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Sequential NMR assignment of the RAS-binding domain of Byr2
No full textHuber, Fritz, Gronwald, Wolfram, Wohlgemuth, Sabine, Herrmann, Christian, Geyer, Matthias, Wittinghofer, Alfred, Kalbitzer, Hans R. (2000): Sequential NMR assignment of the Ras-binding domain of Byr2. Journal of Natural History 34: 157-158, DOI: 10.13018/bmr4463, URL: http://dx.doi.org/10.13018/bmr446
Structurally and Catalytically Important Residues in the Phosphate Binding Loop of Adenylate Kinase of Escherichia coli
No full textAmino acids in the phosphate binding loop of adenylate kinase of Escherichia coli were mutated by site−directed mutagenesis. The mutant proteins with a Pro−9−−−−Gly (P9G) and with a Lys−13−−−−Gln (K13Q) exchange were overexpressed and purified. They were characterized by steady−state kinetics, fluorescence binding, and structural studies, together with the phosphate binding loop mutants P9L and G10V prepared earlier [Reinstein, J., Brune, M., & Wittinghofer, A. (1988) Biochemistry 27, 4712−4720]. The results obtained show that all these mutations change the structure of the protein as evidenced by NMR spectroscopy and temperature−stability studies. All the mutant proteins have increased dissociation constants for substrates and inhibitors, but their catalytic activity, except for K13Q, is not reduced. The results obtained with K13Q suggest that this lysine residue, which is conserved in all guanine and many adenine nucleotide proteins, might have an important role in catalysi
“Atypical Rho Family Members“
No full textOf the 20 Rho GTP-binding proteins in humans, 8 have atypical properties, which are also unusual within the Ras superfamily. These atypical proteins fall into four subfamilies: RhoU/RhoV, Rnd1/Rnd2/Rnd3, RhoH and RhoBTB1/RhoBTB2. These proteins are known or predicted to be predominantly GTP-bound in cells, because of changes in their ability to exchange GDP for GTP or to hydrolyse GTP. Apart from RhoH, they also have N-terminal and C-terminal extensions that give them unique interacting partners and functions. For example, RhoU can bind SH3 domain-containing proteins, Rnd proteins can bind to 14-3-3 proteins, and RhoBTB proteins can interact via their BTB domains with cullin-3, which is involved in proteasomal degradation. The proteins have been implicated in diverse functions, including cell adhesion and migration, vesicle trafficking and cell proliferation
Nouvelles stratégies anticancéreuses (compréhension moléculaire de l’oncogénèse) / New approaches for cancer treatment based on our molecular understanding of oncogenesis
No full textColloque organisé par Johannes L. Bos, Pierre Chardin, Alfred Wittinghofer et Frank McCormick du 4 au 9 mai 2004 Participants Allan Balmain, Anton Berns, Katrien Berns, Johannes L. Bos, Pierre Chardin, Jacqueline Cherfils, Hans Clevers, John De Koning, Ludger Johannes, So Young Kim, Alex Levitzki, Daniel Louvard, Richard Marais, Chris Marshall, Maurice Madelon, Frank McCormick, Laurent Meijer, Tony Pawson, Hugues de Thé, Daan Van Aalten, Karen Vousden, Fred Wittinghofer Compte-rendu The wor..
Re-engineering the mu-conotoxin SIIIA scaffold
No full textVoltage-gated sodium (Na-v) channels are responsible for generation and propagation of action potentials throughout the nervous system. Their malfunction causes several disorders and chronic conditions including neuropathic pain. Potent subtype specific ligands are essential for deciphering the molecular mechanisms of Na-v channel function and development of effective therapeutics. mu-Conotoxin SIIIA is a potent mammalian Na(v)1.2 channel blocker that exhibits analgesic activity in rodents. We undertook to reengineer loop 1 through a strategy involving charge alterations and truncations which led to the development of mu-SIIIA mimetics with novel selectivity profiles. A novel [N5K/D15A]SIIIA(3-20) mutant with enhanced net positive charge showed a dramatic increase in its Na(v)1.2 potency (IC50 of 0.5 nM vs. 9.6 nM for native SIIIA) though further truncations led to loss of potency. Unexpectedly, it appears that SIIIA loop 1 significantly influences its Na-v channel interactions despite loop 2 and 3 residues constituting the pharmacophore. This minimal functional conotoxin scaffold may allow further development of selective Na-V blockers. (C) 2013 Wiley Periodicals, Inc
Strukturelle und biophysikalische Untersuchungen der regulatorischen Domäne von humanem Nalp1
No full textDas 166 kD schwere Protein Nalp1 gehört zur Familie der Nod-ähnlichen Rezeptoren
(NLR), die eine wichtige Rolle im angeborenen Immunsystem spielen. Als intrazelluläre
Rezeptoren erkennen sie Pathogene, die bereits in die Zelle eingedrungen sind. Nach der
Aktivierung durch Pathogen-assoziierte molekulare Strukturen setzen die Nod-ähnlichen
Rezeptoren über einen bislang wenig erklärten Mechanismus Entzündungsreaktionen in
Gang.
Im Rahmen dieser Arbeit konnte die Kristallstruktur der LRR-Domäne von humanem
Nalp1 bis zu einer Auflösung von 1.65 Å aufgeklärt werden. Diese Kristallstruktur liefert die
erste dreidimensionale Beschreibung der regulatorischen Domäne eines Nod-ähnlichen
Rezeptors. Die Struktur zeigt, dass die LRR-Domäne von Nalp1 aus sechs vollständigen
Leucin-reichen Wiederholungen besteht, die aus insgesamt sieben α-Helices und sieben
β-Strängen geformt werden. Durch den geometrischen Vergleich mit LRR-Domänen anderer
Proteine konnte die LRR-Domäne von Nalp1 der RI-ähnlichen Unterfamilie von LRR
Proteinen zugeordnet werden.
Unter Verwendung unterschiedlicher biophysikalischer Methoden wurde untersucht,
ob Muramyldipeptid (MDP) an die isolierte LRR-Domäne von humanem Nalp1 bindet. In der
Literatur ist MDP als Pathogen-assoziierte molekulare Struktur beschrieben worden, die
in vitro den Rezeptor aktiviert. Ligandenbindungsstudien über Isothermale Titrationskaloriemetrie,
Fern-UV CD Spektroskopie sowie Fluoreszenz- und Polarisationsspektroskopie
zeigten keine Interaktion zwischen MDP und der LRR-Domäne von humanem Nalp1.
Aus den Ergebnissen dieser Arbeit kann für den Aktivierungsmechanismus des
humanen Nalp1 gefolgert werden, dass die LRR-Domäne des Rezeptors alleine nicht
ausreichend ist für die Bindung des Liganden
The Space-Time Continuum of Ras Signal Transduction Pathway
No full textDie räumliche Aufteilung periphärer Membran-Proteine, wie GNBP (Ras) moduliert
deren Spezifität der Signalverarbeitung innerhalb der Zelle. Reversible
Palmitoylierung durch Palmitoylacyltransferasen (PATs der DHHC der DHHC
Familie) erzeugt die Verteilung von Ras hin zu der Plasma-Membran (PM) über den
sekretorischen Weg, indem der entropie-getriebenen Gleichverteilung palmitoylierter
Proteine auf alle Zellmembrane entgegenwirkt wird (Rocks et al., 2010). In dieser
Arbeit wird beschrieben, dass DHHC-PATs sich nicht durch Substratspezifität
auszeichnen und es wird postuliert, dass DHHC Proteine die Palmitoylierungsreaktion
nicht katalysieren. Stattdessen verstärken sie die Konzentration des Palmitat-
Thioester-Zwischenproduktes und erzeugen auf diese Weise ein zytosolisches
Reservoir um Palmitoylierung zu vereinfachen.
In dieser Arbeit soll ebenfalls beschrieben werden, wie GSF PDEδ den zügigen
Transfer von Ras Protein zwischen PM, Golgi Apparat, endoplasmatischem
Retikulum (ER) und Zytoplama unterstützt. Weiterhin wird aufgezeigt werden, dass
dies allein solche farnesylierten Ras Proteine betrifft, welche depalmitoyliert oder, im
Fall von Ras mit polykationischem Motiv, PM-desorbiert sind. In Verbindung mit
dem Palmitoylierungskreislauf wirkt PDEδ, indem es die Diffusion von
depalmitoyliertem Ras vereinfacht und erlaubt so dessen kinetisches
Eingefangenwerden am Golgi Apparat ermöglicht. Andererseits erhöht die
Solubilisierung von Kras, welches ein polybasisches Segment auszeichnet, weg von
Endomembranen die Geschwindigkeit, mit der Kras von der PM wieder eingefangen
werden kann, wodurch dessen Equilibriumsverteilung aufrecht erhalten wird. Dies ist
wichtig, da PDEδ auf diese Art die durch Ras vermittelte Signaltransduktion
verstärkt, indem es die Ras-Konzentration an der PM erhöht, und im Gegenzug
bewirkt das Herunterregeln von PDEδ ein Unterdrücken von regulierten und
onkogenischen Ras Signalen. Zusätzlich wird die Regulierung von farnesyliertem
Ras*PDEδ Einheiten via G-Protein Arl2/Arl3 auf eine GTP-abhängige Art
beschrieben. Diese Erkenntnis deckt einen von PDEδ-abhängigen Mechanismus auf,
der für die räumliche Organisation von Ras Proteinen in Zellmembranen
verantwortlich ist und dessen Einfluss auf das Signalverhalten von Ras Wildtyp- bzw.
mutierter Form
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