OPEN FAU Online-Publikationssystem der Friedrich-Alexander-Universität Erlangen-Nürnberg
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User-centered design approach to visualize PROMs for molecular tumor boards
No full textIntegrating Patient-Reported Outcome Measures (PROMs) into Molecular Tumor Boards (MTBs) remains challenging due to the complexity of data visualization and integration into clinical workflows. This work, as part of the German PM4Onco project, aims to identify visualization requirements for PROMs and develop a prototype for PROMs integration in cBioPortal, facilitating broader application within oncology care. We employed a qualitative research approach, including developing personas for MTB stakeholders, conducting a literature-based requirements analysis, organizing a co-design workshop to create low-fidelity prototypes, and evaluating the highest-rated prototype variant through an online survey distributed to MTB physicians across Germany. Seven specialist groups were identified, with key needs including intuitive visualization, clear axis labeling, and longitudinal symptom tracking. The resulting mid-fidelity mockup incorporated PROMs data within cBioPortal’s timeline view and a detailed PROMs tab, featuring trend indicators, line graphs, and customizable health displays. Usability evaluation by MTB members yielded a SUS score of 67, indicating an initial indicator of acceptable usability, with suggestions for improvements like threshold scores and deeper clinical data integration. While PROMs offer critical patient insights, they remain underused in MTBs. Our early-stage prototype demonstrates potential for addressing this gap, with future work focusing on implementation, broader testing, and international validation.Bundesministerium für Bildung und Forschunghttps://doi.org/10.13039/50110000234
Measuring Abdominal Skin‐Surface Distances Using Photos for Perforator Mapping Analysis—A Validation Study on 3D‐Printed DIEP‐Flap Models
No full textABSTRACT Background We present a novel method for accurately measuring skin‐surface distances using standard smartphone photos and Photoshop, validated on 3D‐printed DIEP‐flap models and on calibration grid‐patterns. Materials and Methods Distance measurements are acquired in Photoshop in a calibration plane between dots on a grid‐pattern as well as between perforators on photos of 3D‐printed models and compared against ground‐truth. Margins of errors are calculated from fitted linear models. Results Submillimeter accuracy can be achieved within errors of ±0.45 mm (80% probability) and ±0.8 mm (95% probability) for measuring distances on the dot‐grid. On the 3D‐printed DIEP‐models, distance measurements are accurate within ±1.75 mm (80% probability) and ±3.1 mm (95% probability). Conclusions We introduce a simple yet highly accurate technique to measure skin‐surface distances using normal photos. Depending on the scenario, submillimeter or conservatively very low millimetre errors can be achieved, sufficiently accurate for clinical use, whilst maintaining topographic relationships of the measurements.Bayrisches Forschungsinstitut für Digitale TransformationBayerisch‐Kalifornischen Hochschulzentrum 10.13039/50110001417
Spot Melting Strategy for Contour Melting in Electron Beam Powder Bed Fusion
No full textSpot melting is an emerging alternative to traditional line melting in electron beam powder bed fusion, dividing a layer into thousands of individual spots. This method allows for an almost infinite number of spot arrangements and spot melting sequences to tailor material and part properties. To enhance the productivity of spot melting, the number of spots can be reduced by increasing the beam diameter. However, this results in rough surfaces due to the staircase effect. The classical approach to counteract these effects is to melt a contour that surrounds the infill area. Creating effective contours is challenging because the melted area ought to cover the artifacts from the staircase effect and avoid porosity in the transition area between the infill and contour, all while minimizing additional energy and melt time. In this work, we propose an algorithm for generating a spot melting sequence for contour lines surrounding the infill area. Additionally, we compare three different approaches for combining the spot melting of infill and contour areas, each utilizing a combination of large infill spots and small contour spots. The quality of the contours is evaluated based on optical inspection as well as the porosity between infill and contour using electron optical images, balanced against the additional energy input. The most suitable approach is used to build a complex brake caliper.The authors gratefully acknowledge funding by the Deutsche Forschungsgemeinschaft (DFG, German Research Foundation)-Project ID 61375930-SFB 814-“Additive Manufacturing” TP T07.Deutsche Forschungsgemeinschaft (DFG, German Research Foundation
Exploration of ACOD1-itaconate in controlling Coxiella burnetii infection in mice
No full textBackground and objectives: The zoonotic disease Q fever is caused by the obligate intracellular gram-negative bacterium Coxiella (C.) burnetii. Humans are infected by inhalation of infectious material from the reservoir animals (sheep, goats, cattle). Q fever is usually a self-limiting asymptomatic or mild flu-like respiratory infection but can become chronic and cause endocarditis in some patients. Despite extended treatment courses antibiotics are frequently inefficient in chronic Q fever. In activated macrophages Acod1 expression is upregulated and ITA exerts anti-microbial and immunoregulatory effects. MES and CTC have different but overlapping effects on the expression of inflammatory genes and macrophage metabolism. Here we investigated how C. burnetii replication is regulated by the mitochondrial enzyme cis-aconitate decarboxylase 1 (ACOD1 or IRG1) and its product itaconate (ITA). We also investigated the effect of ITA isomers mesaconate (MES) and citraconate (CTC) on C. burnetii.
Methods: The attenuated Nine Mile phase II (NMII) strain of C. burnetii was used for infection of bone-marrow derived macrophages (BMM) and of mice. Following infection, BMM were treated with ITA and its isomers (MES and CTC). MTT assay was used to determine cellular toxicity of the supplemented isomers. The intracellular concentration of the isomers was measured by gas chromatography mass spectrometry analysis (GC-MS). Cytokine proteins were analyzed by ELISA and by multiplex bead-based analysis (LEGENDplex assay). The impact of Acod1 knock-out and of ITA supplementation on the control of C. burnetii replication was determined by different readouts like immunofluorescent microscopy, FACS analysis, qPCR and immunohistochemistry from infected BMM and mouse organ samples. For in vivo experiments, mice were infected via the intraperitoneal and intratracheal routes following ITA treatment (i.p). In adoptive cell transfer experiments BMM were transferred to the mice via i.p. route the day before and after C. burnetii infection (i.p.). Expression analysis of different genes of interest was performed by qRT-PCR form infected BMM and mice organs. Finally, the direct effect of ITA and its isomers on C. burnetii was determined by OD measurement and CFU count.
Results: Expression of Acod1 mRNA was upregulated after C. burnetii infection and led to ITA production in BMM and in organs of infected mice, which was essential for restricting C. burnetii replication. BMM from Acod1-/- mice was unable to control C. burnetii growth. In vivo, an increased bacterial burden along with weight loss and stronger inflammatory gene expression were noticed in Acod1-/- compared to control mice after intraperitoneal and intratracheal infection. Exogenously supplemented ITA and its isomers were easily taken up by BMM, where ITA but not its isomers restricted C. burnetii replication in Acod1-/- BMM. Following infection, enhanced uptake of ITA and MES but not CTC was noticed in BMM where MES but not CTC competed with ITA for uptake. In contrast, all three isomers directly inhibited C. burnetii growth in axenic culture in a dose-dependent manner, and ITA was found more potent than MES and CTC. Finally, exogenous ITA treatment efficiently reduced the tissue pathogen load in Acod1-/- mice. However, treatment with ITA was not effective in other C. burnetiid-susceptible mice deficient in TLR-signaling (Myd88-/-), production of IFNγ (Ifnγ-/-) or lymphoid immune cells (Rag2-/-γChain-/-). On the other hand, adoptive transfer of Acod1+/+ BMM the day before infection promoted control of bacterial replication in Acod1-/- as well as Myd88-/- mice, indicating a synergistic effect of ITA and other mechanisms in pathogen control.
Conclusions and discussion: Being a key factor in macrophage-mediated control of C. burnetii, ACOD1-derived ITA needs further investigation to develop new treatment strategies for chronic Q fever. A special focus should be on the yet unknown mechanistic details of C. burnetii control in BMM and in mice. In addition, the divergent effect of ITA isomers in controlling C. burnetii in BMM and in axenic culture suggests differences in their uptake and intracellular transport mechanisms, which may have important consequences for employing ITA and its isomers for treatment of bacterial infections. Furthermore, investigation of ITA isomers’ effect on C. burnetii should be extended to our in vivo mouse model of Q fever
Subduktionskomponenten und Manteldynamiken während der Entwicklung des Lau–Tonga–Kermadec Arc-Backarc Systems
Get PDFA subduction zone is the largest recycling location where sediments, oceanic crust, and mantle lithosphere return to and re-equilibrate with the Earth’s mantle, triggering melting and incidentally forming the continental crust. However, additional efforts are needed to gain further insights into the chemical recycling processes that occur during subduction to better comprehend the chemical evolution of the Earth’s mantle.
A subduction zone causes the formation of a magmatic arc-trench complex, which is divided into the forearc, arc front, and back-arc. The characterization of a back-arc basin provides important insights into the interaction processes between two melting regions, driven by plate convergence and spreading, as well as the complexities of mantle flow and the pathways of subduction input with a diversity of magma compositions. Therefore, integrating our knowledge of back-arc and arc front volcanism can offer a much better understanding of the processes and dynamics of the entire subduction system.
Despite the importance of understanding the back-arc–arc system, these systems remain poorly understood due to the intricacies of the processes influencing the composition of the arc-trench complex. To further understand the magma source during the evolution of the back-arc–arc
system, I selected three areas in the Lau–Tonga–Kermadec subduction system in the southwestern Pacific, namely the Kermadec back-arc–arc system (south), Seamount 3 (S3; middle), and the northern Tonga Ridge (north). Each area exhibits a different back-arc evolution stage due to the decreasing spreading rate from north to south in the subduction system. Specifically, the Kermadec Arc-Backarc system is characterized by immature back-arc rifting but not focused spreading. The middle area represents the early stage of back-arc spreading, whereas the northern Lau Basin is a mature back-arc basin with several spreading centers and additional rifts in the arc and fore-arc regime.
The Kermadec Arc-Backarc system (25–39°S), an immature back-arc rifting stage, serves as an important natural laboratory to examine the controls on arc magma compositions. This is due to the variable physical parameters that are thought to influence subduction magmatism, such as the thickness and composition of the upper plate, mantle depletion and partial melting, and the slab components, which vary along the arc. The analysis of back-arc and rear-arc volcanism provides insights into how mantle composition varies with distance from the trench. Here, I present new major and trace element data, as well as Pb–Sr–Nd–Hf isotope data for 101 lava samples from 10 volcanoes along the Kermadec Arc. These data are combined with published data for volcanic arc front, rear-arc, and back-arc lavas. Based on these data, I propose that geochemical variations result mainly from differences in the degree of partial melting, as well as the amount and composition of subducting slab components.
To the north, the back-arc basin continuously develops with an increasing back-arc spreading rate. Boninite, a rare high-Si, high-Mg, low-Ti lava, has been reported from back-arcs, reararcs, and arc locations and can be generated in subduction-related environments such as subduction initiation (fore-arc or ophiolitic terrane) and back-arc–arc systems. Cooper et al. (2010) suggested that boninitic magma should be constrained to the arc regime, where remelting of highly depleted residual mantle beneath the arc regime occurs after the extraction of tholeiitic melts beneath the back-arc spreading center. However, in the early stage of back-arc spreading, boninite could be formed when the back-arc spreading centers are close to the arc front and exhibit mixed geochemical characteristics between dry and enriched (MORB-like) and wet and depleted mantle (arc-like). I conducted a study on boninitic magmatism at Volcano S3, which is located approximately 5 km east of the back-arc spreading center (Valu Fa Ridge; VFR) and has erupted boninitic lavas at 22.30°S. My findings suggest that boninitic lavas can form at back-arc spreading centers that are located close enough to an active arc, and I present new data on whole-rock compositions, minerals, and olivine-hosted melt inclusions to support this assertion.
The northernmost Lau Basin represents the mature back-arc spreading stage, where the thin lithosphere derived from active back-arc spreading is extended. Here, I study the boninitic magmatism at the rifted Tonga Ridge (fore-arc crust). Normally, the petrogenesis of boninite at the fore-arc has been associated with subduction initiation. However, the boninitic magmas in the study area are not related to a subduction initiation event, as indicated by their younger age (around 1.3 Ma) compared to the Tonga fore-arc crust (> 20 Ma). In this study, I present new whole-rock, mineral, and 40Ar–39Ar age data for the boninitic lavas from the rifted walls at the northern Tonga Ridge and propose that the lavas were formed by decompression melting of a highly depleted peridotite or harzburgite source containing a small trapped melt fraction enriched in fluid-mobile elements from the subduction materials.Eine Subduktionszone ist ein Ort, an dem Sedimente, ozeanische Kruste und Mantel- Lithosphäre in großen Mengen in den Erdmantel zurückgeführt werden, wodurch einerseits Schmelzvorgänge ausgelöst werden, und andererseits neue kontinentale Kruste entsteht. Um die damit verbundenen Recyclingprozesse während der Subduktion besser zu verstehen und die chemische Entwicklung des Erdmantels nachvollziehen zu können, sind jedoch weitere Studien vonnöten.
Eine Subduktionszone führt zur Bildung eines magmatischen Arc-Trench-Komplexes, der in Forearc, Arc Front und Back Arc unterteilt wird. Die Charakterisierung eines Back Arc-Beckens liefert wichtige Erkenntnisse, sowohl über die Interaktionsprozesse zwischen zwei Schmelzregionen, die durch Plattenkonvergenz und -spreizung angetrieben werden, als auch über die Komplexität des Mantelflusses sowie die Wege des subduzierten Eintrags, die mit einer Vielfalt von Magmazusammensetzungen assoziiert sind. Aus diesen Gründen kann das Einbringen unseres Wissens über den Back Arc and Forearc Vulkanismus zu einem besseren Verständnis über die Prozesse und die Dynamiken des gesamten Subduktionssystems ermöglichen.
Trotz der Notwendigkeit das Back Arc-Arc-System zu verstehen, sind diese Systeme aufgrund der vielfältigen Prozesse, die die Zusammensetzung des Arc-Trench-Komplexes beeinflussen, nach wie vor schlecht verstanden. Um die Zusammensetzung der Schmelzregion während der Entwicklung des Back Arc-Systems besser zu verstehen, habe ich drei Gebiete im Lau–Tonga–Kermadec-Subduktionssystem im südwestlichen Pazifik ausgewählt, nämlich das Kermadec Arc-Back Arc-System (Süden), Seamount 3 (S3; Mitte) und den nördlichen Tonga Rücken (Norden). Jedes Gebiet weist aufgrund der von Norden nach Süden abnehmenden Spreizungsrate im Subduktionssystem ein anderes Back Arc-Entwicklungsstadium auf. Das Kermadec Arc-Back-Arc-System ist durch junges Back Arc Rifting, aber nicht durch fokussierte Spreizung gekennzeichnet. Das mittlere Gebiet repräsentiert das frühe Stadium der Back Arc-Spreizung, während das nördliche Lau-Becken ein vollentwickeltes und ausgeprägtes Back Arc-Becken mit mehreren Spreizungszentren und zusätzlichen Rifts im Arc- und Forearc darstellt.
Das Kermadec Arc-Back Arc-System (25–39°S), ein junges Back Arc-Rifting-Stadium, dient als ein wichtiges natürliches Labor, um zu untersuchen welche Faktoren die Zusammensetzung der Arc Magmen kontrolliert. Dies liegt an den variablen physikalischen Parametern, von denen
man annimmt, dass sie den Magmatismus innerhalb einer Subduktionszone beeinflussen, wie z. B. die Dicke und Zusammensetzung der oberen Platte, die Mantelverarmung und das partielle Schmelzen sowie die Komponenten der subduzierten Platte, die entlang des Arcs variieren. Die Untersuchung des Back Arc- und Rear Arc-Vulkanismus gibt Aufschluss darüber, wie die Zusammensetzung des Mantels mit der Entfernung zur Tiefseerinne variiert. Hier präsentiere ich neue Haupt- und Spurenelementdaten sowie Pb–Sr–Nd–Hf-Isotopendaten für 101 Lava- Proben von 10 Vulkanen entlang des Kermadec Arcs. Diese Daten werden mit bereits veröffentlichten Daten von Laven der Arc Front, dem Rear Arc und dem Back Arc kombiniert.
Auf der Grundlage dieser Daten schlage ich vor, dass geochemische Variationen hauptsächlich auf Unterschiede im Aufschmelzgrad sowie der Menge und Zusammensetzung der Komponenten der subduzierenden Platte resultieren.
Zum Norden hin entwickelt sich das Back Arc-Becken kontinuierlich mit einer zunehmenden Back Arc-Spreizungsrate. Boninite, seltene Laven mit hohem Si-Gehalt, hohem Mg-Gehalt und niedrigem Ti-Gehalt, wurden in Back Arcs, Rear Arcs und Forearcs gefunden und können in Konfigurationen, die mit Subduktionszonen assoziiert sind, wie Subduktionzonensinitiierung (Forearc oder Ophiolithe) und Back Arc-Arc-Systemen entstehen. Cooper et al. (2010) schlugen vor, dass boninitische Magmen auf das Arc-Regime beschränkt sein sollten, wo das Wiederaufschmelzen des stark abgereicherten Restmantels unter dem Arc-Regime nach der Extraktion tholeiitischer Schmelzen unter dem Back Arc-Spreizungszentrum stattfindet. Im Frühstadium der Back Arc-Spreizung könnten sich jedoch Boninite bilden, wenn die Back Arc- Spreizungszentren nahe an der Arc Front liegen und gemischte geochemische Eigenschaften zwischen trockenem und angereichertem (MORB-ähnlichem) und nassem und verarmten Mantel (Arc-ähnlichem) aufweisen. Ich habe eine Studie über boninitischen Magmatismus am Vulkan S3 durchgeführt, der sich etwa 5 km östlich des Back-Arc-Spreizungszentrums (Valu Fa Ridge; VFR) befindet und bei 22.30°S boninitische Laven eruptiert hat. Meine Ergebnisse deuten darauf hin, dass sich boninitische Laven in Back Arc-Spreizungszentren bilden können, die nahe genug an einem aktiven Arc liegen, und ich präsentiere neue Daten von Gesamtgesteinsanalysen, Mineralen und Schmelzeinschlüssen aus Olivinen, um diese Behauptung zu stützen.
Das nördlichste Lau-Becken repräsentiert ein entwickeltes Back Arc-Spreizungsstadium, in dem die dünne Lithosphäre, die aus der aktiven Back Arc-Spreizung hervorgeht, erweitert wird. Hier untersuche ich den boninitischen Magmatismus am gerifteten Tonga Rücken (Forearc Kruste). Normalerweise wird die Petrogenese von Boniniten an Forearcs mit dem Einsetzen der Subduktion in Verbindung gebracht. Die boninitischen Magmen im Untersuchungsgebiet sind jedoch nicht mit einer Subduktionszoneninitiierung verbunden, wie ihr jüngeres Alter (ca. 1,3 Ma) im Vergleich zur Tonga Forearc Kruste (> 20 Ma) zeigt. In dieser Studie präsentiere ich neue Gesamtgesteins-, Mineral- und 40Ar–39Ar-Altersdaten für die boninitischen Laven von den gerifteten Hängen des nördlichen Tonga Rückens und schlage vor, dass die Laven durch Dekompressionsschmelzen einer stark verarmten Peridotit- oder Harzburgit-Quelle entstanden sind, die eine kleine eingeschlossene Schmelzfraktion enthält, die mit fluid-mobilen Elementen aus dem subduzierten Material angereichert ist
Grundlage für eine Chimäre Antigenrezeptor-basierte adoptive T Zell-Immuntherapie im murinen Cytomegalovirus Infektionsmodell
Get PDFThe human cytomegalovirus (HCMV) is a widespread pathogen but usually causes mild and uncomplicated infection in healthy, immunocompetent individuals. However, in immunocompromised patients, especially stem cell transplant recipients, de novo infection or reactivation of latent infection can result in life-threatening complications. One cause of such severe complications is HCMV’s arsenal of viral effector proteins, which allow it to effectively evade the host immune system. Expression of human leukocyte antigen (HLA) molecules on the surface of infected cells is downregulated, rendering HCMV-infected cells invisible to effector T cells; however, these represent a crucial host defense mechanism to control infection. An elegant design to circumvent certain immune evasion mechanisms are chimeric antigen receptors (CARs). These receptors detect HCMV-infected cells in a HLA-independent manner and turn one of the virus’ strengths into a weakness: While the plethora of glycoprotein complexes found in the envelope of the virions directs infection of a variety of cell types, their expression on the infected cell’s surface makes them perfect targets for CARs. Engineered T cells equipped with CARs distinctively recognize and eliminate target cells displaying specific antigens on their surface; in this case: HCMV-specific glycoproteins. This study constitutes an initial investigation into the potential of CAR-T cell therapy as a treatment option for HCMV infections using the model system of the murine cytomegalovirus (MCMV).
To evaluate the functionality of MCMV-specific CAR-T cells, a suitable in vitro model is required. Stable cell lines expressing different glycoprotein complexes of MCMV, consisting of glycoprotein B (gB), gN/gM or gH/gL, were generated. These cell lines were used to confirm the functionality of CAR-T cells in general, circumventing viral effector functions which interfere with T cell response.
A novel molecular biosensor was invented to specifically indicate T cell-mediated cytotoxicity. By genetically engineering a fluorescent protein to undergo conformational changes, inducing green fluorescence upon cleavage by granzyme B (GZMB), the cleavage-responsive sensor for T cell activity level (CRSTAL) was generated and tested. This was complemented by the existing nano-luciferase (nLuc) system, which detects general cell damage. Thus, two individual readouts for CAR-T cell killing assays were established and used as a modular system. Target cells expressing one of the glycoprotein complexes and one of the two cytotoxicity reporters were generated to evaluate the efficacy of MCMV-specific CAR-T cells.
Based on this framework, different CAR constructs targeting either gB, gH or gN were designed. Murine T cells were transduced via an optimized protocol and eight of the CARs exhibited strong surface expression. The resulting CAR-T cells were tested in killing assays. Out of eight expressed CARs, six constructs exerted successful lysis of reporter cells expressing the respective target antigen. Co-incubation assays with MCMV-infected cells showed a strong inhibition of viral replication by T cells transduced with one of six CAR constructs. In contrast to existing literature, T cells expressing one of five CARs were, in fact, able to specifically lyse MCMV-infected cells, of which gB-targeting M11-based CARs displayed the strongest cytolytic activity.
This work presents an optimized transduction protocol for murine T cells with CAR constructs as well as a novel fluorogenic reporter for T cell activity (CRSTAL). The latter can be applied in settings where conventional cytotoxicity markers are limited by anti-apoptotic effector functions of certain viruses. By applying this and other reporters, we have shown that MCMV-specific CAR T cells are able to inhibit MCMV replication in vitro and to specifically lyse infected target cells, laying the foundation for investigation of CAR-T cell therapy as a viable treatment option for severe CMV infections.Für die meisten gesunden, immunkompetenten Menschen ist das humane Cytomegalovirus (HCMV) ein relativ harmloser Erreger, der während einer Infektion kaum Schaden anrichtet. Bei immungeschwächten Personen, insbesondere bei Empfängern von Stammzell-transplantaten, kann eine Neuinfektion oder die Reaktivierung der latenten Infektion jedoch zu lebensbedrohlichen Komplikationen führen. Eine Ursache für derart schwerwiegende Komplikationen ist das Arsenal viraler Effektorproteine des HCMV, die es ihm ermöglichen, das Immunsystem des Wirts wirksam zu umgehen. Die Expression von humanen Leukozyten Antigenen (HLA) auf der Oberfläche infizierter Zellen wird herunterreguliert, wodurch HCMV-infizierte Zellen für Effektor-T Zellen des Wirts unsichtbar werden; eine starke T Zell-Antwort ist jedoch für die Kontrolle der Infektion entscheidend. Ein elegantes Konzept zur Umgehung bestimmter Immunevasionsstrategien sind Chimäre Antigenrezeptoren (CARs). Diese Rezeptoren erkennen HCMV-infizierte Zellen auf HLA-unabhängige Weise und wandeln eine der Stärken des Virus zu einer Schwäche um: Die verschiedenen Glykoproteinkomplexe in der Virushülle ermöglichen zwar die Infektion einer Vielzahl von Zelltypen, macht sie aber auch zu perfekten Zielen für CARs. Mit CARs ausgestattete T Zellen erkennen und eliminieren Zielzellen, die bestimmte Antigene auf ihrer Oberfläche tragen; in diesem Fall: HCMV-spezifische Glykoproteine. Diese Studie stellt eine erste Untersuchung des Potenzials der CAR-T Zelltherapie als Behandlungsoption für HCMV-Infektionen dar, wobei das Modellsystem des murinen Cytomegalovirus (MCMV) verwendet wird.
Um die Funktionalität von MCMV-spezifischen CAR-T Zellen zu bewerten, wird ein geeignetes in vitro Modell benötigt. Stabile Zelllinien, die verschiedene Glykoproteinkomplexe von MCMV, bestehend aus Glykoprotein B (gB), gN/gM oder gH/gL, exprimieren, wurden generiert. Diese Zelllinien wurden verwendet, um die Funktionalität der CAR-T Zellen ohne den Einfluss von viralen Effektor-Funktionen zu evaluieren.
Ein neuartiger molekularer Biosensor wurde generiert, um spezifisch die T Zell-vermittelte Zytotoxizität nachzuweisen. Durch die gezielte Manipulation eines fluoreszierenden Proteins wurde ein Reportermolekül entwickelt, das bei der Spaltung durch Granzym B (GZMB) eine grüne Fluoreszenz hervorruft. Der hierdurch entstandene cleavage-responsive sensor for T cell acitivity level (CRSTAL) wurde getestet und zusammen mit einem bestehenden Nano-Luciferase (nLuc)-System, das eine allgemeine Zellschädigung nachweist, für die Evaluation von CAR-T Zell-vermittelten zytolytischen Effekten verwendet. Hierfür wurden Zielzellen generiert, die jeweils einen Glykoproteinkomplex und einen der beiden Reporter exprimieren.
Auf dieser Grundlage wurden verschiedene CAR-Konstrukte entwickelt, die entweder gegen gB, gH oder gN gerichtet sind. Murine T Zellen wurden nach einem optimierten Protokoll transduziert, wobei acht der CAR Konstrukte eine starke Oberflächenexpression aufwiesen. Die resultierenden CAR-T Zellen wurden in Koinkubationsversuchen getestet. Von den acht exprimierten CARs führten sechs Konstrukte zu einer erfolgreichen Lyse von Reporterzellen, die das jeweilige Zielantigen exprimieren. Koinkubationsexperimente mit MCMV-infizierten Zellen zeigten eine starke Hemmung der viralen Replikation durch T Zellen, die mit einem der sechs CAR-Konstrukte transduziert waren. Im Gegensatz zu Ergebnissen aus früheren Studien waren T Zellen, die einen von fünf CARs exprimieren, in der Lage, MCMV-infizierte Zellen spezifisch zu lysieren, wobei gB-bindende, auf M11-basierte CARs die stärkste zytolytische Aktivität zeigten.
In dieser Arbeit werden ein optimiertes Transduktionsprotokoll für murine T Zellen mit CAR Konstrukten sowie ein neuartiger fluorogener Reporter für die T Zell-Aktivität (CRSTAL) vorgestellt. Dieser kann in Situationen eingesetzt werden, in denen herkömmliche Zytotoxizitätsmarker durch die anti-apoptotischen Effektor-Funktionen bestimmter Viren eingeschränkt sind. Durch die Anwendung dieses und anderer Reporter wurde gezeigt, dass MCMV-spezifische CAR T Zellen in der Lage sind, die Replikation von MCMV in vitro zu hemmen und infizierte Zellen spezifisch zu lysieren. Diese Arbeit setzt somit den Grundstein für die Erforschung der CAR-T Zelltherapie als praktikable Behandlungsoption für schwere CMV-Infektionen
Advances in the Electrophoretic Deposition (EPD) Technology for Coatings and Self-Standing Structures Based on Biopolymers and Bioactive Glasses for Biomedical Applications
Get PDFTo tackle the drawbacks of metallic implants, such as infections caused by the implant or inadequate interaction with the biological environment, novel composite coating materials that are compatible with living tissues and possess antibacterial properties are being developed. The natural polymer chitosan (CS) is often used to achieve anti-infective devices due to its appealing intrinsic physical and biological characteristics. One key feature of CS is its ability to form complexes with a wide range of metal ions. In this context, the chelation of CS with therapeutic metal ions, which interact with a number of biological structures and metabolic systems, is a promising platform for biomedical applications.
In the first part of this work, functional coatings based on copper(II)-chitosan complexes were developed and used to coat metallic substrates by electrophoretic deposition (EPD). First, EPD parameters were optimized for the deposition of CS coatings by the Taguchi design of experiment (DoE) approach with a mixed-level design. Coatings were produced by using optimal EPD conditions. For this purpose, the previously fabricated copper(II)-chitosan complexes were dissolved and deposited on the cathode during EPD in the form of ionic complexes. After that, these complexes were deposited together with strontium-doped bioactive glasses. Different physicochemical and biological evaluations were performed on these coatings. On the whole, the application of copper(II)-chitosan complexed with strontium-doped bioactive glasses coating exhibited high promise in enhancing the biological efficacy of the implants.
After that, CS complexes were fabricated using another promising metal (gallium) with different concentrations of gallium ions. Fourier Transform Infrared Spectroscopy (FTIR) confirmed the complexation between gallium and CS for all investigated concentrations, while Energy-Dispersive X-ray Spectroscopy (EDX) validated the homogenous distribution of the metal ions within the polymer matrix. The outcomes from the physicochemical characterization of the produced complexes, as well as the versatility of the production method encouraged further investigation of this material as coatings of medical devices. For that purpose, EPD was performed utilizing previously optimized parameters. The method of covalently attaching a biologically relevant metal ion to the polymer ligand effectively gave the required antibacterial capabilities to the CS-based coatings.
Recently, there has been increasing interest in using plant-derived medicines (phytotherapeutic drugs). For that reason, ferulic acid, which is usually derived from seeds, leaves, and plant cell walls was incorporated in the EPD coating. The DoE approach was used to obtain optimized ferulic acid loaded CS and CS complexed – bioactive glasses composite coatings. The produced coatings showed hydroxyapatite formation in simulated body fluid (SBF). The ferulic acid release profile showed a gradual release due to the incorporation of mesoporous bioactive glass (MBGNs). The release tended to reach a plateau after approximately 42 days. Furthermore, the synergistic effect of metal ions and a phytotherapeutic drug (FA) was observed during biological characterization. All coatings significantly enhanced MG-63 and MC3T3-E1 cell proliferation. The produced coatings represented effective antibacterial effects against S. aureus and E. coli bacteria after 1 day of incubation.
EPD is widely used in coating technology. However, in this thesis, EPD is proposed to fabricate self- and free-standing three-dimensional shapes for applications in tissue engineering. The aim is to successfully produce a novel asymmetric bilayer membrane for guided bone regeneration (GBR) applications, using the EPD process. Membranes were composed of two layers, namely a thin dense layer and a thick porous layer. The dense layer consists of CS and embedded MBGNs, whereas the porous layer consists of CS/gelatin/MBGNs and Cu(II)-CS/gelatin/MBGNs. The dense layer was further functionalized with a phytotherapeutic drug known as naringin (Nar). The produced bilayer membranes were extensively characterized using different physicochemical and biological characterization techniques. The produced bilayer films were stable enough for handling and tissue engineering applications. Highly distributed and embedded MBGNs were observed in both layers. SBF studies confirmed hydroxyapatite formation in the porous structure of the samples after 7 days. Enzymatic degradation showed continuous degradation behavior of the produced films. The release of Nar showed an initial burst release followed by continuous sustained release. The antibacterial effect of Cu(II) and Nar on gram-positive and gram-negative bacteria was observed. Finally, cell studies confirmed the cytocompatibility of the produced films. Overall, the results presented in this thesis affirm EPD as a powerful and versatile technique for multifunctional coatings as well as for free-standing three-dimensional film fabrication. The current research opens up several new research avenues for the use of EPD in the framework of tissue repair and regeneration applications.Um die Nachteile metallischer Implantate, wie beispielsweise durch das Implantat verursachte Infektionen oder unzureichende Wechselwirkungen mit der biologischen Umgebung, zu vermeiden, werden neuartige Verbundbeschichtungsmaterialien entwickelt, die mit lebendem Gewebe kompatibel sind und antibakterielle Eigenschaften besitzen. Das natürliche Polymer Chitosan (CS) wird aufgrund seiner attraktiven physikalischen und biologischen Eigenschaften häufig zur Herstellung antiinfektiöser Geräte verwendet. Ein wesentliches Merkmal von CS ist seine Fähigkeit, mit einer Vielzahl von Metallionen Komplexe zu bilden. In diesem Zusammenhang ist die Chelatisierung von CS mit therapeutischen Metallionen, die mit einer Reihe biologischer Strukturen und Stoffwechselsysteme interagieren, eine vielversprechende Plattform für biomedizinische Anwendungen.
Im ersten Teil dieser Arbeit wurden funktionelle Beschichtungen auf Basis von Kupfer(II)-Chitosan-Komplexen entwickelt und zur Beschichtung metallischer Substrate durch elektrophoretische Abscheidung (EPD) eingesetzt. Zunächst wurden die EPD-Parameter für die Abscheidung von CS-Beschichtungen durch den Taguchi-Design-of-Experiment-Ansatz (DoE) mit einem Mixed-Level-Design optimiert. Die Beschichtungen wurden unter den optimalen EPD-Bedingungen hergestellt. Zu diesem Zweck wurden die zuvor hergestellten Kupfer(II)-Chitosan-Komplexe gelöst und während der EPD in Form ionischer Komplexe auf der Kathode abgeschieden. Anschließend wurden diese Komplexe zusammen mit Strontium-dotierten bioaktiven Gläsern abgeschieden. An diesen Beschichtungen wurden verschiedene physikalisch-chemische und biologische Untersuchungen durchgeführt. Insgesamt erwies sich die Anwendung von Kupfer(II)-Chitosan, komplexiert mit einer Strontium-dotierten bioaktiven Glasbeschichtung, als vielversprechend für die Verbesserung der biologischen Wirksamkeit der Implantate.
Anschließend wurden CS-Komplexe unter Verwendung eines anderen vielversprechenden Metalls (Gallium) mit unterschiedlichen Konzentrationen an Galliumionen hergestellt. Die Fourier-Transformations-Infrarotspektroskopie (FTIR) bestätigte die Komplexierung zwischen Gallium und CS für alle untersuchten Konzentrationen, während die energiedispersive Röntgenspektroskopie (EDX) die homogene Verteilung der Metallionen innerhalb der Polymermatrix bestätigte. Die Ergebnisse der physikalisch-chemischen Charakterisierung der hergestellten Komplexe sowie die Vielseitigkeit der Produktionsmethode regten zu weiteren Untersuchungen dieses Materials als Beschichtungen für medizinische Geräte an. Zu diesem Zweck wurde die EPD unter Verwendung zuvor optimierter Parameter durchgeführt. Die Methode der kovalenten Bindung eines biologisch relevanten Metallions an den Polymerliganden verlieh den CS-basierten Beschichtungen effektiv die erforderlichen antibakteriellen Eigenschaften.
In letzter Zeit besteht ein zunehmendes Interesse an der Verwendung pflanzlicher Arzneimittel (Phytotherapeutika). Aus diesem Grund wurde Ferulasäure, die üblicherweise aus Samen, Blättern und pflanzlichen Zellwänden gewonnen wird, in die EPD-Beschichtung eingearbeitet. Der DoE-Ansatz wurde verwendet, um optimierte mit Ferulasäure beladene CS- und CS-komplexierte – bioaktive Glasverbundbeschichtungen zu erhalten. Die hergestellten Beschichtungen zeigten eine Hydroxylapatitbildung in simulierter Körperflüssigkeit (SBF). Das Ferulasäure-Freisetzungsprofil zeigte eine allmähliche Freisetzung aufgrund des Einbaus von mesoporösem bioaktivem Glas (MBGNs). Die Freisetzung erreichte tendenziell nach etwa 42 Tagen ein Plateau. Darüber hinaus wurde bei der biologischen Charakterisierung der synergistische Effekt von Metallionen und einem Phytotherapeutikum (FA) beobachtet. Alle Beschichtungen steigerten die Zellproliferation von MG-63 und MC3T3-E1 deutlich. Die hergestellten Beschichtungen zeigten nach einem Tag Inkubation eine wirksame antibakterielle Wirkung gegen S. aureus- und E. coli-Bakterien.
EPD wird häufig in der Beschichtungstechnik eingesetzt. In dieser Arbeit wird jedoch EPD zur Herstellung selbständiger und freistehender dreidimensionaler Formen für Anwendungen im Tissue Engineering vorgeschlagen. Ziel ist die erfolgreiche Herstellung einer neuartigen asymmetrischen Doppelschichtmembran für Anwendungen zur gesteuerten Knochenregeneration (GBR) mithilfe des EPD-Verfahrens. Membranen bestanden aus zwei Schichten, nämlich einer dünnen, dichten Schicht und einer dicken, porösen Schicht. Die dichte Schicht besteht aus CS und eingebetteten MBGNs, während die poröse Schicht aus CS/Gelatine/MBGNs und Cu(II)-CS/Gelatine/MBGNs besteht. Die dichte Schicht wurde mit dem Phytotherapeutikum Naringin (Nar) weiter funktionalisiert. Die hergestellten Doppelschichtmembranen wurden mithilfe verschiedener physikalisch-chemischer und biologischer Charakterisierungstechniken umfassend charakterisiert. Die hergestellten Doppelschichtfilme waren stabil genug für die Handhabung und Anwendungen im Tissue Engineering. In beiden Schichten wurden stark verteilte und eingebettete MBGNs beobachtet. SBF-Studien bestätigten die Bildung von Hydroxylapatit in der porösen Struktur der Proben nach 7 Tagen. Der enzymatische Abbau zeigte ein kontinuierliches Abbauverhalten der hergestellten Filme. Die Freisetzung von Nar zeigte eine anfängliche stoßweise Freisetzung, gefolgt von einer kontinuierlichen anhaltenden Freisetzung. Es wurde die antibakterielle Wirkung von Cu(II) und Nar auf grampositive und gramnegative Bakterien beobachtet. Schließlich bestätigten Zellstudien die Zytokompatibilität der hergestellten Filme. Insgesamt bestätigen die in dieser Arbeit präsentierten Ergebnisse, dass EPD eine leistungsstarke und vielseitige Technik für multifunktionale Beschichtungen sowie für die freistehende dreidimensionale Filmherstellung ist. Die aktuelle Forschung eröffnet mehrere neue Forschungswege für den Einsatz von EPD im Rahmen der Anwendung zur Gewebereparatur und -regeneration
The effect of Rsk2 on TNFα-mediated bone loss in the TMJ and craniofacial skeleton
Get PDFObjectives This study aims to investigate the impact of the pro-osteoblastogenic ERK-activated ribosomal S6 kinase ( Rsk2) on Tumor necrosis factor (TNF)α-induced bone loss in the craniofacial system, focusing on its role in rheumatoid arthritis (RA). The objective is to understand whether Rsk2 , previously shown to have protective effects in long bones against TNFα-induced bone resorption, exhibits similar effects in the craniofacial region. Materials , and Methods. The study compares mice with TNFα overexpression, Rsk2 knockout mice, and a combination of TNFα, and Rsk2 knockout mice using detailed micro-computed tomography coupled with landmark based morphometric analysis, and classical histology. The overall skull morphology, mandible shape, and the temporomandibular joint were examined. Additionally, histological sections were utilized to examine the synovial membrane. Results Combining TNFα, and Rsk2 deficiency does not further alter overall skull shape compared to TNFα alone. TNFα overexpression shortens the mandibular ramus, exacerbated by Rsk2 absence. Micro-computed tomography (µCT) reveals significant temporomandibular joint damage from TNFα, independent of Rsk2 . However, histological sections show increased synovial membrane thickness with TNFα, heightened in the absence of Rsk2 . Conclusions Rsk2 mitigates TNFα-induced effects on mandibular ramus length in the craniofacial system but has limited impact on the temporomandibular joint, except for synovial membrane thickness. Overall, Rsk2 demonstrates a weaker preventive effect on TNFα-induced craniofacial bone loss compared to its established role in the appendicular skeleton. Clinical Relevance This study highlights regional differences in Rsk2's protective mechanisms, emphasizing the need for further exploration of the underlying mechanisms for these disparities. Understanding these regional differences can be crucial for the development of targeted therapeutic interventions.Open Access funding enabled and organized by Projekt DEAL.Universität Leipzig (1039
Ångström-Lokalisierung eines Nanpartikels durch transversale Kerker-Streuung
No full textThe aim of the thesis is to experimentally demonstrate a localization scheme of a single nanoparticle with a resolution of less than an Ångström, followed by its proof-of-concept on-chip version using a silicon based photonic crystal waveguide. The theory of the localization follows the principle of Kerker’s forward/backward scattering. Here we demonstrated a modified version of the Kerker’s scattering—transverse Kerker scattering—where the single nanoparticle exhibits directional scattering in the plane perpendicular to propagation of light. This was achieved via excitation of a Huygen’s dipole—a combination of two orthogonally polarized linear dipoles with a relative phase of π/2—in the nanoparticle using tightly focused cylindrical vector beams, such as, radially or azimuthally polarized beams. Such a beam exhibits a strong longitudinal field component in the center of the beam i.e. on the optical axis upon tight focusing. However, around the optical axis within the focal plane, presence of both longitudinal and transverse field components allows us to excite Huygen’s dipole in the nanoparticle, to obtain strongly directional scattering. And the position information of the nanoparticle gets encoded within the strength and the direction of the scattering pattern. The strength of the directivity depends on the excitation beam parameters, such as wavelength, field distribution, the particle parameters, such as size, refractive index, and the position of the nanoparticle within the focal spot, relative to the optical axis. We numerically optimized some of these parameters to get an estimate for the values that lead to the strongest displacement sensitivity of the directional scattering. In the experimental setup developed in-house, radially and azimuthally polarized paraxial light beams were prepared and analyzed with high precision to ensure good mode quality. Polarization tailored paraxial beams are then focused tightly onto silicon nano-sphere using microscope objective. Due to the high refractive index of silicon and its dielectric nature, a combination of electric and magnetic dipole moments gets excited, where the strength of these dipoles depends on the scattering cross section and the particle position relative to optical axis. We experimentally demonstrated the wavelength dependent directivity trend for a silicon nanosphere of diameter 168 nm using both radially and azimuthally polarized excitation. Using azimuthally polarized excitation of wavelength 545 nm, we could detect a particle displacement of 3 Å with a localization accuracy down to 0.6 Å. For the on-chip version, we used a photonic crystal waveguide based microchip with a 520 nm diameter particle at the center of 3-way waveguide crossing. Careful choice of waveguide and particle parameters allowed to perform the experiment in the telecom band (1608 nm excitation wavelength). As a first proof of concept, we could demonstarte a localization accuracy of 7.5 Å for a 520 nm particle, which is at the order of λ/300
Magnetische Akkumulation von SPIONs unter arteriellen Flussbedingungen: Der Effekt von Serum und roten Blutzellen
Get PDFEine der Grundsäulen der konventionellen Therapie von kardiovaskulären Erkrankungen und malignen Neoplasien ist nach wie vor die systemische Gabe von verschiedenen Wirkstoffen. Das kann jedoch besonders im Rahmen der Chemotherapie, zu teils schweren Nebenwirkungen für den Patienten führen, die nicht selten für eine Limitierung der Therapie verantwortlich sind. Bis jetzt fehlt ein Klinik erprobtes Verfahren, welches eine gezielte Applikation des Wirkstoffes im betreffenden Gewebe ermöglicht. Die Nanomedizin erlangt hier als neuer Ansatz zur Distributionsplattform immer mehr Aufmerksamkeit. Eine solche mögliche Anwendung der Nanomedizin wird derzeit bei SEON, der Sektion für Experimentelle Onkologie und Nanomedizin der HNO-Klinik Erlangen, mit dem Konzept des Magnetic Drug Targeting (MDT) erforscht. Dabei werden mit wirkstoffbeladene superparamagnetische Eisenoxid – Nanopartikel (SPIONs) unter Anlage eines externen magnetischen Feldes im erkrankten Gewebe angereichert. So soll die systemisch wirksame Dosis des Medikaments reduziert werden und gleichzeitig eine höhere Konzentration im anvisierten Gewebe erzielt werden. Während dieses Verfahren in der Tumorbehandlung erste vielversprechende Ergebnisse zeigen konnte, ist das Konzept MDT im kardiovaskulären Bereich bisher noch wenig erprobt. Da sich hier die pathologischen Mechanismen vorzugsweise in den größeren Arterien abspielen, muss das externe Magnetfeld stark genug sein, um die im fließenden Blut herrschenden Schubeffekte und hydrodynamisch wirksamen Kräfte überwinden zu können. Mittels eines ex-vivo Models aus menschlichen Umbilikalarterien konnte bei SEON bereits eine Anreicherung von verschiedenen SPIONs in der Gefäßwand unter Flussbedingungen mit Zellkulturmedium erreicht werden. Im Rahmen dieser Arbeit untersuchten wir den Effekt von verschiedenen Blutbestandteilen auf die Möglichkeit einer magnetischen Akkumulation unterschiedlicher SPIONs unter permanentem Fluss