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Synthèse d'Analogues Acycliques de l'UDP-Galactose en tant qu'Inhibiteurs de la Biosynthèse des Parois Mycobactériennes
No full textOligogalactofuranosides are essential glycoconjugates of the mycobacterial cell wall. The search for the biosynthetic origin of galactofuranoside residues has led to the discovery of an isomerase (UDP-Galactopyranose Mutase) that catalyzes an unusual ring contraction between UDP-galactopyranose and UDP-galactofuranose. The mechanism of this unique interconversion has attracted attention because of the unexpected role of the FAD cofactor. FAD seems to play the role of catalytic nucleophile by an unforeseen addition on the anomeric position of galactose. Importantly, the discovery of UGM inhibitors may lead to the development of novel therapeutic strategies for the treatment of tuberculosis.(DOCSC02) -- FUNDP, 201
The LQ-Optimal Control Problem for Invariant Linear Systems
No full textThis work is concerned with the study of the linear quadratic (LQ) optimal control
problem for linear systems with affine inequality constraints on the state and/or the input tra-
jectories, and in particular for input/state-invariant linear systems. The study of such systems
is motivated notably by the coexistence problem in a chemostat model where, for biologi-
cal reasons, it is meaningful to aim at forcing the state and the input trajectories to remain
in a cone. Necessary and sufficient optimality conditions are established for the input/state-
invariant LQ problem by using the maximum principle with state and input constraints and
by using the admissibility of the solution of the standard LQ problem. Similar and specific
results are obtained for the particular LQ problem for positive systems, which are character-
ized by the invariance of the nonnegative orthant of the state space. The methods developed
in this thesis are applied to the chemostat model via the study of locally positively input/state-
invariant nonlinear systems. The main results of this work are illustrated by some numerical
examples.Ce travail a pour objet l’étude du problème de commande optimale au sens linéaire
quadratique (LQ) pour des systèmes linéaires avec contraintes d’inégalité affines sur les
trajectoires d’état et/ou d’entrée, et en particulier pour des systèmes linéaires entrée/état-
invariants. L’étude de ces systèmes est motivée notamment par le problème de coexistence
dans un modèle de chémostat où, pour des raisons biologiques, il est important de chercher
à forcer les trajectoires d’état et d’entrée de rester dans un cône. Des conditions nécessaires
et suffisantes d’optimalité sont établies pour le problème LQ invariant entrée/état en utilisant
le principe du maximum avec contraintes sur l’état et l’entrée et à l’aide de l’admissibilité
de la solution du problème LQ standard. Des résultats similaires et spécifiques sont obtenus
pour le problème LQ appliqué aux systèmes positifs, qui sont caractérisés par l’invariance
de l’orthant non négatif de l’espace d’état. Les méthodes développées dans cette thèse
sont appliquées au modèle de chémostat via l’étude des systèmes non linéaires localement
entrée/état-invariants. Les principaux résultats de ce travail sont illustrés par des exemples
numériques.(DOCSC00) -- FUNDP, 201
Hierarchically micro-meso-macroporous catalysts constructed from zeolite nanocrystals: Design, Synthesis and Application
No full textA series of novel hierarchically porous catalysts with significant micro-meso-macroporous structures constructed from zeolite nanocrystals have been successfully synthesized by a quasi solid state crystallization transformation process using a glycerin medium. These catalysts possess well-defined macropores and interconnected mesopores in the macropore walls which were constructed by selected microporous zeolitic units. A series of products, including hierarchically porous acidic aluminosilicates catalysts and hierarchically heteroatom-doped catalysts have been synthesized successfully by the quasi solid state crystallization transformation process. Hierarchical micro-meso-macroporous acidic catalysts constructed from zeolite ZSM-5 nanocrystals were synthesized using this synthetic system under the effect of a structure directing agent. The final product MMM-ZSM-5(2) presented an exceptional catalytic performance for the cracking of 1,3,5-triisopropylbenzene (TIPB). Hierarchically micro-meso-macroporous acidic catalysts constructed from zeolite Beta nanocrystals have also been synthesized. The acidity properties of the products formed after different crystallization transformation periods were investigated. Furthermore, hierarchically micro-meso-macroporous catalysts with heteroatom-doping into the zeolite architecture were also synthesized by this quasi solid state crystallization transformation process. Hierarchically micro-meso-macroporous catalysts constructed from crystalline titanium-doped silicalite-1(TS-1) were also obtained. The final product MMM-TS-1(3) presented superior catalytic performances both for the epoxidation of styrene and 2,4,6-trimethylstyrene. Finally, hierarchically micro-meso-macroporous catalysts constructed from zirconium-doped silicalite-1 (ZrS-1) nanocrystals were also synthesized successfully. The present work demonstrates that the quasi solid state crystallization transformation process is a facile and versatile method to synthesize micro-meso-macroporous catalysts with high performances in different reactions.Une nouvelle gamme de catalyseurs à porosité hiérarchisée, constituée d’une proportion significative de structures micro-méso-macroporeuses et construits par l’assemblage de nanocristaux de zéolithes, a été mise au point avec succès par un processus de cristallisation à l’état quasi solide, et ce via l’emploi de glycérine. Ces catalyseurs sont caractérisés par un réseau de macropores bien définis, dont les parois sont constituées de mésopores interconnectés, eux-mêmes délimités par des unités zéolithiques microporeuses adaptées. Une série de produits, incluant des catalyseurs aluminosilicatés acides à porosité hiérarchisée ainsi que des catalyseurs dopés en hétéroatomes à porosité hiérarchisée, a été synthétisée avec succès par la méthode de cristallisation à l’état quasi solide. Des catalyseurs acides micro-méso-macroporeux hiérarchisés construits par des nanocristaux de zéolithes ZSM-5 furent premièrement mis au point par ce procédé, tout en y étudiant l’influence de l’agent structurant. Le produit le plus prometteur résultant de cette étude, le MMM-ZSM-5(2), présente d’exceptionnelles performances catalytiques pour le craquage de la large molécule de 1,3,5-triisopropylbenzène (TIPB). Des catalyseurs acides micro-méso-macroporeux hiérarchisés construits par des nanocristaux de zéolithes Beta furent également synthétisés. Les propriétés acides des matériaux ayant subis des périodes variables de cristallisations furent investiguées. De plus, des catalyseurs micro-méso-macroporeux hiérarchisés dopés en hétéroéléments et arborant des structures zéolithiques furent également produits par la méthode de la cristallisation à l’état quasi solide. Des catalyseurs micro-méso-macroporeux hiérarchisés formés par l’assemblage de nanocristaux répondant à la structure de la silicalite-1 et enrichit en titane (TS-1) ont aussi été obtenus. Le produit le plus prometteur résultant de cette analyse, le MMM-TS-1(3), présente des propriétés catalytiques supérieures dans l’époxydation du styrène et dans l’oxydation de la large molécule de 2,4,6-triméthylstyrène. Finalement, Des catalyseurs micro-méso-macroporeux hiérarchisés formés par l’assemblage de nanocristaux répondant à la structure de la silicalite-1 et enrichit en zirconium (ZrS-1) ont aussi été obtenus. Le présent travail démontre que le processus de cristallisation à l’état quasi solide est une méthode aisée et polyvalente pour la synthèse de catalyseurs micro-méso-macroporeux à hautes performances pour la catalyse de réactions chimiques.(DOCSC02) -- FUNDP, 201
On the regulation of Brucella melitensis virulence through flagellin synthesis and self-quorum quenching
No full textThe mammalian innate immune system uses pattern recognition receptors (PRRs), including Toll-like receptors (TLRs) and Nod-like receptors (NLRs) to detect microbial components during infection and subsequently trigger an appropriate immune response. These microbial features are often referred to as pathogen-associated molecular patterns (PAMPs) and are considered as part of the molecular signature of the invading pathogen. Brucella is an intracellular bacterium that causes the worldwide zoonotic disease brucellosis. A key characteristic of Brucella infection is its chronic nature. The ability of Brucella to cause long-lasting infections relies at least on its survival, replication and persistence within immune phagocytic cells while avoiding sustained recognition by PRRs due to non-canonical surface molecules that lack marked PAMP-activities. However, reaching a chronic state of infection implies a balance between pathogen virulence and host resistance. Accordingly, brucellae are not entirely invisible to the immune system, which can yet detect them and shape an immune response. Production of IFN-γ, the mediator of the T helper 1 (TH1) immune response, and granuloma formation are crucial for host resistance against Brucella melitensis infection.
Bacterial flagellin, the monomeric subunit of flagellar filament is a PAMP. Here, we show that tight regulation of flagellin FliC synthesis during infection is crucial for the equilibrated relationship between Brucella and its experimental murine host. Indeed, ectopic flagellin production attenuates B. melitensis virulence, while the lack of FliC enhances bacterial persistence, which results in severe splenic pathology. These findings suggest that Brucella flagellin is an important immune target, and our work provides first insights into the mechanisms that enable the host to detect this protein. Indeed, while Brucella most likely evades recognition by the extracellular flagellin sensor TLR5, we show that cytosolic FliC is a PAMP for NLRC4 that plays a role, along with caspase-1 in controlling B. melitensis in vivo. However, we propose that a still unidentified flagellin-dependent but NLRC4- and caspase-1-independent pathway could also contribute to host resistance to B. melitensis infection. Data presented here suggest that the failure of mice to control flagellin-deficient B. melitensis mutants would not be due to a defect in the IFN-γ response, but rather to alteration of the granulomatous response.
In the second part of this work, we show that regulation of flagellin production in Brucella occurs through quorum sensing (QS). QS is a regulatory system that allows genetic reprogramming in response to a threshold concentration of small diffusible signalling molecules that are produced and released by bacteria. Here, we provide data showing that B. melitensis produces long-chain N-acyl-homoserine lactones (AHLs) as QS cues, and controls their concentration by means of an AHL-inactivating protein called AiiD. Both AHLs production and inactivation occur in B. melitensis during in vitro growth and macrophage infection. Furthermore, we show that quenching self-produced AHLs regulates expression of virulence genes, including the virB operon coding for a type IV secretion system and flagellar genes. Importantly, flagellin production is defective in the absence of AiiD, and a B. melitensis strain deleted for aiiD shows similar phenotypes than a flagellin-deficient mutant in vivo.(DOCSC03) -- FUNDP, 201
Elaboration de revêtements organiques et inorganiques sur un substrat de titane en vue de l’apport du caractère ostéoinducteur
No full textMetallic implants are widely used these days but need seriously improvement to show longer life and better biomedical applications properties. That’s where nanoscience and surface modification can be useful by opening a wide range of possibilities. This work is more precisely focused on orthopaedic or dental applications. To be used as dental or orthopaedic implants, the metal has to show properties like biocompatibility, great corrosion resistance, good bulk properties, but also a bioactivity. This last characteristic means that bone should spontaneously grow on the implant surface unless we’ll encounter adhesion problems and risks of loosening.
The way proposed in this work is the optimisation of the titanium surface properties. In fact, titanium and its alloys present good bulk properties but do not show good bioactivity. By the deposition of a thin tantalum oxide layer on bare titanium, we improve that last point. The tantalum deposition is investigated by two different methods, first one is electrodeposition in ionic liquid media and second one is sol-gel deposition. As some works in literature showed that roughness could play a role in osteoinductive properties, the morphology of the thin oxide layer is controlled by two different approaches, polystyrene spheres monolayer or titanium anodisation. We also attempted to insert multiwall carbon nanotubes in the tantalum oxide matrix. And finally, the last step is the organic modification by molecules containing 3 to 5 phosphonic groups.
Then, once these systems elaborated and otpimized, the osteoinductive character is evaluated by measuring the hydroxyapatite growth rate in a simulated body fluid.Le recours aux implants de type métalliques lors d’actes chirurgicaux est de plus en plus fréquent. Dès lors, l’élaboration de nouveaux matériaux plus performants dans ce domaine est devenue cruciale. Le recours pour cela à la nanoscience et aux techniques de modification de surface ouvre un large panel de possibilités. Le travail présenté dans cette thèse s’inscrit dans ce domaine, et plus spécifiquement dans l’optimisation des qualités de matériaux utilisés dans les implants dentaires ou orthopédiques. Les métaux, en plus d’être biocompatibles, doivent impérativement présenter un caractère bioactif, ce qui signifie ici promouvoir la croissance osseuse. Sans cette propriété, nous sommes confrontés à des problèmes d’adhérence et d’intégration de l’implant au système.
L’approche développée dans ce travail est l’amélioration des propriétés de surface du titane. Ce métal est choisi car lui et ses alliages présentent des caractéristiques volumiques adéquates pour leur utilisation comme implant. Cependant, le caractère ostéoinductif leur fait défaut. Dans le but d’enlever cette lacune, notre recherche s’est basée sur la déposition d’une couche mince d’oxyde de tantale, reconnu pour présenter un caractère ostéoinductif ainsi qu’une excellente biocompatibilité. Deux méthodes de déposition ont été investiguées, l’électrodéposition dans un milieu liquide ionique et la déposition par voie sol-gel. La rugosité étant un facteur influençant la vitesse de croissance osseuse, nous avons également proposé deux méthodes de structuration de la couche mince de tantale. D’autre part, l’insertion de nanotubes de carbone dans la matrice d’oxyde de tantale est une approche supplémentaire étudiée dans ce travail. Enfin, la dernière étape est la modification de ces systèmes par une monocouche d’acide organophosphonique.
Le caractère ostéoinducteur de tous ces systèmes élaborés a été évalué par une étude de la croissance d’hydroxyapatite en milieu simulant le liquide physiologique.(DOCSC02) -- FUNDP, 201
Caractérisation des réponses cellulaires des kératinocytes dans un épiderme reconstruit humain lors d'une exposition à des substances sensibilisantes
No full textn/aCaractérisation des réponses cellulaires des kératinocytes dans un épiderme reconstruit humain lors d’une exposition à des substances sensibilisantes
La peau constitue l’organe le plus externe du corps humain et assure notamment une fonction de barrière de protection contre les agressions de l’environnement extérieur. L’application d’une substance chimique non tolérée par notre organisme peut induire au niveau de la peau une réaction de dermatite de contact par allergie qui constitue la forme la plus répandue d'immunotoxicité rencontrée chez l'homme. Dès lors, il est important pour l’industrie chimique, pharmaceutique et cosmétique d’évaluer le potentiel sensibilisant des diverses substances chimiques mises sur le marché. A l’heure actuelle, les propriétés sensibilisantes d’un composé chimique sont évaluées sur animaux par le test du local lymph node essai. Ce test s’inscrit dans une volonté de remplacement, de réduction et de raffinement des méthodes in vivo ; cependant, cet essai alternatif est toujours dépendant de l’utilisation d’animaux. Il existe une réelle pression éthique, législative et économique sur le monde scientifique qui encourage le développement de tests in vitro, efficaces pour la prédiction des propriétés sensibilisantes d’un composé chimique, totalement indépendants de l’utilisation des animaux de laboratoire.
Par leur localisation dans l’épiderme, qui constitue la première barrière de notre organisme, les kératinocytes jouent un rôle important dans l’initiation et la régulation de l’inflammation cutanée induite suite à l’application topique d’un composé sensibilisant. Des équivalents épidermiques, produits au laboratoire, ont été utilisés dans le cadre de cette étude afin d’évaluer les réponses de sensibilisation induites suite à un contact topique avec quatre substances sensibilisantes de référence. Sur base de la quantification de l’IL-1alpha et l’IL-8 dans le milieu extracellulaire, nous avons pu mettre en évidence un profil caractéristique d’expression et de libération de l’IL-1alpha et l’IL-8, pouvant potentiellement être utilisé pour identifier les composés chimiques aux propriétés sensibilisantes. Ce type de composé induit une libération importante d’IL-8, comparativement à une substance irritante qui stimule la libération des deux interleukines investiguées (IL-1alpha et IL-8).
Afin d’améliorer la caractérisation des réponses cellulaires induites par les sensibilisants, nous avons cherché à identifier les voies de signalisation responsables de l’expression et de la libération de l’IL-8 dans le milieu extracellulaire. Les résultats obtenus dans cette étude soulignent une phosphorylation transitoire du récepteur de l’EGF ligand-dépendante et -indépendante suite à l’application des quatre sensibilisants sur épidermes reconstruits. Une inhibition spécifique de l’activité tyrosine kinase de ce récepteur à permis de mettre en évidence une induction et une libération de l’IL-8 et d’HB-EGF dépendantes de la phosphorylation de ce récepteur membranaire. Nous avons écarté l’implication d’HB-EGF en tant qu’agoniste de ce récepteur. Une inhibition de l’activité des protéines tyrosine-phosphatase suite à la présence intracellulaire de molécules oxydantes ou électrophiles, ainsi qu’une perturbation de la membrane plasmique des kératinocytes, pourraient potentiellement être responsables de la phosphorylation ligand-indépendante du récepteur de l’EGF.
Cette approche in vitro semble prometteuse pour l’identification de biomarqueurs de sensibilisation cutanée. Une libération d’IL-8 et d’HB-EGF, dépendante de la phosphorylation du récepteur de l’EGF, lors d’une application sur équivalents épidermiques de substances sensibilisantes pourrait dans le futur s’intégrer dans les essais in vitro destinés à évaluer les propriétés sensibilisantes des composés chimiques.(DOCMED02) -- FUNDP, 201
Structural study of HIV-1 integrase inhibition by quinolones: contribution to the rational design of new inhibitors
No full textIn the design of new antiviral agents against AIDS, HIV-1 integrase is an attractive target because this enzyme plays an essential role in the virus replication cycle by integrating the viral DNA into the host cell genome. Among all integrase inhibitors described to date, the β-diketo acid derivatives represent an important family. These compounds have the particularity to posess a chemical group able to chelate the Mg2+ metal cofactor present in the enzyme active site and essential to its catalytic activity. In this thesis, we have undertaken the study of the mechanism of inhibition of HIV-1 integrase by substituted quinolone based on experimental and theoretical approach.
A series of quinolone substituted at position 3 by a β-diketo-acide/ester motif able to chelate the Mg2+ metal cofactor and at position 6 by various groups (halogen, hydrophilic or hydrophobic groups) has been synthesized as potential HIV-1 integrase inhibitors. These compounds were evaluated for their anti-integrase activity in in vitro assays using integrase overexpressed in E. coli and purified by affinity chromatography. The antiviral activity of compounds was also tested in ex vivo assays.
To obtain the three-dimensional structure of an enzyme-ligand complex, the catalytic core domain of HIV-1 integrase was overexpressed in E. coli and purified by affinity chromatography. To improve the level of purity of the active protein obtained, other purification techniques were tested.
Experimental studies (XRD, UV-visible, FT-IR, ATR) and theoretical calculations on the diketo acid compounds allowed to identify the most stable conformations of the diketoacid moiety and its complexation mode in solution with the Mg2+ cofactor. To determine the binding mode of developed quinolone within the DNA-bound enzyme, integrase/DNA model was built. Docking studies highlighted a binding mode in agreement with the observed structure-activity relationships. These molecular modeling studies allowed us to propose a mechanism of inhibition of HIV-1 integrase by quinolone compounds.Dans le cadre de la conception de nouveaux agents antiviraux contre le SIDA, l’intégrase du VIH-1 constitue une cible de choix car cette enzyme joue un rôle essentiel dans le cycle de réplication du virus en intégrant l’ADN viral dans le génome de la cellule hôte. Parmi les nombreux inhibiteurs de l’intégrase décrits jusqu’à présent, les dérivés β-dicéto-acide représentent une famille importante. Ces composés ont la particularité de posséder un groupement capable de chélater le cofacteur métallique Mg2+ présent au sein du site actif de l’enzyme et essentiel à son activité catalytique. Dans ce travail de thèse, nous avons entrepris l’étude du mécanisme d’inhibition de l’intégrase du VIH-1 par des dérivés de type quinolone sur base d’une approche expérimentale et théorique.
Une série de quinolones présentant en position 3 un groupement β-dicéto-acide/ester capable de chélater le cofacteur métallique Mg2+ et en position 6 divers groupements (groupements halogène, hydrophile ou hydrophobe) a été synthétisée comme inhibiteurs potentiels de l’intégrase du VIH-1. L’activité anti-intégrase de ces composés a été mesurée par des tests in vitro en utilisant de l’intégrase surexprimée dans E. coli et purifiée par chromatographie d’affinité. L’activité antivirale de ces composés a également été évaluée dans des tests ex vivo.
Dans le but d’obtenir la structure tridimensionnelle d’un complexe enzyme-ligand, le domaine catalytique de l’intégrase du VIH-1 a été surexprimé dans E. coli et purifiée par chromatographie d’affinité. Afin d’améliorer la purété de la protéine active obtenue, d’autres techniques de purification ont été testées.
Les études expérimentales (DRX, UV-visible, FT-IR, ATR) et les calculs théoriques réalisés sur les composés dicéto-acide sélectionnés ont permis d’identifier les conformations les plus stables de la chaîne dicétoacide ainsi que son mode de complexation en solution avec le cofacteur Mg2+. Afin de déterminer le mode de liaison des composés quinolone au sein du site actif de l’enzyme lié à son substrat ADN, un modèle intégrase/ADN a été construit. Les études de docking ont mis en évidence un mode de liaison en accord avec les relations structure-activité observées. Ces études de modélisation moléculaire nous ont permis de proposer un mécanisme d’inhibition de l’intégrase du VIH-1 par des composés quinolone.(DOCSC02) -- FUNDP, 201
Etude hydrogéologique et dimensionnement par modelisation du "système-traçage" du réseau karstique de Han-sur-Lesse (Massif de Boine - Belgique).
No full textThe cave of Han-sur-Lesse is a shallow-hole (gouffre de Belvaux) – resurgence (trou de Han) system excavated by the Lesse river in the Givetian limestones (380 to 360 Ma) of the Boine Massif. Since 2004, a large experimental spread (17 recording stations) was developed on the site, aiming to better understand the hydro-geological behaviour of this karstic system. Hydrographs, piezometric data and physico-chemical parameters were recorded. Tracer tests, during different hydrological conditions, were carried out. This information allowed us to suggest a conceptuel model of the hydrogeology of the Boine massif. During low water conditions, the underground Lesse course can be compared to a one-dimensional drain with a succession of underground river stretches and flooded areas. Underground river stretchs are accessible and can be easily proportioned. It is not the case for flooded areas. Based on comments of divers, these areas are considered as free surface high flow sections developed in intensely fractured and karstified limestones. One of the aims of this work is to proportion these areas. A tracer test with sampling sites located upstream and downstream of flooded areas was carried out in September '09 in low water conditions. The measured breakthrough curves showed that the crossing of flooded areas led to a slowing down of the tracer cloud and a delay in the restitution of a part of the tracer. The tracer results were modelled with the river flow and transport model OTIS (One-dimensional Transport with Inflow and Storage) (Runkel, 1998). This model is based on the temporary storage processes described by Bencala and Walter (1983). In our model, the flooded areas of the Han-sur-Lesse karstic system are considered as high flow sections composed of a sum of small flow sections in interaction with storage zones due to the heterogeneousness of the flow media. The fitting of the modelled curves on the experimental data are accurate showing that the model could be used not only to quantify the value of transport parameters but also to estimate the dimension of the saturated karst system. This model was also applied to other active karstic systems of the Boine Massif. The results are also conclusive.Le réseau karstique de Han-sur-Lesse est un système "perte (gouffre de Belvaux) – résurgence (trou de Han)" de la Lesse développé au sein des calcaires givetiens du massif de Boine (Han-sur-Lesse). Une caractérisation du comportement hydrogéologique de ce massif a été entreprise dès novembre 2004. Celle-ci repose sur une méthodologie essentiellement expérimentale. Un dispositif de mesure permanent, constitué de dix-sept stations d'enregistrement (stations de jaugeage, stations limnimétriques, stations piézométriques), a été mis en place. Des campagnes d'échantillonnage ont été effectuées en périodes de basses et de hautes eaux afin de définir le faciès physico-chimique des eaux du système. Plusieurs essais de traçage ont été réalisés, dans divers contextes hydrologiques, afin d'étudier la dimension transmissive du système. Les résultats de l'ensemble de ces mesures nous permettent de proposer un schéma conceptuel du comportement hydrogéologique du massif de Boine. Durant les périodes de basses eaux, le cours souterrain de la Lesse peut être assimilé à un système unidimensionnel hétérogène consistant en une alternance de tronçons de rivière souterraine et de zones noyées à haut degré de karstification. Les tronçons de rivière sont accessibles et aisément dimensionnables. Les zones noyées, grands volumes de roches, intensément fracturés, karstifiés et hautement transmissifs uniquement accessibles en plongée, sont, quant à elles, difficiles à dimensionner. Un essai de traçage avec échantillonnage à l'amont et à l'aval de ces zones noyées a été réalisé en septembre 2009 dans des conditions d'étiage. Les courbes de restitution mesurées démontrent que la traversée des zones noyées induit un ralentissement significatif du nuage de traceur et accroît les effets de retard. Les résultats de cet essai de traçage ont été modélisés à l'aide du logiciel Otis (One-Dimensional Transport with Inflow and Storage) (Runkel, 1998). Ce modèle repose sur les processus d'emmagasinement temporaire décrits par Bencala et Walters (1983). L'objectif est, non seulement de quantifier les paramètres d'écoulement et de transport, mais aussi de dimensionner les zones noyées. Dans ce modèle, nous conceptualisons les zones noyées comme de vastes sections d'écoulement composées d'une zone d'écoulement principal et d'une zone d'emmagasinement temporaire induite par les irrégularités de la section d'écoulement. Les résultats de ces modélisations étant concluants, le modèle Otis a également été appliqué sur des systèmes karstiques aux propriétés différentes.(DOCSC04) -- FUNDP, 201
Développement d'une base de données relationnelle permettant de filtrer des groupes de gènes biologiquement pertinents dans l'analyse des données de damiers à ADN
No full textThe objective of this project is to reduce the background noise which limits the interpretation of experiments using microarrays, by integrating information from genomic databases to statistical analysis. Statistical methods generate a high background noise, filtered today only downstream of the analysis, by analytical tools and bibliographic biological information. They are unable to filter false negatives according to statistical criteria.
These criteria are generally used independently of each other and independently for each gene. Their consideration is neither automatic nor weighted.
To filter the results of the analysis of microarrays, a promising way is to submit to the statistical analysis subsets of genes between which relations have been established in reference to bioinformatics databases. The aim of the project is to develop a relational database specifically dedicated to the analysis of these results, by crossins information from numerous available databases.
A request may be structured via an expert system and this information may be integrated at various levels of the decision-making statistical methodology to increase substantially its power.L'objectif de ce projet est de réduire le bruit de fond qui limite l'interprétation des expériences utilisant des damiers à ADN, en intégrant la démarche statistique aux informations des bases de données génomiques. Les méthodes statistiques produisent un important bruit de fond qui est filtré, aujourd'hui uniquement en aval de l'analyse, par des outils d'analyse bibliographique et des informations biologiques.
Ces critères sont généralement utilisés indépendamment les uns des autres et indépendamment pour chaque gène. Leur prise en considération n'est ni automatique, ni pondérée. Ils sont également incapables de réintégrer des faux négatifs écartés par le critère statistique.
Pour filtrer les résultats des analyses de microarrays, une voie prometteuse est de soumettre à l'analyse statistique des sous-ensembles de gènes entre lesquels des liens auront été établis, en référence aux bases de données bioinformatiques. L'objectif du projet de développer une base de données relationnelle spécifiquement dédicacée à l'analyse de ces résultats, qui s'appuie sur les informations croisées venant d'autres bases et banques de données existantes.
Une requête pourra être structurée et rendue utilisable via un programme expert pour être intégrée à plusieurs niveaux dans la méthodologie décisionnelle statistique et en augmenter substantiellement la puissance.(DOCSC03) -- FUNDP, 201
Synthetic Approaches Towards Modified Peptide Nucleic Acids (PNAs) for Biomimetical Nanostructured Surfaces
No full text“There is plenty of room at the bottom”. These were the famous words of Richard P. Feynman in 1959 that led to the birth of nanotechnology and nanoscience. Electronic devices based on inorganic semiconductors have been part of our daily lives for the last 60 years. Their miniaturisation has occurred gradually over the years, however, according to Moore’s law the contemporary microelectronic industry’s “top-down” manufacturing technique will soon reach its limits. Therefore, the recent development and increased knowledge of organic semiconductors has led to a tendency to explore alternative avenues with a focus on the creation of electronic devices based on organic molecules. The invention of techniques such STM (1981) and AFM (1986) have facilitated this research, allowing the imaging and manipulation of surfaces and molecules at the nanometre scale (0.1-100 nm). The next step is therefore the development of methods for the controlled fabrication of molecular assemblies and their integration into usable macroscopic systems. In this respect, the “bottom-up” approach offers considerable advantages over any other methodology (i.e. “top-down”) for the construction of nanoscale functional materials and devices. This approach generally exploits the hierarchical self-assembly of functional molecules through multiple non-covalent interactions to prepare long range ordered and defect-free assemblies barely accessible through conventional covalent synthesis. However, an intrinsic drawback of investigating such systems in solution or in a crystal is that molecular components cannot be directly addressed on a nanometric scale. As a consequence, the best engineering methodology involves modifying the surfaces of bulk materials such as metals or semiconductors by deposition of functional organic materials. The modified surfaces are then characterised using scanning probe microscopies (e.g. STM, AFM). To this end, surface-confined, supramolecularly constructed, bi-dimensional (2D) networks, featuring regular porous domains (controllable both in shape and size) are of particular significance in this research domain because their cavities can be used as receptors for the confinement of other remotely controlled functional molecules (e.g. molecular switches, luminescent chromophores). Since these complex nanostructures could ultimately find applications as optoelectronic devices, research efforts in this domain have been gathering momentum in recent years.
In Chapter 1, the reader is introduced to the methods employed to construct porous networks on surfaces via supramolecular interactions. The second part of the chapter deals with recent examples of recognition, selection and immobilisation of guest molecules within the cavities of the networks, which is followed in the third part with a discussion about surface assemblies that display structural features or functionality in the third dimension. The last section of the chapter is devoted to the construction of porous networks on surfaces via the interactions of biomimetic molecules (e.g. DNA), which leads to the objectives of the present doctoral project.
Inspired by the self-assembly of DNA into nanoporous arrays, it was postulated that the Watson-Crick base pairing of oligonucleotide’s nucleobases would be ideal in preparing 2D porous networks with large receptor cavities. The idea was to covalently attach complementary single stranded oligonucleotides to rigid angular and linear unit core modules respectively, and then allow the two units to self-assemble on surfaces. However, instead of using DNA oligonucleotides, the use of peptide nucleic acid (PNA) oligonucleotides was proposed since more robust architectures would be obtained due to the higher duplex stability displayed by this class of biomimetic molecules. This doctoral dissertation describes the synthetic steps taken towards achieving this goal.
The design of the angular and linear units bearing complementary PNA oligomers, required for the preparation of self-assembled nanoporous arrays is presented. However, prior to synthesizing these complex molecules, a simpler proof of principle was required to confirm that PNA duplexes could be formed on surfaces and also, whether the presence of chromophoric moieties (e.g. porphyrin) appended to the PNA strands had any effect on duplex formation and duplex stability. The molecule designed for this proof of principle was a self-complementary PNA dodecamer bearing a porphyrin adduct.
The synthesis of the self-complementary PNA oligomer required for the preparation of the PNA-porphyrin adduct is described in the first part of Chapter 2. The main synthetic routes and protecting-group strategies used to prepare PNA monomers and oligomers are described first. This is followed by a discussion of the orthogonal protecting group strategies chosen for our project that would allow the isolation of PNA oligomers bearing protected nucleobases following resin-cleavage. This is contrary to the general norm in existing strategies wherein resin-cleavage and nucleobase deprotection is carried out in situ, however, it was required in our synthetic strategy since the terminal amino group of the PNA oligomers was required for further solution phase reactions. To this end, two protecting group strategies were proposed, a Fmoc/Mmt and Fmoc/Cbz-protecting group strategies. The solid support chosen for the Fmoc/Mmt strategy was Tentagel featuring a base-cleavable linker. Due to the failure to hydrolyse the linker during the resin-cleavage step, the Fmoc/Mmt strategy was abandoned. In the second strategy, an acid-cleavable Rink amide resin was chosen as the solid support, therefore a Fmoc/Cbz-protecting group strategy was chosen since it would allow the TFA-mediated cleavage of the oligomer from the resin, without the deprotection of the Cbz groups from the nucleobases.
The preparation of the target PNA oligomer (sequence: TTAATTAATTAA) using the Fmoc/Cbz strategy is described in the next section. First, the required monomers for the oligomer synthesis were prepared using established procedures. Then, following reports of the advances in microwave assisted solid phase peptide synthesis claiming improved purity of oligomer products using short coupling times, the solid phase PNA oligomerisation was attempted using microwave irradiation. Three attempts were performed. The first, using a standard laboratory microwave, resulted in a complex mixture of products at the dodecamer stage. An improvement was observed in the results using the CEM discover SPS microwave which was specifically designed for solid phase synthesis, however, the crude dodecamer obtained was still inseparable from the by-products. Similar results were obtained with the CEM liberty microwave, which was an automated solid phase synthesis setup. Finally, utilising manual solid phase synthesis, the target PNA dodecamer was obtained. The HPLC chromatogram of crude PNA dodecamer obtained following resin cleavage displayed a single major product, which was subsequently purified. The oligomer was then deprotected by treatment with TMSI, and was analysed by mass spectrometry, which confirmed that the target dodecamer had been isolated.
Section 2.2 described our efforts to prepare PNA-chromophore adducts. Following the isolation of the PNA dodecamer, attempts to covalently attach a porphyrin moiety to the resin-bound oligomer via an amide linkage failed, possibly due to steric hindrance. Subsequently, an azide linker was appended to the oligomer, and attempts to attach an acetylene functionalised porphyrin using a Cu(I)-catalysed 1,3-dipolar cycloaddition were performed. Unfortunately, this approach also did not yield the target adduct. These unsuccessful results paved the way to the development of a Cu(I)-free 1,3-dipolar cycloaddition that enabled the attachment of chromophores to the PNA oligomer.
Recently published reports of Cu(I)-free 1,3-dipolar cycloaddition reactions applied on DNA oligomers offered inspiration towards this goal. The reported strategies involved the generation of a nitrile oxide species, which then reacted with either an alkene or an alkyne to form an isoxazoline or an isoxazole. Two methods of generating the nitrile oxide species were evaluated using anthracene derivatives. The first method involved the base-mediated dehydrochlorination of anthracene hydroximoyl chloride to yield the nitrile oxide, which then reacted with a dipolarophile that was introduced into the reaction mixture. The second approach to generating a nitrile oxide species involved treating an O-silylated hydroxamic acid derivative of anthracene with trifluoromethanesulfonic anhydride in the presence of a base (Carreira’s method). Following successful trapping of the nitrile oxides generated by both methods using trimethylsilyl ethylene as the dipolarophile, the reactions were applied on a resin-bound, acetylene-functionalised PNA dodecamer. Both methods yielded the target PNA-anthracene adduct.
Since the nitrile oxide-acetylene 1,3-dipolar cycloaddition reaction had never been applied on porphyrins, a method had to be developed. Attempts to prepare a hydroximoyl chloride derivative of a porphyrin resulted in the decomposition of the macrocycle upon treatment with chlorinating agents (NCS, tert-BuOCl, and 1-chlorobenzotriazole), therefore, the hydroximoyl chloride method was abandoned in favour of the Carreira method. An O-silylated hydroxamic acid derivative of porphyrin was synthesized, and upon exposure to trifluoromethanesulfonic anhydride and Et3N, the nitrile oxide was generated and was trapped with a large excess (200 eq.) of trimethylsilyl ethylene yielding the target tetra-isoxazole porphyrin derivative in 62% yield, which corresponded to a yield of 89% per 1,3-dipolar cycloaddition. Optimisation of the reaction conditions using phenyl acetylene as the dipolarophile allowed similar yields to be obtained with only a 10 eq. excess of the acetylene.
Having developed a protocol that was compatible with both PNA and porphyrin, the utility of the method to prepare a variety of PNA-chromophore adducts was tested. Hydroxamate derivatives of pyrene, porphyrin, phenanthroline and fluorescein chromophores were prepared. Subsequently, the corresponding nitrile oxide species were generated and were reacted with the resin-bound, acetylene-functionalised PNA dodecamer. The PNA-pyrene adduct was successfully isolated, however, the other target PNA-chromophore products were not isolated. The porphyrin nitrile oxide derivative was insoluble in the reaction medium, thus preventing the cycloaddition reaction from proceeding. In the case of the fluorescein hydroxamate, the presence of nucleophilic functional groups in the starting material were probably reactive towards the trifluoromethanesulfonic anhydride reagent, therefore it was unlikely that the nitrile oxide species was formed, and thus the cycloaddition reaction could not proceed. Finally, the reaction with the phenanthroline derivative yielded a new product, however mass spectrometry analysis indicated that it did not correspond the target PNA-phenanthroline adduct. Further work is currently underway to re-evaluate these reactions.
In parallel to the synthetic work, a preliminary study into the deposition of PNA onto mica surfaces was investigated using AFM imaging. Deposition of drops of an aqueous solution of deprotected self-complementary PNA dodecamer onto clean mica surfaces using spin coating resulted in aggregates of PNA on the surface. Following annealing of the solution, a repeated deposition of a single drop of the solution resulted in a completely different surface assembly. The surface was saturated by what was thought to be PNA duplexes. This was confirmed by the deposition of drop of a solution that was diluted ten-fold which resulted in an AFM image where bright spot were intermitted by clean mica surface. Topographical analysis of the surface indicated that the bright spots were an average in 1 nm in height, which closely corresponds to the expected height of PNA duplexes, thus confirming that PNA duplexes could be deposited onto surfaces.“There is plenty of room at the bottom”. Ces célèbres mots, prononcés par Richard P. Feynman en 1959, conduisirent à la naissance de la nanotechnologie et de la nanoscience. Les appareils électroniques à base de semi-conducteurs font partie de notre quotidien depuis ces dernières six décennies. Leur miniaturisation a pris place graduellement au cours des années, cependant, d’après la loi de Moore, la technique de production “top-down” de l’industrie microélectronique contemporaine atteindra bientôt ses limites. Dès lors, les développements récents et la connaissance accrue des semi-conducteurs organiques ont mené à l’exploration de voies alternatives se concentrant sur la création d’appareils électroniques à base de molécules organiques. L’invention de techniques telles que la STM (1981) et l’AFM (1986) ont facilité cette recherche, permettant l’imagerie et la manipulation de surfaces et de molécules à l’échelle nanométrique (0.1-100 nm). L’étape suivante est alors le développement de méthodes permettant le contrôle de la fabrication d’assemblages moléculaires et leur intégration dans des systèmes macroscopiques fonctionnels. À cet égard, l’approche “bottom-up” offre des avantages considérables par rapport aux autres méthodologies (i.e.“top-down”) pour la construction à l’échelle nanométrique de matériaux et appareils fonctionnels. Cette approche exploite généralement l’auto-assemblage hiérarchique de molécules fonctionnelles via de multiples interactions non-covalentes afin de préparer des assemblages ordonnés à longue-distance et sans défauts inhérents, à peine accessibles par de la synthèse covalente conventionnelle. Cependant, investiguer de tels systèmes en solution ou dans un cristal présente un inconvénient intrinsèque. En effet à l’échelle nanométrique, tous les composés moléculaires ne peuvent être atteints. Dès lors, la modification des surfaces de matériaux tels que les métaux ou semi-conducteurs, par déposition de matériaux organiques fonctionnels, semble être la méthodologie d’ingénierie la plus prometteuse. Les surfaces modifiées sont alors caractérisées via des microscopies à sonde locales (tel que la STM, AFM). À cette fin, des réseaux bidimensionnels (2D) construits d’une manière supramoléculaire que présentant une surface confinée et des domaines poreux réguliers (contrôlables à la fois en forme et en taille) sont d’une importance particulière dans ce domaine de recherche, étant donné que leurs cavités peuvent être utilisées comme récepteurs pour le confinement d’autres molécules fonctionnelles (comme par exemple des interrupteurs moléculaires ou des chromophores luminescents). Puisque ces nanostructures complexes pourraient ultimement trouver des applications comme appareils optoélectroniques, des efforts de recherche dans ce domaine ont provoqué beaucoup d’enthousiasme au cours des dernières années.
Dans le Chapitre 1, les méthodes employées pour construire des domaines poreux sur surfaces via des interactions supramoléculaires sont introduites au lecteur. La deuxième partie de ce chapitre traite des exemples récents de reconnaissance, sélection et immobilisation de molécules guest dans les cavités du réseau. Celle-ci est suivie d’une troisième partie présentant une discussion sur les assemblages sur surface exposant des caractéristiques structurelles ou des fonctionnalités dans la troisième dimension. La dernière section de ce chapitre est dévouée à la construction de réseaux poreux sur surfaces via les interactions de molécules biomimétiques (tel que l’ADN), ce qui mène ainsi aux objectifs de ce présent projet de thèse.
Sur base de l’auto-assemblage de l’ADN en réseaux nanoporeux, il a été postulé que l’appariement de Watson-Crick des nucléobases de l’oligonucléotide serait idéal pour la préparation de domaines 2D poreux présentant de larges cavités réceptrices. Notre idée fut d’attacher covalement des oligonucléotides complémentaires à simples brins à des modules rigides angulaires et linéaires, respectivement, et ainsi permettre aux deux modules de s’auto-assembler sur surface. Cependant, nous avons proposé l’utilisation d’oligonucléotides d’acides nucléiques peptidiques (ANP) en lieu et place d’oligonucléotides d’ADN afin d’obtenir des architectures plus robustes grâce à la stabilité plus élevée des duplex formés par cette classe de molécules biomimétiques. Cette dissertation doctorale décrit les étapes synthétiques réalisées afin d’accomplir cet objectif.
La conception des unités angulaires et linéaires portant des oligomères d’ANP complémentaires nécessaires à la préparation des réseaux nanoporeux auto-assemblés est décrite. Toutefois, avant de synthétiser ces molécules complexes, une preuve de principe plus simple était nécessaire pour confirmer que les duplex d’ANP pouvaient être formés sur surface, et également observer si la présence d’entités chromophoriques (comme la porphyrine) attachés aux brins d’ANP avait des effets sur la formation du duplex et sa stabilité. La molécule élaborée à cet égard fut un adduit formé par un dodécamère auto-complémentaire d’ANP portant une porphyrine .
La synthèse de l’oligomère auto-complémentaire d’ANP requis pour la préparation de l’adduit ANP-porphyrine est décrite dans la première partie du Chapitre 2. Les voies de synthèse principales et les stratégies de protection utilisées pour préparer les monomères et oligomères d’ANP sont décrites en premier lieu. Ensuite, une discussion sur les stratégies de protections orthogonales choisies pour notre projet est introduite au lecteur. Celles-ci permettraient l’isolation d’oligomères d’ANP portant des nucléobases protégées après clivage de la résine. Une telle stratégie est contraire aux normes rencontrées dans les méthodologies existantes, dans lesquelles le clivage de la résine et la déprotection des nucléobases sont réalisés in situ. Cela dit, procéder autrement était indispensable pour notre stratégie de synthèse puisque le groupement aminé terminal des oligomères d’ANP est nécessaire pour des réactions ultérieures en solution. A cette fin, nous avons proposé deux stratégies de protection, l’une impliquant des groupements protecteurs Fmoc/Mmt, et l’autre des groupements protecteurs Fmoc/Cbz. Le support solide choisi pour la stratégie Fmoc/Mmt fut le Tentagel, présentant un lien clivable dans des conditions basiques. À cause de l’hydrolyse non concluante de ce lien pendant l’étape de clivage de la résine, nous avons abandonné la stratégie Fmoc/Mmt. Dans la seconde stratégie, nous avons choisi comme support solide une résine amide de Rink clivable dans des conditions acides. Dès lors nous avons choisi une stratégie exploitant les groupements protecteurs Fmoc/Cbz puisque celle-ci permettrait le clivage de l’oligomère de la résine par du TFA, sans déprotéger les groupements protecteurs Cbz des nucléobases.
La préparation de l’oligomère d’ANP cible (séquence: TTAATTAATTAA) utilisant la stratégie Fmoc/Cbz est décrite dans la section suivante. Tout d’abord, les monomères requis pour la synthèse de l’oligomère ont été préparés à partir de procédures déjà établies. Ensuite, sur base de rapports décrivant les avancées réalisées en synthèse peptidique sur phase solide assistée par micro-onde et clamant une pureté accrue des produits d’oligomérisation, tout en utilisant des temps de couplage courts, nous avons tenté de réaliser l’oligomérisation de l’ANP sur phase solide en utilisant des irradiations micro-ondes. Trois tentatives ont été effectuées. La première impliquait l’utilisation d’un micro-onde standard de laboratoire. Cet essai a résulté en un mélange complexe de produits au niveau du dodécamère. Une amélioration des résultats a été observée en utilisant le micro-onde CEM discover SPS, conçu spécifiquement pour la synthèse sur phase solide. Cependant, le dodécamère désiré était toujours inséparable des sous-produits. Des résultats similaires ont été observés avec le micro-onde CEM liberty, un système automatisé pour la synthèse sur phase solide. Finalement, en réalisant une synthèse manuelle sur phase solide, le dodécamère d’ANP cible a été obtenu. Le chromatogramme HPLC du brut du dodécamère d’ANP obtenu après clivage de la résine montre un seul produit majoritaire, qui a été purifié par la suite. L’oligomère a alors été déprotégé par traitement avec du TMSI et a été analysé par spectrométrie de masse, qui a confirmé que le dodécamère cible avait bien été isolé.
La section 2.2 décrit nos efforts pour préparer les adduits ANP-chromophore. Après avoir isolé le dodécamère d’ANP, des tentatives pour attacher covalement via un lien amide l’entité porphyrine à l’oligomère lié à la résine ne furent guère concluantes, certainement dû à un encombrement stérique. Subséquemment, un linker azoture a été greffé à l’oligomère, et des essais pour attacher une porphyrine fonctionnalisée par un groupement acétylène, via une cycloaddition 1,3-dipolaire catalysée par du Cu(I) ont été réalisés. Malheureusement, cette approche n’a pas non plus fourni l’adduit cible. Ces résultats non fructueux ont ouvert la voie au développement d’une cycloaddition 1,3-dipolaire sans Cu(I), qui a elle permis la liaison des chromophores aux oligomères d’ANP.
De récents rapports publiés sur les réactions de cycloaddition 1,3-dipolaire sans Cu(I) appliquées sur des oligomères d’ADN nous ont inspiré et aidé à atteindre ce but. Les stratégies rapportées impliquaient la génération d’un oxyde de nitrile, qui était alors mis en réaction avec soit un alcène ou un alcyne, pour former une isoxazoline ou un isoxazole respectivement. Deux méthodes permettant la génération d