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Caractérisation moléculaire du syndrome CAID : mise en évidence des rôles non canoniques de SGO1 dans la régulation de la signalisation TGF-β et de l'épigénomique
Get PDFLes contractions rythmiques résultent de l’activité stimulatrice du nœud sinusal dans le cœur et des cellules interstitielles de Cajal (CICs) dans les intestins. Nous avons découvert un nouveau syndrome résultant d’une combinaison de la maladie du nœud sinusal (MNS) et de la pseudo-obstruction intestinale chronique (POIC). Ce syndrome, que nous avons nommé Chronic Atrial and Intestinal Dysrhythmia (CAID), résulte d’une mutation récessive du gène SGO1 (K23E). Cependant, les rôles connus de SGO1 n'expliquent pas l'apparition postnatale du syndrome ni la pathologie spécifique, suggérant que des rôles non canoniques de SGO1 conduisent aux manifestations cliniques observées. Cette hypothèse est supportée par la comparaison de CAID avec les autres cohésinopathies qui présentent principalement des phénotypes développementaux sans ou avec des défauts légers du cycle cellulaire.
Ce projet visait à une découverte non biaisée des mécanismes non canoniques expliquant le syndrome CAID en utilisant le dogme de la biologie moléculaire (ADN→ARNm→protéine) comme ligne directrice. Pour ce faire, nous avons effectué des criblages multi-omiques sur des fibroblastes de peau de patients CAID et de contrôles sains. Les résultats des criblages ont été validés par électrophysiologie, étude des voies de signalisation pertinentes, immunohistochimie, pyroséquençage des rétrotransposons LINE-1 et quantification des marques d’histones.
Nos études multi-omiques ont confirmé des changements dans la régulation du cycle cellulaire, mais aussi dans la conduction cardiaque et la fonction des muscles lisses. Plus spécifiquement, plusieurs canaux potassiques étaient sous-régulés. L’électrophysiologie a confirmé une diminution du courant potassique rectifiant entrant (IK1). L'immunohistochimie des coupes intestinales de patients CAID a confirmé l’augmentation de l’expression de SGO1 et BUB1, un régulateur de la voie de signalisation TGF-β. De plus, la voie canonique de TGF-β est augmentée et est découplée de la voie non canonique. Au niveau épigénétique, une signature unique d’hyperméthylation et de fermeture de la chromatine a été observée. Ce qui est soutenu par l’augmentation de la méthylation de H3K9me3 et de H3K27me3.
En conclusion, le syndrome CAID est associé à plusieurs changements ayant possiblement un effet cumulatif plutôt que d’une seule voie de signalisation dérégulée. Nos résultats désignent la perturbation du courant IK1, la dérégulation de la signalisation TGF-β, l’hyperméthylation de l’ADN et la compaction de la chromatine comme éléments conducteurs potentiels des manifestations cliniques observées. La voie TGF-β et les changements épigénétiques peuvent être ciblées par des médicaments existants, constituant ainsi des cibles thérapeutiques prometteuses pour le traitement du syndrome CAID.Rhythmic contractions are driven by the pacemaker activity of the cardiac sinus node and the intestinal interstitial cells of Cajal (ICC). We have discovered a new syndrome resulting from a combination of sick sinus syndrome (SSS) and chronic intestinal pseudo-obstruction (CIPO). This syndrome, which we have named Chronic Atrial and Intestinal Dysrhythmia (CAID), results from a recessive mutation in the SGO1 gene (K23E). However, the known roles of SGO1 do not explain the postnatal onset of the syndrome nor the specific pathology, suggesting that non-canonical roles of SGO1 lead to the clinical manifestations observed. This hypothesis is supported by the comparison of CAID with other cohesinopathies which mainly exhibit developmental phenotypes without or with mild cell cycle defects.
This project aimed towards an unbiased discovery of noncanonical mechanisms explaining CAID using the molecular biology dogma (DNA→mRNA→protein) as a guideline. We performed multi-omic screens on skin fibroblasts from CAID patients and healthy controls. Screening results were validated by electrophysiology, study of relevant signaling pathways, immunohistochemistry, LINE-1 retrotransposon pyrosequencing, and histone marks quantification.
Our multiomics analyses confirmed changes in cell cycle regulation, but also in cardiac conduction and smooth muscle function. More specifically, several potassium channels were downregulated. Electrophysiology studies confirmed a decrease in the inward rectifier potassium current (IK1). Immunohistochemistry in CAID patient’s intestinal sections confirmed overexpression of SGO1 and BUB1, a regulator of TGF-β signaling pathway. Additionally, the canonical TGF-β signaling was increased and decoupled from noncanonical signaling. At the epigenetic level, CAID patient fibroblasts have a unique signature of hypermethylation and chromatin closure. This is supported by the increased methylation of H3K9me3 and H3K27me3.
In conclusion, CAID syndrome is associated with several changes that, may have a cumulative effect rather than a single deregulated signaling pathway. Our results reveal the disturbance of the IK1 current, the deregulation of TGF-β signaling, DNA hypermethylation and chromatin accessibility changes as potential conductors of intestinal and cardiac manifestations of CAID syndrome. In particular, the TGF-β pathway and epigenetic changes, may be targeted by existing drugs, thus constituting promising therapeutic targets for the treatment of CAID syndrome
Étude des conséquences fonctionnelles de la mutation SGO1 K23E sur la voie de signalisation TGF-β
Get PDFNous avons identifié un nouveau syndrome d’arythmie généralisée rare dans la population franco-canadienne, CAID syndrome (Chronic Atrial and Intestinal Dysrhythmia) causé par une mutation fondatrice récessive dans le gène Shugoshin-like 1 (SGO1). La mutation change une lysine par un acide glutamique à la position 23. Les patients affectés souffrent d'une maladie du nœud sinusal et d'une pseudo-obstruction intestinale chronique. À ce jour, c’est la seule pathologie affectant à la fois le pacemaker cardiaque et le pacemaker intestinal.
Nous avons montré que la mutation SGO1 K23E stimule la voie de signalisation TGF-β, qui est impliquée dans de très nombreux processus biologiques, et dont le rôle de SGO1 dans celle-ci reste inconnu. Une étude a identifié la protéine BUB1, impliquée dans la localisation centromérique de SGO1, comme régulatrice de la voie TGF-β (2015). Ce qui suggère une implication possible de SGO1 dans ce processus.
L’objectif de ce projet de Maîtrise est de caractériser ce nouveau rôle de SGO1 lors du développement du nœud sinusal, ainsi que l’impact de la mutation K23E. L’état de phosphorylation de protéines impliquées dans cette voie TGF-β a été quantifié dans des fibroblastes de peau de patients et de sujets témoins, par la technologie ALPHA (Amplified Luminescence Proximity Homogenous Assay), et les résultats révèlent que la mutation K23E engendre une augmentation de la voie canonique et une inhibition de la voie non-canonique de TGF-β.We recently identified a novel generalized dysrhythmia syndrome in the French-Canadian population that we termed CAID syndrome (Chronic Atrial and Intestinal Dysrhythmia), caused by a recessive homozygous mutation in the gene Shugoshin-like 1 (SGO1). The mutation changes a lysine by a glutamic acid at the position 23. All patients have sick sinus syndrome as well as chronic intestinal pseudo-obstruction, making it the first generalized pace making syndrome affecting both the cardiac and the intestinal pacemaker.
We previously have shown that the SGO1 K23E mutation affect the TGF-ß signaling pathway, which is involved in many crucial biological process, although the role of SGO1 in this pathway has not been well characterized. A study identified the BUB1 protein involved in the centromeric localization of SGO1, as regulator of this pathway (2015). This suggests a possible implication of SGO1 in this process.
The objective of this Master project is to characterize this new role of SGO1 during the sinus node development, and the impact of the K23E mutation. The phosphorylation state of some proteins involved in this TGF-β pathway has been quantified in skin fibroblasts of both patients and controls, by using the ALPHA technology (Amplified Luminescence Proximity Homogenous Assay), and the results reveal that the K23E mutation induces an increase of the canonical TGF-β pathway and also, an inhibition of the non-canonical pathway
Établissement d’un nouveau modèle de souris pour étudier les cellules valvulaires interstitielles : ADAMTS19-Cre-ert2
Get PDFSuperviseur : Dr. Piet Van Vliet
Collaborateurs: Dr. Alexandre Dubrac, Dr. Martin SmithRésumé
INTRODUCTION : Les maladies valvulaires du cœur surviennent dans 2% de la population, impliquant souvent un reflux sanguin dû au rétrécissement de la valve. Nous avons récemment identifié deux familles non apparentées étant atteintes par une sténose aortique. Le séquençage exomique des familles a révélé une mutation entrainant une perte de fonction homozygote pour le gène ADAMTS19. La relation entre la perturbation du gène ADAMTS19 et la sténose a été reproduite et donc confirmée grâce à une souris ADAMTS19-LACZ KO/KO. Cette souris montre également que ADAMTS19 est spécifiquement exprimé dans les cellules valvulaires interstitielles (VICs) dans les valves. Le rôle d’ADAMTS19 durant le développement des valves reste inconnu. Pour analyser le patron d’expression d’ADAMTS19 pendant le développement du cœur, nous avons obtenu un modèle de souris transgénique contenant une CRE-tamoxifen inductible (Cre-ERT2) qui est exprimé sous l’influence du promoteur humain ADAMTS19. HYPOTHESE/OBJECTIF : Nous émettons l’hypothèse que le promoteur humain d’ADAMTS19 inséré dans la souris ADAMTS19-Cre-ERT2 contient toutes les séquences régulatrices permettant d’exprimer le gène ADAMTS19 et que ADAMTS19 est principalement exprimé au niveau des cellules valvulaires interstitielles dans les valves. L’objectif est de caractériser le patron d’expression d’ADAMTS19 en analysant sa distribution durant le développement grâce à une souris reportrice tdTomato. Comme ADAMTS19 est spécifiquement exprimé dans les VICs, cet outil transgénique permettrait d’étudier ces cellules durant le développement. METHODE/RESULTAT : Suite à une étude in silico le promoteur ADAMTS19 est apparu comme extrêmement conservé. Par conséquent, pour analyser l’expression d’ADAMTS19 nous avons obtenu une souris BAC ADAMTS19-Cre-ERT2 contenant la séquence conservée que nous avons croisé avec une souris reportrice tdTomato. Le Tamoxifen est administré aux femelles gestantes par gavage aux jours embryonnaires E9,5, E11,5 ainsi que E13,5, et les cœurs sont extrait a E16,5. Des coupes de cœurs embryonnaires vont permettre d’identifier la localisation et la morphologie des cellules marquées. L’expression d’ADMATS19 dans les cellules valvulaires interstitielles est consistant avec le fait qu’ADAMTS19 est connu pour affecter les valves durant le développent et dans le cas de maladie valvulaire. Cependant, le patron des valves n’est pas reproductible au travers des générations. De plus, nous observons qu’ADAMTS19 est marqué dans des cellules des oreillettes et ventricule dans une lignée et dans une sous population de cellules de l’artère pulmonaire dans une autre. CONCLUSION : L’analyse des séquences de chaque lignée par séquençage permettre d’investiguer la raison de ses différents patrons et de mettre en évidence des régulateurs spécifiques.BACKGROUND: Valvular heart disease (VHD) occurs in ~2% of the general population, often
resulting in reduced or disturbed blood flow. We recently identified two unrelated families with recessive
inheritance patterns of progressive polyvalvular heart disease in absence of any clear syndromic
phenotype. Exome sequencing revealed homozygous, rare, loss of function (LOF) alleles in both families
for the gene ADAMTS19. The relation between ADAMTS19 mutation and aortic stenosis were confirm via
an ADAMTS19-LacZ KO/KO mouse model. This model also shows that ADAMTS19 is specific of VICs
during valve development. The ADAMTS protein family includes 19 proteases that are involved in matrix
remodeling, and tissue homeostasis in development and disease. However, the role of ADAMTS19
specifically during valve development remains unknown. We aim to characterize ADAMTS19 expression
using a BAC transgenic ADMTS19-CRERT2 mouse. HYPOTHESE/OBJECTIVE We hypothesize that
the BAC used to make the ADMTS19-CRERT2 mouse contains all the regulatory elements to express it
and also that its expression will be specific to the VICs. The objective is to establish the ADAMTS19-
CREERT2 and therefore to create a new tool to study VICs in vivo. METHODS/RESULTS: In silico
analysis of the human and mouse ADAMTS19 genomic regions showed a high level of conservation.
Thus, to analyze ADAMTS19 expression patterns during mouse development, we obtained a BAC
transgenic mouse model containing a tamoxifen inducible Cre (CreERT2) that is expressed under the
influence of the human ADAMTS19 promoter and surrounding genomic region. We crossed males from
several lines created in parallel with Rosa-tdTomato reporter females to generate offspring in which
expression of the fluorescent tdTomato reporter is activated in ADAMTS19-expressing cells upon
tamoxifen administration. Surprisingly, whole mount imaging of embryos induced at E13.5 and isolated
at E16.5 revealed strong, but distinct labelling patterns in offspring from different ADAMTS19CreERT2
sublines. Whereas one line exclusively labelled VICs, consistent with ADAMTS19 in situ RNA
expression data from the Eurexpress database, another line specifically labelled cells in atrial and
ventricular, but not VICs. A third line seems to label only a subset of cells in the pulmonary artery.
Labeling of ADAMTS19-positive VICs is consistent with ADAMTS19 affecting valve development and
VHD. In addition, we observed exclusive ADAMTS19-dependent labelling in atrial and ventricular cells
or in a subset of pulmonary artery cells in two different sublines. CONCLUSION: The distinct expression
patterns in offspring from different ADAMTS19-Cre-ERT2 lines indicates that although regulation of
ADAMTS19 is conserved between human and mouse, expression in VICs versus other cells may be
dependent on mutually exclusive regulatory mechanisms
Characterization of two sorting nexins : sorting nexin-11 and sorting nexin-30
Get PDFÀ l’intérieur de la cellule sillonnent d’innombrables molécules, certaines par diffusion et d’autres sur des routes moléculaires éphémères, empruntées selon les directives spécifiques de protéines responsables du trafic intracellulaire. Parmi celles-ci, on compte les sorting nexins, qui déterminent le sort de plusieurs types de protéine, comme les récepteurs, en les guidant soit vers des voies de dégradation ou de recyclage. À ce jour, il existe 33 membres des sorting nexins (Snx1-33), tous munies du domaine PX (PHOX-homology). Le domaine PX confère aux sorting nexins la capacité de détecter la présence de phosphatidylinositol phosphates (PIP), sur la surface des membranes lipidiques (ex : membrane cytoplasmique ou vésiculaire). Ces PIPs, produits de façon spécifique et transitoire, recrutent des protéines nécessaires à la progression de processus cellulaires. Par exemple, lorsqu’un récepteur est internalisé par endocytose, la région avoisinante de la membrane cytoplasmique devient occupée par PI(4,5)P2. Ceci engendre le recrutement de SNX9, qui permet la progression de l’endocytose en faisant un lien entre le cytoskelette et le complexe d’endocytose.
Les recherches exposées dans cette thèse sont une description fonctionnelle de deux sorting nexins peux connues, Snx11 et Snx30. Le rôle de chacun de ces gènes a été étudié durant l’embryogenèse de la grenouille (Xenopus laevis). Suite aux résultats in vivo, une approche biomoléculaire et de culture cellulaire a été employée pour approfondir nos connaissances.
Cet ouvrage démontre que Snx11 est impliqué dans le développement des somites et dans la polymérisation de l’actine. De plus, Snx11 semble influencer le recyclage de récepteurs membranaires indépendamment de l’actine. Ainsi, Snx11 pourrait jouer deux rôles intracellulaires : une régulation actine-dépendante du milieu extracellulaire et le triage de récepteurs actine-indépendant. De son côté, Snx30 est impliqué dans la différentiation cardiaque précoce par l’inhibition de la voie Wnt/β-catenin, une étape nécessaire à l’engagement d’une population de cellules du mésoderme à la ligné cardiaque. L’expression de Snx30 chez le Xénope coïncide avec cette période critique de spécification du mésoderme et le knockdown suscite des malformations cardiaques ainsi qu’à d’autres tissus dérivés du mésoderme et de l’endoderme.
Cet ouvrage fournit une base pour des études futures sur Snx11 et Snx30. Ces protéines ont un impact subtil sur des voies de signalisation spécifiques. Ces caractéristiques pourraient être exploitées à des fins thérapeutiques puisque l’effet d’une interférence avec leurs fonctions pourrait être suffisant pour rétablir un déséquilibre cellulaire pathologique tout en minimisant les effets secondaires.The intracellular milieu is housed by countless numbers of intracellular molecules travelling by diffusion or along transient paths, which are regulated by specific trafficking proteins. Among these traffic regulators are the sorting nexins that determine the fate of internalized proteins by directing toward a defined path, which can lead to either degradation or recycling. To date, 33 sorting nexins (Snx1-33) have been identified, which all share a common characteristic, the presence of a PX (PHOX-homology) domain. The PX domain is a phosphatidylinositol phosphate (PIP)-binding domain, which helps bring sorting nexins to PIP-enriched areas of lipid membranes. For example, during receptor endocytosis, the surrounding membrane becomes transiently occupied by PI(4,5)P2. PI(4,5)P2 is then recognized by Snx9, which contributes to the progression of endocytosis by linking the receptor complex to the actin cytoskeleton.
The research presented in this thesis is the first to investigate the functions for two sorting nexins, Snx11 and Snx30, during embryogenesis and endosomal protein trafficking. Results obtained from knockdown experiments in the frog (Xenopus laevis) were combined with data from cell culture and biomolecular experiments to propose a function for these two proteins. The data presented here suggest that Snx11 is involved in somitogenesis, and regulates actin-dependent and -independent processes. Snx11 could serve as a scaffolding protein, linking the extra-cellular matrix to the actin cytoskeleton and could also function in actin-independent receptor recycling. On the other hand, Snx30 is implicated in early cardiogenesis and promotes the commitment of a population of mesoderm cells to the cardiac lineage. It does so through the inhibition of Wnt/β-catenin signaling but the underlying mechanism is still unclear. Expression of Snx30 in Xenopus coincides with this critical period of cardiac specification and knockdown of Snx30 results in cardiac malformations as well as other defects in mesoderm- and endoderm-derived tissue. In addition, data from both Xenopus and HEK293T cell culture show that knockdown of Snx30 increases Wnt/β-catenin signaling.
This work provides the basis for future studies on Snx11 and Snx30. Interestingly, Snx11 and Snx30 seem to act as fine-tuners of signaling pathways. These proteins could potentially become interesting therapeutic targets due to their specificity and relatively subtle impact when knocked-down. As such, interference with their function could be useful to re-balance a cellular disequilibrium while minimizing side effects
Cartographie génétique d’une forme familiale autosomale dominante d’anévrysmes du septum inter-ventriculaire et de communications inter-ventriculaires au chromosome 10p15
Get PDFLes malformations cardiaques congénitales (CHM) représentent 28 % de toutes les malformations congénitales majeures et touchent 8 pour 1000 naissances à terme. Elles sont la cause de mortalité et de morbidité non infectieuse la plus fréquente chez les enfants de moins d’une année de vie.
Les communications interventriculaires (VSD) forment le sous-type de CHM le plus fréquent et l’aggrégation familiale est extrêmement rare. Le but de cette étude était d’identifier les facteurs génétiques et les régions chromosomiques contribuant aux VSD.
Une grande famille ségréguant diverses formes de pathologies septales, incluant des VSD, des anévrysmes du septum interventriculaire (VSA) et des communications interauriculaires (ASD), a été examinées et caractérisées cliniquement et génétiquement. Dix-huit membres de la famille, sur trois générations, ont pu être étudiés. (10 affectés : 4 VSD, 3 VSA, 2 ASD et une tétralogie de Fallot).
L’analyse de liaison multipoint paramétrique démontre un logarithme des probabilités maximal (LOD) de 3.29 liant significativement le chromosome 10p15.3-10p15.2 aux traits observés dans cette famille.
Le pointage LOD oriente vers une région pauvre en gènes qui a déjà été associée aux malformations du septum interventriculaire, mais qui est distincte de la région du syndrome de DiGeorge de type 2 sur le chromosome 10p. De plus, plusieurs scénarios d’analyse de liaison suggèrent que la tétralogie de Fallot est une phénocopie et qu’elle est donc génétiquement différente des autres pathologies du septum observées dans cette famille.
En bref, cette étude associe une forme rare de VSD/VSA au chromosome 10p15 et permet d’étendre le spectre de l’hétérogénéité des pathologies septales.
Mots-clés : Malformations cardiaques congénitales, malformations du septum, tétralogie de Fallot, analyse de liaison, chromosome 10p15, génétique moléculaireCardiac malformations represents 28 % of all major congenital malformation and affect 8 per 1000 live birth. They are the most frequent cause of non infectious mortality and morbidity in childen of less then 1 year of life.
Although ventricular septal defects (VSD) are the most common congenital heart lesion, familial clustering has been described only in rare instances. The aim of this study was to identify genetic factors and chromosomal regions contributing to VSD.
A unique, large kindred segregating various forms of septal pathologies—including VSD, ventricular septal aneurysms, and atrial septal defects (ASD)—was ascertained and characterized clinically and genetically. Eighteen family members in three generations could be studied, out of whom 10 are affected (2 ASD, 3 septal aneurysm, 4 VSD, and 1 tetralogy of Fallot).
Parametric multipoint LOD scores reach significance on chromosome 10p15.3-10p15.2 (max. 3.29). The LOD score support interval is in a gene-poor region where deletions have been reported to associate with septal defects, but that is distinct from the DiGeorge syndrome 2 region on 10p. Multiple linkage analysis scenarios suggest that tetralogy of Fallot is a phenocopy and genetically distinct from the autosomal dominant form of septal pathologies observed in this family.
This study maps a rare familial form of VSD/septal aneurysms to chromosome 10p15 and extends the spectrum of the genetic heterogeneity of septal pathologies. Fine mapping, haplotype construction, and resequencing will provide a unique opportunity to study the pathogenesis of septal defects and shed light on molecular mechanisms of septal development
Cartographie génétique d’une forme familiale autosomale dominante d’anévrysmes du septum inter-ventriculaire et de communications inter-ventriculaires au chromosome 10p15
No full textLes malformations cardiaques congénitales (CHM) représentent 28 % de toutes les malformations congénitales majeures et touchent 8 pour 1000 naissances à terme. Elles sont la cause de mortalité et de morbidité non infectieuse la plus fréquente chez les enfants de moins d’une année de vie.
Les communications interventriculaires (VSD) forment le sous-type de CHM le plus fréquent et l’aggrégation familiale est extrêmement rare. Le but de cette étude était d’identifier les facteurs génétiques et les régions chromosomiques contribuant aux VSD.
Une grande famille ségréguant diverses formes de pathologies septales, incluant des VSD, des anévrysmes du septum interventriculaire (VSA) et des communications interauriculaires (ASD), a été examinées et caractérisées cliniquement et génétiquement. Dix-huit membres de la famille, sur trois générations, ont pu être étudiés. (10 affectés : 4 VSD, 3 VSA, 2 ASD et une tétralogie de Fallot).
L’analyse de liaison multipoint paramétrique démontre un logarithme des probabilités maximal (LOD) de 3.29 liant significativement le chromosome 10p15.3-10p15.2 aux traits observés dans cette famille.
Le pointage LOD oriente vers une région pauvre en gènes qui a déjà été associée aux malformations du septum interventriculaire, mais qui est distincte de la région du syndrome de DiGeorge de type 2 sur le chromosome 10p. De plus, plusieurs scénarios d’analyse de liaison suggèrent que la tétralogie de Fallot est une phénocopie et qu’elle est donc génétiquement différente des autres pathologies du septum observées dans cette famille.
En bref, cette étude associe une forme rare de VSD/VSA au chromosome 10p15 et permet d’étendre le spectre de l’hétérogénéité des pathologies septales.
Mots-clés : Malformations cardiaques congénitales, malformations du septum, tétralogie de Fallot, analyse de liaison, chromosome 10p15, génétique moléculaireCardiac malformations represents 28 % of all major congenital malformation and affect 8 per 1000 live birth. They are the most frequent cause of non infectious mortality and morbidity in childen of less then 1 year of life.
Although ventricular septal defects (VSD) are the most common congenital heart lesion, familial clustering has been described only in rare instances. The aim of this study was to identify genetic factors and chromosomal regions contributing to VSD.
A unique, large kindred segregating various forms of septal pathologies—including VSD, ventricular septal aneurysms, and atrial septal defects (ASD)—was ascertained and characterized clinically and genetically. Eighteen family members in three generations could be studied, out of whom 10 are affected (2 ASD, 3 septal aneurysm, 4 VSD, and 1 tetralogy of Fallot).
Parametric multipoint LOD scores reach significance on chromosome 10p15.3-10p15.2 (max. 3.29). The LOD score support interval is in a gene-poor region where deletions have been reported to associate with septal defects, but that is distinct from the DiGeorge syndrome 2 region on 10p. Multiple linkage analysis scenarios suggest that tetralogy of Fallot is a phenocopy and genetically distinct from the autosomal dominant form of septal pathologies observed in this family.
This study maps a rare familial form of VSD/septal aneurysms to chromosome 10p15 and extends the spectrum of the genetic heterogeneity of septal pathologies. Fine mapping, haplotype construction, and resequencing will provide a unique opportunity to study the pathogenesis of septal defects and shed light on molecular mechanisms of septal development
Intracellular trafficking of protease : Activated Receptor 2 (PAR2) by members of sorting nexins family
Get PDFLe dogme voulant que les récepteurs couplés aux protéines G (GPCRs) activent des voies de signalisation seulement lorsqu’ils sont localisés à la membrane plasmatique, a récemment été remis en question. Des données récentes indiquent que certains GPCRs peuvent également induire une réponse intracellulaire à partir des compartiments intracellulaires dont le noyau.
Les récepteurs activés par la protéase (PAR) sont des membres de la famille GPCR. Les PARs sont activés par le clivage de la partie N–terminale du récepteur ce qui permet au ligand attaché sur le récepteur de se lier à sa poche réceptrice. Quatre PARs ont été décrits : PAR1, PAR2, PAR3 et PAR4. PAR2 peut susciter des effets mitogéniques et participer aux processus comme l’angiogenèse et l'inflammation. Alors que beaucoup d'effets intracellulaires de PAR2 peuvent être expliqués lorsqu’il est localisé à la membrane plasmatique, une fonction intracrine de PAR2 a aussi été proposée. Pourtant les mécanismes par lesquels PAR2 peut provoquer l’expression de gènes ciblés sont toujours inconnus.
Le but de notre étude était de vérifier l’existence d’une population nucléaire de PAR2. Nous avons également émis l’hypothèse que les voies activées par l’activation de PAR2 dépendent de sa localization cellulaire. En utilisant des techniques de microscopie confocale et de "Western Blot" nous avons démontré la présence d’une population nucléaire de PAR2. À la suite de la stimulation de PAR2, nous avons observé une augmentation de la translocation du récepteur de la membrane plasmatique au noyau. En utilisant la technique de "RT – PCR", nous avons observé des rôles différents de PAR2 à la surface de la cellule et du noyau dans l’initiation de l’expression des gènes.
Afin d’identifier les mécanismes responsables de la translocation nucléaire de PAR2, nous avons évalué l’implication des membres de la famille de "Sorting Nexins (SNX)" dans la translocation nucléaire de PAR2.
"Sorting Nexins" est un groupe de protéines avec des fonctions de transport bien établies. SNX1 et SNX2 ont été identifiés comme responsables du transfert de PAR1 vers les lysosomes. SNX11 n'a pas encore été étudié et nous avons émis l’hypothèse qu'il pourrait être un autre membre de la famille des SNX impliqué dans la signalisation de PAR2.
Pour ce faire, nous avons développé des "knockdowns" stables pour SNX1, SNX2 et SNX11 dans les cellules HEK293. En utilisant les essais d’immunofluorescence, "Western Blot" et de cytométrie en flux, nous avons déterminé que tous les trois membres du groupe SNX sont des partenaires d'interaction de PAR2. Toutefois, seul SNX11 se co-localise avec son partenaire au noyau et est responsable de sa translocation nucléaire. Les expériences de "RT - PCR" sur les lignées de cellule de SNXs "knockdowns" ont démontré que la fonction de PAR2 nucléaire dépend surtout de SNX11; néanmoins SNX1 et SNX2 peuvent aussi l’influencer, suggérant qu'ils font aussi partie du réseau signalétique de PAR2.
En conclusion, PAR2 est déplacé de la membrane plasmatique à la membrane nucléaire après sa stimulation avec un agoniste. La translocation nucléaire de PAR2 par un mécanisme impliquant SNX11, initie des effets intracellulaires différents de sa signalisation membranaire.
Mots clés : récepteurs couplés à la protéine G, “Sorting Nexins”, récepteurs activés par la protéase, translocation nucléaire, membrane nucléaire, signal nucléaire.During the recent years the existing statements that G – protein coupled receptors (GPCRs) are relaying signals only from the plasma membrane have been challenged. It has become clear that some GPCRs can also signal from intracellular compartments and the nucleus. The role and the function of these nuclear GPCRs are subject of intensive investigations.
Protease - activated receptors (PAR) are members of the GPCR family. PARs are activated by the cleavage of the N – terminus of the receptor followed by binding of the tethered ligand on to the receptor. Four PARs have been described: PAR1, PAR2, PAR3 and PAR4. PAR2 can induce mitogenic effects and participate in processes such as angiogenesis and inflammation. While many of the intracellular effects of PAR2 can be explained with its plasma membrane signalling pathway, intracrine effects of PAR2 have also been proposed. However the mechanisms by which PAR2 can induce its target gene expressions are still unknown.
The purpose of our study was to investigate whether a distinct nuclear population of PAR2 exists. We hypothesized that the roles of PAR2 at different cellular compartments are different since signalling pathways depend on subcellular context. Using confocal microscopy and Western blot techniques we were able to demonstrate the presence of a nuclear population of PAR2. Upon stimulation of the cell membrane PAR2, we observed significant translocation of the receptor from the plasma membrane to the nucleus. Using RT – PCR technique we detected diverse roles of cell surface and nuclear PAR2 on triggered gene expression.
In the current study we have attempted to reveal the mechanisms responsible for PAR2 nuclear translocation. We tested the hypothesis that members of the Sorting Nexin (SNX) family are involved in PAR2 nuclear translocation.
Sorting Nexins are a new, large group of proteins with well established cargo functions. SNX1 and SNX2 have been demonstrated to be responsible for lysosomal sorting of PAR1. SNX11 has not been studied yet, and we hypothesized that it may be another SNX involved in PAR2 signalling.
We developed stable knockdowns for SNX1, SNX2 and SNX11 in HEK293 cells. Using immunofluorescence, Western Blot analysis and FACS assays, we determined that all three members of SNX group are interaction partners of PAR2. However only SNX11 co-localized with its partner in the nucleus and is responsible for its nuclear translocation. RT – PCR experiments on SNXs knockdowns cell lines demonstrated that PAR2 nucleus function is mostly dependent on SNX11; nevertheless SNX1 and SNX2 knockdowns can also attenuate it, suggesting that they are part of PAR2 signalling network.
In conclusion, PAR2 is being translocated from the plasma membrane to the nuclear membrane after its stimulation with SLIGKV. PAR2 nucleus translocation triggers intracellular effects different from its cell membrane signalling. SNX11 is the major factor responsible for PAR2 nuclear sorting.
Keywords: G – protein coupled receptors, Sorting Nexins, Protease - activated receptors, nuclear translocation, nuclear membrane, nuclear signallin
Characterization of two sorting nexins : sorting nexin-11 and sorting nexin-30
Get PDFÀ l’intérieur de la cellule sillonnent d’innombrables molécules, certaines par diffusion et d’autres sur des routes moléculaires éphémères, empruntées selon les directives spécifiques de protéines responsables du trafic intracellulaire. Parmi celles-ci, on compte les sorting nexins, qui déterminent le sort de plusieurs types de protéine, comme les récepteurs, en les guidant soit vers des voies de dégradation ou de recyclage. À ce jour, il existe 33 membres des sorting nexins (Snx1-33), tous munies du domaine PX (PHOX-homology). Le domaine PX confère aux sorting nexins la capacité de détecter la présence de phosphatidylinositol phosphates (PIP), sur la surface des membranes lipidiques (ex : membrane cytoplasmique ou vésiculaire). Ces PIPs, produits de façon spécifique et transitoire, recrutent des protéines nécessaires à la progression de processus cellulaires. Par exemple, lorsqu’un récepteur est internalisé par endocytose, la région avoisinante de la membrane cytoplasmique devient occupée par PI(4,5)P2. Ceci engendre le recrutement de SNX9, qui permet la progression de l’endocytose en faisant un lien entre le cytoskelette et le complexe d’endocytose.
Les recherches exposées dans cette thèse sont une description fonctionnelle de deux sorting nexins peux connues, Snx11 et Snx30. Le rôle de chacun de ces gènes a été étudié durant l’embryogenèse de la grenouille (Xenopus laevis). Suite aux résultats in vivo, une approche biomoléculaire et de culture cellulaire a été employée pour approfondir nos connaissances.
Cet ouvrage démontre que Snx11 est impliqué dans le développement des somites et dans la polymérisation de l’actine. De plus, Snx11 semble influencer le recyclage de récepteurs membranaires indépendamment de l’actine. Ainsi, Snx11 pourrait jouer deux rôles intracellulaires : une régulation actine-dépendante du milieu extracellulaire et le triage de récepteurs actine-indépendant. De son côté, Snx30 est impliqué dans la différentiation cardiaque précoce par l’inhibition de la voie Wnt/β-catenin, une étape nécessaire à l’engagement d’une population de cellules du mésoderme à la ligné cardiaque. L’expression de Snx30 chez le Xénope coïncide avec cette période critique de spécification du mésoderme et le knockdown suscite des malformations cardiaques ainsi qu’à d’autres tissus dérivés du mésoderme et de l’endoderme.
Cet ouvrage fournit une base pour des études futures sur Snx11 et Snx30. Ces protéines ont un impact subtil sur des voies de signalisation spécifiques. Ces caractéristiques pourraient être exploitées à des fins thérapeutiques puisque l’effet d’une interférence avec leurs fonctions pourrait être suffisant pour rétablir un déséquilibre cellulaire pathologique tout en minimisant les effets secondaires.The intracellular milieu is housed by countless numbers of intracellular molecules travelling by diffusion or along transient paths, which are regulated by specific trafficking proteins. Among these traffic regulators are the sorting nexins that determine the fate of internalized proteins by directing toward a defined path, which can lead to either degradation or recycling. To date, 33 sorting nexins (Snx1-33) have been identified, which all share a common characteristic, the presence of a PX (PHOX-homology) domain. The PX domain is a phosphatidylinositol phosphate (PIP)-binding domain, which helps bring sorting nexins to PIP-enriched areas of lipid membranes. For example, during receptor endocytosis, the surrounding membrane becomes transiently occupied by PI(4,5)P2. PI(4,5)P2 is then recognized by Snx9, which contributes to the progression of endocytosis by linking the receptor complex to the actin cytoskeleton.
The research presented in this thesis is the first to investigate the functions for two sorting nexins, Snx11 and Snx30, during embryogenesis and endosomal protein trafficking. Results obtained from knockdown experiments in the frog (Xenopus laevis) were combined with data from cell culture and biomolecular experiments to propose a function for these two proteins. The data presented here suggest that Snx11 is involved in somitogenesis, and regulates actin-dependent and -independent processes. Snx11 could serve as a scaffolding protein, linking the extra-cellular matrix to the actin cytoskeleton and could also function in actin-independent receptor recycling. On the other hand, Snx30 is implicated in early cardiogenesis and promotes the commitment of a population of mesoderm cells to the cardiac lineage. It does so through the inhibition of Wnt/β-catenin signaling but the underlying mechanism is still unclear. Expression of Snx30 in Xenopus coincides with this critical period of cardiac specification and knockdown of Snx30 results in cardiac malformations as well as other defects in mesoderm- and endoderm-derived tissue. In addition, data from both Xenopus and HEK293T cell culture show that knockdown of Snx30 increases Wnt/β-catenin signaling.
This work provides the basis for future studies on Snx11 and Snx30. Interestingly, Snx11 and Snx30 seem to act as fine-tuners of signaling pathways. These proteins could potentially become interesting therapeutic targets due to their specificity and relatively subtle impact when knocked-down. As such, interference with their function could be useful to re-balance a cellular disequilibrium while minimizing side effects
Intracellular trafficking of protease : Activated Receptor 2 (PAR2) by members of sorting nexins family
Get PDFLe dogme voulant que les récepteurs couplés aux protéines G (GPCRs) activent des voies de signalisation seulement lorsqu’ils sont localisés à la membrane plasmatique, a récemment été remis en question. Des données récentes indiquent que certains GPCRs peuvent également induire une réponse intracellulaire à partir des compartiments intracellulaires dont le noyau.
Les récepteurs activés par la protéase (PAR) sont des membres de la famille GPCR. Les PARs sont activés par le clivage de la partie N–terminale du récepteur ce qui permet au ligand attaché sur le récepteur de se lier à sa poche réceptrice. Quatre PARs ont été décrits : PAR1, PAR2, PAR3 et PAR4. PAR2 peut susciter des effets mitogéniques et participer aux processus comme l’angiogenèse et l'inflammation. Alors que beaucoup d'effets intracellulaires de PAR2 peuvent être expliqués lorsqu’il est localisé à la membrane plasmatique, une fonction intracrine de PAR2 a aussi été proposée. Pourtant les mécanismes par lesquels PAR2 peut provoquer l’expression de gènes ciblés sont toujours inconnus.
Le but de notre étude était de vérifier l’existence d’une population nucléaire de PAR2. Nous avons également émis l’hypothèse que les voies activées par l’activation de PAR2 dépendent de sa localization cellulaire. En utilisant des techniques de microscopie confocale et de "Western Blot" nous avons démontré la présence d’une population nucléaire de PAR2. À la suite de la stimulation de PAR2, nous avons observé une augmentation de la translocation du récepteur de la membrane plasmatique au noyau. En utilisant la technique de "RT – PCR", nous avons observé des rôles différents de PAR2 à la surface de la cellule et du noyau dans l’initiation de l’expression des gènes.
Afin d’identifier les mécanismes responsables de la translocation nucléaire de PAR2, nous avons évalué l’implication des membres de la famille de "Sorting Nexins (SNX)" dans la translocation nucléaire de PAR2.
"Sorting Nexins" est un groupe de protéines avec des fonctions de transport bien établies. SNX1 et SNX2 ont été identifiés comme responsables du transfert de PAR1 vers les lysosomes. SNX11 n'a pas encore été étudié et nous avons émis l’hypothèse qu'il pourrait être un autre membre de la famille des SNX impliqué dans la signalisation de PAR2.
Pour ce faire, nous avons développé des "knockdowns" stables pour SNX1, SNX2 et SNX11 dans les cellules HEK293. En utilisant les essais d’immunofluorescence, "Western Blot" et de cytométrie en flux, nous avons déterminé que tous les trois membres du groupe SNX sont des partenaires d'interaction de PAR2. Toutefois, seul SNX11 se co-localise avec son partenaire au noyau et est responsable de sa translocation nucléaire. Les expériences de "RT - PCR" sur les lignées de cellule de SNXs "knockdowns" ont démontré que la fonction de PAR2 nucléaire dépend surtout de SNX11; néanmoins SNX1 et SNX2 peuvent aussi l’influencer, suggérant qu'ils font aussi partie du réseau signalétique de PAR2.
En conclusion, PAR2 est déplacé de la membrane plasmatique à la membrane nucléaire après sa stimulation avec un agoniste. La translocation nucléaire de PAR2 par un mécanisme impliquant SNX11, initie des effets intracellulaires différents de sa signalisation membranaire.
Mots clés : récepteurs couplés à la protéine G, “Sorting Nexins”, récepteurs activés par la protéase, translocation nucléaire, membrane nucléaire, signal nucléaire.During the recent years the existing statements that G – protein coupled receptors (GPCRs) are relaying signals only from the plasma membrane have been challenged. It has become clear that some GPCRs can also signal from intracellular compartments and the nucleus. The role and the function of these nuclear GPCRs are subject of intensive investigations.
Protease - activated receptors (PAR) are members of the GPCR family. PARs are activated by the cleavage of the N – terminus of the receptor followed by binding of the tethered ligand on to the receptor. Four PARs have been described: PAR1, PAR2, PAR3 and PAR4. PAR2 can induce mitogenic effects and participate in processes such as angiogenesis and inflammation. While many of the intracellular effects of PAR2 can be explained with its plasma membrane signalling pathway, intracrine effects of PAR2 have also been proposed. However the mechanisms by which PAR2 can induce its target gene expressions are still unknown.
The purpose of our study was to investigate whether a distinct nuclear population of PAR2 exists. We hypothesized that the roles of PAR2 at different cellular compartments are different since signalling pathways depend on subcellular context. Using confocal microscopy and Western blot techniques we were able to demonstrate the presence of a nuclear population of PAR2. Upon stimulation of the cell membrane PAR2, we observed significant translocation of the receptor from the plasma membrane to the nucleus. Using RT – PCR technique we detected diverse roles of cell surface and nuclear PAR2 on triggered gene expression.
In the current study we have attempted to reveal the mechanisms responsible for PAR2 nuclear translocation. We tested the hypothesis that members of the Sorting Nexin (SNX) family are involved in PAR2 nuclear translocation.
Sorting Nexins are a new, large group of proteins with well established cargo functions. SNX1 and SNX2 have been demonstrated to be responsible for lysosomal sorting of PAR1. SNX11 has not been studied yet, and we hypothesized that it may be another SNX involved in PAR2 signalling.
We developed stable knockdowns for SNX1, SNX2 and SNX11 in HEK293 cells. Using immunofluorescence, Western Blot analysis and FACS assays, we determined that all three members of SNX group are interaction partners of PAR2. However only SNX11 co-localized with its partner in the nucleus and is responsible for its nuclear translocation. RT – PCR experiments on SNXs knockdowns cell lines demonstrated that PAR2 nucleus function is mostly dependent on SNX11; nevertheless SNX1 and SNX2 knockdowns can also attenuate it, suggesting that they are part of PAR2 signalling network.
In conclusion, PAR2 is being translocated from the plasma membrane to the nuclear membrane after its stimulation with SLIGKV. PAR2 nucleus translocation triggers intracellular effects different from its cell membrane signalling. SNX11 is the major factor responsible for PAR2 nuclear sorting.
Keywords: G – protein coupled receptors, Sorting Nexins, Protease - activated receptors, nuclear translocation, nuclear membrane, nuclear signallin
Heart-on-a-chip for drug screening and disease modeling
No full textLa technologie cœur sur puce (HOC) s’est imposée comme une approche puissante pour reproduire in vitro les propriétés structurelles, mécaniques et fonctionnelles du cœur natif, permettant la création de plateformes physiologiquement pertinentes pour le criblage pharmacologique et la modélisation des maladies. Cette thèse présente une série d’études portant sur la conception, la fabrication et la validation de systèmes HOC basés sur des biomatériaux, la bioconstruction 3D et des cellules souches dérivées de patients, afin de répondre aux limites des modèles cardiaques conventionnels (par exemple, les modèles animaux). Dans la première étude, des encres bioactives composites ont été développées en combinant la gélatine méthacryloylée, l’alginate méthacrylate et l’oxyde de graphène réduit afin de créer des tissus cardiaques bioimprimés en 3D possédant des propriétés électromécaniques adaptées. L’encre optimisée a démontré une résistance mécanique, une conductivité et une imprimabilité améliorées, tout en maintenant une forte viabilité cellulaire, une bonne organisation et une contractilité efficace de plusieurs types cellulaires cardiaques. Ces constructions en forme d’anneau ont été intégrées dans une plateforme HOC automatisée à haut débit, comportant des paires de piliers flexibles, validant leur utilité pour des applications à grande échelle en recherche cardiaque. Dans la deuxième étude, une méthode innovante a été développée pour mesurer simultanément et de manière continue les contraintes contractiles à l’échelle micro- et macroscopique, à l’aide de capteurs de stress microsphériques ultrasouples, marqués en bordure. Intégrés dans des tissus cardiaques humains ingénierés (EHTs) à base de fibrine/Geltrex, ces capteurs se déformaient sous l’effet de l’activité contractile, permettant la visualisation et la quantification des contraintes locales. Le déplacement des piliers a également été utilisé comme méthode de mesure des forces contractiles à l’échelle tissulaire. La plateforme a ensuite été validée par l’application d’agents pharmacologiques, révélant des effets distincts sur la fonction contractile et soulignant l’importance de la composition et de la rigidité de la matrice extracellulaire dans la modulation de la contractilité. Dans la troisième étude, un modèle personnalisé de cardiomyopathie dilatée (DCM) a été élaboré à partir de cardiomyocytes dérivés de cellules souches pluripotentes induites humaines provenant de patients atteints de DCM. Co-cultivés avec des fibroblastes cardiaques humains et intégrés avec des billes fluorescentes, les EHTs ont présenté des phénotypes spécifiques à la maladie, notamment une désorganisation cellulaire, une altération de la gestion du calcium, une réduction de la force contractile et des arythmies ventriculaires. Des effets inotropes et chronotropes ont été observés après traitement à la noradrénaline, confirmant la réactivité de la plateforme à une intervention thérapeutique connue et son applicabilité en médecine personnalisée. Dans l’ensemble, cette thèse fait progresser le domaine de l’ingénierie tissulaire cardiaque en intégrant des innovations en biomatériaux, des technologies de mécanosensibilité et des cellules souches dérivées de patients dans des modèles HOC fonctionnels. Ces plateformes constituent des outils à haute fidélité pour l’étude de la physiologie cardiaque, la compréhension des mécanismes pathologiques et l’évaluation préclinique de médicaments.Heart-on-a-chip (HOC) technology has emerged as a powerful approach to replicate the structural, mechanical, and functional properties of the native heart in vitro, enabling physiologically relevant platforms for drug screening and disease modeling. This thesis presents a series of studies focused on the design, fabrication, and validation of HOC systems using biomaterials, bioprinting, and patient-derived stem cells to address key limitations in conventional cardiac models (e.g., animal models). In the first study, composite bioinks were developed by incorporating gelatin methacryloyl, alginate methacrylate, and reduced graphene oxide to create 3D bioprinted cardiac constructs with suitable electromechanical properties. The optimized bioink demonstrated enhanced mechanical strength, printability, and conductivity while supporting high cell viability, alignment, and contractility of multiple cardiac cell types. These ring-shaped constructs were integrated into an automated high-throughput HOC featuring flexible pillar pairs, validating their utility for scalable applications in cardiac research. In the second study, an innovative approach was established for simultaneous and continuous measurement of contractile stresses at micro- and macro-scales using ultrasoft edge-labeled microspherical stress gauges. Embedded within fibrin/Geltrex-based engineered heart tissues (EHTs), these ultrasoft mechanosensors deformed in response to contractile activity, enabling the visualization and quantification of local stress patterns. The pillar deflection was also used as the tissue-scale contractile measurement method. The platform was further validated with pharmacological agents, revealing distinct effects on contractile function and highlighting the importance of extracellular matrix composition and stiffness in modulating contractility. In the third study, a personalized disease model of dilated cardiomyopathy (DCM) was developed using human induced pluripotent stem cell-derived cardiomyocytes from DCM patients. Co-cultured with human cardiac fibroblasts and integrated with fluorescent beads, the EHTs exhibited disease-specific phenotypes, including disrupted cell organization, impaired calcium handling, reduced contractile strength, and ventricular arrhythmias. Inotropic and chronotropic effects were observed upon norepinephrine treatment, confirming the platform’s responsiveness to therapeutic intervention with known effects and its applicability in precision medicine. Collectively, this thesis advances the field of cardiac tissue engineering by integrating biomaterial innovation, mechanosensing technology, and patient-specific stem cells into functional HOC models. These platforms offer high-fidelity tools for evaluating cardiac physiology, understanding disease mechanisms, and facilitating preclinical drug testing
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