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Amphiphil oligonucleotides and microRNAs : implementation of nanoplatforms for diagnostic and therapeutic application
No full textDe nombreuses études ont montré l'intérêt thérapeutique de molécules dérivant des microARN (inhibiteurs ou analogues) en cancérologie. Cependant avant d'espérer en faire de futurs médicaments, il est indispensable d'élaborer des systèmes permettant leur délivrance préférentielle dans les cellules cancéreuses. Dans ce travail, nous avons développé deux plateformes innovantes basées sur les microARN : la première utilise les propriétés optiques des quantum dots (QD) et est destinée à l'imagerie des microARN ; la seconde repose sur la sérum albumine humaine (SAH) et a une finalité de délivrance ciblée de microARN. La mise en place de ces plateformes a nécessité la synthèse d'une petite chimiothèque de bioconjugués lipidiques dérivés des microARN (inhibiteurs ou analogues), le but étant d'exploiter l'effet hydrophobe pour les fixer à la surface des QD (ancrage hydrophobe dans la paroi lipidique des QD) et de la SAH (interaction avec les sites de liaison aux acides gras). Dans les deux cas, différentes études incluant des caractérisations physico-chimiques (MET, DLS), des expériences in vitro (SPR) et in cellulo (microscopie de fluorescence, criblage fonctionnel, RTqPCR) ont montré la potentialité de ces nouvelles plateformes.Exploitation of gene-silencing is a very promising strategy in human therapeutics. Several engineered small non coding RNAs (inhibitors or mimics) are already in preclinical and clinical trials. However a key impediment to the wider success of these approaches remains the specific delivery of RNA-derived molecules into cancerous cells. This work aimed at developing two innovative microRNA-based plateforms : the first one relying on quantum dots (QD) is dedicated to microRNA imaging and the second one based on human serum albumin (HSA) represents a new targeted delivery system. The implementation of both plateforms required the synthesis of a small library of microRNA derived lipidic bioconjugates (inhibitors or mimics), the aim being to exploit the hydrophobic effect for their loading on QD (hydrophobic anchoring in the hydrophobic QD surface) and on HSA (interaction with fatty acid binding sites). In both cases, different studies including physico-chemical caracterizations (TEM, DLS), in vitro (SPR) and in cellulo experiments (fluorescence microscopy, functional screening, RTqPCR) demonstrated the great promises held by these new plateforms
Oligonucléotides amphiphiles et microARNs (mise en place de nanoplateformes à visée diagnostiques et therapeutiques)
Full text linkDe nombreuses études ont montré l'intérêt thérapeutique de molécules dérivant des microARN (inhibiteurs ou analogues) en cancérologie. Cependant avant d'espérer en faire de futurs médicaments, il est indispensable d'élaborer des systèmes permettant leur délivrance préférentielle dans les cellules cancéreuses. Dans ce travail, nous avons développé deux plateformes innovantes basées sur les microARN : la première utilise les propriétés optiques des quantum dots (QD) et est destinée à l'imagerie des microARN ; la seconde repose sur la sérum albumine humaine (SAH) et a une finalité de délivrance ciblée de microARN. La mise en place de ces plateformes a nécessité la synthèse d'une petite chimiothèque de bioconjugués lipidiques dérivés des microARN (inhibiteurs ou analogues), le but étant d'exploiter l'effet hydrophobe pour les fixer à la surface des QD (ancrage hydrophobe dans la paroi lipidique des QD) et de la SAH (interaction avec les sites de liaison aux acides gras). Dans les deux cas, différentes études incluant des caractérisations physico-chimiques (MET, DLS), des expériences in vitro (SPR) et in cellulo (microscopie de fluorescence, criblage fonctionnel, RTqPCR) ont montré la potentialité de ces nouvelles plateformes.Exploitation of gene-silencing is a very promising strategy in human therapeutics. Several engineered small non coding RNAs (inhibitors or mimics) are already in preclinical and clinical trials. However a key impediment to the wider success of these approaches remains the specific delivery of RNA-derived molecules into cancerous cells. This work aimed at developing two innovative microRNA-based plateforms : the first one relying on quantum dots (QD) is dedicated to microRNA imaging and the second one based on human serum albumin (HSA) represents a new targeted delivery system. The implementation of both plateforms required the synthesis of a small library of microRNA derived lipidic bioconjugates (inhibitors or mimics), the aim being to exploit the hydrophobic effect for their loading on QD (hydrophobic anchoring in the hydrophobic QD surface) and on HSA (interaction with fatty acid binding sites). In both cases, different studies including physico-chemical caracterizations (TEM, DLS), in vitro (SPR) and in cellulo experiments (fluorescence microscopy, functional screening, RTqPCR) demonstrated the great promises held by these new plateforms.BORDEAUX2-Bib. électronique (335229905) / SudocSudocFranceF
Bimodal probe PET/OI : application in cancerology
No full textLa nécessité de détecter de manière encore plus efficace et surtout plus spécifique les tumeurs ou d’autres maladies a fait évoluer les techniques d’imagerie médicale vers la bimodalité, voire la multimodalité. Durant ces dernières années, de nombreuses recherches ont été menées dans le but de concevoir des agents de contraste hybrides. La Tomographie par Emission de Positon (TEP) est une méthode sensible qui permet l’identification et la localisation d’une tumeur ainsi qu’un suivi thérapeutique. L’imagerie optique (via la fluorescence) permet de guider le chirurgien pendant la tumorectomie. Une sonde portant ces deux types d’imagerie pourrait rendre possible la prise en charge complète d’un patient, du diagnostic d’un cancer à son traitement par chirurgie, puis son suivi post opératoire. Ce projet consiste donc à développer une sonde bimodale TEP/IO basée sur la fonctionnalisation d’un cyclotrivératrilène (CTV) utilisé comme plateforme. En effet, le CTV présente une forme de bol avec trois « bras » fonctionnalisables. Il a ainsi été envisagé d’introduire sur ces « bras » un cRGD, permettant la reconnaissance spécifique des intégrines αvβ3, un arylsilane permettant d’introduire en dernière étape de synthèse un 18F nécessaire à la TEP, ainsi qu’un fluorophore (en premier lieu un benzothiadiazole - BTD). La synthèse de ces différentes molécules ainsi que leur couplage sur la plateforme conduisant à la première sonde bimodale désirée sont présentés. Les propriétés de fluorescence de certains intermédiaires et de la molécule finale sont évaluées. Des analyses biologiques préliminaires, comme la cytotoxicité, la radiance et la fluorescence in vitro ainsi que la fluoration à froid et la radiosynthèse sont exposées. Dans une seconde partie, des voies d’amélioration de cette première sonde sont explorées, notamment pour optimiser les propriétés de fluorescence. Un BODIPY est alors utilisé pour remplacer le BTD permettant d’envisager l’obtention d’une sonde de deuxième génération prometteuse pour des applications in vivo.Medical imaging is spreading more and more into a bimodal system. Considerable research has been conducted in this field of hybrid contrast agents over the last years. Therefore, Positron-Emission Tomography (PET), a sensitive method, can allow the identification and localization of a tumor and the therapy monitoring, while fluorescence can help during surgery. A probe with these two kinds of medical imaging would make possible the entire patient support, from the diagnosis of the cancer to the treatment by surgery and the therapy monitoring. This project consists in the development of a bimodal probe PET/OI, based on the functionalization of a cyclotriveratrylene (CTV) used as a template. This macromolecule presents a bowl shape with three “arms”. These three parts are functionalized with a cRDG, a peptide able to recognize the activity of αvβ3 integrins, an arylsilane, allowing the introduction of a 18F during the last step of the synthesis for PET imaging and a fluorophore (as first intention, a benzothiadiazole - BTD). The synthesis of the different synthons as well as the coupling with the platform by “click” chemistry reactions leading to the obtention of the first desired bimodal probe are presented in this manuscript. The fluorescence of some intermediate products and of the final molecule is measured. Some preliminary biological analyses are conducted, like cytotoxicity test, the radiance, and the in vitro fluorescence as well as the cold fluorination and radiosynthesis of the probe. The second part of this thesis describes some ways of improvement for the probe, notably concerning the fluorescence properties. The synthesis of other fluorophores is presented and the coupling with the one that has presented the most favorable properties (a BODIPY) is described allowing to consider the obtention of a very promising second-generation probe for in vivo applications
Amphiphil oligonucleotides and microRNAs : implementation of nanoplatforms for diagnostic and therapeutic application
No full textDe nombreuses études ont montré l'intérêt thérapeutique de molécules dérivant des microARN (inhibiteurs ou analogues) en cancérologie. Cependant avant d'espérer en faire de futurs médicaments, il est indispensable d'élaborer des systèmes permettant leur délivrance préférentielle dans les cellules cancéreuses. Dans ce travail, nous avons développé deux plateformes innovantes basées sur les microARN : la première utilise les propriétés optiques des quantum dots (QD) et est destinée à l'imagerie des microARN ; la seconde repose sur la sérum albumine humaine (SAH) et a une finalité de délivrance ciblée de microARN. La mise en place de ces plateformes a nécessité la synthèse d'une petite chimiothèque de bioconjugués lipidiques dérivés des microARN (inhibiteurs ou analogues), le but étant d'exploiter l'effet hydrophobe pour les fixer à la surface des QD (ancrage hydrophobe dans la paroi lipidique des QD) et de la SAH (interaction avec les sites de liaison aux acides gras). Dans les deux cas, différentes études incluant des caractérisations physico-chimiques (MET, DLS), des expériences in vitro (SPR) et in cellulo (microscopie de fluorescence, criblage fonctionnel, RTqPCR) ont montré la potentialité de ces nouvelles plateformes.Exploitation of gene-silencing is a very promising strategy in human therapeutics. Several engineered small non coding RNAs (inhibitors or mimics) are already in preclinical and clinical trials. However a key impediment to the wider success of these approaches remains the specific delivery of RNA-derived molecules into cancerous cells. This work aimed at developing two innovative microRNA-based plateforms : the first one relying on quantum dots (QD) is dedicated to microRNA imaging and the second one based on human serum albumin (HSA) represents a new targeted delivery system. The implementation of both plateforms required the synthesis of a small library of microRNA derived lipidic bioconjugates (inhibitors or mimics), the aim being to exploit the hydrophobic effect for their loading on QD (hydrophobic anchoring in the hydrophobic QD surface) and on HSA (interaction with fatty acid binding sites). In both cases, different studies including physico-chemical caracterizations (TEM, DLS), in vitro (SPR) and in cellulo experiments (fluorescence microscopy, functional screening, RTqPCR) demonstrated the great promises held by these new plateforms
Protein Surface Recognition with Urea-based foldamers : application to the design of ligands targeting histone chaperone proteins
No full textAvec 8,8 millions de décès dénombrés en 2015, le cancer est l’une des plus grandes causes de mortalité dans le monde. De nouvelles stratégies thérapeutiques ont émergé et l’identification de nouvelles cibles biologiques comme notamment la protéine Asf1, un chaperon d’histone H3-H4 surexprimée dans les cellules cancéreuses et en particulier le cancer du sein. Cette protéine possède différentes fonctions dans la cellule et agit à plusieurs endroits par des interactions protéine-protéines. Au cours de cette thèse de doctorat, nous avons développé une stratégie originale de design d’inhibiteurs d’interactions protéine-protéine avec des foldamères peptidomimes à base d’urées. Ces foldamères ont 1) la capacité de se replier en hélice 2,5, rappelant les hélices α des peptides et 2) d’être hautement tolérés et initiateurs d’hélicité lorsqu’ils sont conjugués à des fragments peptidiques. Nous avons développé des oligomères mixtes comprenant une alternance de segment(s) peptidique(s) et multi-urée, appelées chimères, ayant l’avantage de combiner la reconnaissance naturelle de peptides et la forte propension des oligourées à former des hélices stables. Après une étude structurale montrant qu’avec l’insertion d’un court segment à base d’urées dans un peptide hydrosoluble adoptant une conformation en hélice la conformation hélicoïdale pour une majorité des chimères est conservée, des composés mimant la partie hélicoïdale C-terminale de l’histone H3 ont été élaborés. Une interaction de l’ordre du micromolaire avec Asf1 a été observée en solution puis validée à l’état solide par cristallographie aux rayons X. En vue d’optimiser la reconnaissance de ces chimères avec la surface d’Asf1 et leur sélectivité, un panel de modifications a été réalisée (i.e. séquence primaire, longueur du segment urée). Nous avons ainsi conçu des chimères α/urée possédant des affinités de liaison pour Asf1 comprises entre le nano- et micromolaire. Le composé le plus prometteur a été internalisé avec succès dans des cellules cancéreuses après conjugaison bioreductible avec un peptide vecteur et pourrait conduire à la mort cellulaire de la lignée tumorale étudiée.In 2015, 8.8 million of death were due to cancer making it an important cause of death in the world. The necessity to develop new anticancer treatments led to the search and discovery of new biological targets, such as Asf1, a histone chaperone protein of H3-H4 which is overexpressed in cancer cells, in particular in breast cancer. This protein plays a role in different biological processes in cells through protein-protein interactions (PPIs). During this thesis, we developed an original strategy to design inhibitors of PPIs with urea-based peptidomimetics. These foldamers are able to fold into stable 2.5-helix reminiscent to the natural α-helix. Designed urea-based foldamers have been synthesized as hybrid oligomers consisting of α-peptide and oligourea segments. With a combination of the two backbones, these compounds named “chimeras” presents advantages of both species with the natural recognition of α-peptides and the innate helical stability of oligourea. First, a model study was performed to evaluate the impact of the introduction of short urea segments into a long water-soluble peptide. Circular dichroism experiments confirmed that the helical conformation was conserved. New series of compounds that mimic a helical part of H3 were synthesized and their interaction with Asf1 was studied in solution and in solid state using a range of biophysical methods. Several modifications into the sequence were performed (side chain substitution, size of the urea segment or compound) in order to improve the recognition of Asf1 surface as well as their selectivity. We conceived oligourea-peptide chimeras with affinity for Asf1 in the micromolar range. Our best compound linked to a cell penetrating peptide was shown to enter into cells and to induce cell death
Pharmaceutical formulation and characterization of innovative lipidic nanosystems for the treatment of cutaneous and/or ocular poisoning by a vesicant agent
No full textL’ypérite est un agent vésicant provoquant de graves lésions cutanées et oculaires qui représente toujours aujourd'hui une menace terroriste. Plus de 100 ans après sa première utilisation, aucun antidote n’a encore été découvert. Dans ce contexte, le projet NEOMAY propose la conception d’une formulation galénique innovante de nanoémulsion multiple H/L/H véhicule de principes actifs dont la phase huileuse interne et la phase aqueuse externe ont été gélifiées constituant un nanosystème de type "nano(émul)bigel". Le nanosystème a été conçu pour permettre l'incorporation simultanée de principes actifs hydrophiles et lipophile constituant ainsi un véhicule de principes actif tout-en-un. Le caractère innovant de ce nanosystème lipidique réside dans la double gélification et notamment la gélification de la phase huileuse grâce à un nucléolipide oléogélifiant issu d'une synthèse originale. Aucun oléogel de ce type n'a été décrit dans la littérature. Le développement et l'incorporation d'un tel composé comme excipient dans une formulation de type nanoémulsion représentait donc un défi. La caractérisation des propriétés gélifiantes et l’étude rhéologique de ce composé ont permis de déterminer les concentrations optimales pour pouvoir l’intégrer dans des formulations de nanoémulsions simples de type L/H nanoémulgels puis dans des systèmes multiples H/L/H pour former le "nano(émul)bigel". L'absence de toxicité cellulaire a été démontrée in vitro sur des kératinocytes immortalisés. Le process optimisé d’obtention des systèmes multiples a reposé sur le développement d’un procédé d’émulsification haute énergie avec une gélification séquentielle des différentes phases. Pour la gélification de la phase aqueuse externe, le choix s'est orienté sur un hydrogélifiant connu, le Poloxamère 407. Différentes méthodes de caractérisation de ces systèmes ont été explorées. Enfin la recherche d'effets thérapeutiques de ces nanosystèmes lipidiques gélifiés et chargés en principes actifs a été réalisée in vivo sur un modèle murin original de brûlure cutanée à l’ypérite spécialement développé par l'IRBA. Les premiers résultats semblent montrer amélioration tardive de la cicatrisation.Mustard gas is a blistering agent that causes severe skin and eye damage and is still a terrorist threat today. More than 100 years after its first use, no antidote has yet been discovered. In this context, the NEOMAY project proposes the design of an innovative galenic formulation of a multiple W/O/W nanoemulsion as a vehicle for active ingredients, in which the internal oil phase and the external water phase have been gelled to form a "nano(emul)bigel". The nanosystem was designed to allow simultaneous incorporation of hydrophilic and lipophilic active ingredients, thus constituting an all-in-one vehicle. The innovative character of this lipidic nanosystem lies in the double gelation and in particular the gelation of the oily phase thanks to an oleogelator nucleolipid resulting from an original synthesis. Such an oleogel has not been described in the literature to date. The development and incorporation of such a compound as an excipient in a nanoemulsion formulation was therefore a challenge. Characterization of gelling properties and rheological study of this compound made it possible to determine the optimal concentrations to integrate it into simple nanoemulsion formulations of the O/W nanoemulgel and subsequently into multiple W/O/W systems to form a "nano(emul)bigel". The absence of cellular toxicity was demonstrated in vitro on immortalized keratinocytes. The development of a high energy emulsification process with sequential gelling of the different phases has led to an optimized process for obtaining multiple systems. The well-known hydrogelator, Poloxamer 407, allowed the external aqueous phase gelation. Different methods were explored to fully characterize these systems. Finally, in vivo investigations on an original model of mice burned by mustard, specially developed by IRBA, have been carried out to evaluate the therapeutic effects of these gelled lipid nanosystems loaded with active ingredients. The first results seem to show a delayed improvement in healing
Development of flavins-based radical nanobombs : from synthesis to photo-sensibilisation
No full textLa Riboflavine (RF) est une vitamine essentielle aux réactions biochimiques cellulaires. La présence du cycle isoalloxazine dans leurs structures confère aux flavines des propriétés rédox, photosensibilisatrices et des propriétés d’émission de fluorescence qui peuvent être exploitées en ingénierie tissulaire et en thérapie anticancéreuse. En effet, les transporteurs à la RF sont surexprimés au niveau des cancers de la prostate, du sein ou encore au niveau de cellules endothéliales angiogéniques. L’irradiation avec une lumière bleue de faible énergie induit le passage de la RF, de son état fondamental vers un état excité permettant la production de radicaux libres.Notre équipe souhaite exploiter les propriétés physicochimiques et de ciblage des flavines. Nous nous sommes concentrés sur le développement de vésicules à base de flavines conjuguées à des phopholipides, dans le cadre d’applications biomédicales. Par le passé, notre équipe a montré que la RF conjuguée à des phospholipides formait des auto-assemblages de morphologie multi-lamellaires, inhibant ainsi ses capacités d’émission de fluorescence et de production radicalaire.L’objectif de l’étude actuelle a été de développer des vésicules aux propriétés radicalaires augmentées. L’ajout d’un groupement encombrant tert-butyle sur le cycle isoalloxazine a induit la formation de nano-objets vésiculaires (de diamètre hydrodynamique de 60nm) qui restent stables 12 jours et sont capables d’encapsuler une sonde fluorescente. De plus, ces liposomes retrouvent une activité radicalaire, à la différence des auto-assemblages de RfdiC14 permettent de valider le concept de nano-bombes radicalaires.Dans le but d’accroître l’activité radicalaire des flavines, des halogènes ont été introduits sur les positions 7 et/ou 8 du cycle isoalloxazine. Cette étude systématique a montré qu’effectivement ces atomes lourds induisaient une augmentation du pouvoir radicalaire jusqu’à 6 fois. En additionnant l’hypothèse de l’encombrement stérique et de l’augmentation du pouvoir radicalaire par un halogène, un composé final a été synthétisé. Cette flavine comportant à la fois un tolyle, et un atome de brome. La formulation et la caractérisation de ces phospholipides sont actuellement étudiées dans notre laboratoire.Riboflavin (RF) is an essential vitamin which participates in fundamental physiological events. The presence of isoalloxazine ring in its structure induces redox, photosensitizing and fluorescence properties that can be exploited in tissue engineering and cancer therapies. Irradiation with low energy blue light excites RF to a high energetic state that can ultimately generate reactive oxygen species (ROS) efficient for tissue repair or for tumor destruction. Moreover, the upregulation of RF transporters in cancer cells offers RF targeting abilities.The goal of our current work is to develop nanodevices for cancer therapies using RF derivatives. It consists in synthesizing flavin analogs conjugated to phospholipid should be able to generate spheric self-assemblies after formulation steps. The expected liposomes enriched in flavines were named flavisomes.As a first step, flavin analogs with a bulky tert-butyl group were designed to favour liposome-like structures rather than lamellar morphologies observed with RF derived phospholipids. The synthesis and formulation, of this phospholipid allowed the preparation of flavisomes (hydrodynamic diameter: 60nm) stable during 12 days and able to encapsulate a fluorescent dye. In addition, its irradiation led to the production of ROS affording “free radical nano-bombs” with promising applications in cancer therapy.As a second step, in order to increase the free radical activity of flavins, halides have been introduced on the isoalloxazine ring in position 7 and/or 8 . This systematic study have shown that halides in these positions enhance up to 6 times free radical production. At last, a derivative including both a steric hindrant group (tolyl) and a heavy halide atome (bromine) was designed and synthesized. Formulation and physico-chemical characterization are currently underway. Results should propose innovating liposome-like flavisomes with boosted radical production
Engineering biologically active peptides using foldamers
No full textLes structures hélicoïdales, outre leur rôle structural dans les protéines, sont aussi présentes aux interfaces participant directement aux interactions avec des protéines partenaires et contribuant ainsi à de nombreux processus biologiques. L'utilisation de courts segments peptidiques hélicoïdaux pour moduler ou perturber ces interactions, lorsqu'elles sont associées à des maladies humaines, représente un réel intérêt pharmacologique. Toutefois, des segments peptidiques isolés ne permettent pas toujours de conserver une structure secondaire bien définie et présentent souvent une susceptibilité accrue à la dégradation par les enzymes circulantes. Par ailleurs, et à quelques exceptions près, les peptides non formulés ou sans modification dans leur structure affichent généralement une faible perméabilité membranaire, ce qui limite encore leur utilisation. La découverte que des hélices peptidiques stabilisées chimiquement peuvent surmonter certains, sinon tous ces obstacles, est à l’origine d'avancées récentes notables pour le développement thérapeutique des peptides. Dans ce contexte, la technologie des Foldamères suscite un intérêt grandissant pour mimer et stabiliser des hélices peptidiques. L’objectif principal de ce projet de thèse qui est dirigé par Gilles Guichard (CBMN, UMR 5248) et Sébastien Goudreau (CEO d’UREkA) est d’identifier les principes généraux pouvant guider l’optimisation basée sur la structure de foldamères oligourées ciblant des surfaces de protéines. Cet objectif pourra être atteint en combinant des études de relation structure-activité et la détermination de structures à résolution atomique de complexes entre les cibles protéiques sélectionnés pour leur intérêt thérapeutique et les ligands foldamères étudiés. Il s’agira également d’étudier de nouvelles approches chimiques comme la macrocyclisation pour stabiliser les conformations hélicoïdales de ces foldamères à base d’urée, et d’évaluer l’impact de ces différentes modifications sur les propriétés de résistance à la protéolyse et de pénétration cellulaire des composés étudiés.Helical structures, in addition to their structural role in proteins, are also present at interfaces that directly participate in interactions with partner proteins and thus contribute to many biological processes. The use of short helical peptide segments to modulate or disrupt these interactions, when associated with human diseases, represents a real pharmacological interest. However, isolated peptide segments do not always maintain a well-defined secondary structure and often have increased susceptibility to degradation by circulating enzymes. Moreover, and with a few exceptions, unformulated or structurally undefined peptides generally exhibit low membrane permeability, further limiting their use. The discovery that chemically stabilized peptide helices can overcome some, if not all, of these obstacl es is at the origin of significant recent advances in the therapeutic development of peptides. In this context, the foldamer technology has gained increased interest to mimic and stabilize peptide helices. The main objective of this thesis project, which was supervised by Gilles Guichard (CBMN, UMR 5248) and Sébastien Goudreau (CEO of UREkA), is to identify the general principles that can guide the optimization based on the structure of oligourea foldamers targeting protein surfaces. This objective can be achieved by combining structure-activity relationship studies and determination at atomic resolution of structures of complexes between protein targets selected for their therapeutic interest and the foldamer ligands studied. New chemical approaches such as macrocylization to stabilize the helical conformations of these urea-based foldamers have also been considered to further enhance their resistance to proteolysis and increase their ability to enter in cel
Chemical modifications of aptamers, for biomedical imagery applications
No full textL’objectif de ma thèse a été de développer de nouvelles sondes utilisables en imagerie biomédicale, basées sur l’utilisation d’aptamères, pour la détection de deux types de tumeurs : les glioblastomes et les mélanomes. Les traceurs développés ont pour objectif de cibler la protéine matricielle hMMP-9. Lors d’une thèse précédente, un aptamère anti hMMP-9 noté F3B a été obtenu. Afin de transformer cet aptamère en une sonde pour l’imagerie biomédicale, différents conjugués F3B ont été préparés: Cy5, DOTA ou MAG3. L’affinité des nouveaux conjugués pour l’hMMP-9 a été évaluée par SPR et sur coupes de tumeurs. Des études de biodistribution des conjugués F3B-DOTA et F3B-MAG3 ont été réalisées sur des souris portant le mélanome, les résultats ont montré que les deux aptamères marqués détectent spécifiquement l’hMMP-9. De plus, la détection de la protéine hMMP-9 par le conjugué F3B-CY5 a été confirmée par imagerie de fluorescence. Afin d’améliorer la sensibilité de détection des tumeurs, deux types de modifications ont été envisagées, développer des structures multimériques de F3B et élaborer d’un système bi-fonctionnel. Pour ces deux approches, nous avons synthétisé un dendrimère à point focal, pouvant donner accès à une imagerie multi-modale. Ce dendrimère porte deux ou trois bras espaceur porteurs d’un groupement azoture utilisé pour le couplage avec les aptamères par la chimie «click». Le dendrimère porte au point focal une fonction amine NH2 utilisée pour fixer une biotine, afin de déterminer l'affinité Kd de cette nouvelle sonde par SPR. Par la suite un ligand DOTA sera fixé afin de pouvoir visualiser ce traceur en TEMP.The aim of my thesis was to develop new probes that can be used in biomedical imaging, based on the use of aptamers for the detection of two types of tumors: glioblastomas and melanomas. Tracers have been developed with the aim to target the matrix protein hMMP-9. In a thesis, an aptamer anti-hMMP-9 noted F3B was obtained. Based on this compound, different derivatives were prepared for using in biomedical imaging: F3B-Cy5, F3B-DOTA or F3B-MAG3. The affinity of the new conjugates for hMMP-9 was evaluated by SPR and on sections of human melanomas. Biodistribution studies of F3B-DOTA conjugates and F3B-MAG3 were performed at on melanoma bearing mice, the results showed that both radiolabeled aptamers specifically detected the hMMP-9. In addition, optical fluorescence imaging confirmed the binding to hMMP-9 by F3B-CY5. In order to improve tumor detection sensitivity, two types of modifications were investigated: developing of F3B multimeric structures and a bi-functional system. For both these approaches, we synthesized a dendrimer with a focal point, which could give access to a multi-modal imaging. This dendrimer has two or three spacers bearing an azide group used for coupling with aptamers by "click" chemistry. The dendrimer carrying at the focal point an amine function NH2 used for fixing biotin in order to determine the affinity Kd of this new probe by using SPR. A DOTA ligand will be fixed later in order to view this tracer in SPECT
Riboflavin-based amphiphiles for tumour-targeted nanosystems
No full textLa riboflavine (RF) est une vitamine essentielle pour la croissance et le développement cellulaire. Elle possède des propriétés physico-chimiques intéressantes et est internalisée dans les cellules par des transporteurs spécifiques. Le premier objectif de ce projet était de synthétiser des dérivés amphiphiles de la RF (RFA) et d'étudier leurs capacités d'auto-assemblages. Le second objectif était d'insérer les RFA dans des liposomes et d'évaluer leur efficacité de ciblage tumoral in vitro et in vivo. La préparation des différents RFA repose sur l'ajout d'un lipide en différentes positions de la RF. L’un d'eux, de type phospholipide (RfdiC14) a été capable de former des objets tridimensionnels de taille μm constitués de lamelles multicouches dont l’architecture et la dynamique sont très différentes de celles des phospholipides classiques. L’insertion de RfdiC14 dans des liposomes est efficace et n’influence pas leurs propriétés physico-chimiques. Les liposomes fonctionnalisés ont montré une internalisation cellulaire spécifique dans les lignées A431, PC3 et HUVECs. Afin de tester l’efficacité du ciblage tumoral in vivo, un analogue de RfdiC14 portant un espaceur PEG a été préparé puis inséré dans des liposomes péguylés. Grâce à un marquage adéquat (ICG et DiR), leur accumulation tumorale a été suivie par imagerie photoacoustique dans un modèle A431 et leur biodistribution évaluée par imagerie μCT/FMT dans un modèle PC3. Les résultats montrent une légère amélioration de l’accumulation tumorale dans les xénogreffes A431 et une augmentation du ciblage vasculaire dans le modèle tumoral PC3. La biodistribution globale des liposomes marqués est comparable à celle des contrôles.Riboflavin (RF) is an essential vitamin for cell growth and development. It possesses interesting physicochemical properties and is internalized by the cells through specific transporters. The first aim of this study was to prepare amphiphile derivatives of RF (RFA) and study their auto-assembly. The second aim was to insert RFA into established drug delivery systems and test their tumour-targeting potential in vitro and in vivo. RFA were prepared by the molecule functionalization with lipid moieties in different positions. One of them, a phospholipid-like derivative (RfdiC14) was able to self-assembly in aqueous solutions into μm-sized 3D objects constituted from slightly curved multilayer lamellas. The bilayer architecture and dynamics were very different from ordinary phospholipids. In contrast, the insertion of small amount of RfdiC14 in a liposome did not influence membrane dynamics and physicochemical characteristics. RfdiC14-functionalised liposomes displayed high and specific uptake in vitro in A431, PC3 cells and HUVECs. The efficiency of RF targeting was also tested in vivo. For that purpose, liposome composition was optimized and a new RF amphiphile with a PEG spacer between RF and lipid was prepared. The tumour accumulation of the liposomes labelled with ICG was studied by photoacoustic imaging in A431 tumour model. The biodistribution of DiR labelled liposomes was accessed by combined μCT/FMT imaging in PC3 tumour model. The results show slight improvement of the tumour accumulation in A431 xenographts and the enhancement of vascular targeting in PC3 tumour model. The overall biodistribution of the RF-targeted liposomes was comparable to control
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