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Das Fibromyalgiesyndrom als Autoimmunerkrankung: Nachweis antineuronaler Autoantikörper in Fibromyalgiesyndrom
No full textFibromyalgia syndrome (FMS) is a pain disorder of unknown aetiology with a prevalence of up to 5% in the general population. About 80% of the affected persons are women. FMS is characterized by chronic widespread pain (CWP) and additional symptoms such as fatigue, depression and cognitive deficits, and positive tender points. In recent studies morphological and functional changes in peripheral nociceptors of FMS patients were described. In a cohort of patients with chronic widespread pain, lower gene expression and lower serum protein concentrations of the anti-inflammatory cytokines IL-4 and IL-10 were found in venous blood. Later, numerous other studies approached the question of cytokines, chemokines, and other inflammatory mediators in fibromyalgia, including IL-17A. A new hypothesis suggests that FMS patients, like patients with rheumatoid arthritis, develop autoantibodies that contribute to the pathophysiology of the disease. As in rheumatoid arthritis, it might be antibodies against citrullinated protein. We therefore used serum of a cohort of 184 FMS patients to test the hypothesis that FMS might be an autoimmune mediated disorder. We searched for autoantibodies with help of immunohistological binding assays using rat DRG sections. Additionally, we have examined our collected FMS sera for the presence of some known autoantibodies with Enzyme-linked Immunosorbent Assay (ELISA). Finally, we evaluated whether FMS subgroups with and without autoantibodies would differ in their demographic or clinical features.
Upon analysis our cohort of FMS patients, we found autoantibodies to rat dorsal root ganglia (DRG) in 67/184 sera. The subgroups did not differ in demographic data, BMI, and accompanying diseases. Seropositive patients more often had lower pain intensities (0-4), than the DRG-seronegative patients, supporting the hypothesis that autoantibodies are rather protective than destructive. Moreover, the lower pain intensity among DRG-seropositive patients was related to the nuclear binding pattern at the level of large neurons. There were no further differences between seropositive and seronegative group regarding pain characteristics. Addressing the psychological status, the study shows higher STAI-T values in seronegative patients. There was no relation within the FMS cohort between the symptom severities, such as fatigue, waking unrefreshed, cognitive symptoms, and somatic symptom disabilities and presence of the autoantibodies. Thus, at present, we cannot propose FMS with autoantibodies is different from FMS without these.
In terms of identification of a neuronal subtypes we could show a more prominent serum binding in IB4-negative neurons in the seropositive cohort, however without quantification measurements due to technical difficulties. Additionally, we would like to emphasize that there is a significant difference in ACPA- autoantibody prevalence and the presence of FMS.
Additional studies and more research is needed to further investigate the autoimmune processes in FMS. These findings would contribute not only to the pathophysiology, but also to more accurate clinical investigations and potentially to improved treatment in these patients.Das Fibromyalgiesyndrom ist eine Schmerzstörung von unbekannter Ätiologie mit einer Prävalenz von bis zu 5% in der Allgemeinbevölkerung. Rund um 80% der betroffenen Personen sind Frauen. FMS wird von chronischen Schmerzen in mehreren Körperregionen und zusätzlichen Symptomen wie Müdigkeit, Depressionen und kognitive Defizite, sowie Tenderpoints gekennzeichnet. In neulich durchgeführten Studien wurden sowohl morphologische als auch funktionelle Veränderungen an den peripheren Nozizeptoren in den FMS erkrankten Personen beschrieben. Eine Kohorte der Teilnehmer mit chronischen Schmerzen in mehreren Körperregionen zeigte eine niedrigere Genexpression und auch eine niedrigere Serumkonzentration der entzündungshemmenden Zytokine, wie zum Beispiel IL-4 und IL-10, im venösen Blut. Ebenso beschäftigten sich auch zahlreiche andere Studien mit dem Thema der Zytokine, Chemokine und Entzündungsmarker in Fibromyalgie, inklusive IL-17A. Eine neue Hypothese weist darauf hin, dass FMS-Patienten ähnlich wie Patienten mit der rheumatoiden Arthritis, Autoantikörper entwickeln, welche zum pathophysiologischen Mechanismus von der Krankheit beitragen. Wie in der rheumatoiden Arthritis könnten es die Antikörper gegen citrullinierte Proteine sein. Um die Hypothese, dass Fibromyalgie eine autoimmunbasierte Grunderkrankung ist, näher zu untersuchen, testeten wir eine Kohorte aus 184 Fibromyalgie-Patienten. Wir suchten nach Autoantikörpern mit Hilfe immunhistologischer Bindungsversuche auf dem Spinalganlienratengewebe. Zudem prüften wir mittels Enzyme-linked Immunosorbent Assay (ELISA), ob die Fibromyalgieseren bestimmte Autoantikörper aufweisen. Letztendlich verglichen wir die Fibromyalgiesubgruppen mit und ohne Autoantikörper basierend auf ihre demographischen und klinischen Eigenschaften.
Nach der Auswertung unserer Kohorte von FMS-Patienten, konnten wir Autoantikörper im peripheren neuronalen Ratengewebe in 67/184 bestimmen. Die Subgruppen unterscheiden sich nicht in ihren demographischen Charakteristiken, BMI sowie in den begleitenden Erkrankungen. Die Spinalganglien-seropositiven Patienten präsentierten öfters niedrigere Schmerzintensitäten (0-4), als die spinalgangien-seronegativen, somit unterstützend die Hypothese, dass die Autoantikörper eher protektiv als destruktiv wirken. Ferner, die niedrige Schmerzintensität der spinalganglien-seropositiven Patienten stand im engen Zusammenhang mit dem Bindungsmuster der großen Neuronen. Weitere Untersuchungen zeigten keine erheblichen Unterschiede im Rahmen der Schmerzsybtypen zwischen der spinalganglien- seropositiven und spinalganglien-seronegativen Gruppe. Bezüglich psychologischer Merkmale, betont die Studie, dass STAI-T- Parameter höher unter den spinalganglien-seronegativen Teilnehmern vorzufinden waren. Dadurch dass wir keinen Zusammenhang in der Symptomatik wie zum Beispiel Müdigkeit, kognitives Denken, unerholsamer Schlaf sowie die somatische Symptomatik und der Anwesenheit der Antiköroper feststellen konnten, ist davon auszugehen, dass es sich bei dem autoimmungetriggerten FMS-Erkrankungsbild um die gleiche Krankheit handelt wie in dem nicht- autoimmungetriggerten.
Bei der Bestimmung der neuronalen Subtypen gelingt es uns einen deutlichen Bindungsmuster der IB4-negativen Neuronen in der spinalganglien- seropositiven Kohorte nachtzuweisen. Eine Quantifizierung dieser war aufgrund technischer Schwierigkeiten nicht möglich. Ebenso möchten wir hervorheben, dass es einen Zusammenhang zwischen den ACPA- Autoantikörpernprävalenz und dem Auftreten der Fibrolmaylgieerkrankung gibt.
Nichtsdestotrotz sind weitere Studien und mehr Forschungseinsatz notwendig, um vor allem weiter die autoimmunen Prozesse in FMS zu untersuchen. Dies würde nicht nur zur Pathophysiologie, sondern auch zu einer sorgfältigeren klinischen Diagnose und einer besseren Behandlungseffizienz beisteuern
Untersuchung der Auswirkungen von Klima- und Landnutzungswandel auf die Ausbreitung gemäßigter Graslandarten mithilfe eines dynamischen und metabolischen Artausbreitungsmodells
No full textOne of the biggest threats to life on earth is human-induced climate and land-use change.
There has been an increase in global temperatures, precipitation patterns have changed, and extreme weather events are becoming more frequent. Ecosystems are being altered and re-structured. All this has lead to a steep increase in species extinction rates, effectively causing a global mass extinction event. This can lead to the destabilisation of ecosystems, which generates the loss of ecosystem services. These ecosystem services provide humankind with sustainable life, and their loss is a critical development.
In this thesis, I focus on grassland systems, which are among the most severely affected by climate and land-use change. Grasslands are highly important for ecosystem services, especially in the light of more frequently occurring extreme weather events such as floods, as grasslands can enhance water retention and reduce runoff. Despite their significance, grasslands are expected to decrease in biodiversity and area in southern Germany, the study region of this thesis.
To assess future pathways and impacts of climate and land-use change, scientists use computer models. One type of model is the so-called species distribution model, which can predict how species will shift their habitat and abundances under different climate and/or land-use change scenarios. I created one such model that integrates several mechanisms, namely demographic, metabolic, and dispersal processes, and published it as an easy-to-install package to facilitate user accessibility. In Chapter I of this thesis, I introduce MetaRange.jl and explain its functionality in-depth with the help of a case study.
Results show an overall decrease in the occurrence of Orchis militaris and highlight the importance of local population dynamics and dispersal for accurate future predictions.
In Chapter II, I investigate the joint effects of climate and land-use change on several grassland species. Results suggest that it is possible for land-use change to amplify negative effects of climate change. The study reveals potential hotspots of biodiversity loss as well as potential refugia, and emphasises the importance of conservation measures.
In the discussion, I illustrate the implications of my findings for nature conservation, and for the field of ecological modelling. I describe challenges that arose during my research and mention failed approaches. Finally, I propose detailed ideas for future model implications.Eine der größten Bedrohungen für das Leben auf der Erde ist der vom Menschen verursachten Klima- und Landnutzungswandel. Die globalen Temperaturen sind gestiegen, die Niederschlagsmuster haben sich verändert, und extreme Wetterereignisse treten immer häufiger auf. Die Ökosysteme werden verändert und neu strukturiert. All dies hat zu einem steilen Anstieg des Artensterbens und damit zu einem globalen Massenaussterben geführt. Dies kann zu einer Destabilisierung der Ökosysteme führen, was den Verlust von Ökosystemleistungen zur Folge hat. Diese Ökosystemleistungen ermöglichen der Menschheit ein nachhaltiges Leben, und ihr Verlust ist eine kritische Entwicklung.
In dieser Arbeit konzentriere ich mich auf Graslandsysteme, die mit am stärksten von Klima- und Landnutzungswandel betroffen sind. Grasland ist für die Ökosystemleistungen von großer Bedeutung, insbesondere im Hinblick auf häufiger auftretende extreme Wetterereignisse wie Überschwemmungen, da Grasland die Wasserrückhaltung verbessern und den Abfluss verringern kann. Trotz ihrer Bedeutung wird erwartet, dass die Artenvielfalt und die Fläche von Grasland in Süddeutschland, der Untersuchungsregion dieser Arbeit, abnehmen werden.
Um künftige Wege und Auswirkungen von Klima- und Landnutzungswandel abzuschätzen, verwenden Wissenschaftler Computermodelle. Eine Art von Modell ist das so genannte Artenverteilungsmodell, das vorhersagen kann, wie sich der Lebensraum und die Häufigkeit von Arten unter verschiedenen Klima- und/oder Landnutzungswandelszenarien verändern werden. Ich habe ein solches Modell erstellt, das mehrere Mechanismen integriert, nämlich demografische, metabolische und Ausbreitungsprozesse, und es als einfach zu installierendes Paket veröffentlicht, um den Benutzern den Zugang zu erleichtern. In Kapitel I dieser Arbeit stelle ich MetaRange.jl vor und erkläre seine Funktionsweise ausführlich anhand einer Fallstudie. Die Ergebnisse zeigen einen allgemeinen Rückgang des Vorkommens von Orchis militaris und verdeutlichen die Bedeutung der lokalen Populationsdynamik und der Ausbreitung für genaue Zukunftsprognosen.
In Kapitel II untersuche ich die gemeinsamen Auswirkungen von Klima- und Landnutzungswandel auf mehrere Graslandarten. Die Ergebnisse deuten darauf hin, dass der Landnutzungswandel negative Auswirkungen des Klimawandels verstärken kann. Die Studie zeigt potenzielle Hotspots des Biodiversitätsverlustes sowie potenzielle Refugien auf und unterstreicht die Bedeutung von Schutzmaßnahmen.
In der Diskussion veranschauliche ich die Auswirkungen meiner Ergebnisse auf den Naturschutz und auf das Gebiet der ökologischen Modellierung. Ich beschreibe Herausforderungen, die sich während meiner Forschung ergaben, und erwähne gescheiterte Ansätze. Schließlich schlage ich detaillierte Ideen für zukünftige Modellimplikationen vor
Real-Time Quaking-Induced Conversion (RT-QuIC) for the Detection of Pathological α-Synuclein in the Skin of Patients with Parkinson's Disease
No full textPathologisches alpha-Synuclein gilt schon seit geraumer Zeit als potenzieller Biomarker für die Parkinson-Erkrankung. Real-Time Quaking-Induced Conversion (RT-QuIC) ist eine neue, sensitive und effiziente Methode, bereits geringe Mengen von aggregiertem alpha-Synuclein in unterschiedlichen Medien zu detektieren. Ziel dieser Arbeit war, die diagnostische Genauigkeit, Zuverlässigkeit und Übertragbarkeit von dermalem alpha-Synuclein-RT-QuIC zu bestimmen. Ein möglicher Einsatz als frühdiagnostischer Marker sollte geprüft werden. Darüber hinaus sollte die Korrelation zwischen der Menge an nachgewiesenem alpha-Synuclein und der klinischen Symptomatik, sowie dem Krankheitsstadium untersucht werden. Dafür unterzogen sich im Zeitraum Mai 2019 bis einschließlich Dezember 2020 PatientInnen mit klinisch gesichertem MP (n=33) und gesunde KontrollprobandInnen (n=33) einer Hautstanzbiopsie. Die Rekrutierung der Teilnehmenden erfolgte ausschließlich in der Neurologischen Klinik und Poliklinik des Universitätsklinikums Würzburg. Die Hautproben entstammten dem Oberschenkel (OS), dem unteren Rücken (Th10), sowie dem Bereich der Halswirbelsäule (C7). Im Rahmen der klinischen Phase erfolgte außerdem die Erhebung klinischer Daten mit Hilfe verschiedener Patientenfragebögen. Anschließend wurden die entnommenen Hautproben (insgesamt 190) im Labor verarbeitet und mittels RT-QuIC-Assay untersucht. Das durchgeführte Haut-RT-QuIC-Assay erwies sich insgesamt als eine vielversprechende Methode, um alpha-Synuclein-Aggregationen in der Haut von Parkinson-PatientInnen nachzuweisen. Bei 28 von 33 der PatientInnen konnten hinreichend alpha-Synuclein-Aggregationen nachgewiesen werden. Die Sensitivität lag somit bei 84.8% und die Spezifität bei 93.9%. Das ergab eine diagnostische Genauigkeit von 90.1%. Eine hohe alpha-Synuclein-Aktivität korrelierte hierbei allerdings nicht mit der Krankheitsdauer und dem Vorhandensein verschiedener nicht motorischer Symptome. Lediglich ein Zusammenhang mit dem Auftreten von RBD konnte gesehen werden. In der praktischen Durchführung erwies sich die Hautstanzbiopsie als eine leicht durchführbare und minimalinvasive Methode zur Gewinnung von Hautproben. Die drei unterschiedlichen Biospsieentnahmestellen zeigten sich in dieser Arbeit in ähnlichem Maße positiv und es ergaben sich keine Hinweise auf einen Verteilungsgradienten. Zusammenfassend kann gesagt werden, dass pathologisches alpha-Synuclein und der dermale RT-QuIC-Assay einen vielversprechenden Ausblick auf die zukünftige Diagnostik der Parkinson-Krankheit geben.Pathological α-synuclein has long been considered a potential biomarker for Parkinson's disease. Real-Time Quaking-Induced Conversion (RT-QuIC) is a new, sensitive, and efficient method for detecting even small amounts of aggregated α-synuclein in various media. The aim of this study was to determine the diagnostic accuracy, reliability, and transferability of dermal α-synuclein RT-QuIC. A potential use as an early diagnostic marker was to be examined. Furthermore, the correlation between the amount of detected α-synuclein and clinical symptoms, as well as disease stage, was investigated. For this purpose, from May 2019 to December 2020, patients with clinically confirmed Parkinson's disease (n=33) and healthy control subjects (n=33) underwent skin punch biopsies. Recruitment of participants took place exclusively at the Neurological Clinic and Polyclinic of the University Hospital Würzburg. The skin samples were taken from the thigh (OS), lower back (Th10), and cervical spine area (C7). During the clinical phase, clinical data were also collected using various patient questionnaires. Subsequently, the collected skin samples (a total of 190) were processed in the laboratory and analyzed using the RT-QuIC assay. The conducted skin RT-QuIC assay proved to be a promising method for detecting α-synuclein aggregations in the skin of Parkinson's patients. Sufficient α-synuclein aggregations could be detected in 28 out of 33 patients. Thus, sensitivity was 84.8% and specificity was 93.9%, resulting in a diagnostic accuracy of 90.1%. However, high α-synuclein activity did not correlate with disease duration or the presence of various non-motor symptoms; only a relationship with the occurrence of REM sleep behavior disorder (RBD) could be observed. In practical implementation, the skin punch biopsy proved to be an easily performed and minimally invasive method for obtaining skin samples. The three different biopsy sites showed similar positive results in this study, and there were no indications of a distribution gradient. In summary, it can be said that pathological α-synuclein and the dermal RT-QuIC assay provide a promising outlook for the future diagnosis of Parkinson's disease
Influence of the HGF/c-Met signaling pathway on immune checkpoint ligands in head and neck carcinoma cell lines and spheroids
No full textIm Laufe der letzten Jahre ist durch den Versuch der Entwicklung neuer Therapieansätze für Tumoren im Kopf-Hals-Bereich zunehmend auch das den Tumor umgebende Mikromilieu in den Fokus der Forschung gerückt. Durch einige bereits publizierte Arbeiten konnte eine Wirkung des HGF/Met-Signalweges auf das Tumormikromilieu nachgewiesen werden. Für die Versuche wurden die vier etablierten Tumorzellen Detroit562, SCC9, HN und BHY aus humanen Plattenepithelkarzinomen der Kopf-Hals-Region verwendet. Neben den adhärent wachsenden Zellen wurden aus den etablierten Zelllinien Sphäroide herangezogen, um die Versuchssituation dem ursprünglichen Tumorgewebe ähnlicher zu gestalten.
Zunächst wurde nachgewiesen, dass alle verwendeten Zelllinien den c-Met-Rezeptor exprimieren. Durch HGF-Stimulation kam es bei allen Zelllinien zu einer Aktivierung des c-Met-Rezeptors. Auffällig war hier bei der Zelllinie Detroit562, dass bereits die Kontrollgruppe ohne HGF-Stimulation eine starke Phosphorylierung zu erfahren schien, da hier ebenfalls vermehrt aktivierter c-Met-Rezeptor nachgewiesen werden konnte.
Durch die Versuche mit adhärent wachsenden Zellen konnten in dieser Arbeit die aus anderen Arbeiten bereits erlangten Erkenntnisse vom Einfluss von HGF auf die Expression von PD-L1 nachgewiesen werden. Durch die Stimulation mit HGF kommt es zu einer verstärkten Expression von PD-L1 auf der Oberfläche der Tumorzellen. PD-L1 wiederum sorgt dafür, dass die Tumorzellen nicht vom Immunsystem als entartet erkannt und eliminiert werden können. Für die Zelllinie Detroit562 konnte sowohl auf mRNA-Ebene, auf Proteinebene und auf der Zelloberfläche nach HGF-Stimulation vermehrt PD-L1 nachgewiesen werden. Durch eine zusätzliche oder alleinige Inhibition mit Foretinib konnte eine PD-L1-Konzentration vergleichbar zur unbehandelten Kontrolle nachgewiesen werden. Dadurch lässt sich zeigen, dass die vermehrte Expression von PD-L1 spezifisch durch die HGF-Stimulation hervorgerufen wurde. Mittels Durchflusszytometrie konnte für alle Zelllinien eine vermehrte Expression von PD-L1 nach HGF-Stimulation nachgewiesen werden, die sich durch zusätzliche Zugabe von Foretinib wieder abschwächte. Mittels Western Blot und qPCR ließ sich auch für die Zelllinie HN der in der Durchflusszytometrie gezeigte HGF Effekt nachweisen. Für die Zelllinie BHY konnte eine vermehrte Expression von PD-L1 nach HGF-Stimulation neben der Durchflusszytometrie auch mittels qPCR nachgewiesen werden.
Neben PD-L1 wurde mit B7-H4 ein weiteres Immuncheckpoint-Protein untersucht. B7-H4 zählt, wie auch PD-L1, zu den inhibitorischen Immuncheckpoint-Proteinen und verhindert die Aktivierung der T-Zellen im Mikromilieu des Tumors. Hierbei konnte für die Zelllinie Detroit562 die höchste Expression von B7-H4 ermittelt werden, die durch eine HGF-Stimulation stark vermindert wird und sich durch zusätzliche Zugabe von Foretinib wieder erhöht. Auch für SCC9 war mittels qPCR eine Reduktion der Expression von B7-H4 nach HGF-Stimulation nachweisbar, die allerdings deutlich geringer ausfiel als bei Detroit562. Diese Nachweise konnten für Detroit562 auch mittels Western Blot bestätigt werden. Für BHY und HN konnte geringfügig mehr B7-H4 mittels qPCR nachgewiesen werden, wenn eine HGF-Stimulation stattfand. Generell war die Expression in beiden Zelllinien jedoch auch mit HGF-Stimulation gering. Mittels Western Blot war kein spezifischer Nachweis von B7-H4 für die Zelllinien HN und BHY möglich. Auffällig war, dass sich B7-H4 nicht mittels Durchflusszytometrie nachweisen ließ. Dies lässt vermuten, dass B7-H4 nicht oder nur in geringer Menge auf der Zelloberfläche zu finden ist oder von dort sehr schnell wieder internalisiert wird. Wie die Immunfluoreszenzfärbung in Detroit562 gezeigt hat, scheint es intrazellulär nicht in bestimmten Zellorganellen gehäuft aufzutreten, sondern sich gleichmäßig im Zytoplasma zu verteilen. Eine deutliche Anfärbung der Zellmembran war auch bei dieser Methode nicht festzustellen. Die starke Abnahme von B7-H4 bei mit HGF stimulierten Detroit562-Zellen ließ sich auch bei dieser Methode bestätigen.
Die Versuchsreihen mit Sphäroiden wurden neu etabliert. Es ist gelungen, aus adhärent wachsenden Zellen kugelige 3D-Zellobjekte zu züchten, die auch unter Laborbedingungen eine dem menschlichen Tumorgewebe ähnliche Situation erzeugen können und dadurch realitätsnähere Situationen in der Forschung simuliert werden können. Sphäroide der Zelllinie Detroit562 wiesen durch HGF-Stimulation im Western Blot und in der Durchflusszytometrie eine verstärkte Expression von PD-L1 auf, die durch Foretinib wieder vermindert wurde. So gelang es bei den Detroit562-Sphäroiden mittels Western Blot und Durchflusszytometrie die bei den adhärent wachsenden Zellen gewonnenen Erkenntnisse zu bestätigen. Für die Sphäroide der Zelllinien BHY, HN und SCC9 bestätigten sich die aus den Versuchen mit adhärent wachsenden Zellen eher schwachen Veränderungen nach HGF-Stimulation. Die Vereinzelung der Zellen aus den Sphäroiden für die Durchflusszytometrie-Messung führte zu einem großen Anteil an Zelltrümmern, so dass für eine endgültige Bewertung der Ergebnisse eine Optimierung des Verfahrens notwendig wäre. Die Zelllinie Detroit562 wurde im Gegensatz zu anderen Zelllinien aus einer Metastase entnommen, zudem ist im Vergleich zu anderen Zelllinien der c-Met-Rezeptor überexprimiert. Dies könnte erklären, warum insbesondere diese Tumorzellen aus allen Versuchen durch besonders eindeutige Ergebnisse herausstachen. Durch die vorliegende Arbeit wird mit dem HGF/c-Met-Signalweg ein in Zukunft weiter an Bedeutung gewinnender Weg genauer beleuchtet, der als Grundlage für neue Therapieansätze zur Bekämpfung von Kopf-Hals-Tumoren dienen kann.In recent years, attempts to develop new therapeutic approaches for tumors in the head and neck region have increasingly brought the microenvironment surrounding the tumor into the focus of research. Several previously published studies have demonstrated an effect of the HGF/Met signaling pathway on the tumor microenvironment. The four established tumor cells Detroit562, SCC9, HN and BHY from human squamous cell carcinomas of the head and neck region were used for the experiments. In addition to the adherent growing cells, spheroids were used from the established cell lines to make the experimental situation more similar to the original tumor tissue.
First, it was demonstrated that all cell lines used express the c-Met receptor. HGF stimulation led to activation of the c-Met receptor in all cell lines. It was noticeable in the Detroit562 cell line that even the control group without HGF stimulation appeared to experience strong phosphorylation, as an increased level of activated c-Met receptor could also be detected here.
The experiments with adherent growing cells in this study were able to prove the findings from other studies on the influence of HGF on the expression of PD-L1. Stimulation with HGF leads to increased expression of PD-L1 on the surface of the tumor cells. PD-L1 in turn ensures that the tumor cells cannot be recognized as degenerate by the immune system and eliminated. For the Detroit562 cell line, increased PD-L1 was detected at the mRNA level, at the protein level and on the cell surface following HGF stimulation.
With additional or sole inhibition with foretinib, a PD-L1 concentration comparable to the untreated control could be detected. This shows that the increased expression of PD-L1 was specifically caused by HGF stimulation. Using flow cytometry, an increased expression of PD-L1 after HGF stimulation was detected for all cell lines, which was attenuated again by the additional addition of foretinib. Using Western blot and qPCR, the HGF effect shown in flow cytometry could also be detected for the HN cell line. For the cell line BHY, an increased expression of PD-L1 after HGF stimulation could also be detected by qPCR in addition to flow cytometry.
In addition to PD-L1, another immune checkpoint protein, B7-H4, was investigated. Like PD-L1, B7-H4 is one of the inhibitory immune checkpoint proteins and prevents the activation of T cells in the tumor microenvironment. The highest expression of B7-H4 was determined for the Detroit562 cell line, which is greatly reduced by HGF stimulation and increases again with the additional addition of foretinib. A reduction in the expression of B7-H4 after HGF stimulation was also detectable for SCC9 using qPCR, although this was significantly lower than for Detroit562.
These findings were also confirmed for Detroit562 by Western blot. For BHY and HN, slightly more B7-H4 was detected by qPCR when HGF stimulation was applied. However, expression was generally low in both cell lines even with HGF stimulation. No specific detection of B7-H4 was possible for the HN and BHY cell lines by Western blot. It was striking that B7-H4 could not be detected by flow cytometry. This suggests that B7-H4 is not found on the cell surface, or only in small quantities, or is very quickly internalized from there. As the immunofluorescence staining in Detroit562 has shown, it does not appear to be concentrated intracellularly in certain cell organelles, but is distributed evenly in the cytoplasm. A clear staining of the cell membrane was also not observed with this method. The strong decrease of B7-H4 in Detroit562 cells stimulated with HGF was also confirmed by this method.
The series of experiments with spheroids was newly established. It has been possible to grow spherical 3D-cell objects from adherently growing cells, which can also generate a situation similar to human tumor tissue under laboratory conditions and thus simulate more realistic situations in research. Spheroids of the Detroit562 cell line showed increased expression of PD-L1 by HGF stimulation in Western blot and flow cytometry, which was reduced again by foretinib.
In the Detroit562 spheroids, Western blotting and flow cytometry were used to confirm the findings obtained with adherently growing cells. For the spheroids of the BHY, HN and SCC9 cell lines, the rather weak changes seen in the experiments with adherently growing cells were confirmed after HGF stimulation. The separation of the cells from the spheroids for the flow cytometry measurement led to a large proportion of cell debris, so that an optimization of the procedure would be necessary for a final evaluation of the results.
In contrast to other cell lines, the Detroit562 cell line was taken from a metastasis and in addition, the c-Met receptor is overexpressed compared to other cell lines. This could explain why these tumor cells in particular stood out from all experiments due to their particularly clear results. This study sheds light on the HGF/c-Met signaling pathway, a pathway that will become increasingly important in the future and could serve as the basis for new therapeutic approaches to combat head and neck tumors
Biologische Netzwerke - von Signalprozessierung in DNA-kodierten Proteinnetzwerken zu nicht-lokaler Informationsverarbeitung im Cortex
No full textThis thesis focuses on systems biology methods to understand signal processing in biological networks. These systems exist in a complex, inherently interconnected space that is not readily quantifiable. To order the complexity of different systems, I use an approach grounded in the theory of emergence, which posits that a system's evolution can exceed the mere sum of its individual parts through interaction and communication, leading to increased processing power and environmental representation. Our strategy involves setting up a mathematical representation of biological systems using networks composed of nodes representing entities like nucleic acids, proteins, and neurons and edges representing interactions between them. These networks then facilitate systemic analyses integrating insights from various scientific fields, including molecular biology, neurobiology, physics, and computer science, thus fostering a deeper understanding of biological signal processing.
During my thesis work, I established a fundamental approach for creating and evolving models of different biological networks. The initial step involves setting up a network model of interacting components (“topology”) based on the biological system’s morphology, followed by analyzing the reconstructed network topology (e.g., where are central components, modulatory inputs, key signal pathways, and integration points). The topology then informs space-time-dependent rules for dynamic simulations (who activates whom and whether a process is fast or slow) that are validated against observed biology. This iterative alignment process between simulation and experiment gradually refines the model, fostering a more accurate representation of the biological system in question. Importantly, a model improves understanding while enhancing the efficiency and efficacy of experiments, which has practical implications such as resource conservation and reduced reliance on model animals.
The three chapters of the thesis focus on information processing at the DNA, protein, and cortical level. These processing domains are interconnected. DNA encodes information for RNA, which governs the signaling networks of proteins. At this level, we primarily studied the functions and behavior at the intracellular level and discussed the implications of system defects, pathology, and disease on information processing. However, the intracellular processing integrates into broader intercellular networks, such as cell-cell interaction and neural networks, eventually forming correlated units in cortical columns. The columns form the basis of the cortical network architecture associated with cognition, higher brain functions, and consciousness. As an outcome of our modeling approaches, we can study the system at different levels: zoom in to fine-tuned differences and zoom out to detect major drives.
In detail, we could deduce and publish substantial and precise findings by integrating diverse information sources into large-scale network models and resulting simulations of biological systems (two first authors, two book chapters, five coauthorships, two preprints). Discoveries include identifying a silent SNP in the Ambra1 gene influencing RNA folding, which disturbed splicing, thus altering its expression level and protein function. However, large-scale system effects on protein networks, neuronal, and behavior levels remain obscured by emergent complexity. To comprehend the causality of the DNA effects, we need an understanding of the processing of the following emergent levels. Therefore, we established a framework for predicting and validating protein interactions within species and at species intersection. Using this framework for reconstructing fungal interactions during host invasion and evasion, I could elucidate key interactions during the immune evasion of the fungi, A. fumigatus, within the phagolysosome. We got insights into how the fungi manipulate the host, e.g., prevent phagolysosome maturation and the host’s counteractions. Furthermore, we have identified drugs potentially disrupting the critical interactions between the host and the pathogen, thereby expanding our arsenal of antifungal strategies. We were validating the pivotal interactions in subsequent experiments and are presently assessing the efficacy of the drugs in infection models. Moreover, I show that the modeling framework, together with the large-scale integration of proteomics and transcriptomics, is effective for elucidating significant differences in platelet signaling of mice and men. This holds considerable importance as mice serve as invaluable model organisms for thrombosis (causes of stroke and heart attack) and inflammatory research. Beyond that, the thesis elucidates the dynamic functionalities of blood platelets, offering insights into platelet-related diseases and showcasing how platelets make rapid decisions in complex environments. Likewise, I explored the network dynamics underlying megakaryocyte (mother cells of platelets) behavior during transendothelial migration and its implications for conditions such as thrombocytopenia. Investigating the reconstructed networks and dynamics allows for obtaining fundamental mathematical principles of how cells solve environmental complexity problems in general. One such observation was that fast-changing and highly variable nodes within feedback loops are indispensable for dynamic behavior such as cell migration or cell-cell communication. Here, fast dynamics might give rise to oscillatory signal processing, which demands different decoding strategies but offers more degrees of freedom and the possibility of establishing a new information processing paradigm.
We explored this new domain of information processing by establishing a network model built on the principles of feedback loops and oscillators, aiming to simulate cortical dynamics. I could show that this oscillatory network model adds a new emergence level to local, modular information processing as information is processed non-locally and is represented holistically within a wave interference pattern. By adapting the model to cortical scales, we could show that it faithfully replicates electrophysiological characteristics of healthy and diseased brains and promises to elevate our understanding of disorders like schizophrenia, Alzheimer's, and epilepsy. Here, the model provides a solid theoretical framework for understanding the fundamental processes of neural tissues. Further analyses of the cortical model show that it could be suitable for maximizing information integration, a defining property that might be important for facilitating the development of consciousness. These profound insights into cortical systems present a fresh perspective on cortical processing and its evolution (1st author paper submitted). They agree with electrophysiological data and should now be followed up further by even more experiments.
In conclusion, this thesis outlines the general principles of biological information processing and underlines the vital role of information integration in the intricate dance of life, environment, adaptive processing, and cognition. The analysis of the different emergent levels reveals a viable path for the evolution of networks, and increasing information integration appears to be a key signature. Biological networks may facilitate survival through increasing information integration to overcome inherent system limitations in interfacing with complex environments to improve the correspondence between sensing and actions.Diese Dissertation konzentriert sich auf Methoden der Systembiologie, um die Signalverarbeitung in biologischen Netzwerken zu verstehen. Solche Systeme existieren in einem komplexen, inhärent miteinander verbundenen Raum, der nicht leicht quantifizierbar ist. Um die Komplexität verschiedener Systeme zu ordnen, verwende ich einen Ansatz, der in der Theorie der Emergenz verankert ist. Diese Theorie besagt, dass die Evolution eines Systems, durch Interaktion und Kommunikation, über die bloße Summe seiner Einzelteile hinausgehen kann, was zu einer erhöhten Verarbeitungskapazität und Umweltrepräsentation führen kann. Unsere Strategie beinhaltet das Aufstellen einer mathematischen Repräsentation biologischer Systeme mit Netzwerken, die aus Knoten bestehen, welche Entitäten wie Nukleinsäuren, Proteine und Neuronen darstellen, und Kanten, die Interaktionen zwischen ihnen repräsentieren. Diese Netzwerke erleichtern dann systemische Analysen, die Einsichten aus verschiedenen wissenschaftlichen Bereichen integrieren, darunter Molekularbiologie, Neurobiologie, Physik und Informatik, was zu einem tieferen Verständnis der biologischen Signalverarbeitung führt.
Während meiner Thesis-Arbeit habe ich einen grundlegenden Ansatz für das Erstellen und Entwickeln von Modellen verschiedener biologischer Netzwerke etabliert. Der erste Schritt beinhaltet das Aufstellen eines Netzwerkmodells interagierender Komponenten („Topologie“), basierend auf der Morphologie des biologischen Systems, gefolgt von der Analyse der rekonstruierten Netzwerktopologie (z.B. wo befinden sich zentrale Komponenten, modulatorische Eingaben, Schlüsselsignalwege und Integrationspunkte). Die Topologie informiert dann raumzeitabhängige Regeln für dynamische Simulationen (wer aktiviert wen und ob ein Prozess schnell oder langsam ist), die gegen die beobachtete Biologie validiert werden. Dieser iterative Abgleichungsprozess zwischen Simulation und Experiment verfeinert das Modell allmählich und fördert eine genauere Repräsentation des betreffenden biologischen Systems. Wichtig ist, dass ein Modell das Verständnis verbessert und gleichzeitig die Effizienz und Wirksamkeit von Experimenten steigert, was praktische Auswirkungen wie Ressourcenschonung und reduzierte Abhängigkeit von Modellorganismen hat.
Die drei Kapitel der Dissertation konzentrieren sich auf die Informationsverarbeitung auf DNA-, Protein- und kortikaler Ebene. Diese Verarbeitungsdomänen sind miteinander verbunden. DNA kodiert Informationen für RNA, die die Signalnetzwerke von Proteinen steuert. Auf dieser Ebene haben wir hauptsächlich die Funktionen und das Verhalten auf intrazellulärer Ebene untersucht und die Auswirkungen von Systemfehlern, Pathologie und Krankheiten auf die Informationsverarbeitung diskutiert. Die intrazelluläre Verarbeitung integriert sich jedoch in breitere interzelluläre Netzwerke, wie Zell-Zell-Interaktion und neuronale Netzwerke, und bildet schließlich korrelierte Einheiten in kortikalen Säulen. Diese Säulen bilden die Basis der kortikalen Netzwerkarchitektur, die mit Kognition, höheren Gehirnfunktionen und dem Bewusstsein verbunden ist. Als Ergebnis meiner Modellierungsansätze können ich das System auf verschiedenen Ebenen untersuchen: hineinzoomen, um fein abgestimmte Unterschiede zu erkennen, und herauszoomen, um globale Flüsse zu erkennen.
Im Detail konnten wir durch die Integration verschiedener Informationsquellen in groß angelegten Netzwerkmodellen und daraus resultierende Simulationen biologischer Systeme wesentliche und präzise Erkenntnisse ableiten und veröffentlichen (zwei Erstautorenschaften, zwei Buchkapitel, fünf Ko-Autorenschaften, zwei preprints). Zu den Entdeckungen gehören die Identifizierung eines stillen SNP im Ambra1-Gen, das die RNA-Faltung beeinflusst, was das Spleißen stört und somit das Expressionsniveau und die Protein-Funktion verändert. Groß angelegte Systemeffekte auf Proteinnetzwerk-, Neuronnetzwerk- und Verhaltensebene bleiben jedoch durch emergente Komplexität verschleiert. Um die Kausalität der DNA-Effekte zu verstehen, wird ein Verständnis der Informationsverarbeitung der folgenden emergenten Ebenen benötigt. Daher haben wir ein Konzept für die Vorhersage und Validierung von Proteininteraktionen innerhalb von Arten und an Artenschnittstellen etabliert. Mit diesem Paradigma für die Rekonstruktion von Pilzinteraktionen während der Wirtsinvasion und -umgehung konnte ich Schlüsselinteraktionen während der Immunflucht des Pilzes A. fumigatus im Phagolysosom aufdecken. Wir erhielten Einblicke, wie der Pilz den Wirt manipuliert, z. B. die Reifung des Phagolysosoms verhindert, und in die entsprechenden Gegenmaßnahmen des Wirts. Darüber hinaus haben wir Medikamente identifiziert, die potenziell die kritischen Wechselwirkungen zwischen Wirt und Pathogen stören und damit unser Arsenal an Antimykotika erweitern. Wir haben die entscheidenden Porteinwechselwirkungen in nachfolgenden Experimenten validiert und bewerten gegenwärtig die Wirksamkeit der Medikamente in Infektionsmodellen. Darüber hinaus zeige ich, dass das Modellierungskonzept zusammen mit der groß angelegten Integration von Proteomik und Transkriptomik effektiv ist, um bedeutende Unterschiede in der Thrombozytensignalgebung von Mäusen und Menschen zu erläutern. Dies ist von erheblicher Bedeutung, da Mäuse als unverzichtbare Modellorganismen für die Thromboseforschung (Ursachen von Schlaganfall und Herzinfarkt) und Entzündungsforschung dienen. Darüber hinaus erläutert die Dissertation die dynamischen Funktionalitäten von Blutplättchen und bietet Einblicke in plättchenbezogene Krankheiten und zeigt auf, wie Plättchen schnelle Entscheidungen in komplexen Umgebungen treffen. Ebenso habe ich die Netzwerkdynamik untersucht, die dem Verhalten von Megakaryozyten (Mutterzellen von Thrombozyten) während der transendothelialen Migration zugrunde liegt und deren Auswirkungen auf Zustände wie Thrombozytopenie. Durch die Untersuchung der rekonstruierten Netzwerke und Dynamiken können grundlegende mathematische Prinzipien gewonnen werden, wie Zellen generell Umweltkomplexitätsprobleme lösen. Eine solche Beobachtung war, dass schnell wechselnde und hochvariable Knoten in Rückkopplungsschleifen unverzichtbar für dynamisches Verhalten wie Zellmigration oder Zell-Zell-Kommunikation sind. Hier könnten schnelle Dynamiken zu oszillierender Signalverarbeitung führen, die unterschiedliche Dekodierungsstrategien erfordert, aber mehr Freiheitsgrade und die Möglichkeit bietet, ein neues Informationsverarbeitungsparadigma zu etablieren.
Ich habe dieses neue Gebiet der Informationsverarbeitung erforscht, indem ich ein Netzwerkmodell auf der Grundlage von Feedbackschleifen und Oszillatoren generiert habe, um kortikale Dynamiken zu simulieren. Ich konnte zeigen, dass dieses oszillierende Netzwerkmodell eine neue Emergenzebene zur lokalen, modularen Informationsverarbeitung hinzufügt, da Informationen nicht lokal verarbeitet werden und ganzheitlich innerhalb eines Welleninterferenzmusters dargestellt werden. Durch die Anpassung des Modells an kortikale Maßstäbe konnten wir zeigen, dass es elektrophysiologische Merkmale gesunder und kranker Gehirne getreu nachbildet und verspricht das heutige Verständnis von Störungen wie Schizophrenie, Alzheimer und Epilepsie zu verbessern. Hier bietet das Modell einen soliden theoretischen Rahmen für das Verständnis der grundlegenden Prozesse von Nervengeweben. Weitere Analysen des kortikalen Modells zeigen, dass es geeignet sein könnte, die Informationsintegration zu maximieren, eine definierende Eigenschaft, die für die Förderung der Entwicklung des Bewusstseins wichtig sein könnte. Diese tiefgreifende Einsicht in kortikale Systeme bietet eine frische Perspektive auf die kortikale Verarbeitung und ihre Evolution.
Zusammenfassend skizziert diese Arbeit die allgemeinen Prinzipien der biologischen Informationsverarbeitung und unterstreicht die entscheidende Rolle der Informationsintegration im komplexen Zusammenspiel von Leben, Umwelt, adaptiver Verarbeitung und Kognition. Die Analyse der verschiedenen emergenten Ebenen offenbart einen gangbaren Weg für die Evolution von Netzwerken und eine zunehmende Informationsintegration scheint ein Schlüsselmerkmal zu sein. Biologische Netzwerke können das Überleben fördern, indem sie die Informationsintegration steigern, um die inhärenten Systembeschränkungen bei der Interaktion mit komplexen Umgebungen zu überwinden und die Übereinstimmung zwischen Wahrnehmung und Handlungen zu verbessern
Effects of Tumor Treating Fields on the Blood-Brain Barrier
No full textTumor Treating Fields (TTFields) sind eine neue Therapiemodalität bei Glioblastomen. Durch Zufall wurde beobachtet, dass TTFields morphologische Veränderungen in einem in vitro Modell der Blut-Hirn-Schranke (BHS) aus mikrovaskulären Endothelzellen (cerebEND-Zellen) verursachten. Das Ziel dieser Arbeit war es daher, diese Effekte genauer zu erforschen. Beim Austesten der besten Behandlungsfrequenz war nicht die beim Glioblastom therapeutisch wirksame Frequenz von 200 kHz optimal. Die größten Effekte auf die BHS traten nach einer 72-stündigen Behandlung mit 100 kHz TTFields auf. Dabei veränderten die cerebEND-Zellen ihre typische lang gestreckte Spindelform und stellten sich nach der Therapie kurz und rundlich dar. Des Weiteren verlagerte sich das Tight Junction Protein Claudin-5 von der Zellmembran in das Zytoplasma. Die Gesamtkonzentration von Claudin-5 blieb dabei unverändert. Diese Effekte waren reversibel, sodass sich die cerebEND-Zellen nach Beendigung der TTFields-Therapie innerhalb von 96 h vollkommen erholten. Die Erholung der Zellen beruhte nicht auf einer Zellproliferation und eine TTFields-Behandlung verursachte keinen apoptotischen Zelltod. Das bedeutet, dass die Vitalität der cerebEND-Zellen durch die Therapie unbeeinflusst war. Weiterführende Arbeiten wiesen nach, dass die durch eine 100 kHz TTFields-Behandlung über 72 h verursachten morphologischen Veränderungen zu einer signifikant erhöhten Permeabilität der BHS für Moleküle bis zu einer Größe von 65 kDa führten. Der zugrunde liegende Mechanismus beruht wahrscheinlich auf der Phosphorylierung von Claudin-5 über den GEF-H1/Rho/ROCK Signalweg, wodurch Claudin-5 von der Zellmembran der cerebEND-Zellen in das Zytoplasma disloziert. Dies hat zur Folge, dass sich die interzellulären Kontakte lösen und sich die BHS öffnet. Diese Beobachtungen könnten die Grundlage für eine deutlich verbesserte Therapie von ZNS-Erkrankungen sein, da potenziell wirksame medikamentöse Therapeutika eingesetzt werden könnten, welche aktuell die BHS nicht überqueren können. Zugleich bieten TTFields eine im Vergleich zu anderen Methoden nebenwirkungsarme Möglichkeit, um die BHS gezielt und reversibel zu öffnen. In Zusammenschau der vorhandenen Daten aus verschiedenen präklinischen Versuchen wäre es denkbar, TTFields mit einer Frequenz von 100 kHz für erste klinische Studien einzusetzen.Tumor Treating Fields (TTFields) are a new therapeutic modality for glioblastoma. By chance,
TTFields were observed to cause morphological changes in an in vitro model of the blood-brain
barrier (BBB) of microvascular endothelial cells (cerebEND-cells). The aim of this thesis was
therefore to investigate these effects in more detail. When testing the best treatment frequency, the
frequency of 200 kHz, which is therapeutically effective for glioblastoma, was not optimal. The
greatest effects on the BBB occurred after 72 hours of treatment with 100 kHz TTFields. The
cerebEND-cells changed their typical elongated spindle shape and appeared short and round after
the therapy. Furthermore, the tight junction protein claudin-5 dislocated from the cell membrane to
the cytoplasm. The total concentration of claudin-5 remained unchanged. These effects were
reversible, so that the cerebEND-cells fully recovered within 96 hours after the end of TTFields
therapy. Cell recovery was not based on cell proliferation, and TTFields treatment did not cause
apoptotic cell death. This means that the vitality of the cerebEND-cells was unaffected by the
therapy. Further work showed that the morphological changes caused by a 100 kHz TTFields
treatment over 72 h, led to a significantly increased permeability of the BBB for molecules up to 65
kDa in size. The underlying mechanism is likely due to the phosphorylation of claudin-5 via the
GEF-H1/Rho/ROCK signaling pathway, causing claudin-5 to dislocate from the cell membrane of
cerebEND-cells into the cytoplasm. As a result, the intercellular contacts are loosened and the BBB
opens. These observations could be the basis for a significantly improved therapy of CNS diseases,
as potentially effective drug therapeutics could be used, which currently cannot cross the BBB. At
the same time, TTFields offer a way to open the BBB in a targeted and reversible manner with few
side effects compared to other methods. Combined with the available data from various preclinical
trials, it would be conceivable to use TTFields with a frequency of 100 kHz for initial clinical trials
Non invasive brain stimulation in the treatment of anxiety disorders
No full textAngststörungen zählen zu den häufigsten psychischen Erkrankungen weltweit. Obwohl die kognitive Verhaltenstherapie neben der Psychopharmakotherapie in der klinischen Praxis gut etabliert ist, profitieren nicht alle Patienten gleichermaßen von dieser Behandlungsmethode. Daher ist es von besonderer Relevanz, dieses Therapieverfahren zu optimieren und weiterzuentwickeln. Ein besonderer Forschungsschwerpunkt liegt auf der gezielten Förderung der Furchtextinktion, ein zugrundeliegender Lernprozess der expositionsbasierten Intervention. Erste vielversprechende Befunde deuten darauf hin, dass der Einsatz von nicht-invasiven Hirnstimulationsverfahren die Extinktionsprozesse bei gesunden Personen sowie bei Personen mit Angststörungen als ergänzende Intervention zur Expositionstherapie steigern könnte. Eine kürzlich veröffentlichte Laborstudie beispielsweise zeigte, dass die transkranielle Magnetstimulation über dem linken posterioren Präfrontalkortex zur indirekten Aktivierung des ventromedialen Präfrontalkortex während des Extinktionslernens die Extinktionsprozesse bei gesunden Probanden verstärkte. Das Ziel dieser Dissertation war es, die Laborbefunde in den klinischen Kontext bei Personen mit Angststörungen zu übertragen. Da jedoch noch einige Fragen bezüglich der optimalen Stimulationsparameter für die Übertragung dieser Ergebnisse offen sind, sollten zusätzlich einige dieser offenen Fragen beantwortet werden, um einen wichtigen Beitrag zur Optimierung der Expositionstherapie bei Personen mit Angststörungen zu leisten. Die vorliegende Arbeit umfasst zwei parallel durchgeführte Studien.
In der ersten Studie führten 76 Personen mit pathologischer Höhenangst zwei Expositionssitzungen in virtueller Realität durch. Vor den beiden Expositionsübungen erhielten die Probanden entweder eine aktive oder Placebo transkranielle Magnetstimulation mit länger anhaltenden modulierenden Effekten über dem individuellen linken posterioren Präfrontalkortex (gemäß der Laborstudie). Zur Überprüfung des zusätzlichen Stimulationseffekts auf das Therapieoutcome wurden die phobischen Symptome vor und nach der Behandlung sowie zum Follow-Up nach sechs Monaten mittels Fragebögen und zwei Verhaltenstests erfasst. Die Datenauswertung zeigte eine signifikante Reduktion der Höhenangst in beiden Stimulationsgruppen, jedoch wurde kein zusätzlicher Effekt der aktiven Stimulation festgestellt. Diese Ergebnisse weisen darauf hin, dass die Expositionstherapie in virtueller Realität zwar effektiv zur Verringerung phobischer Symptome eingesetzt werden kann, der Einsatz der transkraniellen Magnetstimulation jedoch weiter untersucht werden muss.
In der zweiten Studie durchliefen 87 gesunde Versuchsteilnehmer ein dreitägiges Furchtkonditionierungs- und Extinktionsparadigma. Die Furchtkonditionierung fand am ersten Tag statt, das Extinktionslernen am zweiten Tag, und die Spontanerholung, das Reinstatement und der Extinktionsabruf am dritten Tag. Unmittelbar vor oder nach dem Extinktionslernen wurde jeweils entweder eine aktive oder eine Placebo transkranielle Magnetstimulation über dem linken posterioren Präfrontalkortex (an den Koordinaten -56, 2, 40 des Montreal Neurological Institutes; gemäß der zuvor beschriebenen Laborstudie) appliziert. Zu allen drei Studienzeitpunkten wurden physiologische Furchtreaktionen mittels Hautleitfähigkeitsreaktionen gemessen. Darüber hinaus wurden Ratings und die State-Angst erfasst. Die Ergebnisse zeigten, dass die aktive Stimulation vor dem Extinktionslernen im Vergleich zur Placebo-Stimulation einen unmittelbaren dämpfenden Effekt auf die physiologischen Furchtreaktionen zum Extinktionslernen hatte, jedoch nicht auf die Ratings oder die State-Angst. Hinzu kommt, dass weder die aktive Stimulation vor noch nach dem Extinktionslernen anhaltenden Effekte auf die physiologischen Furchtreaktionen am dritten Tag hatte. Diese Ergebnisse weisen darauf hin, dass die transkranielle Magnetstimulation über dem linken posterioren Präfrontalkortex das Potenzial hat, physiologische Furchtreaktionen während des Extinktionslernens zu modulieren, aber weitere Untersuchungen sind erforderlich, um die langfristigen Effekte auf das Extinktionsgedächtnis zu fördern.
Zusammengenommen deuten die Befunde beider Studien darauf hin, dass die aktive Anwendung einer transkraniellen Magnetstimulation über dem individuellen linken posterioren Präfrontalkortex bzw. an den Koordinaten -56, 2, 40 des Montreal Neurological Institutes zu einer unmittelbaren Reduktion der physiologischen Furchtantwort bei gesunden Probanden führen kann, jedoch nicht zu länger anhaltenden Effekten, weder zum Abruf des Extinktionsgedächtnisses bei gesunden Probanden noch nach der Behandlung bei Personen mit pathologischer Höhenangst. Das Ausbleiben zusätzlicher anhaltender Effekte könnte auf verschiedene Faktoren zurückzuführen sein, die im Rahmen dieser Arbeit diskutiert werden.Anxiety disorders are among the most prevalent mental health conditions worldwide. Although cognitive behavioral therapy is well established in clinical practice alongside pharmacotherapy, not all patients benefit equally from this treatment approach. Therefore, the optimization and further development of this therapeutic modality is crucial. Current research focuses particularly on the enhancement of fear extinction, a learning process underlying exposure-based intervention. Preliminary findings suggest that the use of non-invasive brain stimulation techniques can enhance extinction processes in both healthy individuals and patients with anxiety disorders as an adjunctive therapeutic tool. In a recent laboratory study, a beneficial effect of non-invasive transcranial magnetic stimulation to the left posterior prefrontal cortex to indirectly activate the ventromedial prefrontal cortex during extinction learning was observed in healthy participants. This dissertation aims to translate these laboratory findings into a clinical setting for individuals with anxiety disorders. However, since several questions remain open regarding the optimal stimulation parameters for the translation of these findings, this dissertation also aims to answer some of these open questions and thus make an important contribution to the optimization of exposure therapy for individuals with anxiety disorders. To achieve this, two studies were conducted simultaneously.
In the first study, 76 participants with a pathological fear of heights underwent two virtual reality exposure sessions. Before each exposure session, participants received either active or a placebo transcranial magnetic stimulation with longer-lasting modulatory effects to the left posterior prefrontal cortex (according to the laboratory study). Phobic symptoms were assessed before and after treatment and at the six-month follow-up using questionnaires and two behavioral approach tests. The results demonstrated a significant reduction in phobic symptoms in both stimulation groups, but no additional effect was observed in the active stimulation group. These results show the efficacy of virtual reality exposure therapy in reducing phobic symptoms, however, the additional use of transcranial magnetic stimulation requires further investigation.
In the second study, 87 healthy participants underwent a three-day fear conditioning and extinction paradigm in a laboratory setting with fear conditioning on the first day, extinction learning on the second day, and spontaneous recovery, reinstatement, and extinction recall on the third day. Immediately before or after extinction learning, either active or placebo transcranial magnetic stimulation was applied to the left posterior prefrontal cortex (at the coordinates -56, 2, 40 of the Montreal Neurological Institute; according to the laboratory study). Physiological fear responses were measured using physiological skin conductance responses across all three days. Furthermore, ratings and state anxiety were assessed. The findings revealed that active stimulation before extinction learning resulted in an immediate dampening effect on physiological fear responses during extinction learning compared to placebo stimulation. However, there were no effects on rating or state anxiety. In addition, neither active stimulation before nor after extinction learning showed sustained stimulation effects on extinction recall when compared to placebo stimulation. These findings demonstrate the potential of transcranial magnetic stimulation to modulate physiological fear responses during extinction learning, however, more research is needed to enhance its long-term effects on extinction memory.
Taken together, these findings suggest that transcranial magnetic stimulation to the individual left posterior prefrontal cortex or at the coordinates -56, 2, 40 of the Montreal Neurological Institute can result in a reduction of physiological fear responses in healthy participants. However, no longer lasting effects were observed, neither on extinction recall in healthy subjects nor after exposure therapy in participants with a pathological fear of heights. The absence of any additional prolonged effects might be attributed to various factors discussed in this thesis
Transkriptomische und genomische Ansätze zur Erforschung der RNA-Biologie des Darmsymbionten
No full textThe human intestine is home to hundreds of bacterial species that collectively modulate, exploit and maintain the host’s physiological equilibrium. The dominant phyla in the gut are the Bacteroidota and Bacillota and, among the former, the anaerobe, Gram negative Bacteroides spp. are major human mutualists. B. thetaiotaomicron has over time become a model species of the beneficial microbiota due to its relative ease of cultivation and the development of genetic tools. However, many aspects of this bacterium’s physiology and mechanistic details of its interaction with host cells and tissues remain unknown. Notably, the RNA biology of Bacteroides spp. has been largely neglected until recently. This includes small noncoding RNA (sRNAs), which are universal regulators of gene expression in bacteria and are predicted to be present in the hundreds within the Bacteroides genome.
This thesis describes the establishment of sequencing-based approaches for the characterization of the gene content and expression profiles of B. thetaiotaomicron. Special attention is dedicated to sRNAs, known in other species for their critical role in quickly adapting to external and intrinsic stimuli and expected to be equally important in Bacteroides due to the dynamic nature of the gut environment. Here, using comparative genomics, we determine the conservation and secondary structures of various B. thetaiotaomicron sRNAs and predict several Bacteroides RNA-binding proteins (RBPs). We then present a strategy for ribosomal RNA (rRNA) depletion from RNA sequencing (RNA-seq) libraries, which allows to increase the informational output obtained from low-input studies such as single-bacteria RNA-seq. Next, a CRISPR interference (CRISPRi) screening approach is established and harnessed to determine the context-dependent functional relevance of sRNAs, revealing regulators of bile stress susceptibility and mucus adherence. Finally, the transcriptomes of both human and B. thetaiotaomicron cells are profiled during colonization of a gut epithelium model, revealing host responses to bacterial presence and Bacteroides metabolic specialization and sRNA expression dynamics. Together, the work reported here expands our knowledge of the B. thetaiotaomicron RNA landscape and introduces several tools and strategies for its investigation.Der menschliche Darm beherbergt Hunderte von Bakterien, die gemeinsam das physiologische Gleichgewicht des Wirtes modulieren, ausnutzen und aufrechterhalten. Die vorherrschenden Phyla im Darm sind die Bacteroidota und Bacillota. Unter den ersteren sind die anaeroben, gramnegativen Bacteroides spp. die wichtigsten menschlichen Mutualisten. B. thetaiotaomicron hat sich im Laufe der Zeit zu einer Modellspezies der kommensalen Mikrobiota entwickelt, da es sich relativ leicht kultivieren lässt und Hilfsmittel zur genetischen Manipulation vorhanden sind. Viele Aspekte der Physiologie dieses Bakteriums sowie mechanistische Details seiner Interaktion mit Wirtszellen und -geweben sind jedoch noch unbekannt. Vor allem die RNA-Biologie von Bacteroides spp. wurde bis vor kurzem weitgehend vernachlässigt. Dies gilt auch für kleine, nicht kodierende RNAs (sRNAs), welche universelle Regulatoren der Genexpression in Bakterien sind und im Genom von Bacteroides zu Hunderten vorhergesagt werden.
Diese Arbeit beschreibt die Etablierung sequenzierungsbasierter Ansätze zur Charakterisierung des Geninhalts und der Expressionsprofile von B. thetaiotaomicron. Besonderes Augenmerk gilt dabei den sRNAs, die bei anderen Spezies für ihre kritische Rolle während der schnellen Anpassung an externe und intrinsische Stimuli bekannt sind. Aufgrund der dynamischen Natur der Darmumgebung nimmt man daher an, dass sie bei Bacteroides eine ebenso wichtige Rolle spielen. Durch vergleichende Genomik sagen wir die Erhaltung und die Sekundärstrukturen verschiedener sRNAs von B. thetaiotaomicron voraus und prognostizieren mehrere Bacteroides RNA-bindende Proteine (RBPs). Es wird außerdem eine Strategie zur Abreicherung ribosomaler RNA (rRNA) aus RNA-Sequenzierungsbibliotheken (RNA-seq) vorgestellt. Diese ermöglicht es, den Informationsgehalt von Studien mit geringem Ausgangsmaterial, wie z. B. Einzelbakterium RNA-seq, zu erhöhen. Darüber hinaus wird ein CRISPR-Interferenz-Screening-Ansatz (CRISPRi) eingeführt und genutzt, um die kontextabhängige funktionelle Bedeutung von sRNAs zu bestimmen und Regulatoren für die Anfälligkeit für Gallenstress und die Schleimadhäsion aufzudecken. Schließlich werden die Transkriptome sowohl von menschlichen als auch von B. thetaiotaomicron-Zellen während der Besiedlung eines Darmepithelmodells charakterisiert, um die Reaktionen des Wirts auf die bakterielle Präsenz, die metabolische Spezialisierung von Bacteroides und die Dynamik der sRNA-Expression aufzudecken. Insgesamt erweitert die hier vorgestellte Arbeit unser Wissen über die RNA-Landschaft von B. thetaiotaomicron und stellt mehrere Instrumente und Strategien für ihre Untersuchung zur Verfügung
Metabolische Neuprogrammierung der T-Helferzell-Differenzierung in Autoimmunerkrankungen
No full textThe immune system is essential for protecting the body against invading pathogens, but there are instances in which it fails to distinguish between self and foreign structures. This results in an immune response against the body's own cells, potentially leading to autoimmune diseases such as inflammatory bowel diseases, rheumatoid arthritis, or multiple sclerosis. The development of autoimmune diseases is often driven by pathogenic Th17 cells, which produce inflammatory cytokines and other factors that provoke inflammation and tissue damage. Therefore, targeting the effector function of pathogenic Th17 cells emerged as a promising strategy for the treatment of autoimmune diseases. Compared to other T cell subsets, Th17 cells reveal a unique metabolic profile, which promises novel avenues for their therapeutic targeting. To explore the contribution of glycolysis and mitochondrial respiration in the pathogenicity of Th17 cells, we developed two mouse models with T cell-specific ablation of the glucose transporter 3 (GLUT3) and the mitochondrial phosphate carrier (mPiC), respectively. Deletion of GLUT3 or mPiC both impaired the effector function of pathogenic Th17 cells, thus providing complete protection against experimental autoimmune encephalomyelitis (EAE) and T cell-mediated colitis in mice. GLUT3-mediated glucose uptake was required for the epigenetic reprogramming of Th17 cells, whereas mPiC controlled the effector function through cellular redox regulation. Mechanistically, GLUT3-mediated glucose metabolism fuels ATP citrate lyase (ACLY)-dependent acetyl-CoA generation in Th17 cells, which is a crucial intermediary metabolite for fatty acid synthesis (FAS) as well as post-translational modifications of proteins. While FAS remained unaffected in GLUT3-deficient Th17 cells, the availability of acetyl-CoA played a pivotal role in the acetylation of histones, leading to the epigenetic remodeling of inflammatory gene loci.
In addition to the regulation of Th17 cells through glucose-dependent histone acetylation, we discovered that the pathogenicity of Th17 cells is also controlled by mitochondrial respiration and the regulation of cellular redox homeostasis at the complex I of the electron transport chain (ETC). Using mPiC-deficient mice as a genetic model for mitochondrial insufficiency, we discovered that the rate of mitochondrial respiration controls the cellular NAD+/NADH redox balance via the malate-aspartate shuttle. An imbalance of this critical redox rheostat resulted not only in the production of reactive oxygen species (ROS) but also in a depletion of cytosolic NAD+, a crucial cofactor in numerous biochemical processes.
Collectively, our study uncovered that both glycolysis and mitochondrial respiration contribute substantially to the pathogenicity of Th17 cells and the development of autoimmunity. GLUT3 plays a pivotal role in generating acetyl-CoA for epigenetic remodeling, while mPiC governs NAD+ levels and redox homeostasis in Th17 cells. These insights could spur the development of novel therapeutic strategies for the treatment of inflammatory and autoimmune diseases by modulating the metabolism of pathogenic Th17 cells.Das Immunsystem schützt den Körper zuverlässig vor Krankheitserregern, jedoch kann es vorkommen, dass die Unterscheidung zwischen körpereigenen und fremden Strukturen gestört wird. Dies kann eine Immunantwort gegen körpereigene Zellen zur Folge haben, was zu Autoimmunerkrankungen wie entzündlichen Darmerkrankungen, rheumatoider Arthritis oder Multipler Sklerose führen kann. Diese sind oft durch eine Zunahme von pathogenen Th17-Zellen gekennzeichnet und deren Botenstoffe tragen maßgeblich zur Autoimmunpathologie bei. Die gezielte Beeinflussung von Th17-Zellen und deren Funktion gilt daher als vielversprechende Strategie für die Behandlung von Autoimmunerkrankungen. Th17-Zellen weisen, im Vergleich zu anderen T-Zellen, ein charakteristisches metabolisches Profil auf. Dies ermöglicht neue und hochspezifische Therapieansätze, indem gezielt Stoffwechselprozesse beeinflusst werden, die für die krankmachende Wirkung von Th17-Zellen entscheidend sind. In dieser Arbeit sollte daher die Rolle des Glukosestoffwechsels und der mitochondrialen Atmung in Th17-Zellen eingehender untersucht werden. Dazu wurden der Glukosetransporter 3 (GLUT3) und der mitochondriale Phosphattransporter (mPiC) in T-Zellen genetisch ausgeschaltet. In beiden Fällen zeigte sich eine selektive Hemmung von pathogenen Th17-Zellen, wodurch die Tiere vor einer autoimmunen Enzephalomyelitis und T-Zell-vermittelter Kolitis geschützt waren. Mechanistisch konnten wir zeigen, dass der GLUT3 vermittelte Glukosestoffwechsel für die epigenetische Programmierung von Th17-Zellen erforderlich ist, während mPiC das zelluläre Redox-Gleichgewicht reguliert. Interessanterweise spielen in beiden Fällen die Mitochondrien eine Schlüsselrolle. Dabei ist der GLUT3 abhängige Glukosestoffwechsel für die Bereitstellung von Acetyl-CoA aus dem mitochondriellen Zitronensäurezyklus entscheidend. Acetyl-CoA ist ein wichtiger Ausgangsstoff für die Lipidbiosynthese und dient als Substrat posttranslationaler Modifikationen auch der Regulation von Proteinen. Letzteres war für Differenzierung und Funktion von Th17-Zellen entscheidend, da die Produktion von Acetyl-CoA und die Acetylierung von Histon-Seitenketten die Th17-spezifische Genexpression reguliert. Neben der Kontrolle von Th17-Zellen durch epigenetische Mechanismen konnten wir weitergehend zeigen, dass die Funktion dieser Zellen auch durch das zelluläre Redox-Gleichgewicht bestimmt wird. Durch die reduzierte Phosphataufnahme in die Mitochondrien von mPiC-defizienten T-Zellen, kommt es zu einem „Stau“ an der Elektronentransportkette, was Auswirkungen auf die enzymatischen Prozesse am Komplex I hat. Dieser bestimmt das zelluläre NAD+/NADH-Gleichgewicht indirekt über den Malat-Aspartat-Shuttle. Eine Fehlsteuerung dieses Systems verursacht nicht nur die Produktion von reaktiven Sauerstoffspezies in den Mitochondrien, sondern führt auch zu einer Limitierung von zytoplasmatischem NAD+, einem entscheidenden Kofaktor in zahlreichen biochemischen Prozessen. Zusammenfassend konnten wir zeigen, dass sowohl der Glukosestoffwechsel als auch die Zellatmung am Komplex I maßgeblich zur Differenzierung und Pathogenität von Th17-Zellen beitragen, und dass diese Stoffwechselprozesse vielversprechende neue Angriffspunkte darstellen, die für die Entwicklung spezifischer therapeutischer Strategien zur Behandlung von Autoimmunkrankheiten dienen könnten
BDNF-vermittelte synaptische Plastizität in Mausmodellen von Dystonie
No full textDystonia is a debilitating neurological disease characterized by abnormal postures and involuntary movements. Although over 30 genes are linked to dystonia, the underlying mechanisms remain unclear. Key contributors to dystonia pathology include the dopaminergic system in the basal ganglia and the cerebellum, both crucial for motor function. The striatum, part of the basal ganglia, receives excitatory inputs from the motor cortex, and its synaptic functioning is vital for movement generation. Synaptic plasticity, involving long-term potentiation (LTP) and long-term depression (LTD), is implicated in movement disorders, including dystonia. Presynaptic BDNF release, binding to TrkB receptors in striatal spiny projection neurons (SPNs), mediates synaptic plasticity.
Two common dystonia-associated genes are THAP1 and GNAL. THAP1 is a transcription factor regulating various genes, while GNAL is a Gα subunit of G protein-coupled receptors, linked to D1 receptors in SPNs. Few animal models exist for these genes, especially for DYT-GNAL dystonia, which lacks a translational model.
In this study, two novel mouse models for DYT-THAP1 and DYT-GNAL dystonia were generated using CRISPR/Cas9 to introduce THAP1 F81L or GNAL V137M mutations found in patients. Initial behavioral characterization showed no differences compared to control animals, but both models displayed impaired gross motor performance, potentially due to fine motor movement deficits. Several genes involved in striatal synaptic signaling or linked to dystonia were altered in both models.
In conclusion, the novel mouse models are valuable for investigating dystonia pathology and offer a patient-related translational approach. Both models show motor deficits, differential gene expression, and potential BDNF expression alterations. Further research is needed to determine if BDNF/TrkB signaling abnormalities contribute to motor symptoms and if this applies broadly to dystonia in patients.Dystonie ist eine neurologische Erkrankung, die durch unwillkürliche Bewegungen gekennzeichnet ist. Das dopaminerge System in den Basalganglien und das Kleinhirn tragen beide zu der Dystonie-Pathologie bei. Beide Strukturen sind entscheidend für motorische Funktion. Das Striatum, ein Teil der Basalganglien, erhält Projektionen aus dem Motorkortex, und korticostriatale Synapsen sind für die Bewegungserzeugung von entscheidender Bedeutung. Synaptische Plastizität spielt eine wichtige Rolle bei Bewegungsstörungen. Die präsynaptische Freisetzung von BDNF, das an TrkB-Rezeptoren in striatalen Projektionsneuronen bindet, vermittelt synaptische Plastizität.
Zwei mit Dystonie assoziierte Gene sind THAP1 und GNAL. THAP1 ist ein Transkriptionsfaktor, der verschiedene Gene reguliert, während GNAL eine Gα-Untereinheit von G-Protein-gekoppelten Rezeptoren ist, die mit D1-Rezeptoren in striatalen Neuronen verbunden ist. Es gibt nur wenige Tiermodelle für diese Gene, besonders für DYT-GNAL-Dystonie, für die ein translationales Modell fehlt.
In dieser Studie wurden zwei Mausmodelle für DYT-THAP1 und DYT-GNAL-Dystonie mittels CRISPR/Cas9 generiert, um THAP1 F81L- oder GNAL V137M-Mutationen einzuführen, die in Patienten gefunden wurden. Die Verhaltenscharakterisierung zeigte keine Unterschiede zur Kontrolle, aber beide Modelle wiesen eine beeinträchtigte grobmotorische Leistung auf, möglicherweise aufgrund von Defiziten in der Feinmotorik. Gene, wichtig für synaptische Signalübertragung oder in Dystonie, waren in den Modellen verändert.
Zusammenfassend sind diese Mausmodelle nützlich für die Untersuchung von Dystonie und bieten einen translationalen Ansatz. Beide Modelle zeigen motorische Defizite, veränderte Genexpression und mögliche Veränderungen in der BDNF-Expression. Weitere Untersuchungen sind nötig, um festzustellen, ob Abnormalitäten im BDNF/TrkB-Signalweg zu den motorischen Symptomen beitragen und ob dies allgemein auf die Entwicklung von Dystonie bei Patienten zutrifft