REAL-d

N. Rózsa, Erzsébet

Az államiság modelljei a Közel-Keleten – a vahhábita királyságtól az iszlám köztársaságig.

Volk, Balázs

Nitrogéntartalmú heterociklusos gyógyszerjelölt vegyületek előállítása és vizsgálataik

Kégl, Tamás

Katalitikus karbonilezési reakciók vizsgálata számításos módszerekkel

Venglovecz, Viktória

A gasztrointesztinális epitél sejtek iontranszport folyamatainak jelentősége ép és kóros körülmények között

Nagy, Szabolcs Tamás

  
 
MTA Doktori értekezés tézisei 
Gazdasági állatok spermaminőség-ellenőrzésének 
automatizálási lehetőségei 
Dr. Nagy Szabolcs Tamás 
Keszthely 
2019 
dc_1642_19
Powered by TCPDF (www.tcpdf.org)
 2 
 
  
dc_1642_19
Powered by TCPDF (www.tcpdf.org)
 3 
 
TARTALOM 
 
BEVEZETÉS, CÉLKITÚZÉSEK .......................................................................................... 4 
EREDMÉNYEK ÉS KÖVETKEZTETÉSEK ...................................................................... 6 
TÉZISPONTOK, ÚJ TUDOMÁNYOS EREDMÉNYEK ................................................... 8 
KÖSZÖNETNYILVÁNÍTÁS ............................................................................................... 11 
A TÉZISEKET BIZONYÍTÓ PUBLIKÁCIÓK ................................................................. 12 
 
  
dc_1642_19
Powered by TCPDF (www.tcpdf.org)
 4 
 
BEVEZETÉS, CÉLKITŰZÉSEK 
A sikeres termékenyítés eléréséhez egyrészt az egyes spermiumoknak kell több szempontból is 
megfelelőnek lenniük (membránintegritás, akroszóma-állapot, mitokondriális aktivitás, 
kromatinintegritás stb.), másfelől az adott ejakulátumnak vagy mélyhűtött-felolvasztott 
termékenyítő adagnak megfelelő arányban kell tartalmaznia ilyen ondósejteket. Az ideális in 
vitro fertilitási teszt egyidejűleg a lehető legtöbb tulajdonságot értékeli sejtszinten.  
A spermiumok az alábbi doménekre oszthatók: fej, középrész és farok. Ezek további 
szubdoménekre bonthatók: a fejen a plazmamembrán szubdoménjei a gaméta-interakcióban 
játszanak szerepet (zóna-kötődés, akroszóma-reakció, zóna penetráció stb.). Az akroszóma a 
spermiumfej apikális részén található vezikulum, amely a zóna penetrációhoz szükséges 
enzimeket tartalmazza. A fej tartalmazza továbbá a spermium speciális, protamin-DNS 
komplexből álló kromatinját. A középrészben találhatók a mitokondriumok, amelyek az 
energiatermelésben játszanak szerepet. A farok szerepe a motilitás biztosítása.  A spermiumok 
kromatin-állományának szerkezeti rendellenességei a termékenyítőképesség, illetve a hím 
pronukleusz-képződés zavarait okozhatják, továbbá káros hatással lehetnek az embrió 
fejlődésére is. Ezeket a rendellenességeket „nem kompenzálhatónak” tekintjük, mivel a 
szubfertilis hímek termékenyítőképessége nem javítható a termékenyítő adag sejtszámának 
növelésével. Azok az ondósejtek, amelyek nem kompenzálható rendellenességekkel bírnak, 
képesek ugyan a petesejtbe hatolni és a termékenyítésre is, de az embriófejlődés szenvedhet 
zavart.  
Vizsgálataim fő célja a mesterséges termékenyítésre használt sperma domén-specifikus 
minőségellenőrzésének automatizálása volt flow citometria – áramlási sejtanalízis – 
alkalmazásával. A flow citometria rövid idő alatt nagyszámú sejt (> 10 000 sejt mintánként, 
másodpercenként akár 1000-2000 spermium) objektív értékelését teszi lehetővé. A 
spermiumok hordozófolyadékban áramolva lézersugáron haladnak keresztül. A spermiumok 
által visszavert fény a sejtek méretéről és belső összetettségéről ad információt, a lézer pedig a 
spermiumokhoz kötődő fluoreszcens festékeket is gerjeszti, lehetővé téve az egyes domének, 
sejtszervek különböző színnel való jelölését, így a berendezések multiparaméteres analízisre is 
alkalmasak.  
dc_1642_19
Powered by TCPDF (www.tcpdf.org)
 5 
 
Vizsgálataim során a plazmamembrán-destabilizáció, a mitokondriális membránpotenciál, az 
akroszóma-integritás és a kromatinstruktúra (DNS-károsodások és kromatinkondenzációs 
zavarok) flow citométeres értékelését végeztem el. 
dc_1642_19
Powered by TCPDF (www.tcpdf.org)
 6 
 
EREDMÉNYEK ÉS KÖVETKEZTETÉSEK 
Vizsgálataim eredményei alapján megállapítottam, hogy a flow citometriára épülő 
spermatológiai analízis hasznos eleme lehet a szaporodásbiológiai kutatólaboratóriumoknak, és 
a mesterséges termékenyítő állomások rutinszerű, napi spermabírálati rendszerébe is 
illeszthető.   
Kidolgoztam egy új fluoreszcens festékkombinációt a korai membránváltozások 
(plazmamembrán-destabilizáció) detektálására (Hallap és mtsai, 2006); a spermiumok 
mitokondriális membránpotenciál-változásainak (a mitokondriumok aktivitásának) mérésére 
(Hallap és mtsai, 2005a). Egy általunk korábban kifejlesztett hármas fluoreszcens 
festékkombináció alkalmazásával (amely egyidejűleg jelzi a plazmamembrán és az akroszóma 
integritását, sérüléseit, Nagy és mtsai, 2003) felderítettem a mélyhűtést, felolvasztást és 
inszeminációt követő időszakban végbemenő membránváltozások kinetikáját, a 
plazmamembrán és az akroszóma deteriorációjának időbeli sorrendjét (Nagy és mtsai, 2004).   
Megállapítottam, hogy a tenyészbikák kromatinintegritása nem változik az életkor 
előrehaladtával (Hallap és mtsai, 2005b). A humán andrológia területén standard laboratóriumi 
technikának tekintett Sperm Chromatin Structure Assay (SCSA) azonban nem bizonyult 
alkalmasnak a fertilis és szubfertilis tenyészbikák megkülönböztetésére (Nagy és mtsai, 2013). 
Az SCSA analízis során a DNS fragmentációja mellett értékelhető a spermiumkromatin 
kondenzáltsági állapota is, amely citogenetikai terheltséget hordozó bikákon végzett 
vizsgálataink (Révay és mtsai, 2009) szerint alkalmas lehet a spermiumokból történő gyors 
citogenetikai szűrővizsgálatok elvégzésére (Nagy és mtsai, 2013).  
Kidolgoztam egy olyan fluoreszcens kontrasztfestési technikát, amellyel az ondósejtek 
plazmamembránjának integritása értékelhető úgy, hogy a flow citométeres alkalmazások során 
a korábbi technikáktól eltérően az élő és elhalt sejtek detektálása azonos detektorral történhet, 
így a többi detektor szabadon alkalmazható más fluoreszcens próbák jeleinek rögzítésére. Ezen 
technika alkalmazásával megnyílik a lehetőség olyan multiparaméteres flow citométeres 
spermatológiai tesztek kidolgozására, amelyek egyidejűleg több domén állapotának 
értékelésére alkalmasak, emellett az élő/elhalt állapot egyidejű értékelése fontos kiegészítője 
lehet más sejtélettani vizsgálatoknak is, mint például a mitokondriális aktivitás, vagy a 
kromatinállapot felmérése. A jelenleg folyó és jövőben tervezett kutatásaim egyik fő 
dc_1642_19
Powered by TCPDF (www.tcpdf.org)
 7 
 
irányvonala a multiparaméteres spermatológiai tesztek továbbfejlesztése, az új tesztek 
fertilitásra vonatkozó diagnosztikai-prognosztikai értékének megállapítása.    
dc_1642_19
Powered by TCPDF (www.tcpdf.org)
 8 
 
TÉZISPONTOK, ÚJ TUDOMÁNYOS EREDMÉNYEK 
1. Az általam kidolgozott fluoreszcens plazmamembrán- és akroszómaintegritási teszt 
nem igényel speciális minta-előkészítési lépeseket, standard asztali flow citométerrel 
(kék lézer, zöld, narancssárga és vörös fluoreszcens detektorok) értékelhető, tehát elég 
egyszerű ahhoz, hogy akár a mesterséges termékenyítő állomások rutin laboratóriumi 
munkarendjébe illeszthető legyen. A teszt hasznos lehet továbbá új mélyhűtési 
technikák kidolgozásában is a nekrózis és akroszóma-exocitózis lépéseinek gyors és 
precíz követésével. 
2. A spermiummorfológiai vizsgálat a jövőben is a bikasperma rutin 
minőségellenőrzésének fontos eszköze lesz, különösen, ha a rutinszerű vizsgálatok a 
normális morfológiájú ondósejtek arányára koncentrálnak. A major 
spermiumdefektusok aránya valamelyest gyengébb, de szintén szignifikáns 
diszkriminatív paraméternek bizonyult, azonban a mesterséges termékenyítő állomások 
napi gyakorlatában való alkalmazását mégsem ajánlom, mivel az eredmények 
értelmezése mélyebb spermatológiai ismereteket igényel, és az egyes laboratóriumok, 
értékelő személyek, alkalmazott mintapreparálási eljárások és osztályozási módszerek 
eltérései miatt az ismételhetősége gyengébb. A részletes morfológiai vizsgálatok 
szerepe akkor válik hangsúlyossá, ha az adott egyed a rutin vizsgálat során nem éri el a 
fentiekben meghatározott küszöbértéket, ekkor az előforduló rendellenességek 
vizsgálata hasznos információval szolgálhat a spermatogenezis zavarainak feltárásában. 
Nem szabad azonban figyelmen kívül hagyni, hogy a vizsgálat megfelelő statisztikai 
erejének biztosítása érdekében mintánként több száz sejt értékelése szükséges. Az 
SCSA paraméterek meglepően gyenge diagnosztikai értéket mutattak a fertilitás 
tekintetében. Az SCSA teszt HIGR paramétere azonban hasznos eszköz lehet a 
kvantitatív kromoszóma rendellenességet (meiotikus zavarok, transzlokációk) hordozó 
tenyészbikák felismerésére. Azon egyedek esetében, amelyek magas HIGR értéket 
mutatnak, további, részletes citogenetikai vizsgálatok elvégzése szükséges. 
3. Az általam kidolgozott flow citométeres citogenetikai gyorsteszttel felismerhetők a 
kromoszóma traszlokációt heterozigóta formában hordozó és a diploid spermiumokat 
termelő bikák. A fluoreszcens jelölő kit egyszerűen használható, nem igényel bonyolult 
minta-előkészítési lépéseket, és az egyszerű asztali flow citométerek standard optikai 
dc_1642_19
Powered by TCPDF (www.tcpdf.org)
 9 
 
rendszerével értékelhető. A Kolmogorov-Smirnov opció a legtöbb flow citométeres 
adatelemző szoftverben elérhető, így nincs szükség további szoftverbeszerzésre. Az 
egyes apaállatok, sőt, egyes ejakulátumok is könnyen vizsgálhatók, és a tesztet akkor is 
használhatjuk, ha a kérdéses állat nem érhető el. A teszt illeszthető az olyan, mesterséges 
termékenyítő állomásokon működő rutin spermalaboratóriumok munkarendjébe, ahol a 
flow citometriát már alkalmazzák, és a vizsgálatot elegendő a bika élete során egyszer 
elvégezni. 
4. A TUNEL-teszttel végzett DNS-károsodási mérések hamis pozitív eredményei arra 
hívják fel a figyelmet, hogy a citométer nem képes a fluoreszcens jel helyének (DNS 
vagy mitokondrium például) lokalizálására, ezért minden flow citométeres kísérlet 
során kritikus fontosságú a fluoreszcens jelölések mikroszkópos ellenőrzése. A Nicoletti 
teszt viszont jóval egyszerűbb és gyorsabb, a vizsgálat során nem tapasztaltam hamis 
pozitív jelölést, diagnosztikai értékének megállapítására azonban a fertilitás 
tekintetében további vizsgálatok szükségesek. 
5. A Merocianin 540/Yo-PRO 1/Hoechst 33342 hármas fluoreszcens festékkombinációja 
flow citometriával értékelve alkalmas módszer a mélyhűtött-felolvasztott, élő 
bikaspermiumok membránstabilitásának értékelésére. A plazmamembrán stabilitása 
szignifikáns korrelációt mutatott több konvencionálisan alkalmazott spermatológiai 
teszttel, mint a motilitás, a spermiumok feji morfológiájának értékelése és a 
membránintegritás. A swim-up kezelés lehetővé tette annak értékelését, hogy az élő, 
stabil membránnal bíró spermium alpopuláció milyen mértékben képes kapacitálódásra. 
A swim-up kezelés alternatív módszer lehet a rutin spermavizsgálati paraméterek 
tekintetében meglehetősen homogén bikapopulációk egyedei közötti fertilitási rangsor 
megállapításában. 
6. Mind a motilitásvizsgálatok, mind a flow citométeres mérések kimutatták, hogy a swim-
up kezelés hatására megnő az intenzív motilitást, illetve magas mitokondriális aktivitást 
mutató spermiumok aránya a termékenyítő adagban. A MitoTracker Deep Red 633 (M-
22426) festéket elsőként alkalmaztam bikaspermiumok értékelésére, és véleményem 
szerint megfelelő teszt flow citométerrel rendelkező rutin spermavizsgáló 
laboratóriumokban, tekintve, hogy mintánként több ezer sejtet értékel rövid idő alatt, 
így objektív alternatívája a szubjektív vagy számítógépes motilitásvizsgálatoknak.  
dc_1642_19
Powered by TCPDF (www.tcpdf.org)
 10 
 
7. Eredményeim szerint már akár 5 °C-os hőmérséklet emelkedés is hatással lehet a 
halspermiumok mitokondriumainak épségére, működésére. A mitokondriumok 
membránpotenciál-változásai arra engednek következtetni, hogy a jelen kísérletben 
alkalmazott inkubációs idő- és hőmérséklet értékek mellett a plazmamembrán-
integritással ellentétben a spermiumok szubletális károsodásokat szenvednek, amelyek 
a konvencionális vitális festési eljárásokkal nem detektálhatók. 
dc_1642_19
Powered by TCPDF (www.tcpdf.org)
 11 
 
KÖSZÖNETNYILVÁNÍTÁS 
Ezúton szeretnék köszönetet mondani társszerzőimnek és munkatársaimnak korábbi (NAIK-
ÁTHK Herceghalom) és jelenlegi (PE Georgikon Kar, Állattudományi Tanszék) 
munkahelyemen.  
Külön szeretnék köszönetet mondani a folyamatos együttműködésért, szakmai és baráti 
tanácsokért Kovács Andrásnak, Husvéth Ferencnek, Bodó Szilárdnak, Magnus Andersson-nak 
(Finnország), Anders Johannisson-nak (Svédország), Heriberto Rodriguez-Martinez-nek 
(Svédország) és Révay Tamásnak (Kanada).  
Köszönettel tartozom Feleségemnek, Lepossa Anitának a folyamatos és töretlen támogatásért.  
A tézisekben ismertetett tudományos munkák pénzügyi hátterét a Swedish Institute (SI), a 
Royal Swedish Academy of Agriculture and Forestry (KSLA), a Knut and Alica Wallenbergs 
Foundation, a Swedish Farmers’ Foundation for Research in Agriculture (SLF), az Estonian 
Science Foundation (ESF), az MTA Bolyai Ösztöndíja és az OTKA biztosította. 
  
dc_1642_19
Powered by TCPDF (www.tcpdf.org)
 12 
 
A TÉZISEKET BIZONYÍTÓ PUBLIKÁCIÓK 
1. Nagy S, Hallap T, Johannisson A, Rodriguez-Martinez H. Changes in plasma membrane 
and acrosome integrity of frozen-thawed bovine spermatozoa during a 4 h incubation as 
measured by multicolor flow cytometry. Anim Reprod Sci. 2004 Feb;80(3-4):225-35. 
2. Hallap T, Nagy S, Jaakma U, Johannisson A, Rodriguez-Martinez H. Mitochondrial 
activity of frozen-thawed spermatozoa assessed by MitoTracker Deep Red 633. 
Theriogenology. 2005 May;63(8):2311-22. 
3.  Hallap T, Nagy S, Jaakma U, Johannisson A, Rodriguez-Martinez H. Usefulness of a 
triple fluorochrome combination Merocyanine 540/Yo-Pro 1/Hoechst 33342 in 
assessing membrane stability of viable frozen-thawed spermatozoa from Estonian 
Holstein AI bulls. Theriogenology. 2006 Apr 1;65(6):1122-36. 
4. Nagy ST, Kakasi B, Pál L, Havasi M, Bercsényi M, Husvéth F. Effects of high ambient 
temperature on fish sperm plasma membrane integrity and mitochondrial activity - A 
flow cytometric study. Acta Biol Hung. 2016 Jun;67(2):125-32. 
5. Nagy S, Johannisson A, Wahlsten T, Ijäs R, Andersson M, Rodriguez-Martinez H. 
Sperm chromatin structure and sperm morphology: their association with fertility in AI-
dairy Ayrshire sires. Theriogenology. 2013 May;79(8):1153-61. 
6. Kakasi B, Nagy S, Pál L, Czimber GE, Husvéth F. A comparison of alternative assays 
to measure DNA damage in stallion spermatozoa: TUNEL test versus 'Nicoletti assay'. 
Acta Vet Hung. 2015 Mar;63(1):118-24. 
7. Nagy S, Polgár PJ, Andersson M, Kovács A. Quick cytogenetic screening of breeding 
bulls using flow cytometric sperm DNA histogram analysis. Acta Vet Hung. 2016 
Sep;64(3):372-379. 
dc_1642_19
Powered by TCPDF (www.tcpdf.org)


Gazdasági állatok spermaminőség-ellenőrzésének automatizálási lehetőségei

Madléna, Melinda

Hungarian

Stomatológiai megbetegedések epidemiológiai vonatkozásai és a lokális prevenció lehetőségei

Juhász, Gabriella

Endofenotípusok alkalmazása a depresszió patomechanizmusának megismerésében

Simon, Gyula

Robusztus mérési és becslési eljárások

Horváth, Kornélia

Petri György költészete verselméleti és líratörténeti megközelítésben.

Schein, Gábor

Füst Milán.

Not a member yet