32 research outputs found
Glicoproteínas en el cristalino de embrión de pollo : Biosíntesis de la porción N-glicosídica
No full textFil: Mentaberry, Alejandro Néstor. Universidad de Buenos Aires. Facultad de Ciencias Exactas y Naturales; Argentina
Glicoproteínas en el cristalino de embrión de pollo : Biosíntesis de la porción N-glicosídica
No full textFil: Mentaberry, Alejandro Néstor. Universidad de Buenos Aires. Facultad de Ciencias Exactas y Naturales; Argentina
Fitorremediación
No full textLa “fitorremediación” consiste en la utilización de las plantas y de los microorganismos asociados a las mismas con fines de descontaminación del medio ambiente. En este contexto, las plantas pueden considerarse como sistemas naturales de extracción y tratamiento de contaminantes. A diferencia de los métodos de tratamiento tradicionales, la energía requerida para su funcionamiento proviene del sol, el costo de mantenimiento es reducido y los efectos indeseados son mínimos.Fil: Segretin, Maria Eugenia. Consejo Nacional de Investigaciones Científicas y Técnicas. Instituto de Investigaciones en Ingeniería Genética y Biología Molecular "Dr. Héctor N. Torres"; ArgentinaFil: Bey, Paula. Consejo Nacional de Investigaciones Científicas y Técnicas. Instituto de Investigaciones en Ingeniería Genética y Biología Molecular "Dr. Héctor N. Torres"; ArgentinaFil: Mentaberry, Alejandro Nestor. Consejo Nacional de Investigaciones Científicas y Técnicas. Instituto de Investigaciones en Ingeniería Genética y Biología Molecular "Dr. Héctor N. Torres"; Argentin
Plant viral vectors as a tool for recombinant vaccine production
No full textOver the last few years the development of plant viral vectors for protein expression has made rapid and impressive progress. Plant viruses are versatile vectors for production of proteins since they are easy to manipulate, quick to evaluate and offer de possibility of large production yields. They are particularly powerful expression systems for the production of recombinant proteins and peptides for vaccination, since they are able to produce antigens alone or conjugated to viral capsids. Several viral vector have been developed for vaccine production, mainly Tobacco mosaic virus (TMV) and Potato virus X (PVX). In this review, we will discuss the advantages of the use of plant virus vectors as expression vectors, the principal vectors that have been developed to date, and the different strategies used for expression, with emphasis on recent research conducted in ArgentinaFil: Bey, Paula. Consejo Nacional de Investigaciones Científicas y Técnicas. Instituto de Investigaciones en Ingeniería Genética y Biología Molecular "Dr. Héctor N. Torres"; ArgentinaFil: Binaghi, María. Consejo Nacional de Investigaciones Científicas y Técnicas. Instituto de Investigaciones en Ingeniería Genética y Biología Molecular "Dr. Héctor N. Torres"; ArgentinaFil: Mentaberry, Alejandro Nestor. Consejo Nacional de Investigaciones Científicas y Técnicas. Instituto de Investigaciones en Ingeniería Genética y Biología Molecular "Dr. Héctor N. Torres"; ArgentinaFil: Zelada, Alicia Mercedes. Consejo Nacional de Investigaciones Científicas y Técnicas. Instituto de Investigaciones en Ingeniería Genética y Biología Molecular "Dr. Héctor N. Torres"; Argentin
Characterization of the 24 kDa protein of potato virus X, and production of transgenic plants with resistance to tobamovirus
No full textLa proteína de 24 kDa (p24) del potato virus X (PVX) es una de las tres proteínas responsables del transporte de este virus en plantas infectadas. En este trabajo de Tesis se obtuvieron anticuerpos específicos contra p24, con los cuales se pudo detectar y caracterizar su expresión en protoplastos y en tejido de plantas de tabaco infectadas. También, se obtuvieron plantas transgénicas que expresan p24 y que pueden complementar el transporte de un mutante de PVX defectivo en este gen. Las plantas transgénicas que producen altos niveles de p24 presentan un fenotipo alterado, que consiste en plantas enanas y cloróticas. Estas plantas mostraron resistencia a la infección con los tobamovirus tobacco mosaic virus (TMV)y tomate virus Ob (ToMV-Ob). Sin embargo, cuando se las infectó con PVX o con el potato virus Y (PVY), no mostraron diferencias en los niveles de virus con respecto a las plantas no transformadas, aunque los síntomas de infección con PVX fueron más severos. Recíprocamente, las plantas transgénicas que expresan la proteína de movimiento (MP) de TMV mostraron resistencia a PVX cuando se inocularon con este virus. Por último, se realizaron estudios de complementación entre mutantes de TMV y de PVX defectivos en transporte, con las plantas transgénicas que expresan p24 y la MP de TMV, para estudiar el grado de interacción entre los sistemas de transporte de ambos virus.The p24 protein, one of the three proteins implicated in local movement of potato virus X (PVX). was expressed in transgenic tobacco plants (Nicotiana tabacum, Xanthi D8 NN). Plants with the highest level of p24 accumulation exhibited a stunted and slightly chlorotic phenotype. These transgenic plants facilitate the cell-to-cell movement of a mutant of PVXthat contained a frameshift mutation in p24, indicating that the transgenic protein provides movement function and is able to act in trans. Upon inoculation with tobacco mosaic virus (TMV),the size of necrotic local lesions was significantly smaller in p24 plants than in nontransgenic. control plants. Resistance to tobamoviruses was also evidenced after inoculation of p24 plants with Ob, a virus that evades the hypersensitive response provided by the N gene. In the later case. no systemic symptoms were observed. and virus accumulation remained low or undetectable by Western immunoblot analysis and back-inoculation assays. In contrast, no differences were observed in virus accumulation after inoculation with PVX, although more severe symptoms were evident on p24 expressing plants compared with control plants. Similarly, infection assays conducted with potato virus Y (PVY) showed no differences between control and transgenic plants. On the other hand, a considerable delay in virus accumulation and symptom development was observed when transgenic tobacco plants containing the MP of TMV were inoculated with PVX. Finally, a movement detective mutant of TMV was inoculated on p24 plants or in mixed infections with PVX on non-transgenic plants. Both types of assays failed to produce TMV infections, implying that TMV MP is not interchangeable with the PVX movement proteins.Fil:Ares, Vera Ximena. Universidad de Buenos Aires. Facultad de Ciencias Exactas y Naturales; Argentina
Análisis de la interacción planta-virus mediante la caracterización molecular de plantas transgénicas que expresan proteínas de movilización de PVX
No full textDurante la primera etapa del presente trabajo, se transformaron Nicotiana tabacumcon el gen ORF3 que codifica la proteina p12 de PVX,con el fin de estudiar los efectosque provoca la expresión de esta proteina viral en la interacción planta-virus. A pesarde que las plantas transgénicas mostraron un aspecto normal, observaciones hechascon el microscopio revelaron la presencia de alteraciones en sus hojas. Al infectarestas plantas con PVX,se observó en sus hojas la aparición de sintomas atípicos y eldesarrollo de resistencia al virus. Los sintomas consistlan en la formación de anillosamarillos concéntricos rodeados de tejido necrosado. Además, los mismos eranacompañados de cambios bioquímicos asociados a la respuesta hipersensible (HR), yno se formaban en plantas transgénicas sanas ni en plantas no transgénicasinfectadas con PVX.No se observó una resistencia similar cuando las plantas p12 seinocularon con TMV o PVY. lo que sugirió la existencia de un mecanismo deresistencia específica contra PVX.A pesar de la aparición de sintomas de tipo HR, nose observó la inducción de una respuesta SAR en plantas p12 infectadas con PVX. Tampoco, se encontraron evidencias que indiquen la presencia de resistencia mediadapor RNA. Durante la segunda etapa del trabajo, se analizaron plantas transgénicas previamentetransformadas con el gen ORF2 que codifica la protelna p24 de PVX. con el fin deestudiar las alteraciones fisiológicas provocadas por la expresión de la misma. Estasplantas mostraron una apariencia clorótica y un marcado enanismo. A pesar de poseerhojas más pequeñas. distancias intemodales más cortas y reducción del tamaño entodos sus órganos, las plantas p24 poseían una relación de los tamaños tallo/raíznormal. Además, el tamaño de meristema radicular resultó más pequeño que el de lasplantas control. Otros análisis revelaron que la tasa fotosíntética estaba disminuida enlas plantas p24 y que los niveles de almidón, tanto en las hojas como en las raices, seencontraban reducidos. Además, las hojas mostraron un alto contenido de nitrato yuna considerable acumulación de transcriptos de proteinas PR. Varias lineas deevidencia sugieren que el fenotipo enano de las plantas p24 serla una consecuenciadirecta de la actividad de la proteina p24, y no un efecto indirecto de la disminución dela fotosíntesis o de los cambios metabólicos.In the first part of the present work, Nicotiana tabacum were transformed with the PVX ORF3 gene coding for the p12 protein, with the aim of studying the effects provoked byits overexpression. Although the transgenic plants exhibited a normal morphologicalaspect, microscopic examination revealed extensive alterations in leaf tissue structure. After challenging with PVX, the transgenic plants showed resistance to PVX infectionand formation of leaf symptoms consisting of concentric rings encircled by necroticborders. These novel symptoms were accompanied by biochemical changes normallyassociated with the Hypersensitive Response (HR) and were absent in non-infectedtransgenic plants or in PVX-infected non-transgenic plants. No equivalent virusresistance was observed after inoculation with TMV or PVY, suggesting the presenceof a specific resistance mechanism in p12 plants. Despite the development of HR-likesymptoms, SAR was not induced in PVX-infected p12 transgenic plants. No evidenceof an RNA-mediated resistance mechanism was found. During the second part of this work, transgenic N. tabacum plants previouslytransformed with the PVX ORF2 gene coding the p24 movement protein were furtheranalyzed with the aim of studying the physiological alterations provoked by viral MP. These plants exhibit a slightly chlorotic appearance and a pronounced stuntedphenotype. Although p24 plants have smaller leaves, shorter internodes and reducedorgans, their shoot to root ratio remained similar to that of control plants. Moreover,root meristems were smaller in p24 plants than in control plants. Further analyses oftransgenic plants showed considerable reductions in photosynthetic rates and lowerstarch levels in both leaves and roots. In addition, p24 leaves showed higher nitratelevels and a significant accumulation of PRs transcripts. Different lines of evidencesuggest that the stunted phenotype observed in p24 plants is a direct consequence ofp24 activity and not an indirect effect derived from diminished photosynthesis or othermetabolic changes.Fil: Kobayashi, Ken. Universidad de Buenos Aires. Facultad de Ciencias Exactas y Naturales; Argentina
Studies on the phosphorylation of the TGBp1 movement protein of Potato virus X
No full textEl Potato virus X (PVX) es un virus de plantas, miembro tipo del género Potexvirus. Su genoma está compuesto por una única molécula de ARN que codifica una replicasa viral, tres proteínas de movimiento (MPs: TGBp1, TGBp2 y TGBp3) y la proteína de la cápside (CP). La proteína TGBp1 es una proteína multifuncional requerida para el movimiento viral de célula a célula en la planta hospedera. Diferentes líneas de investigación sugieren que la fosforilación de las proteínas virales puede regular la replicación y el movimiento viral. En este estudio, se demostró que la proteína TGBp1 es fosforilada por al menos una proteína quinasa, presente en extractos de plantas de Nicotiana tabacum infectadas con PVX y no infectadas, que posee características distintivas de la caseína quinasa 2 (CK2). El análisis en geles bidimensionales de extractos de plantas infectadas permitió determinar que la proteína TGBp1 producida durante la infección viral presenta múltiples isoformas de diferentes puntos isoeléctricos; el tratamiento con fosfatasas de los extractos de plantas infectadas indicó la presencia de isoformas fosforiladas. A través de la combinación de estudios de determinación de aminoácidos fosforilados por espectrometría de masa, comparación de secuencias aminoacídicas de TGBp1 de distintos virus y evaluación de la fosforilación in vitro de mutantes puntuales y de deleción de la proteína TGBp1, se identificaron tres probables sitios de fosforilación por la quinasa CK2 de N. tabacum: S-165, T-193, T-214. Se observó que la simulación de la fosforilación en los residuos T-193 y T-214 regula negativamente la dispersión viral y la capacidad de la proteína TGBp1 de hidrolizar ATP. Los resultados sugieren firmemente que una proteína quinasa de la familia de CK2 estaría involucrada en la fosforilación de TGBp1 durante el curso de la infección viral de N. tabacum. Además, se discute el modo en que la fosforilación podría regular las actividades de la proteína TGBp1 durante la infección viral.Potato virus X (PVX) is the type member of the Potexvirus genus. Its genome is based on a single RNA molecule encoding one viral replicase protein, three movement proteins (MPs: TGBp1, TGBp2 and TGBp3) and the capside protein (CP). In particular, TGBp1 is a multifunctional protein required for virus cell-to-cell movement inside the host plant. Recent work on other plant viruses has indicated that viral proteins phosphorylation by host kinases can regulate processes such us viral replication and mobilization. The results obtained during this Thesis work show that TGBp1 is phosphorylated by at least one kinase protein with properties characteristic of Caseinkinase 2 (CK2). This kinase activity is present in crude extracts prepared from both non-infected and PVX infected Nicotiana tabacum plants. Bi-dimensional gel experiments with crude extracts from PVX infected plants showed that TGBp1 expressed during infection presented several isoforms with different Isoelectrical points. Some of these isoforms were sensitive to phosphatase treatment, suggesting that TGBp1 is phosphorylated in multiple residues. Several experimental approaches (mass spectrometer identification of phosphorylated aminoacids, sequence comparison among TGBp1 homologues from several viruses, and in vitro phosphorylation experiments with mutated versions of TGBp1), allowed the identification of three potential phosphorylation sites by recombinant alpha subunit N. tabacum CK2: S-165, T-193 and T-214. Mimicking phosphorylation on residues T-193 and T-214 had a negative impact on viral spreading and TGBp1 ATP hydrolysis activity. The results presented in this Thesis strongly suggest that a N. tabacum kinase protein belonging to CK2 family is involved in the phosphorylation of TGBp1 during PVX infection. How the phosphorylation regulates TGBp1 activities is discussed.Fil:Módena, Natalia A.. Universidad de Buenos Aires. Facultad de Ciencias Exactas y Naturales; Argentina
Phosphorylation of the TGBp1 movement protein of Potato virus X by a Nicotiana tabacum CK2-like activity
No full textThe movement protein (MP) TGBp1 of the potexvirus Potato virus X (PVX) is a multifunctional protein required for cell-to-cell movement within the host plant. Recent work on other plant viruses has indicated that MP phosphorylation by host kinases can regulate MP function. In this study, we demonstrate that recombinant and native TGBp1 are phosphorylated by Nicotiana tabacum extracts from both PVX-infected and non-infected leaves. The phosphorylation activity present in plant extracts has distinctive characteristics of casein kinase 2 (CK2): it is inhibited by heparin, stimulated by polylysine, and uses either ATP or GTP as phosphoryl donors. We also demonstrate that TGBp1 is efficiently phosphorylated by recombinant tobacco CK2 α subunit and by partially purified tobacco CK2. Phosphopeptide mass mapping reveals that TGBp1 is phosphorylated in Ser-165, which is localized within a CK2 consensus sequence. Our results strongly suggest that a N. tabacum kinase of the CK2 family is involved in TBGp1 phosphorylation during the course of viral infection.Fil: Modena, Natalia Andrea. Consejo Nacional de Investigaciones Científicas y Técnicas. Instituto de Investigaciones en Ingeniería Genética y Biología Molecular "Dr. Héctor N. Torres"; Argentina. Universidad de Buenos Aires. Facultad de Ciencias Exactas y Naturales; ArgentinaFil: Zelada, Alicia Mercedes. Consejo Nacional de Investigaciones Científicas y Técnicas. Instituto de Investigaciones en Ingeniería Genética y Biología Molecular "Dr. Héctor N. Torres"; Argentina. Universidad de Buenos Aires. Facultad de Ciencias Exactas y Naturales; ArgentinaFil: Conte, Ana Florencia. Universidad de Buenos Aires. Facultad de Ciencias Exactas y Naturales; Argentina. Consejo Nacional de Investigaciones Científicas y Técnicas. Instituto de Investigaciones en Ingeniería Genética y Biología Molecular "Dr. Héctor N. Torres"; ArgentinaFil: Mentaberry, Alejandro Nestor. Consejo Nacional de Investigaciones Científicas y Técnicas. Instituto de Investigaciones en Ingeniería Genética y Biología Molecular "Dr. Héctor N. Torres"; Argentina. Universidad de Buenos Aires. Facultad de Ciencias Exactas y Naturales; Argentin
Optimization of the expression of a PVX-based viral amplicon in tobacco plants. Functional characterization of the 15 kDa protein from Garlic mite-borne filamentous virus
No full textCon el objetivo de optimizar la producción de proteínas heterólogas en plantas se desarrolló un sistema de expresión basado en un amplicón derivado del genoma del PVX. Se diseñaron distintos amplicones virales que permiten la expresión, tanto constitutiva como inducible, de proteínas recombinantes. La utilización del amplicón constitutivo permitió obtener, por primera vez, plantas transgénicas que sobrexpresan altos niveles de proteínas virales. Además, se logró expresar exitosamente GFP a partir de un amplicón inducible, tanto en ensayos de expresión transitoria como en plantas transgénicas. Uno de los problemas que dificultan la producción de proteínas de interés en plantas utilizando vectores virales es el establecimiento de respuestas de silenciamiento génico postraduccional (PTGS) en respuesta a la replicación viral. Para intentar superar esta dificultad, se propuso co-expresar un amplicón viral junto con una proteína supresora del PTGS. Se caracterizó la actividad de una nueva proteína supresora del PTGS, la proteína 15K codificada en el genoma del Garlic mite-borne filamentous virus (GmbFV). Si bien esta proteína muestra una actividad supresora débil en plantas silenciadas por agroinfiltración con transgenes u horquillas de silenciamiento, presenta la ventaja de no producir fenotipos aberrantes en plantas transgénicas. Mediante la co-agroinfiltración con construcciones que expresan la proteína 15K y el amplicón PVX-2aA (amplicón que expresa el epítope 2aA del virus de aftosa) se lograron obtener altos niveles de una fusión del epítope de interés a la cápside viral en plantas de Nicotiana benthamiana en un corto período de tiempo. Este resultado sugiere que es posible generar sistemas estables que permitan obtener altos niveles de expresión mediante el cruzamiento entre plantas transgénicas que expresen la proteína supresora 15K y amplicones de interés.In order to optimize the production of heterologous proteins in plants, an expression system based on the PVX genome has been developed. Several viral amplicons have been designed with the purpose of expressing recombinant proteins, either constitutively or in an inducible manner. The use of constitutive amplicons led, for the first time, to the generation of transgenic plants which over-express high levels of viral proteins. Moreover, GFP protein was successfully expressed from an inducible amplicon, both in transient expression assays and in transgenic plants. One of the problems that hinder the production of heterologous proteins using plant viral vectors is the establishment of post-transcriptional gene silencing (PTGS) in response to viral replication. In an attempt to overcome this restriction, the co-expression of PTGS- suppressor proteins and viral amplicons was explored. The 15K protein of Garlic mite-borne filamentous virus (GmbFV) has been characterized as a new PTGS-suppressor. Although this protein shows suppressor activity in agroinfiltration assays triggered by both transgenes or silencing hairpins, it has the advantage of avoiding the development of aberrant phenotypes in transformed plants. Co-agroinfiltration of the 15K protein and the PVX-2aA amplicon (harbouring the 2aA epitope of Foot and mouth disease virus) yielded high levels of a fusion comprising the epitope of interest and the PVX coat protein in N. benthamiana. This result suggest that stable expression systems could be developed by crossing of transgenic plants carrying the 15K suppressor protein and plant viral amplicons.Fil:Bey, Paula. Universidad de Buenos Aires. Facultad de Ciencias Exactas y Naturales; Argentina
Transgenic tobacco plants expressing the Potato virus X open reading frame 3 gene develop specific resistance and necrotic ring symptoms after infection with the homologous virus
No full textTobacco plants were transformed with the open reading frame 3 gene from Potato virus X (PVX) coding for the p12 protein. Although the transgenic plants exhibited a normal morphological aspect, microscopic examination revealed extensive alterations in leaf tissue structure. After being challenged with PVX, the transgenic plants showed resistance to PVX infection and formation of specific leaf symptoms consisting of concentric rings encircled by necrotic borders. These novel symptoms were accompanied by biochemical changes normally associated with the hypersensitive response (HR) and were absent in noninfected transgenic plants or in PVX-infected nontransgenic plants. No equivalent virus resistance was observed after inoculation with Tobacco mosaic virus or Potato virus Y, suggesting the presence of a specific resistance mechanism. Despite development of HR-like symptoms, systemic acquired resistance was not induced in PVX-infected p12 transgenic plants. No evidence of an RNA-mediated resistance mechanism was found.Fil: Kobayashi, Ken. Consejo Nacional de Investigaciones Científicas y Técnicas. Instituto de Investigaciones en Ingeniería Genética y Biología Molecular "Dr. Héctor N. Torres"; ArgentinaFil: Cabral, Silvia. Consejo Nacional de Investigaciones Científicas y Técnicas. Instituto de Investigaciones en Ingeniería Genética y Biología Molecular "Dr. Héctor N. Torres"; ArgentinaFil: Calamante, Gabriela. Instituto Nacional de Tecnología Agropecuaria. Centro Nacional de Investigaciones Agropecuarias Castelar. Centro de Investigación en Ciencias Veterinarias y Agronómicas. Instituto de Biotecnología; Argentina. Universidad de Buenos Aires. Facultad de Ciencias Exactas y Naturales; ArgentinaFil: Maldonado, Sara Beatriz. Consejo Nacional de Investigaciones Científicas y Técnicas; Argentina. Universidad de Buenos Aires. Facultad de Ciencias Exactas y Naturales; ArgentinaFil: Mentaberry, Alejandro Nestor. Consejo Nacional de Investigaciones Científicas y Técnicas. Instituto de Investigaciones en Ingeniería Genética y Biología Molecular "Dr. Héctor N. Torres"; Argentin
