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Establishment of a new method to isolate viable X ray sensitive cells from planarian by fluorescence activated cell sorting
Get PDF学習院大学Gakushuin University博士（理学）Doctor of Scienceプラナリアは、非常に高い再生能力を持つ。これは、全身に多能性幹細胞が存在するためである。プラナリアの細胞は、多能性幹細胞のみが増殖することができ、一度分化してしまうと分裂することができない。さらに、プラナリア多能性幹細胞は、Ｘ線照射によって特異的に消滅するＸ線感受性細胞である。プラナリア多能性幹細胞に焦点を当てた研究は長年行われていたが、多能性幹細胞を精製する方法は遠心分離やフィルターによるろ過にもとづいていたため、死細胞や消化液によるダメージがあり細胞培養や分子解析に適した細胞を得ることができなかった。2006年、林らがFACS(セルソーター)による多能性幹細胞の精製方法を開発したことにより、プラナリア多能性幹細胞の分子レベル、細胞レベルでの研究が飛躍的に進んだ。この方法では、プラナリア多能性幹細胞が盛んに増殖しているためにDNA量が多く、未分化な細胞のため細胞質が少ないという特徴を利用している。核をHoechst 33342、細胞質をCalcein AMにより蛍光染色し、Ｘ線未照射個体とX線照射個体のFACSプロファイルを比較することにより、Ｘ線感受性細胞の分画を特定した(Hayashi et al., 2006)。特にDNA量が多いＸ線感受性分画は、Ｘ1フラクションと命名された。その後、UVレーザーを使わずに精製できる方法として、DRAQ5による核染色を利用した方法が開発された(Peiris et al., 2016)。FACSを用いてプラナリア多能性幹細胞を精製できるようになったが、精製後の多能性幹細胞を培養して増殖させることは未だ成功例はない。本研究で使用しているプラナリアDugesia japonicaでは、X線を照射して多能性幹細胞を特異的に消去した個体に精製した多能性幹細胞を移植しても、移植された多能性幹細胞の増殖は確認されていない。この原因として、細胞の染色方法が挙げられる。プラナリア多能性幹細胞はDNA量を指標にしてFACSにより精製されていたため、DNAをHoechst 33342で飽和状態にすることが必要だった。そのため、一般的な染色方法よりも高濃度で長時間染色する必要があった。そこで、本研究では染色濃度と時間、染色色素の種類を検討し、より毒性の低い多能性幹細胞の精製を試みた。
まず、染色色素の毒性を評価した。ここでは、細胞増殖への影響を比較することで毒性の評価を行った。精製したプラナリア多能性幹細胞を培養して増殖させることができていないので、前駆細胞のモデルとしてラット副腎褐色細胞腫由来のPC12と、多能性幹細胞のモデルとしてマウスES細胞であるEB5を使用した。従来の染色方法である、核をHoechst 33342(32 µＭ)およびDRAQ5(5 µＭ)、細胞質をCalcein AM(0.5 µg/mlおよび0.4 µg/ml)でPC12とEB5を染色した結果、増殖率が低くなり毒性が高いことがわかった。細胞質の蛍光色素であるCalcein AMの単染色をした細胞は、無染色の細胞と同様に増殖したことから、毒性が低いことが示唆された。一方で核の染色色素については、従来の染色濃度より低い濃度を使用しても、また、毒性が低いとされているDyeCycleという染色色素を使用しても毒性があることが判明した(PC12とEB5のどちらに対してもHoechst 33342が最も毒性が低く、次いでDyeCycle、DRAQ5の順に毒性が低かった)。ただ、最も毒性の低かったHoechst 33342の濃度を低くしたところ、多能性幹細胞であるEB5は低濃度のHoechst 33342による核染色が細胞の増殖に全く影響しなかった。この結果から、プラナリア多能性幹細胞を精製する染色方法として、低濃度のHoechst 33342単染色あるいはCalcein AM単染色が候補に挙がった。
低濃度(1, 3, 5, 10 µＭ)のHoechst 33342でプラナリアの細胞を染色し、FACSのプロファイルを確認したところ、従来のプロファイルとは異なり、Hoechst 33342の強度が強いところにX線感受性細胞は見当たらず、逆にHoechst 33342強度が低く細胞の大きさが大きい分画にＸ線感受性細胞が濃縮されていることがわかった(幹細胞は色素をポンピング作用で吐き出す活性が高いことが知られている)。これらのＸ線感受性分画の細胞を集め、従来のHoechst 33342/Calcein AM染色を行うことで、低濃度のHoechst 33342染色法を用いて得られたX線感受性細胞の分画に含まれる細胞が、従来のX1フラクションに分画される割合を調べた。その結果、各濃度で約80～90％のＸ1フラクション細胞を含むことが分かった。そこで、一番濃度の低い1 µＭHoechst 33342染色が精製に適していると考え採用した。
また、Calcein AM単独でプラナリア細胞を染色し、FACSのプロファイルを確認した。プラナリア多能性幹細胞は、X線を照射すると消失し、細胞質が少ないという特徴があるため、X線で消失するCalcein AMの強度が低い分画を選んだ。さらに細胞の大きさが小さい分
画(XS)と大きい分画(XL)に分けてそれぞれの細胞を集めた。その後、従来のHoechst 33342/Calcein AM染色を行って再度分画し、X1フラクションに分画される細胞の割合を確認した。その結果、XLフラクションには約90％のX1フラクション細胞が含まれていることがわかった。
これまでの結果から、1 µＭHoechst 33342単染色と細胞の大きさ、あるいはCalcein AM単染色と細胞の大きさを指標に精製したＸ線感受性分画には同程度のX1フラクション細胞が含まれていたことが確認できた。二つの染色方法のうちどちらがviableな多能性幹細胞の精製に適しているかについて評価するため、幹細胞マーカーであるPIWI A抗体による免疫染色を行った。こちらの結果についても1 µＭHoechst 33342染色とCalcein AM染色により精製したＸ線感受性分画には、約90%のPIWI A陽性細胞が含まれていた。
次に、各染色方法により精製したX線感受性細胞を培養し、生存率を評価した。その結果、培養から２日後までCalcein AM染色により精製したＸ線感受性細胞の生存率が有意に高いことがわかった。以上のことから、Calcein AM染色の方がviableなＸ線感受性細胞の精製に適していると結論付けた。
Calcein AM染色によって精製したＸ線感受性細胞の増殖能を確認するため、Ｘ線照射個体に移植した。X線照射個体にＸ線感受性細胞をインジェクションしてから２週間後に幹細胞マーカーであるPIWI A抗体とＭ期マーカーであるpH3抗体による免疫染色を行った。その結果、インジェクションした尾側の領域でPIWI A陽性細胞とpH3陽性細胞が移植後2週間で約3mmの範囲で広がっている様子が観察されたことから、精製したＸ線感受性細胞は増殖能を保持していることがわかった。
本研究により、Calcein AM単染色による毒性の低いX線感受性細胞の精製方法が確立された。さらに、D. japonicaでは初めてFACSで精製したX線感受性細胞をin vivoで増殖させることに成功し、移植後の多能性幹細胞の挙動についても観察することができた。application/pdfdoctoral thesi
Generative AI in English Education: ChatGPT for Enhanced Learning
Get PDFapplication/pdfThe present paper examines the recent emergence of generative AI, such as ChatGPT, and its prospective impacts on language education, presenting an overview of its potential to enhance English learning and teaching methods. Despite mixed opinions in Japan regarding the use of generative AI in educational settings, the Ministry of Education, Culture, Sports, Science, and Technology (MEXT) endorses its application, suggesting a gradual shift towards accepting and integrating such technologies into the classroom. In light of this endorsement, the present paper showcases practical applications of ChatGPT through five distinct cases, highlighting its utilization for teacher tasks such as (a) translation, (b) document creation, (c) summarization, (d) evaluation, and (e) question generation. These examples illustrate the versatility and practical benefits of ChatGPT in English educational practices. Extending beyond these present applications, the paper then discusses three prospective trends in the synergy between generative AI and English education: (a) the provision of experiential learning environments, (b) personalized learning guidance, and (c) the reduction of teacher workloads. It suggests that the integration of AI tools can lead to a paradigm shift in educational values, potentially ushering in a new era of personalized, efficient, and engaging learning experiences. Considering these future developments, the paper advocates for a balanced approach to adopting these technologies, with a focus on enriching the learning environment and empowering both educators and language learners.departmental bulletin pape
Salt Intake in Japan: Gap between the Family Income and Expenditure Survey and the National Health and Nutrition Survey
Get PDFapplication/pdf本稿では日本人の近年の食塩摂取量が減少していないわりに、主たる摂取源と考えられるしょうゆ、みそ、食塩の販売量・購入量が減少している理由について簡単なデータ分析と先行研究による文献調査を行った。概要は以下のとおり。第1に、簡単なデータ分析調査によると、販売統計（業界統計）と購入統計（家計調査）に乖離がみられる。第2に、先行研究によると、家計調査結果と栄養摂取量は整合的であると考えられるものの、各種制約上から購入統計から食塩摂取量を推計することは簡単ではない。第3に、データ分析や先行研究から、食塩摂取量と販売・購入の関係は簡単にはわからないものの、逆説的ながら、栄養調査の対象日（11月の1日）のような食生活を続けると、食塩摂取量は一気に減少、食塩摂取の目標値は一気に達成できそうとはいえるかもしれない。departmental bulletin pape
コドモ オ セイ ハンザイ セイ ボウリョク トウ カラ マモル タメ ノ ハンレキ ショウカイ セイド フィンランド ノ ハンレキ ショウカイ セイド オ フマエテ
Get PDFapplication/pdf論説departmental bulletin pape
二ホン カンシブン ニオケル チョウフク ゴケイ チョウサ 2 デンシ カシュウ トシ ブンシュウ ジョウゴ イチラン
Get PDFapplication/pdf『田氏家集』は平安前期に活躍した官人島田忠臣の漢詩二百首余りを集めた私家集である。また、『都氏文集』も同時代の官人都良香の漢詩文を集めた私家集であり、その内現在七十作品余りが伝存している。いずれも、平安前期の本邦の漢語受容の状況を窺える貴重な資料である。本稿はこの二集の全文を調査し、同字反復の形態を持つ畳語三十種（延べ三十八例）を抽出した。畳語は中国語音によって語義を構成する場合が多く、その用例を調査することで、本邦においてどの程度当時の中国語への理解が進んでいたのかを概観する資料になると考えられる。調査報告departmental bulletin pape
ゼン ブンカ ノ ブンジン ブンカ 二 タイスル ゲイジュツ ヒョウゲンジョウ ノ エイキョウ ホクソウ コウキ ノ ブンジンガ ニオケル シュキャク カンケイ 二 カンスル イチ シロン
Get PDFapplication/pdf北宋後期に、文人画は大きな転換期を迎えた。それまでの伝統的な山水樹石画のように、道の象徴とされる客体としての山水を通して主体としての作者の道への理解や憧れを表現するのに対し、北宋後期の文人画には異なる表現が登場する。蘇軾に代表される文人グループによる作品では、主体の「心」の作用が強調されていて、作者の心境によって万物を表現するというプロセスが絵画創作の理論におかれるようになる。その理論的根拠に関して、禅宗思想における主客関係に注目した。禅宗は清浄自性を絶対的な主体とし、またこの自性を衆生心と同等にすることにより、絶対的な心性は主体と客体の限界を超えており、主客合一の境地に達することができる。禅宗思想の受容により、文人は絵画創作の中で伝統的な主客関係からの突破を果たし、画かれた客体が表現しているのは、絶対主体の自性であり、衆生心を持つ宇宙全体でもある。本稿では絵画創作における主体と客体の関係を着眼点として、禅宗思想が転換期の文人画に与えた影響を検討した。研究論文departmental bulletin pape
リュウキュウツミ Accipiter gularis iwasakii ノ ハンショクキ ノ コウドウ ギノワンシ モリカワ コウエン ノ チョウサ キロク カラ
Get PDFapplication/pdf研究論文departmental bulletin pape
オンガク チョサクブツ ノ ソウサクセイ オヨビ ルイジセイ ノ ハンダン キジュン ニ カンスル イチ コウサツ
Get PDF学習院大学Gakushuin University博士（法学）Doctor of Law本論文は、音楽著作物の類似性判断について研究をするものである。音楽著作物における類似性判断に関する著名な判決として、記念樹事件がある。同事件の控訴審判決では、ドイツ著作権法旧 24 条 2 項について言及されている。同条項は、いわゆる「硬直したメロディ保護」という、メロディを特別に保護すると読める内容になっており、記念樹事件控訴審判決ではこの条項について「立法例の相違を超えて顧慮すべきものを含む」と述べている。ここから、同判決はドイツ法の影響を受けたのではないかと考えられる。以上の背景を踏まえ、本論文ではドイ ツ著作権法との比較、及び他の種類の著作物と音楽著作物の比較を行い、音楽著作物における創作性及び類似性判断における妥当な基準、運用について論じていくものとする。application/pdfdoctoral thesi