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Interaction between human oncogenic retrovirus and cellular factors of infected cells.
No full textThe purpose of this PhD thesis was to investigate the cellular and molecular interactions between oncogenic retroviruses, particularly HTLV-2 (Human T cell ymphotropic Virus 2), and host factors with potential inhibitory action on retroviral replication. Special attention was concentrated n the host factor CIITA, the HLA class II transactivator.
It was previously shown in this laboratory that CIITA inhibits the transcriptional function of Tax-2 and, consequently, the replication of HTLV-2 virus in human target cells. We tested different fragments of CIITA in 293T cell line, used as a human physiologic system for functional assays with HTLV-2, for the inhibition of Tax-2. We confirm that the Nterminus of CIITA, encompassing the region 1-252, is involved in the block of the Tax-2-mediated transactivation of viral LTR promoter. We also investigated the molecular mechanism at the basis of this effect, and we an unprecedented interaction between CIITA
and Tax-2, that involves the N-term part of CIITA molecule. We identified two
independent regions necessary for the interaction with Tax-2, at the N-terminus and
another one at the C-terminus of CIITA, that are differentially available in the wild type
molecule. We conclude that CIITA could inhibit Tax-2 by directly binding the viral
transactivator, and that this effect may be enhanced by the presence of different factors in common between the host cell and the virus like p300, CBP or PCAF that, together with NF-YB, could help the formation of the inhibiting complex.
We repeatedly observed that when Tax-2 is co-transfected with CIITA, induces a
significant increase of the expression of CIITA, and this effect is evident also with the Nterm deletion mutants and fragments that belong to the central region of CIITA, but not with C-term fragments. We also demonstrate that the rate of CIITA protein increase is dependent on the amount of Tax-2. We identified a region of CIITA that is the target of Tax-2 –mediated increase, including the aminoacids from position 1 to 252.
We asked whether the interaction between the host factor CIITA and the viral transactivator and the increase of CIITA protein could affect also the activity of CIITA on HLA-II promoters. With flow cytometry analysis, we observed that Tax-2 alone does not affect HLA expression, whereas it increases CIITA-mediated expression of HLA-DR on the cell surface. Interestingly, we found also that in the presence of Tax-2 the interaction
between CIITA and NF-YB is significantly more efficient, indicating that CIITA when coexpressed with Tax-2 presents a better functionality on class II genes promoters. We ruled out a possible transcriptional effect of Tax-2 on CMV promoter driving the expression of CIITA, because Tax-2 does not increase the expression of other proteins transcribed from the same CMV promoter, such as GFP and NF-YB, but enhances a CIITA molecule whose expression is under the control of a RSV promoter.
Further studies allowed us to determine that Tax-2 effect is the result of two contributions: Tax-2 stabilizes CIITA mRNA and induces a modification of the kinetic of degradation of CIITA, extending its half-life from 2 to 3 hours.
Together with our previous observations that CIITA inhibits Tax-2 function, these findings
might indicate that HLTV-2 may enhance CIITA protein expression and functionality in
order to exploit its ability to inhibit Tax-2 LTR promoter transactivation and virus
replication. We hypothesize that this “feed back” inhibitory mechanism may control from
one side HTLV virus replication and spreading, but on the other side may also help the virus to maintain a latent state in the infected cells
Materiali fotoattivi nanostrutturati: sintesi, caratterizzazioni e applicazioni.
No full textTitanium dioxide is suitable to answer some important needs of our society, particularly in the environmental field, as a photo catalyst, and in the energy field, for realization of devices for a rational use of solar energy. Thanks to nanotechnology, this material has found a renewed interest by the scientific community for innovative properties that occur as a result of its nanoscale.
The materials based on titanium dioxide produced in this work were obtained by sol-gel method, which is now one of the most studied techniques for the synthesis of nanostructured materials. The interest stimulated by this method is its extreme versatility and advantages of ease of control of process parameters. Specifically, samples were synthesized containing either only titanium dioxide, or inorganic hybrid silica / titania.
The reasons that led to the trial presented here lie in understanding the influence of experimental parameters (composition, temperature, time) that govern the synthesis process on nature and structural characteristics of the material isolated. Morphology, crystallinity and micro-structure, have been investigated by X-ray Powder Diffraction (XRPD), Nitrogen Physisorption, Atomic Force Microscope (AFM) and Debye Function Analysis (DFA). We also correlated the effect of experimental and structural aspects on the functional properties (photocatalytic activity) of the synthesized materials.
Another important aspect of this work concerns the investigation of the application of the materials produced for the surface modification of textile substrates (polyester) in order to obtain "smart textiles" that can effectively reduce environmental pollutants. In this area we investigated the effects of variation of process parameters on the performance exhibited by functionalized textiles
Np95 è coinvolta nel mantenimento dell’informazione epigenetica della cromatina associata a repressione trascrizionale in cellule replicanti e P19 indotte a differenziare a neuroni.
No full textmissin
Provisional odels for management and conservation of Alpine fauna: the red deer (Cervus elaphus) case in the Stelvio National Park.
No full textmissin
Industria tessile, competitività, sviluppo economico: insegnamenti dal caso indiano.
No full textmissin
La nullita’ del provvedimento amministrativo per mancanza degli elementi essenziali.
No full textmissin
Conservation of Biodiversity in Alps: mountain hare (Lepus timidus) as model system.
No full textKnowledge about mountain hare (Lepus timidus) is still scarce, especially in alpine ecosystem. We collected information about mountain hare behaviour and distribution to asses if this species can be a useful indicator of environmental changes across the Alps.
First, we tested two di_erent live capture methods for mountain hare in Scotland and we verified if sex or age composition and body condition of hares di_ered between methods.
Individuals in poor condition were more frequently taken with traps, a tendency which may reflect increased risk taking of individuals in poorer body condition and less aversion to entering traps to bene_t from eating bait. We then used data of body mass of recaptured hares in two study areas in Italy. Here we did not _nd di_erence in body mass between _rst capture and recaptured hares, supporting the hypothesis that di_erences in capture methods, at least partly, depend on the habitat type where they have been applied.
The main part of the _eldwork aimed to investigate space and habitat use of mountain hare in relation to habitat structure and composition. We analysed the space-use patterns of two mountain hare populations from the Central Alps using radiotracking.
We monitored 34 hares, estimating home range size, overlap and site _delity, and compared our data with space use in Scottish and North-European populations. Home ranges of mountain hares did not di_er between two study sites with di_erent habitat types.
Subadult animals used larger ranges than adults and both age groups reduced home range size in autumn, a period that might be critical for hares due to changes in diet and/or high energy expenditure during the previous breeding season. Younger hares probably made exploratory movements to gather information about surrounding habitats. Home ranges in alpine 'edge' populations were smaller than in Scandinavian populations, but within the range of populations in di_erent habitat types in Scotland. Seasonal home ranges overlapped considerably, but di_ered among the sexes: intersexual overlap in males (thus with females) was larger than spatial overlap among other sexes. Seasonal shifts of home ranges were small and site _delity remained constant over the di_erent seasons, suggesting that resource distribution remained constant throughout the year and that the knowledge of an intensively frequented area is an important element of habitat quality.
From data collected with radiotracking we also analysed habitat selection of mountain hares. Hares selected closed habitat and avoided open habitat with poor productivity.
We found the same patterns at di_erent temporal scales: day and night ranges, seasonal ranges and annual ranges. The most preferred habitat type was dwarf mountain-pine, important for hares during winter, being the only available food resource, and still fundamental during the rest of year because it o_ers resting places. Dwarf mountain-pine present the highest High Heating Value (HHV) among the available food resources. For conservation reasons, we also analysed mountain hare interaction with cattle on alpine pastures. Presence of cattle on pastures did not result in a shift in habitat selection by hares.
Based on culled animals, we also analysed reproductive parameters of mountain and brown hare (Lepus europaes): litter size, number of litters per year and number of leverets per litter. Reproductive parameters of mountain hare were similar to those reported for other subspecies across its distribution range. In contrast, those registered in this study for brown hare suggested adaptation of brown hares to colder environments.
Finally, we explored population-genetic parameters, using mtDNA and nuclear microsatellites analysis. Two animals trapped in one of our study areas were hybrids between mountain and brown hare, supporting the fact that hybridisation processes are present also on the Alps as already reported for other populations living in the Northern parts of mountain hare distribution range.
Data collected support the hypothesis that alpine mountain hare populations undergo pressure related to environmental changes. This tendency becomes evident only taking into account di_erent aspects of its ecology, genetics and distribution
Studio di fase i del satraplatino, composto orale del platino, in combinazione sequenziale con capecitabina nel trattamento di pazienti affetti da tumore solido avanzato.
No full textObiettivo Definire la dose massima tollerata (MTD) della combinazione di satraplatino, composto orale del platino (S) e capecitabina (C) in pazienti affetti da tumore solido avanzato. Obiettivo secondario è la valutazione della risposta tumorale.
Metodi Sono stati esplorati quattro livelli di dose: S 60 mg/m2/giorno and C 1650 mg/m2/giorno, S80 and C 1650, S60 and C 2000, S70 and C 2000. Un ciclo corrisponde a 28 giorni di somministrazione sequenziale di S (giorni 1-5) seguito da C (giorni 8-21) e da una settimana di pausa di una settimana.
Risultati Trentasette pazienti sono stati trattati, 24 nella fase di aumento di dose e 13 nella fase di espansione; alla MTD definita a S 70 mg/m2/giorno and C 2000 mg/m2/giorno due pazienti hanno presentato le tossicità limitanti la dose (DLTs): mancato recupero dalla neutropenia entro il 42°giorno e nausea con mancata assunzione della dose di C. Altre tossicità frequenti sono state: nausea (57%), diarrea (51%), neutropenia (46%), anoressia, fatica, vomito (38% ciascuno).
In 2 pazienti affetti da tumore ovarico platino sensibile e un paziente affetto da tumore prostatico sono state osservate riposte parziali confermate.
Conclusione Alla dose di S 70 mg/m2/giorno and C 2000 mg/m2/giorno la combinazione sequenziale di S e C è ben tollerata con tossicità accettabile; è auspicabile l’uso della combinazione in caso di pazienti affetti da tumore noto per la sensibilità al derivati del platino e fluoro uracile soprattutto per la mancanza di nefrotossicità e neurotossicità e la facilità di somministrazione senza necessità di ricovero
Anomalie cromosomiche strutturali come causa di alterata funzionalità genica, piastrinopenia e conseguente suscettibilità allo sviluppo di mielodispasie e/o leucemie.
No full textIl presente studio è stato effettuato su quattro diversi pazienti portatori di anomalie cromosomiche strutturali sia di natura acquisita che costituzionale. Tutti i riarrangiamenti alterano l'espressione di specifici geni e possono essere causativi delle forme di piastrinopenia da cui i nostri pazienti sono affetti. Ciascuna anomalia è stata indagata con metodi di citogenetica standard, di ibridazione in situ fluorescente (FISH), di comparative genomic hybridization su array (a-CGH) e, laddove necessario, sono state utilizzate tecniche di PCR real-time quantitativa e/o Multipainting. In dettaglio vengono presentati i seguenti casi:
CASO 1: paziente maschio affetto da anemia aplastica grave con scarsa presenza a livello midollare della componente granulopoietica e la completa assenza di megacariociti. E’ stata evidenziata nel midollo un’ anomalia cromosomica clonale a carico di un cromosoma n° 21. L'analisi di FISH effettuata con la sonda informativa CTD-2235K24 ha evidenziato la delezione degli esoni 2-8 di RUNX1, mentre le sonde BAC RP11-88N2 e RP11-625E21 hanno mostrato una duplicazione invertita delle bande q22.2 e q22.3, confermata poi anche dall'analisi di a-CGH. È stato dimostrato con esperimenti di real-time PCR quantitativa che l’evento di delezione a carico degli esoni 2-8 del gene RUNX1 comporta una significativa riduzione nell’espressione del gene stesso. Tale ipoespressione spiega le condizioni ematologiche del paziente, in particolare la completa assenza di megacariociti, vista la nota importanza di RUNX1 nella maturazione degli stessi e nella produzione delle piastrine. In prelievi successivi il paziente è andato incontro a una riduzione del clone con il cromosoma der(21) ma ha acquisito un secondo clone caratterizzato da una delezione interstiziale delle braccia lunghe di un cromosoma 13: in particolare la regione interessata (13q13.3-q21.31) risulta da letteratura essere spesso associata a sindromi mielodisplastiche (MDS) e pazienti affetti da MDS con del(13q) hanno una prognosi negativa per l’evoluzione in leucemia.
Questi due cloni sono stati monitorati nel tempo tramite FISH al fine di mantenere sotto controllo la disfunzione midollare ed eventuali sviluppi mielodisplastici/leucemici.
CASO 2: paziente femmina affetta da piastrinopenia cronica. Su prelievi di midollo, sangue periferico e fibroblasti cutanei è stata riscontrata un’anomalia cromosomica costituzionale a carico di un cromosoma n° 21 caratterizzata da un evento di inversione pericentrica. Analisi di FISH hanno dimostrato rottura del gene RUNX1 tra il 4° e il 5° esone. L'analisi di a-CGH ha confermato i risultati di FISH e mostrato anche una duplicazione degli esoni 2-3-4 del medesimo gene, una duplicazione della banda 21q22.2 e una grossa regione di delezione terminale di 2,35 Mb. La FISH effettuata con la sonda fosmidica WI2-1915K14 ha confermato la duplicazione degli esoni 2-3-4 di RUNX1, che sono ritenuti sul braccio lungo del cromosoma invertito, e, con la sonda BAC RP11-88N2, la delezione terminale. La Real-time quantitativa ha mostrato una riduzione nell'espressione relativa del gene RUNX1. Anche in questo caso gli eventi di rottura e duplicazione, di natura costituzionale, spiegano la piastrinopenia di cui la nostra paziente è affetta.
CASO 3: paziente maschio con fenotipo clinico suggestivo per trombocitopenia amegacariocitica congenita (CAMT) in assenza, però, delle mutazioni del gene MPL riconosciute come causa diretta della patologia. La CAMT, come le altre sindromi da insufficienza midollare, potrebbe essere uno stadio pre-leucemico, anche se i casi riportati in letteratura sono assai rari. E’ stata evidenziata un’anomalia cromosomica acquisita a carico di un cromosoma n° 1, caratterizzata da un evento di inversione paracentrica con punti di rottura in p13 e p36. Le analisi di FISH effettuate con sonde BAC informative hanno confermato l'evento di inversione e la presenza di due regioni di delezione prossime ai punti rottura, evidenziate prima solo con l'a-CGH. La Real-time quantitativa ha evidenziato una ridotta espressione del gene MPL, il quale non risulta rotto dall'evento di inversione ma solo traslocato in una regione più centromerica dello stesso cromosoma: l’ipotesi di un effetto di posizione sul gene MPL potrebbe spiegare il fenotipo simil-CAMT riscontrato nel paziente.
CASO 4: paziente femmina con quadro morfologico del midollo e delle piastrine compatibile con Sindrome di Paris-Trousseau: si tratta di una forma costituzionale di piastrinopenia con inclusione di piastrine caratterizzate da granuli α giganti e causata da delezione terminale di un cromosoma n° 11, in una regione dove è mappato il gene FLI1 (11q24), causativo della patologia. Da analisi su midollo è stato evidenziato un cariotipo complesso caratterizzato dalla presenza di un cromosoma derivativo 11 da traslocazione t(3;11)(q21;q25), di un cromosoma derivativo 2 e da monosomia 3. Analisi di MultiFISH a a-CGH hanno meglio chiarito la natura del riarrangiamento. La regione monosomica del cromosoma 11, confermata con FISH con la sonda BAC RP11-744N12, dimostra la perdita clonale di una copia del gene FLI1: questo spiega il quadro di piastrinopenia della paziente.
CONCLUSIONI
La rottura del gene RUNX1 (CASO 1 e 2), la perdita di una copia del gene FLI1 (CASO 4) e l'effetto di posizione del gene MPL (CASO 3) comportano disfunzione midollare. Nei casi 1 e 2 la rottura del gene è causa diretta della piastrinopenia di cui soffrono, poiché questo gene è coinvolto nella maturazione dei megacariociti e nella produzione delle piastrine. La Real-time quantitativa ha dimostrato una riduzione nell'espressione relativa di RUNX1. Nel CASO l'effetto di posizione a carico del gene MPL è probabilmente causa del fenotipo simil-CAMT del paziente: la Real-time quantitativa ha confemato una riduzione nell'espressione del gene. Nel CASO 4 un complesso riarrangiamento cromosomico strutturale comporta la perdita clonale di una copia del gene FLI1, che è la causa della piastrinopenia della paziente
Analisi critica dei risultati del progetto PM-CARE: valutazione statistica dell’associazione tra esposizione al particolato urbano e parametri clinici di interesse.
No full textLo studio degli effetti sulla salute umana legati all’esposizione a particolato atmosferico sono ormai noti, ma è ancora necessario indagare i meccanismi patogenetici che li determinano. Il presente progetto di dottorato, che si inserisce nel contesto di un progetto di rilevanza nazionale, il progetto PM-CARE, ha l’obiettivo di studiare l’associazione tra esposizione a particolato e l’andamento di una selezione di parametri clinici di interesse.
Il progetto è stato sviluppato mediante l’effettuazione di due monitoraggi, di 24 ore ciascuno, uno nel periodo invernale e l’altro nel periodo estivo, nell’ipotesi di concentrazioni di particolato differenti. La popolazione studiata è stata costituita da 81 volontari, residenti nelle province di Milano e Monza, suddivisi in 3 gruppi: cardiopatici, pneumopatici e “non cardiopatici-non pneumopatici”, (cosiddetti “sani”), per indagare una diversa suscettibilità al particolato.
Le misure di esposizione sono state di tipo individuale, realizzate mediante un prototipo di unità mobile di monitoraggio (M.M.U.), una valigia con rotelle contenente tutti gli strumenti di misura necessari al monitoraggio e facilmente trasportabile dai soggetti. Si è ottenuta, quindi, una stima realistica dell’esposizione relativa a diverse frazioni di particolato, identificate dal diametro aerodinamico delle particelle [da], in termini di concentrazioni gravimetriche (suddivise nelle frazioni con da massimi: 0.5, 1, 2.5 e 10 μm), e di concentrazioni numeriche, (range da > 0.02 μm). Sono stati misurati, inoltre, parametri coinquinanti (O3, CO, NO2) e a parametri microclimatici (T, rH). A completamento dello scenario espositivo, è stata compilata una check-list contenente le principali informazioni sulle caratteristiche degli ambienti di vita dei soggetti, oltre ad un diario delle attività da essi svolte durante i monitoraggi.
Le misure di tipo clinico, contestuali a quelle ambientali, hanno previsto esami di tipo ematochimico, cardiologico e respiratorio.
L’obiettivo del progetto di dottorato è stato quello di studiare l’associazione tra l’esposizione a particolato atmosferico e l’andamento di parametri clinici di interesse, selezionati in collaborazione con il team clinico del progetto. Dopo una prima analisi descrittiva, tali associazioni sono state verificate mediante l’applicazione dei modelli lineari misti per misure ripetute. A completamento dello studio, sono stati valutati, con un’analisi preliminare, i tempi di latenza tra esposizione ed effetto clinico, per i parametri cardiologici continui.
I parametri clinici scelti sono stati la proteina C-reattiva (hs-PCRPCR), il fibrinogeno e due indici della variabilità cardiaca: la frequenza cardiaca (FC) e la deviazione standard dell’intervallo tra due battiti normali N-N (SDNN).
La hs.PCR è uno dei principali indici di infiammazione sistemica ed è associata al rischio di eventi coronarici acuti. Il fibrinogeno è un indicatore dello stato coagulatorio del sangue e il suo incremento è associato a una maggior predisposizione alla formazione di trombi ed eventi coagulatori che possono favorire la sindrome coronaria e l’infarto del miocardio. Entrambi i parametri sono stati derivati da un prelievo sanguigno a fine monitoraggio.
Alterazioni dei parametri cardiologici selezionati risultano associate a una riduzione della variabilità della frequenza cardiaca, a cui si deve un aumento nel rischio di mortalità per cause cardiovascolari, inclusa la morte cardiaca improvvisa. Entrambi i parametri sono stati derivati dal tracciato in continuo dell’elettrocardiogramma di tipo Holter, sulle 24 ore di monitoraggio.
I livelli di particolato sono risultati in media superiori ai livelli raccomandati dalle linee guida della WHO (rispettivamente di 50 μg/m3 e 25 μg/m3) in entrambi i monitoraggi per il PM2.5, e nel monitoraggio invernale per il PM10.
Il PM10, costituito da tutte le particelle con diametro aerodinamico fino a 10 μm, secondo le analisi eseguite, è risultato composto per circa il 67% dalle particelle con da < 0.5 μm, appartenenti alla moda di accumulazione.
Molto evidente, inoltre, è stato il trend stagionale, con livelli di esposizione più alti durante l’inverno. La variazione di concentrazione è stata sostanzialmente dovuta alla classe di particelle con diametro aerodinamico compreso tra 0.3 e 1 μm, (_%:141% e per PM0.3÷0.5 μm e _%: 209% per PM0.5 €1μm) dovuto soprattutto dalla presenza delle emissioni legate ai riscaldamenti domestici. E’ rimasta invece, sostanzialmente invariata la concentrazione delle particelle ultrafini, la cui presenza è fortemente legata alle sorgenti di combustione indoor e al traffico veicolare, indipendenti dal periodo dell’anno. Allo stesso modo anche la concentrazione di PM grossolano non ha subito grandi variazioni, probabilmente perche le sorgenti (polveri di provenienza naturale, pollini, spore, usura pneumatici etc.) non sono associate a fattori climatici.
Infine, sono stati riscontrati diversi livelli di esposizione fra i tre gruppi per la frazione 0.3-1 μm, probabilmente a causa della maggior tendenza dei soggetti “sani” ad effettuare attività outdoor.
Lo studio dell’associazione a particolato per la proteina C-reattiva e per il fibrinogeno, hanno mostrato che esiste un effetto statisticamente significativo dovuto alla concentrazione numerica della frazione grossolana di particolato (5÷10 μm). Le sorgenti legate a questo tipo di esposizione sarebbero quindi di tipo prevalentemente outdoor. Endotossine batteriche, pollini e spore, caratteristici di questa frazione, potrebbero essere i responsabili dell’attivazione o incremento di uno stato di infiammazione sistemica e di processi coagulatori. Inoltre, le patologie caratterizzanti i tre gruppi di soggetti, non hanno influenzato la suscettibilità al particolato.
Gli indicatori della variabilità cardiaca sono risultati influenzati dalla concentrazione numerica di particelle con diametro aerodinamico compreso tra 0.3 e 1 μm, e quindi dalla componente fine del particolato atmosferico. Questa frazione di particelle e legata a sorgenti sia indoor che outdoor e, considerato che la sua concentrazione e risultata predominante nel periodo invernale, l’esposizione della stagione fredda risulterebbe potenzialmente più nociva. Non si e riscontrata, inoltre, una diversa suscettibilità tra i gruppi di soggetti.
Dai risultati, un incremento delle concentrazioni di particolato determinerebbe un aumento della frequenza cardiaca, e una diminuzione di SDNN, traducibile, a livello clinico, in una diminuzione del controllo del sistema nervoso autonomo sulla regolazione del ritmo cardiaco e della funzionalità della bilancia simpato-vagale.
I meccanismi patogenetici compatibili con i risultati sono dunque legati all’infiammazione/ossidazione a livello polmonare, oppure ad un’azione diretta delle particelle sulle terminazioni nervose delle fibre afferenti polmonari, in accordo con la letteratura. La mancanza di un’associazione significativa con le particelle ultrafini escluderebbe l’ipotesi del passaggio diretto di questa frazione nella circolazione sanguigna.
Infine, lo studio preliminare sui tempi di latenza tra esposizione e frequenza cardiaca (per il gruppo ‘non cardiopatici-non pneumopatici’), ha indicato un effetto di tipo immediato (dell’ordine dei 5’-30’) e ritardato (circa 6-8 ore). I risultati, sebbene preliminari, trovano riscontro in quelli di altri gruppi di ricerca.
Per quanto riguarda il parametro SDNN, invece, il tipo di approccio statistico si è rivelato inadeguato alla tipologia di parametro.
Gli sviluppi futuri saranno quindi indirizzati all’approfondimento dei dati in continuo con un approccio statistico più raffinato (applicazione di modelli misti su moving averages a diversi intervalli temporali, utilizzo di smoothing functions).
Da un punto di vista prettamente ambientale, invece, si procederà con l’analisi delle concentrazioni di particolato in funzione di fattori determinanti, quali le attività dei soggetti durante il monitoraggio, le caratteristiche principali delle loro unita abitative e i livelli outdoor registrati dalla centraline ARPA più vicine