è stata immunoprecipitata dalle cellule trattate ed è stata analizzato il suo stato di Tyr-fosforilazione mediante western blot. Mentre il CX-4945, un inibitore selettivo per CK2, ora in fase I degli studi clinici su pazienti con tumori solidi, non ha effetto sulla p-Tyr-CK2l’imatinib riduce la Tyr-fosforilazione di CK2, suggerendo che Bcr/Abl è maggiormente coinvolto nella fosforilazione tirosinica di CK2nelle cellule LAMA84-R.
Per esaminare il potenziale effetto di CK2 e Bcr/Abl nell’interazione delle due chinasi, le cellule LAMA84-R sono state trattate con il CX-4945, l’imatinib, l’inibitore allosterico di Abl GNF-2, e il potente inibitore chinasico non-specifico staurosporina. Solo il trattamento con l’inibitore di CK2, CX-4945, riduce l’interazione fra le due chinasi.
Per sottolineare il ruolo di CK2 durante la proliferazione cellulare, le cellule LAMA84-S/R sono state trattate per 48 h con differenti concentrazioni di CX-4945 e la vitalità cellulare di entrambe le cellule LAMA84-S e LAMA84-R è stata misurata mediante il saggio MTT. I dati suggeriscono che la viabilità di entrambe le linee cellulari decresce all’aumentare della concentrazione del CX-4945, con un maggior effetto dell’inibitore nelle cellule LAMA84-R. Esperimenti effettuati mediante la combinazione di CX-4945 e imatinib, dimostrano che mentre la vitalità delle cellule LAMA84-S trattate con l’imatinib da solo o in combinazione con il CX-4945 è ridotta in modo simile, l’inibizione dell’attività di CK2 da parte del CX-4945 sensibilizza le cellule LAMA84-R a basse concentrazioni di imatinib.
Infine, la possibile interazione fra CK2 e altre proteine è stata analizzata nelle cellule resistenti all’imatinib. A questo proposito, CK2 è stata immunoprecipitata da lisati di cellule LAMA84-R e la sua attività CK2 negli immunocomplessi è stata valutata mediante un saggio chinasico in presenza di [33P]ATP. L’analisi mediante SDS/PAGE dei campioni reattivi evidenzia una banda, di circa 35-38 kDa, 33P-fosforilata in modo comparabile alla banda corrispondente alla subunità CK2 autofosforilata. L’analisi di spettrometria di massa ha dimostrato che la banda corrisponde alla subunità j del fattore eucariotico 3 d’inizio della traduzione (eIF3j) e il sito di fosforilazione è stato identificato nella Ser127 (Q-E-E-S-D-L-E).
L’analisi di spettrometria di massa degli immunoprecipitati di CK2 ha messo in evidenza la presenza di altre subunità di eIF3: b, f, l, g, h, k. Gli immunoprecipitati di eIF3b ottenuti da lisati di cellule LAMA84-R contengono sia CK2cheCK2 e la fosforilazione in vitro degli immunoprecipitati di eIF3b in presenza di [33P]ATP ha dimostrato che anche eIF3b è un substrato di CK2
Synthesis and Evaluation of Platelet Aggregation Inhibitory Activity of Some 3-Phenyl-pyrroloquinazolinones
No full textA series of 3-phenyl-2H-pyrrolo[3,2-f]quinazolin-1-one derivatives (3-PPyQZ) was synthesized starting from 5-amino-indoles, via condensation with N-ethoxycarbonylthiobezamides followed by thermal cyclisation. On the basis of their structural analogy with reported anti-thrombin pyrroloquinazolines, the derivatives were first tested for their capacity to inhibit platelet aggregation. Some of them had in vitro inhibitory effects on collagen and thrombin-induced aggregation in the micromolar range, and much higher inhibition than that shown by new phenyl-pyrroloquinolinones. Experiments to determine the mechanism of action of the most potent inhibitor (compound 18) indicated that it acts in at least two sites: one preceding the agonist-induced increase of cytosolic [Ca2+], and one following this step of the platelet activation cascade. The compound also inhibited thrombin-evoked protein-Tyr-phosphorylation. Although it is premature to draw definitive conclusions, the present results indicate that 3-PPyQZ structure, with the quite potent inhibitor of platelet aggregation compound 18, might constitute a starting point for the synthesis of potential anti-thrombosis agents
Role of CK2 inhibitor CX-4945 in anti-cancer combination therapy - potential clinical relevance
Full text linkProtein kinase CK2 inhibition has long been considered as an attractive anti-cancer strategy based on the following considerations: CK2 is a pro-survival kinase, it is frequently over-expressed in human tumours and its over-expression correlates with a worse prognosis. Preclinical evidence strongly supports the feasibility of this target and, although dozens of CK2 inhibitors have been described in the literature so far, CX-4945 (silmitasertib) was the first that entered into clinical trials for the treatment of both human haematological and solid tumours. However, kinase inhibitor monotherapies turned out to be effective only in a limited number of malignancies, probably due to the multifaceted causes that underlie them, supporting the emerging view that multi-targeted approaches to treat human tumours could be more effective
HOW PROTEIN KINASE CK2 IS INVOLVED IN IMATINIB-RESISTANT CHRONIC MYELOID LEUKEMIA CELLS?
No full textTransport of serotonin into human platelets is regulated by tyrosinephosphorylation of SERT and its interaction with integrin-alphaII/beta3
No full text
Going Beyond Counting First Authors in Author Co-citation Analysis
Full text linkThe present study examines one of the fundamental aspects of author co-citation analysis (ACA) - the way co-citation
counts are defined. Co-citation counting provides the data on which all subsequent statistical analyses and mappings
are based, and we compare ACA results based on two different types of co-citation counting - the traditional type that
only counts the first one among a cited work's authors on the one hand and a non-traditional type that takes into
account the first 5 authors of a cited work on the other hand. Results indicate that the picture produced through this non-traditional author co-citation counting contains more coherent author groups and is therefore considerably clearer. However, this picture represents fewer specialties in the research field being studied than that produced through the traditional first-author co-citation counting when the same number of top-ranked authors is selected and analyzed. Reasons for these effects are discussed
KDM2A and KDM3B as Potential Targets for the Rescue of F508del-CFTR
Full text linkCystic fibrosis (CF) is caused by mutations in the gene encoding of the cystic fibrosis transmembrane conductance regulator (CFTR), an anion-selective plasma membrane channel that mainly regulates chloride transport in a variety of epithelia. More than 2000 mutations, most of which presumed to be disease-relevant, have been identified in the CFTR gene. The single CFTR mutation F508del (deletion of phenylalanine in position 508) is present in about 90% of global CF patients in at least one allele. F508del is responsible for the defective folding and processing of CFTR, failing to traffic to the plasma membrane and undergoing premature degradation via the ubiquitin-proteasome system. CFTR is subjected to different post-translational modifications (PTMs), and the possibility to modulate these PTMs has been suggested as a potential therapeutic strategy for the functional recovery of the disease-associated mutants. Recently, the PTM mapping of CFTR has identified some lysine residues that may undergo methylation or ubiquitination, suggesting a competition between these two PTMs. Our work hypothesis moves from the idea that favors methylation over ubiquitination, e.g., inhibiting demethylation could be a successful strategy for preventing the premature degradation of unstable CFTR mutants. Here, by using a siRNA library against all the human demethylases, we identified the enzymes whose downregulation increases F508del-CFTR stability and channel function. Our results show that KDM2A and KDM3B downregulation increases the stability of F508del-CFTR and boosts the functional rescue of the channel induced by CFTR correctors
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