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Calciumphosphat-Nanopartikel für die Transfektion zur Synthese biologisch aktiver Proteine und zur Gen-Stummschaltung
No full textIn dieser Arbeit wurden Calciumphosphat-Nanopartikel und Calciumphosphat-Nanostäbchen als Nukleinsäure-Träger für die Transfektion von eukaryotischen Zellen untersucht. Es wurde gezeigt, dass die Zugabe des positiv geladenen Polymers Polyethylenimin (PEI) zu den Nukleinsäure-funktionalisierten Calciumphosphat-Nanopartikeln zu einer hohen Transfektionseffizienz führte. Die positiv geladenen Calciumphosphat-Nanopartikel und Calciumphosphat-Nanostäbchen übertreffen die negativ geladenen Partikel in der Transfektionseffizienz. Eine hohe Effizienz wurde sowohl bei der Transfektion als auch bei der Gen-Stummschaltung beobachtet. In-situ-Beobachtungen von mit Calciumphosphat-Nanopartikeln transfizierten Zellen wurden durchgeführt. Die Ergebnisse der time-lapse Mikroskopie zeigen, dass die Expression des hineingetragenen Gens für aktiv teilende Zellen mit der Mitose verknüpft sind. Weiterhin wurden die hBD-3-kodierender-DNA funktionalisierte Calciumphosphat-Nanopartikel hergestellt. Die Produktion von Defensin konnte nach der Transfektion im Zellkulturmedium mit Hilfe von ELISA nachgewiesen werden. Es wurde an unterschiedlichen Zelllinien in-vitro-Transfektionsuntersuchungen mit Calciumphosphat-Nanopartikel und -Nanostäbchen, die mit BMP-7- und VEGF-A-kodierender DNA funktionalisiert wurden, durchgeführt. Die Transfektion führte zur Produktion von BMP-7 und VEGF-A, was durch ELISA gezeigt werden konnte. Die beschriebenen DNA-funktionalisierten Calciumphosphat-Nanopartikel und Calciumphosphat-Nanostäbchen stellen vielversprechende Kandidaten für die Anwendung in weiteren in-vivo-Experimenten in Tier-Modellen und im Bereich der biologisch aktiven Knochenersatzmaterialien dar
Emission of electron-electron and electron-positron pairs from solid surfaces due to electron or positron impact
No full textThe present theoretical work deals with the emission of correlated
electron-electron and electron-positron pairs from crystalline surfaces
induced by the collision of a low-energy primary electron or positron
with a valence electron. For short, these two processes are referred to
as (e,2e) and (p,ep), respectively.
In generalization of earlier theory, an (e,2e) formalism has been
developed, which incorporates spin-orbit coupling and exchange in
ferromagnets on an equal footing. The basic ingredients are
single-particle states, which are solutions of a Dirac equation with an
effective magnetic field. From these states, two-electron states are
obtained, which are correlated by exchange and Coulomb interaction. The
spin-dependent (e,2e) reaction cross section is then expressed as the
transition probability between an initial and a final two-electron
state. While of course already applicable to (e,2e) from nonmagnetic
systems as a special case, the theory has been extended to handle
positron-induced electron-positron emission (p,ep).
The formalism was implemented in a computer code and numerical results
were obtained for several selected crystalline surface systems. The
quasiparticle potential input required for these computations was
obtained by firstly performing, within density functional theory, an ab
initio calculation of the ground state of the system and secondly
augmenting the resulting real potential by a complex self-energy
correction. This quasiparticle potential was also used to calculate
spin- and layer-resolved densities of states (spectral functions), which
are very valuable for the interpretation of the calculated pair emission
spectra.
A comparative study of (e,2e) and (p,ep) was carried out for the Cu(111)
surface. As a consequence of the opposite sign of the Coulomb
interaction, the most outstanding difference appears in angular
distributions of the two emitted particles with equal energies. While
for (e,2e) there is a central depletion zone (exchange-correlation
hole), the (p,ep) distributions exhibit a central accumulation zone
(correlation hill). At larger angles sharp features arise from
single-particle surface resonances.
In conjunction with experimental work at the Max-Planck-Institut für
Mikrostrukturphysik in Halle, spin-dependent (e,2e) angular and energy
distributions were calculated for the ferromagnetic Fe(001) surface.
They are analyzed with the aid of the spin-, momentum-, symmetry- and
layer-resolved valence electron density of states. The observed spectra
are found to arise almost completely from only three surface-parallel
atomic layers. Momentum distributions for parallel spins of the emitted
electrons exhibit an exchange-correlation hole, which is larger than the
correlation hole in the antiparallel spin case. By comparing
experimental antiparallel-spin pair spectra with their theoretical
counterparts an effective screening strength of the Coulomb interaction
in the surface region is determined.
A similar separation of Coulomb correlation and exchange effects in
(e,2e) is possible, if the valence electron is in a recently discovered
spin-polarized surface state on the nonmagnetic W(110) surface. Further,
(e,2e) can achieve a spin-resolved mapping of the dispersion of this
state with surface-parallel momentum.
As a prototype case, for which spin-orbit coupling effects are
comparable in size to magnetic exchange effects, the ferromagnetic
surface system Co/W(110) has been chosen. (e,2e) spectra are presented
together with the underlying spin- and layer-resolved valence electron
spectral density. More detailed insight is provided by calculations, in
which spin-orbit coupling was selectively switched off for the valence
electron and for the primary and emitted electrons. The theoretical
results are in overall agreement with experimental data. Furthermore,
sizable magnetic dichroism is predicted.Emission von Elektron-Elektron- und Elektron-Positron-Paaren aus Festkörperoberflächen infolge eines Elektronen- oder Positronen-Beschusses
Die vorliegende theoretische Arbeit behandelt die Emission von
korrelierten Elektron-Elektron und Elektron-Positron Paaren aus
kristallinen Oberflächen induziert durch den Stoß eines
niederenergetischen primären Elektrons oder Positrons mit einem
Valenzelektron. Diese beiden Prozesse werden kurz als (e,2e)-Prozess
bzw. (p,ep)-Prozess bezeichnet.
In Verallgemeinerung einer früheren Theorie wurde ein (e,2e)-Formalismus entwickelt, der Spin-Bahn-Kopplung und Austausch in Ferromagneten auf gleicher Stufe behandelt. Die grundlegenden Bestandteile sind Einteilchenzustände, die Lösungen einer Dirac-Gleichung mit effektivem Magnetfeld sind. Aus diesen Zuständen werden Zweiteilchenzustände gewonnen, die durch Austausch und Coulomb-Wechselwirkung korreliert sind. Der spinabhängige (e,2e)-Wirkungsquerschnitt wird dann ausgedrückt als Übergangswahrscheinlichkeit zwischen einem
Zweiteilchen-Anfangszustand und einem Zweiteilchen-Endzustand.
Neben der Anwendbarkeit auf (e,2e) von nichtmagnetischen Systemen als Spezialfall, wurde die Theorie so erweitert, dass auch die Positronen-induzierte Elektron-Positron Emission (p,ep) behandelt werden kann.
Der Formalismus wurde in ein Computer-Programm umgesetzt und numerische Ergebnisse für einige ausgewählte kristalline Oberflächensysteme erzeugt. Das für die Rechnungen benötigte Quasiteilchen-Potential erhält man im Rahmen der Dichtefunktional-Theorie aus ab-initio Berechnungen des Grundzustands des untersuchten Systems, ergänzt durch eine komplexe Selbstenergiekorrektur.
Eine vergleichende Untersuchung von (e,2e) und (p,ep) wurde für eine Cu(111)-Oberfläche durchgeführt. Wegen des entgegengesetzten Vorzeichens der Coulomb-Wechselwirkung zeigt sich der auffallendste Unterschied in Winkelverteilungen für auslaufende Teilchen mit gleichen Energien. Während es für (e,2e) einen zentralen Bereich verminderter Intensität gibt (Austausch-Korrelations-Loch), zeigt die (p,ep)-Verteilung einen zentralen Bereich erhöhter Intensität (Korrelations-Hügel). Für größere Winkel zeigen sich aufgrund von Oberflächenresonanzen scharfe Strukturen.
Im Zusammenhang mit Experimenten am Max-Planck-Institut für
Mikrostrukturphysik in Halle wurden spinabhängige Winkel- und
Energieverteilungen der (e,2e)-Spektren für die ferromagnetische Fe(001) Oberfläche berechnet. Diese wurden analysiert mit Hilfe von spin-, impuls-, symmetrie- und lagenaufgelösten
Valenzelektronen-Zustandsdichten. Es stellt sich heraus, dass die
gefundenen Intensitätsverteilungen fast vollständig durch die Emission
aus den drei obersten oberflächenparallelen Atomlagen festgelegt sind.
Impulsverteilungen für parallele Spins der auslaufenden Elektronen
zeigen ein Austausch-Korrelations-Loch, welches größer ist als das
Korrelations-Loch für den Fall antiparalleler Spins. Durch Vergleich der
experimentellen Intensitätsverteilungen für antiparallele Spins mit den
theoretischen Ergebnissen wurde eine effektive Abschirmlänge der
Coulombwechselwirkung im Oberflächenbereich bestimmt.
Der Einfluss von Coulomb-Korrelation und Austausch-Wechselwirkung auf die (e,2e)-Spektren wurde desweiteren an einem kürzlich entdeckten spin-polarisierten Oberflächenzustand in der nichtmagnetischen W(110)-Oberfläche untersucht. Zusätzlich konnte aus den berechneten (e,2e)-Spektren die Dispersion E(k_parallel) des Oberflächenzustands gewonnen werden.
Als System, für das magnetischer Austausch und Spin-Bahn-Kopplung von gleicher Größenordnung sind, wurde Co/W(110), d.h. Kobalt, adsorbiert in wenigen Monolagen auf eine W(110) Oberfläche, ausgewählt. Hierfür werden (e,2e)-Intensitätsverteilungen zusammen mit den zugrundeliegenden spin- und lagenaufgelösten Zustandsdichten gezeigt. Detailliertere Einsicht
wird durch Rechnungen gewonnen, bei denen die Spin-Bahn-Kopplung
selektiv bei dem Valenzelektron, bei dem einfallenden Elektron und bei
den auslaufenden Elektronen abgeschaltet wird. Die theoretischen
Ergebnisse sind allgemein in guter Übereinstimmung mit den
experimentellen Daten. Darüberhinaus lässt sich ein beträchtlicher
magnetischer Dichroismus voraussagen
Zweisprachigkeit, Schulerfolg und Integration von Migrantenkindern mit polnischsprachigem Hintergrund
No full textDer Schulerfolg von Migrantenkindern wird als ein wichtiger Indikator für die Integration angesehen. Der Fokus der Integrationsdebatte liegt in diesem Zusammenhang auf dem über dem Durchschnitt liegenden schulischen Misserfolg einiger Migrantengruppen. Ethnische Gruppen, die sich in Deutschland gut integriert haben, werden in dem Integrationsdiskurs nur wenig beachtet. Schlüssige Erklärungen für ethnische Differenzen konnten in der einschlägigen Forschung bisher nicht gefunden werden.
In der vorliegenden Studie werden die Ursachen für den Schulerfolg von Kindern und Jugendlichen mit polnischsprachigem Hintergrund untersucht. Für den Unterschied zwischen den polnischen Zuwanderern, die den deutschen Schülern vergleichbare Schulabschlüsse erreichen, und anderen ethnischen Gruppen ist nach den Ergebnissen der vorliegenden Disserationsstudie das Bildungsniveau der Mutter der entscheidende Faktor.
Auch die Frage nach der Bedeutung der Muttersprache der in Deutschland lebenden Migranten für den Erwerb des Deutschen als Zweitsprache und den Schulerfolg wird von den Forschern unterschiedlich beantwortet. In der vorliegenden Studie gibt es keine Anzeichen dafür, dass der Erhalt der Muttersprache für die Kinder eine kognitive Belastung darstellt. Die Aufgabe der Muttersprache bringt den potenziell polnischsprachigen Kindern keine Vorteile bei der schulischen Integration, sondern nur den Verlust der Zweisprachigkeit
Disorder patterns (models) in the child and juvenile psychiatric therapy. Impact of disorder patterns on the course of the therapy.
No full textDas Ziel der vorliegenden Untersuchung war, herauszufinden, wie naive und professionelle Störungsmodelle, die im Rahmen der Kommunikation in der kinder- u. jugendpsychiatrischen Behandlung offenbar werden, zusammenwirken und den Kommunikationsprozess gestalten. Im Zentrum der Analyse stand dabei nicht die Wahrheit oder wissenschaftliche Richtigkeit der geäußerten Störungsmodelle, sondern deren Eigenschaften und Auswirkungen auf die Kommunikationsprozesse im Rahmen der kinder- und jugendpsychiatrischen Behandlung. Es wurde eine systemtheoretische Untersuchungsperspektive eingenommen, in der die Analyseeinheit (Fall) nicht eine spezifische Person, sondern die in der Behandlung einer Patientin anfallenden Kommunikationen, die mit Störungsmodellen in Verbindung standen, waren.
Auf der Basis eines heuristischen Rahmenmodells, in dem Störungsmodelle als Entschlüsselungsversuche von störendem Verhalten angesehen werden, mit dem dieses der Kommunikation zugänglich gemacht wird, wurde überprüft, inwieweit sich formale oder inhaltliche Eigenschaften der Störungsmodelle auf die Kommunikation auswirken. Dabei wurde die Interaktion der Störungsmodelle der Beteiligten untersucht.
Für die Untersuchung wurden in einem ersten Schritt mit einer an der rekonstruktiven Sozialforschung orientierten Strategie Störungsmodelle in den vollständig anonymisierten Therapiemitschriften identifiziert und in einer Tabelle zusammengefasst, die diese in ihrem chronologischen Verlauf, kategorisiert nach genannten Symptomatiken und Autoren darstellt. Diese Tabelle diente im weiteren Verlauf als Basis für die Analyse. In der Voruntersuchung wurden 6 Fällen in einem vollständig datengesteuert Verfahren analysiert. Dabei wurde auf die in der Voruntersuchung aufgestellten Hypothesen fokussiert, dass nicht inhaltliche, sondern formale Aspekte dieser Störungsmodelle (z.B. Passung) eine wichtige Rolle in der Strukturierung des Kommunikationsprozesses inne haben. Die Auswirkung der Störungsmodelle auf den Kommunikationsprozess wurde vor dem Hintergrund der asymmetrischen Eltern-Kind Beziehung, sowie in Begriffen von Loyalität und Bindung diskutiert. Auch unterschiedliche Wahrnehmungen von als Symptom beschriebenen Verhaltensweisen, deren Einbettung in familiäre Konfliktstrukturen, sowie deren Kommunikation in offener und verdeckter Form spielten dabei eine Rolle. Der Aspekt der Unbestimmtheit von Symptomen des Verhaltens und Erlebens von Kindern und Jugendlichen bezüglich deren Ursachen wurde dabei als rahmengebend herausgestellt.
Im zweiten Untersuchungsschritt (Hauptuntersuchung) wurden theoriegeleitet anhand der Methode des zufallsgesteuerten Fallvergleichs gut erprobte sozialpsychologische Konstrukte an die Daten angelegt, z.B. aus der Dissonanztheorie, Attributionstheorie oder der Theorie der psychologischen Reaktanz, um für die Störungsmodelle relevante Beschreibungsdimensionen zu explorieren, mit denen sich die in der Voruntersuchung konkretisierten Hypothesen überprüfen ließen. Diese Beschreibungsdimensionen sollten die Erkennung von Mustern in den störungsmodellbezogenen Kommunikationen ermöglichen.
In einem nächsten Schritt wurde versucht, anhand der Fallvergleiche die 14 Fälle zu Typen zu klassifizieren. Es kristallisierte sich in den auf sozialpsychologischen Konstrukten beruhenden Analysen heraus, dass ein attributionaler Ansatz für die Klassifizierung fruchtbar ist, der auf den Gedanken von Weiner beruht und die Störungsmodelle der verschiedenen Akteure in ein 2 x 2 Schema kategorisiert, das aus den Dimensionen Externalität / Internalität und Kontrollierbarkeit / Nicht-Kontrollierbarkeit gebildet wird. Die Unterscheidung von kontrollierbaren und unkontrollierbaren Attributionen für den Bereich der internalen Attribution wurde im Rahmen der vorliegenden Untersuchung auf den Bereich der externalen Attributionen ausgedehnt. Auf der Basis dieser Analyse konnten dann Typen gebildet werden, die insbesondere die Konfliktstruktur, die mit den Attributionen verbunden ist, abbilden.
Im Laufe der Analyse wurde eine Klassifikation der einzelnen Fälle zu 4 Typen vorgenommen, die verschiedene Attributionsabfolgen, bzw. Konfliktmuster beinhalteten. Diese Typen wurden als „Kampf um Autonomie“, „Beschuldigung eines Außenfeindes“ , „Kampf um Bindung“ und „Kampf um familiäre Verantwortung“ bezeichnet. 12 der 14 Fälle der Hauptuntersuchung konnten dabei einem dieser Typen zugeordnet werden. Diese Typen bestanden in charakteristischen Störungsmodell-Kommunikationen, die über den Zeitverlauf eine bestimmte Struktur zeigten (z.B. Polarisierung, Fokusverschiebung). Es handelte sich dabei um Konfliktmuster, die die Falldynamik erklärbar machten und die die Interaktionen strukturierten. Der zentrale Konflikt (z. B. zwischen internal-unkontrollierbaren und internal-kontrollierbaren Attributionen im Falle des Typs „Kampf um Bindung“) zeigte sich zwischen verschiedenen Akteuren, aber auch innerhalb einer Person durch eine Ambivalenz oder Oszillation. Die Konflikttypen wurden in Bezug auf ihre Bedeutung im Therapieprozess diskutiert.
Die in der Voruntersuchung gewonnene Hypothese, dass strukturelle und nicht inhaltliche Merkmale der Störungsmodelle eine wichtige Rolle im psychiatrischen Kommunikationsprozess spielen, konnte teilweise bestätigt werden. Dies aber nicht wie ursprünglich angenommen als Passungsaspekt, sondern als Aspekt der Komplementarität von spezifischen Attributionsmustern, die sich in den Konflikttypen zeigten. Neben dieser formalen Dimension war aber auch ihre inhaltliche Dimension von Bedeutung, da sie Aufschlüsse über Reaktanz fördernde Eigenschaften der jeweiligen Attributionen dadurch gab, dass sie Handlungsoptionen der Beteiligten mehr oder weniger einschränkte. Auch Bindungs- und Autonomieprozesse waren inhaltliche Aspekte, die in der Analyse von Bedeutung waren.The aim of the present study was to find out how naive and professional disorder patterns (models) that have become apparent in the child and juvenile psychiatric therapy, interact and affect the communication process. However, the focus of the study was not the truth or scientific correctness of the disorder patterns described, but their characteristics and effects on the communication processes within the child and juvenile psychiatric therapy. A system theoretical point of view has been adopted where the unit of exploration (case) was not a specific individual, but the disorder pattern related communications resulting from the therapy of a patient.
Based on a general heuristic model where disorder patterns are considered as being attempts to understand distressing behaviour made accessible to communication, it has been checked to what extent any formal or content related characteristics of the disorder patterns have an impact on communication, thereby investigating the interaction of the involved persons' disorder patterns.
In a first step, disorder patterns have been identified in entirely anonymized therapy notes by using a strategy that is based on the reconstructive social research. These disorder patterns have then been summarized in a chart, represented in chronological order and classified by the mentioned symptoms as well as by authors. That chart subsequently served as a basis of the study. In a preliminary exploration, six cases have been analyzed in an entirely data controlled process, thereby focusing on the assumptions made in the preliminary exploration, i.e. that not content-based but formal aspects of the disorder patterns (e.g. match) play an important role in structuring the communication process. The effects of the disorder patterns on the communication process have been discussed in the background of an asymmetric parent-child relationship as well as in terms such as loyalty and attachment. Furthermore, any different perceptions of behaviours described as being symptoms, their inclusion in familial conflict structures as well as their communication in open and latent forms have been of major importance. The aspect of indeterminate symptoms of children's and juveniles' behaviours and experience in relation to their causes has thereby being the underlying basis.
In a second step (main study), well-proven social psychological constructs were applied to the data by using the random case comparison method, e.g. from the dissonance theory, attribution theory or the theory of psychological reactance, in order to explore appropriate descriptive dimensions for the disorder patterns which were used to check the hypotheses defined in the preliminary study. These descriptive dimensions were to enable the identification of patterns in the disorder pattern (models) related communications.
The next step was to try, based on the case comparisons, to classify the fourteen cases by types. It had become apparent in the analyses based on the social psychological constructs, that such attributional approach for classification is very useful that is based on Weiner's notions and which classifies the different participants' disorder patterns into a 2 x 2 scheme, formed from the dimensions of externality / internality and controllability / uncontrollability. The differentiation of controllable and uncontrollable attributions for the internal attribution has been extended to external attribution as well. Based on that study, types could be formed that especially represent the conflict structure which is associated with the attributions.
The individual cases were then classified into four types containing different attributional sequences and conflict patterns. These types were defined as "fight for self-determination", "accusation of an external opponent", "fight for attachment" and "fight for familiar responsibility". Twelve out of fourteen cases could thereby been assigned to one of these types. These types consisted in characteristic disorder pattern communications that showed a specific structure over time (e.g. polarisation, shift of focus). These were conflict patterns explaining the case dynamics and structuring interactions. The essential conflict (e.g. between internal-uncontrollable and internal-controllable attributions as for the "fight for attachment") was divulged between different participants, but also within a person by his ambivalence or oscillation. The types of conflict have been discussed in relation to their importance in the therapeutic process.
The hypothesis confirmed in the preliminary study, i.e. that any structural and non-content characteristics of the disorder patterns play a significant role in the psychiatric communication process, could, to some extent, be substantiated. However, this was not the case under a matching aspect, as originally assumed, but as an aspect of complementarity of different attribution patterns displayed in the types of conflict. In addition to that formal dimension, its content-specific dimension was significant as well, since it provided key information on characteristics promoting the reactance of the respective attributions by, more or less, restricting the participants' course of action. Also, attachment and self-determination processes were part of the content-related aspects which were of specific importance in the study
Reprogramming of somatic common marmoset (Callithrix jacchus) cells towards pluripotency
No full textDa iPS Zellen in jeden Zell- oder Gewebetyp differenziert werden können, der für eine autologe Transplantation benötigt wird, wären induzierte pluripotente Stammzellen in der regenerativen Medizin von großem Nutzen. Daher ist es sinnvoll, zur Erforschung der Generierung (und späteren Differenzierung) von iPS Zellen Tiermodelle einzusetzen, die näher mit dem Menschen verwandt sind als das üblicherweise verwendete Mausmodell. Deshalb war es Ziel der vorliegenden Arbeit, adulte Hautfibroblasten des Weißbüschelaffen (Callithrix jacchus) in iPS Zellen zu überführen. Da zu Beginn der Forschungsarbeiten keine Veröffentlichungen zur Reprogrammierung von Callithrix jacchus Zellen vorlagen, wurden die verwendeten Methoden aus etablierten Praktiken in der Forschung an Menschen- und Mauszellen abgeleitet und dem Affenmodell angepasst. Dabei wurden unterschiedliche lentivirale Methoden und Reprogrammierungs-bedingungen getestet. Die Zellen wurden einerseits mit einem polycistronischen Vek-tor, der die cDNA der humanen Yamanaka-Faktoren OCT4, KLF4, SOX2 und MYC koexprimierte, transduziert. Andererseits wurde der Reprogrammierungsprozess mit separaten Vektoren initiiert, mit Hilfe derer die genannten Faktoren einzeln in die Zelle eingebracht wurden. Weitere Ansätze wurden unter Hinzunahme eines LIN28A-Expressionsvektors durchgeführt. Zur Unterstützung des Reprogrammierungspro-zesses wurden sogenannte Small Molecules zu den Zellen gegeben, die epigenetische Blockaden beseitigen oder Signaltransduktionswege aktivieren oder inhibieren.
Allerdings konnten nur partiell reprogrammierte Zellen (piPS) generiert werden, die auch durch die Verwendung von Small Molecules nicht in vollständige iPS Zellen über-führt werden konnten. Die generierten Kolonien zeigten allerdings Charakteristika pluripotenter Zellen. So exprimierten sie die Alkalische Phosphatase und wurden positiv auf SSEA3- und SSEA4-exprimierende Zellen getestet. Dabei exprimierten aber nur wenige Zellen die Marker TRA-1-81 oder TRA-1-60. Die Analyse der endogenen pluripotenzassoziierten Transkripte in den piPS Zellen mittels qRT-PCR zeigte hingegen, dass diese Gene auf ein höheres Level als in den Fibroblasten induziert wurden. Allerdings wurde je nach Methode nur eine mit ES Zellen vergleichbare Expression von SOX2, MYC und ZFP24 oder KLF4 gemessen; die Hochregulation von POU5F1 war dabei stets unzureichend. Zudem wurde der retrovirale Vektor in den piPS Zellen nicht stillgelegt. Die Hauptkomponentenanalyse (PCA), die auf einer globalen Transkriptomanalyse aufbaut, zeigte, dass die piPS Zellen eine miteinander vergleichbare Genexpression aufwiesen. Im Vergleich zu ES Zellen zeigten sie zwar deutliche Unterschiede, ihre Transkriptome waren diesen aber ähnlicher als denen der Hautfibroblasten.
Auch wenn die somatischen Weißbüschelaffenzellen nicht vollständig reprogrammiert werden konnten, können die generierten piPS Zellen für die Identifizierung transkriptioneller und epigenetischer Veränderung sowie aktiver und inhibierter Signalt-ransduktionswege während der unterschiedlichen Stadien des Reprogrammierungsprozesses eingesetzt werden. Aufbauend auf den Ergebnissen dieser Arbeit könnte in weiteren Forschungen versucht werden, Keratinozyten mit sechs Faktoren auf separaten Vektoren zu transduzieren. Die epithelialen Zellen könnten möglicherweise effizienter reprogrammiert werden, da sie die MET nicht durchlaufen. Auch wenn der polycistronische Vektor zu besseren Reprogrammierungsergebnissen führte, können mit separaten Vektoren mehr als vier Faktoren in die Zellen transduziert werden.Induced pluripotent stem cells (iPSCs) are attractive for regenerative medicine because they can be differentiated towards any somatic cell type and tissues needed for autolo-gous transplantation. It would be desirable to test the medical applicability of this notion in a relevant animal model system which is more closely related to humans than the commonly used mouse model is. Thus the non-human primate common marmoset (Callithrix jacchus) is a suitable choice. The major aim of this thesis was to reprogram dermal fibroblasts of the marmoset monkey towards iPSCs. Because the conditions for reprogramming marmoset cells were illdefined at the beginning of this research project, different lentiviral approaches and reprogramming conditions were used. Thus the somatic cells were transduced with a polycistronic vector, co-expressing the cDNAs for human OCT4, KLF4, SOX2 and MYC (Yamanaka factors). Furthermore the reprogramming process was initiated with separate vectors, each coding a Yamanaka factor together with a different fluorescence protein. In further approaches these were additionally combined with a LIN28A-expression vector. To overcome possible epigenetic roadblocks due to remaining DNA-methylation or to activate or inhibit signaling trans-duction pathways, which are supportive for pluripotency, small molecules were added to the cells.
However, the marmoset skin fibroblasts could not be fully reprogrammed with all the different approaches. Even the use of various small molecules did not yield to fully reprogrammed cells. Indeed the obtained colonies showed some hallmarks of pluripotency. They expressed alkaline phosphatase and stained positive for the pluripotency markers SSEA3 and SSEA4, but they were mostly negative for TRA-1-81 and TRA-1-60 expression. Analysis of endogenous pluripotency associated gene transcription by qRT-PCR showed that these genes were significantly induced above levels of unmanipulated fibroblasts. However, depending on the approach, only SOX2, MYC and ZFP24 or KLF4 expression was comparable between the partial iPSCs (piPSCs) and marmoset embryonic stem cells (ESC). Beyond that especially the up regulation of POU5F1 expression was insufficient. Noteworthy, they also failed to silence retroviral vector expression, a phenomenon normally observed during successful pluripotency induction in human and mouse cells. Furthermore, global transcriptome measurements by RNA-seq and subsequent principle component analysis (PCA) revealed that the generated piPS cells showed comparable gene expression among each other but still different from marmoset ESCs. However, they were much more similar to the ESCs than to the skin fibroblasts indicating their partially reprogrammed state.
Thus piPSCs are not fully reprogrammed they are very powerful to identify transcrip-tional and epigenetic changes as well as active and inhibited signal transduction path-ways during the different stages of the reprogramming process. However, the findings of the piPSC analyses will certainly help to find better ways for an efficient and complete reprogramming of somatic marmoset cells. One could consider transducing kerationcytes with six factors on six separate vectors. The epithelial cells could possibly be reprogrammed more efficiently, because they do not have to pass the MET. Alt-hough the polycistronic vector led to better results, only separate vectors are suitable to transduce cells with more than four factors
Tissue Engineering des Harnleiters: Entwicklung eines Bioreaktorsystems und die anschließende Charakterisierung der gezüchteten Biohybride
No full textHeutzutage betreffen 1-2,5% der Verletzungen des Urogenitaltraktes die Harnleiter und führen dort zu ernsthaften Beeinträchtigungen der Harnableitung. Die derzeit klassischen rekonstruktiven Operationstechniken sind zwar in der Lage bis zu 15 cm eines geschädigten Harnleiters wieder herzustellen, jedoch ist dies von der Position der Verletzung abhängig. Eine aufwendigere Technik, mit einem Darminterponat, welches deutlich längere Strecken überbrücken kann, ist auch mit postoperativen Begleiterscheinungen behaftet. Zu diesen Begleiterscheinungen zählen unter anderem Verengungen, Kalzifizierungen, oder auch übermäßige Schleimproduktion.
Die vorliegende Dissertation präsentiert einen neuen Ansatz zum Harnleiterersatzes mit Hilfe des Tissue Engineerings. Zu diesem Zweck wurde ein Bioreaktorsystem entwickelt und mit verschiedenen Trägermaterialien und Zellen getestet. Die hergestellten Biohybride bestanden aus einem natürlichen Trägermaterial (Kollagen) oder einem Kompositmaterial (Fibrin und PVDF). Dieses wurden in verschieden Kombinationen mit verschiedenen Zelltypen (Urotsa, C2C12, Fibroblasten und/oder glatten Muskelzellen) kultiviert. Zudem wurde ein mechanischer Stimulationsmechanismus zur Ausrichtung der aufgebrachten Muskelzellen etabliert.
Das Bioreaktorsystem zeigt seine Zuverlässigkeit bei der Kultivierung von Zellen in einem modular aufgebauten Bioreaktor von bis zu 2 Wochen. Die wichtigsten Kultivierungsparameter (Temperatur, pH-Wert und CO2-Konzentration) schwanken nur leicht um den Sollwert mit einer Standardabweichung von 1 °C, 0,2 (pH) und 0,3% (CO2-Konzentration). Des Weiteren zeigt das System, dass Kokultivierungen von Urotsa und C2C12 Zellen in Kombination mit einem porösen Kollagenmaterial (Optimaix 3D) möglich sind. Das Trägermaterial ist dabei nahtlos und verfügt über radial verlaufende, miteinander vernetzte Poren mit lokal variierenden Durchmessern. Das System der Mechanotransduktion baut auf einem Kyphoplastiekatheter auf und wurde an primären glatten Muskelzellen angewendet, die sich in einer Fibrinmatrix befanden. Diese Matrix wurde durch ein PVDF-Netz stabilisiert. Mechanisch stimulierte und nichtstimulierte Biohybride wurden biochemisch und mechanisch untersucht, wobei keine signifikanten Unterschiede in Bezug auf ihre Wirkung als Diffusionsbarriere (gegen Harnstoff und Kreatinin) oder der Reißfestigkeit festgestellt werden konnte. Die mechanische Stimulation führte jedoch zur Ausrichtung von glatten Muskelzellen in longitudinaler (außen) und zirkulärer (innerhalb der Fibrinmatrix) Richtung. Dies wurde durch histologische Auswertungen bestätigt.
Die Ergebnisse zeigen, dass das Bioreaktorsystem aufgrund des Stimulationsmechanismus in der Lage ist, Biohybride mit zwei verschiedenen Zellausrichtungen zu generieren. Das Potential des gezüchteten Gewebes muss in weiteren Untersuchungen, u.a. Tierversuchen, charakterisiert werden.Today, 1-2.5% of all genitourinary tract trauma affect the ureters, leading to severe impairments of the urine’s drainage. Till now, classical reconstructive surgery has the possibility to bridge up to 15 cm of damaged tissue, depending on the location. Even the “gold standard”, with intestine interposition, where longer distances can be overcome, can lead to postoperative side effects like stricture formation, calcification or excessive mucous production.
This thesis presents a new attempt for the replacement of damaged ureters by the use of tissue engineering technologies. A bioreactor system is developed for the generation of tubular biohybrids consisting of a natural and a composite biomaterial (pure collagen or fibrin and PVDF) in combination with different cell types (Urotsa, C2C12, fibroblasts and primary smooth muscle cells). A mechanotransduction is established for a mechanical stimulation and orientation of the applied cells.
The bioreactor system allows a reliable incubation of a modularly constructed bioreactor for the cultivation of mammalian cells for up to two weeks. Incubation parameters are kept in defined ranges with deviations of ≤1 °C (temperature), ≤0.2 (pH value) and ≤0.3% (CO2 concentration). Cocultivations of Urotsa and C2C12 cells are possible in combination with a porous OPTIMAIX 3D, which has radially oriented pores with varying diameters. Mechanical stimulation that is based on a kyphoplasty catheter is applied on primary smooth muscle cells that are embedded in a PVDF-supported fibrin matrix. Biochemical and mechanical evaluations reveal that there is no significant difference between a mechanically stimulated and an unstimulated prosthesis with respect to the diffusion of urea/creatinine or the rupture pressure. Histological analysis shows two distinguishable cell layers with a longitudinal alignment on the outer surface and a circular orientation in the matrix of the stimulated fibrin-based prosthesis.
It can be concluded that biohybrids can be generated in this bioreactor system with at least two different cellular orientations. These biohybrids need to be characterised in further (animal) experiments
Simulation und Planspiel in der Bauwirtschaft - Entwurf eines modulorientierten Modellierungsansatzes auf Basis von System Dynamics und dessen prototypische Implementierung in Forschung und Lehre
No full textThe development and application of simulations with the purpose to explore systems and their innate, partly dynamic structures has established itself, among others, in the areas of natural sciences, business studies and political sciences. This similarly applies to business games used in the field of further education to support understanding of complex relationships, especially in business studies. Both always have a model in common which serves as starting point for the development. Hence, the aim of this research project is the development and practical testing of a module-oriented modeling approach, which can be used both in the simulation of multi-causal and dynamic relationships on different levels of the construction industry and in educational games employed in academic and further education. Out of this primary aim, numerous research contributions emerged in the field of modeling, simulation and educational games. The successful conceptual design of a module-oriented development framework for domain specific system-dynamic libraries (SDL approach) demonstrates that it is quite reasonable and possible to connect the development of simulations and business games. Thereby, knowledge synergies are created which enable the interdisciplinary development of simulations and business games. Compared to other fields, significantly less implementations of simulations or business games exist in the construction industry. Therefore, the approach introduced here can provide a valuable contribution to promote further developments, e.g. the explanation of the risk situation of a company, the identification and evaluation of project risks, endangered operational procedures on various functional levels or to improve the understanding of the decision making process in detail.Die Entwicklung und Anwendung von Simulationen mit dem Ziel, Systeme mit ihren teils dynamischen Strukturen zu erforschen hat sich unter anderem in den Bereichen Naturwissenschaften, Betriebswirtschaftslehre und Politikwissenschaften etabliert. Ähnliches gilt für Planspiele, welche auf dem Gebiet der Weiterbildung, vor allem in in der Betriebswirtschaftslehre, zum Verständnis komplexer Zusammenhänge beitragen. Beiden gemein ist immer ein Modell, welches als Ausgangspunkt für die Entwicklung dient. Daher hat dieses Forschungsprojekt die Entwicklung und praktische Erprobung eines modulorientierten Modellierungsansatzes zum Ziel, welcher sowohl in der Simulation von multikausalen und dynamischen Beziehungen auf verschiedenen Ebenen der Bauwirtschaft als auch in Planspielen in der akademischen Aus- und Weiterbildung verwendet werden kann.
Neben diesem vorrangigen Ziel entstanden weitere zahlreiche Forschungsbeiträge auf den Gebieten Modellierung, Simulation und Planspiel. Die erfolgreiche Konzeption eines modulorientierten Entwicklungsrahmens für domänenspezifische system-dynamische Bausteinbibliotheken (SDL-Ansatz) zeigt, dass es durchaus sinnvoll und möglich ist, die Entwicklung von Simulationen und Planspielen zu verbinden. Dabei werden Synergien geschaffen, welche die interdisziplinäre Entwicklung von Simulationen und Planspielen ermöglichen. Im Vergleich zu anderen Bereichen existieren in der Bauindustrie deutlich weniger Implementierungen von Simulationen oder Planspielen. Daher kann der hier vorgestellte Ansatz einen wertvollen Beitrag liefern, um die weitere Entwicklung zu fördern. Zum Beispiel bei der Erklärung der Risikolage eines Unternehmens, der Identifikation und Bewertung von Projektrisiken oder gefährdeter Betriebsabläufe auf verschiedenen Funktionsebenen oder auch um das Verständnis für Entscheidungsprozesse im Detail zu verbessern
Investigation of the structure-property-relation of electrodes for lithium-ion batteries depending on the current collector, the binder as well as the compression and the evaluation of an ionic liquid as electrolyte
No full textEine große Herausforderung des 21. Jahrhunderts stellt die Bereitstellung von Energie unter gleichzeitiger Reduzierung der globalen Schadstoffemissionen dar. Zur Realisierung dieses Ziels sind effiziente, kostengünstige sowie umweltfreundliche Energiespeichersysteme notwendig. Lithium-Ionen-Batterien sind hierbei aussichtsreiche Kandidaten für derartige Speichersysteme.
Neben der elektrochemisch aktiven Komponente wird das elektrochemische Verhalten von Lithium-Ionen-Batterie-Elektroden durch elektrochemisch inaktive Materialien sowie durch die Elektrodenarchitektur beeinflusst. Die vorliegende Arbeit beschäftigt sich hierbei mit der Struktur-Eigenschafts-Beziehung von Lithium-Ionen-Batterie-Elektroden.
Als Anodenmaterial dient das sichere sowie hochleistungsfähige Li4Ti5O12 und als Kathodenmaterial fungiert das sichere, umweltfreundliche und kostengünstige LiFePO4. Ein guter elektrischer Kontakt zwischen der Aktivmasse und dem Stromabnehmer ist notwendig, um einen schnellen Elektronentransfer zwischen diesen beiden Komponenten zu realisieren. Um diesen Transfer zu beeinflussen, wurde die Oberfläche von den metallischen Stromabnehmern chemisch modifiziert. Mit chemischen, elektrochemischen sowie strukturaufklärenden Analysemethoden werden die Wechselwirkungen zwischen dem Stromabnehmer und der Aktivmasse als Funktion des Stromabnehmers und des Bindersystems diskutiert. Ferner wurde die Mikrostruktur von Elektroden mittels Verdichtung gezielt modifiziert. Anhand von elektrochemischen Messungen werden Schlussfolgerungen über die ionische und elektrische Leitfähigkeit in Abhängigkeit des Verdichtungsgrades gewonnen. Darüber hinaus wird der Einfluss der Primärpartikelgröße des LiFePO4 auf die Elektrodenmikrostruktur sowie auf das elektrochemische Verhalten diskutiert.
Ein weiterer Aspekt der vorliegenden Arbeit stellt die Erhöhung der Sicherheit von Lithium-Ionen-Batterien dar. Üblicherweise werden in Lithium-Ionen-Batterien Elektrolyte auf der Basis organischer Carbonate eingesetzt. Solche Carbonate sind leicht entflammbar und weisen somit ein erhebliches Gefahrenpotential auf. Um diese Gefahrenquelle zu vermeiden wird die Funktionalität der schwer entflammbaren, ionischen Flüssigkeit N-Methoxyethyl-N-methylmorpholinium Bis[(trifluoromethyl)sulfonyl]imid als Elektrolyt in Lithium-Ionen-Batterien bewertet.To ensure the energy demand and to reduce simultaneously the global pollution is one of the most important challenges within the 21st century. Low-cost, efficient as well as environmentally friendly energy storage media are essential to meet these requirements. Among these lithium-ion batteries represent one of the most promising candidates.
The electrochemistry of electrodes for lithium-ion batteries is influenced by the electrochemically active material, electrochemically inactive materials as well as by the electrode architecture. This work concerns with the structure-property relation of lithium-ion battery electrodes.
The safe and the high-power capable Li4Ti5O12 serves as anode material and the safe, environmentally-friendly and low-cost LiFePO4 acts as cathode material. A good electrical con-tact between the active mass and the current collector is crucial to realize a fast electron transfer between these two components. To influence this transfer the surface of the metallic current collectors was chemically modified. Depending on the different current collectors and on the binder system the interactions between the current collector and the active mass using chemical, electrochemical as well as optical analytical methods are investigated. Furthermore, the structure of the electrodes was intentionally modified by compressing. With the help of electrochemical measurements the ionic and the electrical conductivity of such electrodes as a function of the compression is discussed. In addition the impact of the primary particle size of LiFePO4 on the structure and on the electrochemistry is shown.
Besides these investigations safety concerns of lithium-ion batteries are pointed out. Usually the electrolytes for lithium-ion batteries are based on organic carbonates. However, such electrolytes are easily flammable resulting in a significant hazard potential. To eliminate that source of danger the functionality of the flame resistant ionic liquid N-Methoxyethyl-N-methylmorpholinium bis[(trifluoromethyl)sulfonyl]imide is evaluated as an alternative electrolyte for lithium ion batteries
Development, Implementation, and Validation of an Acoustic Emission-based Structural Health Monitoring System
No full textEntwicklung, Implementierung und Validierung eines schallemissionsbasierten Strukturüberwachungssystems
Die Strukturüberwachung eng. Structural Health Monitoring (SHM) ist ein grundlegender Prozess für die Kontrolle der Betriebssicherheit und Zuverlässigkeit von Strukturen und Bauteilen während des Betriebs. Ein Überwachungssystem soll die Strukturdegradation in einer frühen Phase erkennen und quantifizieren, um den Totalausfall zu verhindern und somit menschliche und finanzielle Verluste zu vermeiden.
Mit der wachsenden Nachfrage nach kosteneffizienten und robusten Produkten ist SHM mit besonders hohen Anforderungen konfrontiert.
Diese Arbeit befasst sich mit der Entwicklung, Implementierung und experimenteller Validierung eines innovativen SHM-Systems, das auf umfassende Weise Schädigungsmechanismen von unterschiedlichen Materialen erkennt, identifiziert und klassifiziert.
Für in-situ-Strukturüberwachung können verschiedene Methoden angewendet werden. Hier wird die Schallemissionsanalyse eng. Acoustic Emission Technik
(AET) eingesetzt. Acoustic Emission ist eine passive zerstörungsfreie Prüfund Überwachungsmethode. Sie basiert auf der Analyse elastischer Wellen, die durch freigesetzte Energie während mikrostrukturelle Änderungen wie z. B. Risse, Brüche, und Verschleiß entstehen. Unter Verwendung geeigneter Hardware und fortgeschrittener
Signalverarbeitungsverfahren können diese Wellen kontinuierlich und in Echtzeit erfasst und analysiert werden.
Die Leistungsfähigkeit und Zuverlässigkeit einer AE-basierten Schadensdiagnose sind stark abhängig von Material/Werkstoff, Konstruktion und möglichen Schadensszenarien.
Der Fokus dieser Arbeit liegt daher auf der Entwicklung einer hocheffizienten und leicht anpassbaren Field Programmable Gate Array (FPGA)–basierten Messkette
zum Abtasten und Erfassen der erzeugten AE-Signale. Neben der Verwendung von sehr leistungsfähiger Hardware ist eine zuverlässige Interpretation der AE Signale von zentraler Bedeutung. Deswegen erfordern die Entwicklung und Umsetzung von Multi-Level-Signalverarbeitungsansätzen und Mustererkennungsverfahren eine besondere Beachtung. Die experimentelle Validierung des entwickelten Systems
erfolgt durch die Untersuchungen von drei verschiedenen Materialien/Strukturen: Verschleißfeste Metallbleche, Faserverbundwerkstoff Platten und elektrochemische
Zelle. Aufgrund der Diversität der untersuchten Strukturen werden drei Verarbeitungsprozesse entwickelt. Die implementierten Algorithmen können AE-Signale
erkennen, quantifizieren und qualifizieren, so dass AE-basierte Eigenschaften identifiziert und mit den entsprechenden AE-Quellen korreliert sind. Die Diagnose konzentriert sich hauptsächlich auf die Schadenserkennung (Merkmalsextraktion), Schadensabschätzung (Merkmalsauswahl) und Schadensklassifizierung unter Anwendung von Zeit-Frequenz-Analyse, statistischen Ansätzen und überwachten Klassifikationsverfahren.
Die gewonnenen Ergebnisse zeigen eine bemerkbare Verbesserung der Identifizierung und Klassifizierung von Schadensmechanismen und beweisen die Effizienz des angewandten Multi-Level-Verarbeitungsansätze. Die vorgestellte Methodik ermöglicht eine automatisierte Zustandsüberwachung und stellt daher einen wichtigen Schritt in der Entwicklung von sicheren und zuverlässigen Strukturen
dar.In engineering, Structural Health Monitoring (SHM) is an important field of study representing a fundamental process to control the longevity and reliability of structures
during service. The objective of an SHM is to detect and quantify the structure degradation at an earlier stage. The acquisition of such information can contribute to
prevention of total failure and hence avoiding human and financial losses becomes more possible. With the growing demands for cost-efficient and robust products,
SHM is facing particularly high requirements. This thesis focuses on the development, implementation, and experimental validation of an innovative SHM system
able to detect, identify, and classify in an extensive way damage mechanisms occurring in different materials. Several techniques can be applied for in situ health monitoring. In this work, Acoustic Emission Technique (AET) is used. Acoustic
Emission is a passive nondestructive evaluation technique referring to the elastic waves generated by energy release during microstructural changes in the material.
Those changes arise as a result of mechanical and environmental stresses. Monitoring of such a conversion can be continuously done in real-time using suitable
hardware and advanced signal processing methods. The performance and reliability of an AE-based damage diagnosis approach are highly dependent on material, structure
design and the damage scenarios. Therefore, a Field Programmable Gate Array (FPGA)-based measurement chains developed for sensing and acquiring the generated
AE signals. This chain is easily adaptable to different structures and materials. It was therefore kept so far constant as possible throughout all tests conducted. Additionally
to the use of highly efficient hardware that enhance the sensing quality and the data acquisition speed, the implementation of advanced filtering techniques
with high processing accuracy is of central importance. The main objective of this thesis is to prove the function of the system developed to analyze AE waves under
different damage scenarios. For this purpose, three different materials namely wear resistant plates, laminated composite plates, and electrochemical cells are investigated.
Owing to the diversity of the studied materials, special attention is paid to the development and implementation of multilevel signal processing approach and pattern recognition methods. The processing chains are capable to detect, quantify and qualify the AE data, whereby AE-based characteristics are identified and correlated
with the corresponding AE sources. The designed diagnosis methodology concentrates/focuses on damage detection (feature extraction), damage estimation (feature selection), and damage classification by using time-frequency analysis, multilevel statistical approaches, and supervised classification methods. The results obtained show a noticeable/remarkable enhancement of the identification and classification of damage mechanisms. The efficiency of applying multilevel
processing approach is/(could be) thus proved. The methodology presented here, allows an automated structural health monitoring. Hereby, an important step forward
in future development of safe and reliable structures is represented
Sepsis: Detection of bacterial RNA by murine and human pattern recognition receptors
No full textDas Immunsystem der Vertebraten musste sich während der Evolution stetig verbessern, um sich ebenfalls stetig verändernde invasive Pathogene wie Bakterien, Viren und Parasiten als „Fremdkörper“ zu erkennen. Diese Aufgabe erfüllen Rezeptorgruppen, die sowohl membrangebunden in der Plasmamembran und im Endosom, als auch (frei) im Zytoplasma lokalisiert sind. Eine dieser Rezeptorgruppen sind die Toll-like Rezeptoren (TLR), die z. B. in der Erkennung von Gram-negativen Bakterien eine wichtige Rolle spielen. TLR2 und -4 gelten als Mediatoren der Gram-negativ induzierten Sepsispathologie. Sensoren Gram-positiver Bakterien neben TLR2 waren unbekannt. Untersuchungen von Myd88-/- und Unc93B1 defekten primären Mausmakrophagen implizierten neben fehlenden knock-out-Phänotypen für IL-1 Typ Zytokine die Involvierung eines endosomalen TLRs in die Erkennung des Gram-positiven Bakteriums Staphylococcus aureus.
Im ersten Teil meiner Arbeit wurde TLR13, für den kein Ligand beschrieben war, als Rezeptor für ein spezifisches Segment Gram-positiv bakterieller 23S rRNA identifiziert. Durch Überexpression in HEK293 Zellen, Inaktivierung per Punktmutation, knock-down per siRNA Transfektion und knock-out, wurde die TLR13 Abhängigkeit der Erkennung des 23S rRNA Segments von S. aureus bestätigt. Zur Einengung der Liganden untersuchten wir drei hochkonservierte Strukturen mit bekannten Methylierungsmotiven, namentlich SaI, SaII und SaIII, auf ihr TLR13 Aktivierungspotential hin. Lediglich SaIII, das von Bakterien am zum Adenosin 2058 homologen Adenosin methyliert werden kann, induzierte die Expression proinflammatorischer Zytokine. SaIII wurde auf 19 Nukleotide und dann auf die Konsensussequenz GACGGAAAGACC eingeengt. Lokalisiert nahe dem katalytischen Zentrum des Ribosomen wird es durch MLS-Antibiotika gebunden, was die Proteinbiosynthese blockiert. Durch Überexpressionen von Methyltransferasen (ermC und ermB) in Escherichia coli verlor die jeweilige 23S rRNA ihr TLR13-stimu-latives Potential. Zusammengefasst implizierten meine Daten TLR13 als Rezeptor für eine spezifische Sequenz innerhalb der bakteriellen 23S rRNA, deren Methylierung oder Mutation die Bindung an MLS-Antibiotika und TLR13 verhindert.
Im zweiten Projekt befasste ich mich mit der Frage, welche/r Rezeptor/en im Menschen, der lediglich TLR1-10 exprimiert, die Rolle von TLR13 als Sensor der 23S rRNA „übernommen“ hat/haben. Mononukleare Zellen (PBMC) induzierten nach Konfrontation mit Sa19 und mit der am A2058 Analogon (A7) methylierten Variante Sa19m proinflammatorische Zytokine. Auf der Suche nach einer responsiven Zelllinie identifizierte ich mit PMA 3 Tage differenzierte (3ddi) THP-1 Zellen als reaktiv im Gegensatz zu un- und 8 Tage differenzierten Zellen gegenüber Sa19. Parallel wurde ein Sa19-ähnliches Segment der mitochondriellen 16S rRNA identifiziert, namentlich BtmtD3_4, das ebenfalls stimulatorisch in Mensch-spezifischer Weise ist. Unsere Untersuchung der mRNA Expression von den dreierlei unterschiedlich differenzierten THP-1 Zellen implizierte TLR8 als möglichen Kandidaten, was durch siRNA vermittelten knock-down und die Überexpression in HEK293- und RAW246.7 Zellen erhärtet wurde. Weitere Untersuchungen von 3ddi Unc93b1-/-- sowie Tlr8-/- THP-1 Zellen unterstützten diese Daten. In THP-1 Zellen und PBMC induzierten die Total-RNA und die bakteriell- und ribosomalen 23S, 16S und 5S rRNA Fraktionen ebenfalls TLR8 abhängig proinflammatorische Zytokine. Durch die Applikation von T2.5, eines TLR2 spezifischen monoklonalem Antikörper, wurde die Responsivität von 3ddi Tlr8-/- THP-1- und Unc93b1-/- Zellen auf hitzeinaktivierten S. aureus und E. coli signifikant oder gar vollständig inhibiert. In PBMC die mit lebenden Bakterien infiziert wurden führte die Koapplikation von T2.5 und dem endosomalen Inhibitor Chloroquin zu einer ebenfalls weitgehenden Blockade der Zytokininduktion. Die erhobenen Daten schlagen die Blockade von TLR8 und -2 neben Antibiotikatherapie als therapeutischen Eingriff in den Frühphasen bakterieller Infektionen vor.
Die RIG-I-like Helikasen (RLHs) sind neben TLR eine weitere Familie von Muster-erkennungsrezeptoren (PRR). Zu den im Zytoplasma lokalisierten Rezeptoren gehört RIG-I, der als viraler RNA Rezeptor fungiert. Untersuchungen von Mitgliedern unterschiedlicher Rezeptorfamilien auf ihre Responsivität nach Konfrontation mit Bakterien identifizierten RIG-I als Sensor für Gram-negative Bakterien. Die Konfrontation von RIG-I-überexprimierenden HEK293 Zellen identifizierte die tRNA als stimulative RNA Fraktion. Die Responsivität von Unc93B1 defekten Mausmakrophagen implizierte eine TLR3, -7, -8, -9, -11, -12, und -13 unabhängige Aktivie-rung. Die punktuelle 5`-Hydrolyse der Total- und tRNA von Gram-negativen Bakterien inhibierte deren stimulatorisches Potential und implizierte eine am 5`-Ter-minus pyro- oder triphosphorylierte RNA als aktivierende Struktur. Diese Ergebnisse beschreiben RIG-I auch als Sensor für Gram-negativ triphosphorylierte tRNA und nicht lediglich von viraler RNA.The immune system of vertebrates steadily improved during evolution to recognize constantly changing invasive pathogens such as bacteria, viruses and parasites. Pattern recognition receptors (PRR) localized in the plasma- or endosomal membrane and within the cytoplasm sense invading pathogens. Toll-like receptors (TLR) are one family of PRR that detect bacteria. TLR2 and 4 are major mediators of the sepsis pathology induced by Gram-negative bacterial infection. Specific sensors of Gram-positive bacteria besides TLR2 have been uncharacterized. MyD88- and Unc93B1 dependency combined with the lack of knock-out phenotypes for IL-1 type cytokines implied the involvement of an endosomal TLR in the recognition of the Gram-positive bacterium Staphylococcus aureus.
In the first part of my work a specific segment of Gram-positive bacterial 23S rRNA was identified as ligand for the orphan receptor TLR13. The TLR13 dependent detection of S. aureus RNA was confirmed by TLR13 overexpression in HEK293 cells, knock-out, point mutation, and knock-down via siRNA. To narrow down the stimulatory sequence within the 23S rRNA, we investigated three highly conserved 23S rRNA segments with known methylation motifs, namely SaI, Sall and SaIII, and examined their potential to activate TLR13. Only SaIII containing the adenosine 2058 equivalent which confers resistance to antibiotics upon its methylation induced pro-inflammatory cytokine production. After reducing the length of SaIII to 19 nucleotides, we identified the consensus sequence GACGGAAAGACC. This sequence, located near the catalytic center of the ribosome, is bound by MLS antibiotics which blocks nascent protein growth. 23S rRNA lost its TLR13 stimulative potential by overexpression of methyltransferases (ermC and ermB) in Escherichia coli. In summary my data implied TLR13 as a receptor for a specific segment within the bacterial 23S rRNA. Methylation or mutation of A2058 prevents TLR13 recognition and binding of MLS antibiotics thereby causing escape from host surveillance and resistance, respectively.
The second project dealt with the identification of the receptor/s that substitue/s for TLR13 as a sensor of bacterial 23S rRNA, since humans express merely TLR1-10. Mononuclear cells (PBMC) transfected with SA19 and its variant Sa19m, methylated at A7 (A2058 equivalent) both induced pro-inflammatory cytokine productions. Searching for an SA19 reactive cell line, I identified THP-1 cells differentiated with PMA for 3 days (3ddi) as responsive toward Sa19, while both undifferentiated and 8 ddi THP-1 cells are refractory. The Sa19-like mitochondrial 16S rRNA segment BtmtD3_4 also stimulated PBMC. However, its immune stimulatory potential was human specific. Our examination of the mRNA expression of 3ddi THP-1 cells implied TLR8 as possible candidate which was confirmed by siRNA mediated knock-down as well as over-expression in HEK293 and RAW246.7 cells. Further investigation of 3ddi Unc93b1-/-- and TLR8-/- THP-1 cell supported these data. The bacterial total RNA and each 23S, 16S and 5S rRNA fractions induced TLR8 dependent pro-inflammatory cytokine production in THP-1 cells and PBMCs. This stimulatory effect was significantly or even completely abrogated in 3ddi Tlr8-/-- and Unc93b1-/- THP-1 cells upon pretreatment with the TLR2 specific monoclonal antibody (T2.5). PBMC infection with living bacteria pretreated with T2.5 in combination with the endosomal inhibitor chloroquine also resulted in a substantial blockade of cytokine induction. Collectively, the data suggest TLR8/-2 blockade as possible therapeutic intervention in the early stage of bacterial infection induced sepsis.
Another family of PRRs besides TLRs is the RIG-I-like helicase (RLH) family. Members of which are localized within the cytoplasm. One of their members, namely RIG-I, is a viral RNA receptor. In search for receptors recognizing bacteria we identified RIG-I as a sensor for Gram-negative bacteria. RIG-I overexpressing HEK293 cells confronted with bacterial RNA preparations identified tRNA as stimulative motiv. Also, responsiveness of Unc93B1 defective murine macrophages implied a TLR3, -7, -8, -9, -11, -12, -13 independent activation. The selective 5'-phosphohydrolysis of total and tRNA of Gram-negative bacteria inhibited their stimulatory potential and implied a 5`-pyro- or-triphosphorylated RNA as activating structure. These results describe RIG-I as a sensor not only for viral RNA but also for Gram-negative triphosphorylated tRNA