Laboratoire d'Ingénierie des Systèmes Biologiques et des Procédés
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Réalisation d'un système de conversion et de gestion de l'énergie d’un système photovoltaïque pour l’alimentation des réseaux de capteurs sans fil autonomes pour l’application aéronautique
No full textLe projet SACER vise à répondre aux demandes d’Airbus qui ont besoin de disposer de données décrivant le comportement d’un avion ou d’un satellite avant commercialisation ou lancement. Pour mieux répondre à cette demande, un réseau de capteurs sans fil remplacerait les équipements de test filaires existants. Le but est d’apporter des avantages tels qu’une réduction de poids, de coût et de connectique. Pour notre part, nous n’avons travaillé que sur l’application aéronautique.Pour alimenter les capteurs autonomes sans fil embarqués, dans le cadre de cette thèse, il faut concevoir une architecture de récupération d’énergie, un système de stockage de l’énergie ainsi que un circuit de gestion de ces énergies. La principale contrainte pour le système est qu’il doit pouvoir fonctionner de -50C à 100°C, tout en délivrant une puissance de sortie de 3 watts. De plus, l’épaisseur du système doit être inférieure à 3,2 mm.\ud
Pour notre travail, nous avons cherché, dans un premier temps, la meilleure solution possible sur le choix du type de cellules solaires. Le résultat sur les tests des cellules à différentes températures et irradiations dans les conditions de notre application est présenté. Dans un second temps, nous avons testé plusieurs types de systèmes de stockage d’énergie aux températures extrêmes. Enfin, la conception de l’architecture pour la gestion de l’énergie (vue d’ensemble des panneaux photovoltaïques, d’un circuit MPPT, des super condensateurs, et d’un régulateur) est présentée.---------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------Flight tests of a commercial aircraft consist in gathering data during flight to validate aircraft design. However they are very expensive for various reasons. One of them is that most of the sensors implemented to collect data are wired. As an example, for the sole system that monitors the vibrations onboard a large (more than 100 seats) aircraft, more than 100 sensors may be deployed. Such networks are complex to implement, mainly because of the required wiring. A wireless solution is therefore of great interest; however, such a cable-less implementation implies both wireless transmission of data together with energy autonomy.\ud
The purpose of this work is therefore to describe a design of a power generation system, focusing on photovoltaic, together with the associated management strategies for an autonomous wireless sensor network deployed for large aircraft in-flight tests. This work is a part of SACER project. The main requirements are related to the thickness of the system (less than 3,2mm in order not to disturb the aerodynamic air flow) and the output power (3 W per sensor node in order to power the sensor, data processing and transmission system). In addition, the system has to properly work at extremely high and low temperature (-50 to 100°C). Our system consists of three primary components to consider: Energy Harvesting system, Energy storage device and Energy management system.\ud
In this work, we firstly present the comparison of the performance of different photovoltaic technologies at different temperatures concerning their availability and achievable power density in aircraft applications. Secondly, we will investigate the possibility of using batteries and supercapacitor. Finally the power management system, composed by a photovoltaic panel, a power conditioning (MPPT function), supercapacitors and a DC/DC regulator, is presented.\ud
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Développement d'outils et de méthodologies pour l'étude de l'organisation et de la localisation in-vivo de\ud micro-organismes dans des structures biologiques complexes.\ud
No full textCe projet concerne l’analyse de l’organisation de populations microbiennes au sein de structures complexes\ud
comme des dépôts ou des biofilms.\ud
Si différentes méthodes sont couramment utilisées pour étudier la structure globale ou l’organisation locale\ud
d’agrégats microbiens, peu d’entre elles, permettent de réaliser simultanément ces deux analyses et nécessitent\ud
souvent des étapes de préparation qui pénalisent un approche in-vivo et en dynamique.\ud
La stratégie proposée repose sur la mise en oeuvre de micro-organismes modèles autofluorescents (levures et\ud
bactéries) qui peuvent sans aucun traitement être directement observés en microscopie. La similitude du\ud
comportement physiologique de ces micro-organismes avec celui des souches sauvages a été démontrée. Les\ud
conditions d’acquisition des images en microscopie confocale ont été optimisées. Des dispositifs spécifiques ont\ud
été conçus pour générer des dépôts ou des biofilms dans des conditions de contraintes physico-mécaniques et\ud
biochimiques maîtrisées afin d’analyser simultanément leurs caractéristiques et les performances du bioprocédé.\ud
Ainsi les dépôts ont pu être observés in-vivo et in-situ grâce à une cellule de filtration équipée d’une fenêtre\ud
d’observation. Le développement d’un biofilm mixte composé de levures et bactéries modèles autofluorescentes,\ud
dans un réacteur continu spécifique, a également été analysé par microscopie confocale.\ud
Le traitement et les analyses des images acquises au cours des expériences ont été effectués et ont permis\ud
d‘étudier la structure globale des agrégats biologiques et l’organisation tridimensionnelle des micro-organismes\ud
dans ces structures, en mettant par exemple en évidence une répartition hétérogène de deux populations\ud
microbiennes dans des dépôts de filtration ou en comparant la capacité de deux espèces microbiennes à former\ud
des biofilms en étudiant in-vivo la dynamique de croissance de chacune des espèces.\ud
Cette étude a en outre permis de démontrer la pertinence de la méthode proposée, de définir ses limites et son\ud
champ d’application.------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------The aim of this project deals with the analysis of both the local localization and organization of microbial\ud
populations in complex structures such as deposits or biofilms. Different methods are currently used to study the\ud
global structure or the local organization of biological aggregates but only few ones allow a combined approach\ud
and require ex-vivo analyses.\ud
The proposed strategy uses home-designed model auto-fluorescent microorganisms (yeasts and bacteria) which\ud
can be observed directly by microscopy without any dying treatment. Same kinetic behaviours between the wild\ud
strains and their recombinant ones were demonstrated. The confocal microscopy conditions were optimised.\ud
Specific devices were developed to generate deposits or biofilms under controlled and known hydrodynamic or\ud
biochemical environment conditions to analyse their structure characteristics linked to the bioprocess\ud
performances.\ud
Based on the proposed strategy, microbial deposits modifications due to pressure constraints were observed in\ud
vivo in a specifically designed flow cell equipped with a microscope glass coverslip. A mixed biofilm composed\ud
by our auto-fluorescent yeasts and bacteria was carried out in a specific bioreactor allowing the sampling of\ud
biofilms during their development to be analysed by confocal microscopy. Both studies have shown specific\ud
organisations between yeasts and bacteria mainly depending on their size and on the environment conditions\ud
(pressure or dilution rate).\ud
These studies of both local and global structure of biological aggregates and 3D-organisation of the\ud
microorganisms within theses structures demonstrated the relevance of the proposed strategy defining the limits\ud
of the method and proposing various perspectives for further characterizations and applications.\ud
Keys words: Biological aggregates, Structure, Organization, Fluorescent micro-organisms, Confocal Microscopy\ud
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Malicious traffic observation using a framework to parallelize and compose midpoint inspection devices
Get PDFNotre thèse stipule qu'au vu de l'ampleur des agissements malveillants dans l'Internet, les logiciels d'extrémité doivent être surveillés. Pour limiter le nombre de points de surveillance, nous proposons de surveiller les logiciels depuis un point d'interconnexion. Nous avons dans ce but conçu Luth, un outil permettant de composer et de paralléliser un ensemble d'inspecteurs de points d'interconnexion (appelés MI) qui implémentent des mini IDS, IPS ou pare-feux, tout en vérifiant la correction et l'optimalité de ces derniers, à l'aide d'un langage de configuration et des algorithmes associés. Nous utilisons ensuite cet outil pour surveiller des logiciels d'extrémité permettant l'observation de trafic malveillant. Premièrement, après avoir démontré la nécessité de surveiller des pots de miels collecteurs de logiciels malveillants en concevant une attaque originale, nous montrons comment nous configurons Luth pour bloquer les attaques précédemment créées tout en laissant passer les attaques émulées par le pot de miel. Dans un second temps, nous utilisons Luth pour implémenter un bac-à-sable permettant d'analyser dynamiquement et aussi sûrement que voulu, les communications réseaux des logiciels malveillants. Nous montrons comment les informations obtenues par cette analyse permettent de regrouper ces logiciels et ainsi de limiter le nombre de binaires à analyser manuellement. Ensuite nous montrons comment nous générons automatiquement des signatures permettant la détection de ces virus depuis un point d'interconnexion.------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------Our Ph.D states that given the magnitude of malicious behavior in the Internet, end-host software must be monitored. To limit the number of monitoring points, we propose to monitor the software from an interconnection point, i.e. a midpoint. We have designed for this purpose Luth, a tool to compose and parallelize a set of midpoint inspectors (MI) that implement mini IDS, IPS or firewall-s, while checking the correction and optimality of the resulting inspection tree, using a configuration language, its interpreter and associated algorithms. We then configure this tool to monitor some end-host software used to observe malicious traffic. First, we demonstrate why malware downloading honeypots must be monitored by designing an original attack. Then, we show how we configure Luth to block these attacks while accepting the intrusions emulated by the honeypot. In a second step, we use Luth to implement a sandbox that analyzes dynamically and as safely as wanted malware's network communications. We show how the information obtained by this analysis enables us to cluster the analyzed malware and therefore limit the number of malware to analyze manually. Finally, we show how we automatically generate signatures from this analysis to detect those malware from a midpoint device
Analyse en Stabilité et Synthèse de Lois de Commande pour des Systèmes Polynomiaux Saturants
Get PDFLa classe des systèmes non-linéaires dont la dynamique est définie par un champ de vecteurs polynomial est étudié. Des modèles polynomiaux peuvent représenter différents systèmes réels ou bien definir des approximations plus riches que des modèles linéaires pour des systèmes non-linéaires différentiables.\ud
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Des techniques de programmation semi-définie développées récemment ont rendu possible l'étude de cette classe de systèmes avec des outils numériques. Le problème d'analyse en stabilité locale est résolu via des conditions basées sur la positivité de polynomes. Dans le cadre de la synthèse de lois de commande nous proposons un changement de variables linéaire pour traiter la synthèse de lois de commande non-linéaire qui garantissent la stabilité locale. Les ensembles définissant des estimations de\ud
la région d'attraction, définis par des courbes de niveau de la fonction de Lyapunov pour le système, sont également donnés par des fonctions polynomiales.--------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------We study the class of nonlinear dynamical systems which vector field is defined by polynomial functions. A large set of systems can be modeled using such class of functions. Tests for stability are formulated as semidefinite programming problems by considering positive polinomials to belong to the class of Sum of Squares polynomials. Polynomial control law gains are computed based on a linear change of coordinates and\ud
guarantee the local stability of the closed-loop system. Lyapunov theory is then applied in order to obtain estimates of the region of attraction for stable equilibrium points. Such estimates are given by level sets of polynomial positive functions.\ud
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Croissance physique d'îlots de Pt et Co sur oxydes pour l'auto-organisation de nano-bâtonnets de Co élaborés par synthèse chimique.\ud
No full textLe sujet de thèse s’inscrit dans le cadre des stratégies visant à organiser des nanostructures, plus particulièrement les stratégies visant à augmenté la densité d’information dans les médias magnétique. Les techniques de synthèse en chimie douce utilisés au LPCNO-INSA on permet d’élaborer des nano-bâtonnets monocristallins de cobalt dont les propriétés ferromagnétiques en termes d’anisotropie et d’aimantation présentent un grand intérêt pour des applications dans le domaine du stockage magnétique. La maitrise de la croissance de ces nano-bâtonnets de Co organisés perpendiculairement sur un substrat peut permettre de réaliser un média de forte densité. \ud
Nous avons dans un premier temps vérifié la croissance perpendiculaire de nano bâtonnets de cobalt monocristallins sur une couche continue de Pt (111) épitaxiée sur un substrat de saphir (Al2O3) et montré que cette combinaison de deux types de dépôts (physique et chimique) donne effectivement lieu à un réseau dense et perpendiculaire de bâtonnets de Co. Pour but d’organiser cette croissance et découpler physiquement les bâtonnets de Co nous avons alors étudié la croissance de ces bâtonnets de Co sur des îlots 3D métalliques de Pt et de Co.\ud
En première partie nous avons étudié la structure cristalline, La morphologie, les distributions en taille et l’état des contraintes des îlots de Pt et Co déposée sur la surface (0001) du saphir et la surface (001) du MgO par pulvérisation cathodique. Et en deuxième partie, nous avons étudié la croissance des nano bâtonnets de Co sur les ilots de Pt et de Co maitrisés dans l’étape précédente.-----------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------The subject of this thesis is to be part of strategies in order to organize nanostructures, particularly strategies to increase information density in magnetic media. The synthesis techniques used in chemistry (LPCNO-INSA laboratory) is allowed to develop monocrystalline nanorods of cobalt whose ferromagnetic properties in terms of anisotropy and magnetization present a great interest for applications in the field of magnetic storage. The success in controling the growth of these nanorods arranged perpendicularly on a substrate can lead to achieve a high density media. \ud
We tested the perpendicular growth of monocrystalline nanorods of cobalt on a continuous and epitaxial layer of Pt (111) grown on a substrate of sapphire (Al2O3) and showed that this combination of two types of deposits (physical and chemical) give actually a dense and perpendicular network of Co nanorods. In the aim to organizing this growth and decoupling physically the nanorods we studied the growth of these Co nanorods on 3D metallic islands of Pt and Co. \ud
In the first part we studied the crystal structure, morphology, size distributions and the stress state of Pt and Co islands deposited on the surface (0001) of sapphire and (001) surface of MgO by sputtering. And in the second part, we studied the growth of Co nanorods on a Pt and Co islands mastered in the previous step. \ud
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Qualité de service et routage dans les réseaux maillés sans fil
Get PDFCe travail de thèse présente trois contributions qui portent sur le routage et la fourniture de qualité de service dans les réseaux maillés sans fil basés sur IEEE 802.11. La première contribution définit une métrique de routage qui permet de sélectionner les chemins empruntant des liens avec de bonnes performances exprimées en termes d’interférences physiques (qui causent des pertes), d’interférences logiques (qui causent des délais) et de capacité. L’évaluation de cette métrique par rapport aux principales métriques de la littérature scientifique montre une amélioration des performances du réseau. La deuxième contribution concerne l’amélioration du mécanisme de maintenance de route le plus souvent utilisé par les protocoles de routage réactifs. Ce mécanisme considère qu'une route est coupée si l'un de ses liens observe plusieurs échecs successifs de retransmission. Nos études montrent que ces échecs sont assez souvent dûs à de problèmes transitoires sur les liens (bruit, interférence etc.). Nous avons donc proposé des algorithmes de maintenance de route qui appréhendent mieux les problèmes ponctuels ou soutenus sur les liens ce qui permet de prendre une décision cohérente et réfléchie quant à la coupure d’un lien (et donc d'une route). Les études de performances montrent une amélioration conséquente des performances globales du réseau. La dernière contribution propose un cadre pour la fourniture de la Qualité de Service (garantie de bande passante) dans les réseaux maillés multi-interfaces, multi-canaux. Ce cadre intègre un protocole de routage réactif couplé à un mécanisme de contrôle d'admission et de partage de charge. Ces derniers exploitent la diversité des liens entre nœuds voisins afin d’améliorer le taux d’admission des flux avec garantie de bande passante.-----------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------This thesis presents three contributions in the area of routing and Quality of Service for IEEE 802.11-based Wireless Mesh Networks. The first contribution defines a routing metric for the selection of route by taking into consideration the performance of wireless links in terms of physical interference (which causes packet losses), logical interference (which causes delay) and the capacity of the links. The performance evaluation of the proposed metric compared to the popular existing metrics shows an improvement in the performance of the network. The second contribution improves the route maintenance mechanism most often used by reactive routing protocols. The existing mechanism considers a route as broken if any of the links in the route experiences multiple successive transmission failures. Our study shows that the transmission failures are often caused by transient problems on the wireless link (noise, interference etc). We propose a novel mechanism of route maintenance which distinguishes between links with temporary or transient transmission problems compared to those with sustained problems in order to make a coherent decision about link breakage (and consequently route breakage). The performance evaluation shows a substantial improvement in the performance of the network. The final contribution proposes a framework for providing Quality of Service (bandwidth guarantee) in multi-radio multi-channel wireless mesh networks. The framework integrates a reactive routing protocol coupled with an admission control mechanism and load balancing. The framework exploits link diversity between neighboring nodes to improve the flow admission ratio with bandwidth guarantees
Spectroscopie optique et propriétés de spin des boîtes quantiques uniques de GaAs/AlGaAs formées par épitaxie par gouttelettes.
Get PDFCe travail de thèse, essentiellement expérimental, porte sur l'étude par photoluminescence résolue spatialement, temporellement et en polarisation des propriétés de spin des\ud
boîtes quantiques uniques de GaAs/Al GaAs formées par épitaxie par gouttelettes. Les travaux présentés sont organisés autour de trois parties.\ud
Une première partie dédiée à l'étude expérimentale de la corrélation temporelle des photons émis par les boîtes quantiques incorporées dans une membrane bidimensionnelle\ud
de cristaux photoniques. Une dépendance en puissance de la probabilité de coïncidence lors de la corrélation croisée entre les transitions excitonique et biexcitonique de la même boîte est observée et modélisée en fonction du taux d'occupation de la boîte.\ud
Une deuxième partie porte sur les règles de sélection optique dans ces structures, point de départ pour des expériences de pompage optique. L'observation de l'orientation de la polarisation des photons émis par les différentes transitions de la boîte quantique nous\ud
permet de mettre en évidence un couplage entre les états de trous lourds et de trous légers.\ud
Ce couplage est modélisé en fonction de la forme et de l'orientation de la boîte quantique par rapport aux axes cristallographiques. La dernière partie porte sur des expériences de polarisation du spin des noyaux de\ud
la boîte quantique par transfert de la polarisation du spin de l'électron. Ce transfert de polarisation, dû à l'interaction hyperfine entre électron et noyaux, dépend de différents paramètres temporels que nous pouvons ajuster avec notre modèle. Nous présentons également une mesure directe du temps de construction de cette polarisation nucléaire.---------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------This thesis present experimental studies of spin properties in GaAs/AlGaAs quantum dots grown by droplet epitaxy by spatially and temporally resolved photoluminescence measurements. This studies are presented in three different parts. The first part is dedicated to the study of the temporal correlation of the photons emitted by a quantum dot embdedded in two-dimensional photonic crystal membrane. We observe the power dependance of the coincidence probability by cross-correlation measurements between the biexcitonic and the excitonic transitions into a single quantum dot. Our findings are qualitatively understood with a statistic model. The second part focuses on optical selection\ud
rules in these structures, starting point for spin injection experiments. We evidence the mixing between heavy holes and light holes states by analysing the polarisation direction of the luminescence from a single quantum dot. We explain the states mixing by a model that takes into account the shape and the tilting of the quantum dot with respect to the crystallographic axes. The last part presents optical pumping experiments. We inject spin\ud
polarised electrons and observe the creation of a dynamical nuclear polarisation. This polarisation transfert, due to hyperfine interaction, depends on caracteristic times that we can extract thanks to our model. We also present a direct measurement of the creation time of the nuclear spins polarisation
Contribution à la modélisation de l'immunité conduite des circuits intégrés et étude de l'impact du vieillissement sur leur compatibilité électromagnétique
Get PDFLe développement de l'électronique dans les systèmes embarqués à application aéronautique, spatial, ou encore automobile est alimenté par des performances croissantes, une intégration poussée et des coûts attractifs, permettant aux industriels d'offrir des solutions techniques et économiques concurrentielles. Néanmoins, cette évolution rapide nécessite une remise en cause permanente des méthodes de conception des systèmes embarqués, dont on doit garantir la maîtrise du comportement dans des environnements sévères. En particulier, la maîtrise de la compatibilité électromagnétique (CEM) est un élément clé de la réussite des challenges d'intégration et d'évolution technologique. \ud
Cette étude décrit les différentes phases de modélisation de l’immunité d’un circuit intégré analogique, basée sur les informations techniques non confidentielles données par le fabricant du circuit intégré et l’extraction des modèles électriques des éléments du circuit imprimé. Notre travail apporte un cas d’étude dans le cadre d’une proposition de norme "IEC" (International Electrotechnical Commission) sous la référence IEC-62433. De plus, dans ce mémoire, nous mettons en évidence l’impact du vieillissement des composants électroniques sur les performances CEM. Différentes technologies et types de circuits intégrés sont étudiés pour apporter une analyse qualitative sur l’évolution des paramètres CEM après une certaine durée de vie. Nous proposons une méthodologie de qualification pour apprécier l’évolution des marges CEM sous la dénomination « fiabilité électromagnétique ». Cette méthode, basée sur des procédés expérimentaux et statistiques, permet de caractériser l’impact du vieillissement des composants électroniques sur les paramètres CEM. Ces travaux mettent en évidence l’intérêt d’introduire le facteur « effet du temps » dans nos modèles d’immunité afin de garantir la compatibilité électromagnétique de nos systèmes électroniques embarqués tout au long de leur profil de mission----------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------The development of electronic embedded systems in aerospace application, spatial, or automotive is powered by increased performance, advanced integration and attractive prices, enabling manufacturers to offer technical solutions and economic competitiveness. However, this rapid evolution necessitates a questioning of permanent methods of designing embedded systems that must guarantee the control of behavior in severe environments. In particular, the control of electromagnetic compatibility "EMC" is importante of successful challenges of integration and evolution technology. \ud
This study describes the various stages of immunity modeling an analog integrated circuit, based on non-confidential technical information given by the manufacturer of the integrated circuit and models extraction of electrical printed circuit board. Our work provides a case study in the context of standard proposal "IEC" (International Electrotechnical Commission) under reference IEC-62433. Moreover, in this repport we show the impact of aging electronic components on EMC performance. Different types of technologies and integrated circuits are designed to provide a qualitative analysis on the evolution of EMC parameters after a period lifetime. We propose a methodology for qualification of the evolution of EMC margins under the name "electromagnetic reliability". This method, based on experimental methods and statistics, used to characterize the impact of the aging of electronics components on the EMC parameters. These works demonstrate the interest of introducing the factor "time effect" in our immunity models to ensure the electromagnetic compatibility of our electronics systems throughout their mission profile. \ud
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Expression et évolution des lipases de Candida rugosa et Yarrowia lipolytica pour modifier leurs activités et spécificités
No full textLes lipases, protéines ubiquitaires, sont les enzymes les plus étudiées et les plus utilisées dans l’industrie. Elles catalysent un très grand nombre de réactions, d’hydrolyse et de synthèse, conduisant à une grande diversité de molécules, acides, esters, amides…. Les domaines d’applications sont nombreux : les bio-énergies, les arômes, bio-lubrifiants, bio-plastifiants, émulsifiants, produits phytosanitaires et détergents, cosmétiques, synthons pour la chimie fine, produits pharmaceutiques… Aujourd’hui, grâce aux outils génétiques, il est possible de modifier leur activité, spécificité et thermostabilité pour les adapter idéalement aux contraintes industrielles. Dans ce travail de doctorat, nous nous sommes intéressés à quatre lipases d’intérêt industriel. Les 3 premières appartiennent à la famille des lipases de Candida rugosa (Lip1, Lip3 et Lip4). Bien que très homologues, leurs spécificités sont très différentes. Elles se distinguent de toutes les autres lipases par un site actif composé d’un long tunnel avec la triade catalytique à l’entrée de celui-ci. Cela en fait une enzyme particulièrement intéressante pour la conversion et la purification d’acides gras à longue chaîne. La quatrième est une nouvelle lipase identifiée chez la levure oléagineuse, Yarrowia lipolytica. Elle est très active sur les acides gras à longue chaîne, active à pH acide et présentant une grande énantiosélectivité sur des molécules d’intérêt pharmaceutique, les esters d’acide 2- halogéno-aryl acide acétique.\ud
Dans un premier temps, un nouveau système d’expression, une souche spécifique de Yarrowia lipolytica, a été étudié pour l’expression de variants construits par mutagenèse dirigée. Cette souche JMY1212 permet une intégration ciblée dans le génome de Y. lipoytica. Nous avons démontré qu’il s’agissait du premier système d’expression permettant de comparer statistiquement l’activité de variants directement à partir du surnageant de culture. Trois des lipases de Candida rugosa ont été clonées avec succès dans cette souche et leurs activités et spécificités vis-à-vis de la longueur de chaines des acides gras ont été étudiées. Lip1 et Lip3 présentent une spécificité pour les acides gras à longueur de chaine moyenne (C8-C10) alors que Lip4 préfère les C18:1. De, plus, pour la première fois, la purification, à partir d’un mélange d’esters éthyliques issu d’huile de poissons, d’acides gras poly-insaturés (PUFAs); acides cis-5, 8, 11, 14, 17-eicosapentaenoic (EPA) et cis-4, 7, 10, 13, 16, 19-docosahexaenoic (DHA), molécules bonnes pour la santé, a été réalisée avec les trois lipases séparées de C. rugosa. Quelle que soit l’enzyme, le rendement de récupération du DHA est supérieur à 93 % (97, 100 et 93 % pour Lip1, Lip3 et Lip4 respectivement. Une pureté maximale en DHA de ~60 % a été obtenue avec Lip3 et Lip4, à partir d’un mélange initial d’esters éthyliques contenant 25% de DHA. Une différence remarquable entre ces trois enzymes est que Lip4 est capable de mieux hydrolyser l’ester d’EPA (60% contre 14 et 16% pour Lip1 et Lip3). Lip4 est même capable d’hydrolyser le DHA (7% contre 3 et 0 % pour Lip1 et Lip3). La deuxième partie de ce travail a été consacrée à l’amélioration de l’énantiosélectivité des deux enzymes étudiées vis-à-vis de synthons d’intérêt dans l’industrie pharmaceutique, les esters de 2-bromo aryl acide acétique. La construction raisonnée d’un double variant de la lipase Lip2 de Y. lipolytica, D97AV232F, a permis d’obtenir une enzyme totalement énantiosélective (E >200). Celle-ci reconnaît l’énantiomère R alors que la lipase sauvage avait une faible préférence pour l’énantiomère S (E=5). Par ailleurs, cette exceptionnelle augmentation de l’énantiosélectivité s’accompagne d’une amélioration de l’activité de l’enzyme qui est ainsi multipliée par 4,5. Sur ce même mélange d’énantiomères, les 3 lipases de C. rugosa se sont avérées remarquables. Malgré leur grande homologie, leur spécificité est différente. Lip1 et Lip3 sont totalement S spécifiques (E>200), alors que Lip4 est R spécifique (E=15). Le docking moléculaire des énantiomères S et R dans le site actif des lipases Lip1 et Lip4 a permis de mieux comprendre ces différences de spécificité et de proposer des cibles de mutagenèse dirigée. L’encombrement et la nature de l’acide aminé présent en position 296 sont cruciaux pour la discrimination de l’enzyme.---------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------Lipases, ubiquitous proteins, are the most studied enzymes and the most used in industry. They catalyse a great number of reactions, hydrolysis and synthesis, leading to a great diversity of molecules, acids, esters, amides. There are numerous fields of applications: bio-energies, flavours, bio-lubricants, bio-plasticizers, emulsifiers, detergents, cosmetics, synthons for fine chemistry, and pharmaceutical products. Nowadays, thanks to genetic tools, it is possible to modify their activity, specificity and thermostability to ideally adapt enzymes for the industrial constraints. In this work, we were interested in four lipases of industrial interest. The third ones belong to the lipase family of Candida rugosa (Lip1, Lip3 and Lip4). Although they present high homology, their specificities are very different. They are distinct from the other lipases by the active site composed of a long tunnel with the catalytic triad at the entry of the tunnel. It leads to enzymes particularly interesting for the conversion and the purification of long chain fatty-acids. The fourth one is a new lipase identified from oleaginous yeast, Yarrowia lipolytica. It is one of the most active lipase on long chain fatty-acids; it is very active and stable at acid pH and presents a high enantioselectivity on molecules of pharmaceutical interest, the esters of 2- halogeno-aryl acetic acid.\ud
In this work, we first tested a new expression system, a specific strain of Y. lipolytica, for expression of variants obtained by site-directed mutagenesis. This strain JMY1212 enables integration to be targeted to a special locus of the Y. lipoytica genome. We demonstrated that it is the first expression system in which it is possible to compare statistically variant activities directly from the supernatant of the culture.\ud
Secondly, three lipases of C. rugosa were cloned successfully in this strain and their activities and specificities with respect to fatty acid chain lengths were studied. Lip1 and Lip3 have specificity for the fatty-acids of medium chain (C8-C10) whereas Lip4 prefers C18: 1. Moreover, for the first time, purification, from a mixture of ethyl esters issued from fish oil, polyunsaturated fatty acids (PUFAs); cis-5, 8, 11, 14, 17-eicosapentaenoic acid (EPA) and cis-4, 7, 10, 13, 16, 19-docosahexaenoic acid (DHA), molecules with health benefits, was realised with the three C. rugosa lipases, separately. Whatever the enzyme the recovery of DHA is superior to 90 % (97, 100 and 93 % for Lip1, Lip3 and Lip4 respectively. The maximal DHA purity ~60 % was obtained with Lip3 and Lip4, with an initial ethyl ester mixture containing 25% DHA. A remarkable difference between these enzymes lies in the fact that Lip4 is able to better hydrolyse the EPA esters (60% against 13% and 16% respectively for Lip1 and Lip3). Lip4 is also able to hydrolyse DHA (7% against 3 and 0 % for Lip1 and Lip3 respectively).\ud
The third part of this work was devoted to the improvement of the enantioselectivity of the two enzymes studied with respect to the resolution of a racemic mixture of pharmaceutical industry, the R, S esters of 2-bromo aryl acetic acid. The rational construction of a double variant of Lip2 lipase from Y. lipolytica, D97A V232F was realized to obtain a total enantioselective enzyme (E > 200). This variant recognizes the enantiomer R whereas wild-type lipase had a weak preference for the enantiomer S (E=5). In addition, this exceptional increase in the enantioselectivity is accompanied by a 4.5 fold improvement of the activity. With the same mixture of enantiomers, the 3 lipases of C. rugosa proved to be remarkable from the point of view of enantioselectivity. In spite of their high homology, their specificity is different. Lip1 and Lip3 are completely specific for the S enantiomer, whereas Lip4 is R specific (E=15). The molecular docking of the S and R enantiomers in the active site of Lip1 and Lip4 lipases enables the observed differences in specificity to be better understood and targets for site-directed mutagenesis to be proposed. We demonstrated that the nature of the amino acid present in position 296 is crucial for the discrimination of these enzyme
Compréhension et prédiction de l’énantiosélectivité des lipases
Get PDFCette étude a porté sur l’analyse de l’énantiosélectivité de la lipase de Burkholderia cepacia (BCL) pour les acides 2-substitués, synthons chiraux d’intérêt pharmaceutique, avec pour objectif d’examiner le rôle de l’accès au site actif enfoui de BCL sur l’énantiosélectivité et de développer une procédure d’ingénierie permettant de créer des mutants d’énantiosélectivité améliorée. Pour traiter le problème, une nouvelle approche de calcul, basée sur des algorithmes de planification de mouvements issus de la robotique a été développée. Elle permet l’exploration conformationnelle des espaces multi-dimensionnels contraints et a été appliquée au calcul des trajectoires de plusieurs racémiques dans le site actif de BCL et à l’identification de résidus pouvant potentiellement gêner le déplacement du substrat le long du site actif. Les résultats obtenus in silico ont révélé une corrélation qualitative avec les valeurs d’énantiosélectivité et ont permis de proposer des cibles de mutagénèse. Sur cette base, l’ingénierie du site actif de BCL a été entreprise pour moduler sélectivement l’accès des énantiomères R et S à la triade catalytique. Un système d’expression hétérologue de BCL chez E. coli compatible avec une expression en microplaque, a été développé. Une librairie de 57 (3x19) mono-mutants sur les positions : Leu17, Val266 et Leu287 a été construite par iPCR puis criblée en utilisant une procédure à moyen débit pour identifier les variants actifs pour l’hydrolyse du pNPB. L’énantiosélectivité de ces mutants a ensuite été évaluée pour l’hydrolyse du racémique (R,S)-2 bromophényl acétate de 2-chloro-éthyle, par utilisation d’une nouvelle procédure de criblage en deep-wells. Ce crible a permis de mettre en évidence plusieurs mutants dont les plus prometteurs ont été caractérisés. Ainsi les mutants Leu17Ser et Leu17Met présentent une augmentation de l’énantiosélectivité d’un facteur 10 accompagnée d’une augmentation de leur activité d’un facteur 4 à 5. Le mutant Val266Gly présente, quant à lui, une inversion de l’énantiosélectivité pour le substrat d’intérêt. L’étude des trajectoires par les techniques de planification combinée à une représentation sous la forme de carte de voxels a été réalisée en parallèle. Pour les mutants sélectionnés, une bonne corrélation a été observée entre les résultats obtenus in silico et expérimentalement. De plus, cela a permis de proposer de nouvelles combinaisons de mutations ayant conduit à l’identification de deux double-mutants Leu17Met/Val266Met et Leu17Ser/Leu287Ile d’énantiosélectivité supérieure à 150 pour le substrat modèle, révélant ainsi l’intérêt de l’approche semi-rationnelle proposée--------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------This work has been focused on the understanding of the Burkholderia cepacia lipase (BCL) enantioselectivity towards 2-substituted acids which are chiral building blocks of pharmaceutical interest. The main objective of this work was the investigation of the potential role of substrate accessibility toward the buried active site of BCL on enantioselectivity and the development of an engineering procedure for the design of enantioselective mutants. To study further this hypothesis, a novel computational approach, based on motion-planning algorithms, originally used in robotics, was developed. It allows the conformational exploration of constrained high-dimensional spaces and was applied to the computation of trajectories for a set of racemates within the catalytic site. This methodology also enables the identification of residues potentially hindering substrates displacement along the active site. Results obtained in silico were correlated qualitatively with experimental values of enantioselectivity. On the basis of these results, engineering of the narrow active site of BCL has been undertaken to modulate selectively the access of R and S enantiomers to the catalytic triade. An heterologous expression system of BCL in E. coli compatible with production at microplate scale was developed. A library of 57 (3x19) variants targeted at positions Leu17, Val266 and Leu287 was built by iPCR and subsequently screened using a medium-throughput procedure to identify active variants against pNPB hydrolysis. Next, the enantioselectivity of these mutants was evaluated towards a given racemate, the (R,S)-2-chloro ethyl 2-bromophenylacetate, using a novel screening procedure developed in deep wells. Such screening enabled the identification of several variants amongst which the most promising were characterized. Mutants Leu17Ser and Leu17Met showed a remarkable 10-fold increase of their enantioselectivity and a 4- and 5-fold improvement of their specific activity. Compared to the wild-type enzyme, mutant Val266Gly displayed a reversed enantioselectivity for the substrate of interest. Investigation of the trajectories using motion-planning techniques combined to a voxel map representation was carried out. For selected variants, a fair correlation was observed between in silico and experimental results. Moreover, this enabled us to suggest novel combinations of mutations that led to the identification of two double-mutants Leu17Met/Val266Met and Leu17Ser/Leu287Ile showing an enantioselectivity value higher than 150 for the racemic substrate, revealing thus the effiency of the semi-rational strateg