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Assessment of the impact of deregulated signal transduction pathways on the radiotherapy response of non-small-cell lung cancer
Full text linkLungenkarzinome sind weltweit die häufigste Ursache für krebs-assoziierte Todesfälle. Histologisch werden verschiedene Subtypen unterschieden, wobei etwa 85 % als nicht-kleinzelliges Lungenkarzinom (non-small cell lung cancer, NSCLC) diagnostiziert werden. Eine gezielte Bestrahlung stellt neben der operativen Entfernung des Tumors sowie der systemischen Behandlung mit Chemotherapeutika eine wichtige Methode zur kurativen Behandlung von lokal-begrenzten sowie fortgeschrittenen Tumoren dar. Darüber hinaus wird auch in der palliativen Behandlung von NSCLC Bestrahlung eingesetzt. Allerdings entwickeln sich häufig nach einiger Zeit lokale oder systemische Rezidive. Neue Forschungsergebnisse ermöglichen inzwischen eine genauere Definition von Subtypen des NSCLC auf Basis von molekularen Biomarkern. Insbesondere die Aktivierung bestimmter Onkogene bzw. onkogener Signalwege spielt hier eine Rolle und führten zur erfolgreichen Etablierung von zielgerichteten Pharmakotherapien. Im Rahmen einer Bestrahlungstherapie werden derzeit molekulare Charakteristika der jeweiligen Tumore nicht systematisch berücksichtigt, obwohl individuelle Unterschiede in Bezug auf Ansprechraten bei Bestrahlungstherapien als Hinweis auf diskrepante molekulare Konstitutionen der Tumore gewertet werden können. Validierte Biomarker für eine Korrelation mit dem Ansprechen auf eine Strahlentherapie sind bisher jedoch nicht bekannt. Daher wurden Kombinationstherapien aus Bestrahlung und sensitivierender Chemotherapie eher empirisch entwickelt.
Es wird vermutet, dass ein besseres Verständnis von aberranten Signaltransduktionswegen, die die Strahlentherapieantwort modulieren, zur Entwicklung von spezifischeren, rationalen Behandlungsprotokollen, die Strahlentherapie mit zielgerichteter Pharmakotherapie kombinieren, beitragen kann. Aus diesem Grund wurde in dieser Arbeit der Einfluss von ausgewählten Apoptose-Regulatoren, Onkogenen und Mediatoren von Signalwegen auf den Zelltod nach Bestrahlung im Rahmen eines begrenzten „screens“ untersucht.
Als eine erste Gruppe von potentiellen Biomarkern für eine Modulation der Strahlentherapieantwort wurden anti-apoptotische Mitglieder der BCL-2 Proteinfamilie identifiziert. Sowohl BCL-xL als auch MCL-1 vermittelten in A431 Zellen Resistenz gegenüber Bestrahlung. Dies zeigte sich zum einen an der Verminderung von strahlen-induziertem Zelltod nach stabiler Überexpression dieser Modulatoren. Zum anderen steigerte die Überexpression auch das klonogene Überleben der jeweiligen Zellen. Der modulierende Einfluss von BCL-xL auf die Strahlenresistenz konnte auch in Xenograft-Modellen in Mäusen nachgewiesen werden. Überraschenderweise war dieser Effekt jedoch nicht präferentiell auf die anti-apoptotische Funktion von BCL-xL und MCL-1 zurückzuführen, da Bestrahlung generell nur zu einer minimalen Steigerung der Apoptose führte. Da auch strahlen-induzierte Zellzyklus-Veränderungen durch BCL-xL kaum beeinflusst wurden, wurde vermutet, dass BCL-xL einen Einfluss auf die Reparatur von Desoxyribonukleinsäure (DNS)-Schäden haben könnte, die als direkte oder indirekte Folge einer Bestrahlung entstehen. Tatsächlich konnte in dieser Arbeit gezeigt werden, dass die BCL-xL-vermittelte Strahlenresistenz von der Funktionalität des Reparaturweges der homologen Rekombination (homologous recombination repair, HRR) abhängig war und die Überexpression von BCL-xL darüber hinaus zu einer gesteigerten Reparatur von DNS Doppelstrangbrüchen durch die alternative Endverknüpfung (alternative end-joining, alt-EJ) führte. Da dieser Reparaturweg sehr fehleranfällig ist, führte dies zu einem verstärkten Auftreten von Zellen mit Chromosomenaberrationen. Dies könnte in der weiteren Folge im Patienten dazu führen, dass Zellpopulationen entstehen, die einen resistenteren und aggressiveren Phänotyp aufweisen. Um dies zu verhindern, sollten Tumore, die eine Überexpression von anti-apoptotischen BCL-2 Familienmitgliedern aufweisen, mit einer Kombination aus Bestrahlung und zielgerichteten Medikamenten behandelt werden. Dass dies erfolgversprechend sein kann, konnte hier durch verschiedene Methoden gezeigt werden, bei denen BCL-xL und/oder MCL-1 genetisch bzw. funktionell antagonisiert wurden. Diese Methoden umfassten shRNA-vermittelte „knockdowns“, konditionale Überexpression des pro-apoptotischen Proteins BAK sowie die pharmakologische Behandlung von Zellen mit sogenannten „BH3-Mimetika“. Alle diese experimentellen Ansätze führten zu einer Sensitivierung von Lungenkrebszellen gegenüber Bestrahlung. In einem nächsten Schritt sollte dieses Konzept folglich auch klinisch im Rahmen von Studien untersucht werden. Dabei könnte eine Bestrahlungstherapie bei Tumoren, die eine erhöhte Expression von anti-apoptotischen BCL-2 Proteinen aufweisen, z.B. mit Navitoclax kombiniert werden.
Als zweiter potentieller Biomarker der Strahlentherapieantwort bei NSCLC konnte die Serin/Threonin Kinase RAF-1, ein essentielles Signaltransduktionsmolekül, identifiziert werden. In verschiedenen Experimenten führte die konditionale Aktivierung von RAF-1 zu einer signifikanten Verminderung des strahlen-induzierten Zelltods. Das klonogene Überleben in Abhängigkeit von RAF-1 Aktivierung konnte nicht eruiert werden, da bei dem verwendeten System eine permanent aktivierte RAF-1 Kinase das Koloniewachstum allgemein inhibierte. Ein möglicher Erklärungsansatz könnte sein, dass die Aktivierung von RAF-1 zur Induktion eines G2 Arrests führte. Darüber hinaus konnte gezeigt werden, dass die Aktivierung von RAF-1 auch nach Bestrahlung ausreichend ist, um die Zellen vor strahlen-induziertem Zelltod zu schützen. Um die Mechanismen der RAF-1-vermittelten Strahlenresistenz zu ermitteln, sind weitere Studien notwendig.
Zusammenfassend konnten in der vorliegenden Arbeit also zwei unterschiedliche Modulatoren der Strahlentherapieantwort bei NSCLC identifiziert werden, welche sich potenziell für den Einsatz von Biomarker-gesteuerten Therapieprotokollen im Rahmen von klinischen Studien eignen.Lung cancer is the leading cause of cancer-related death worldwide. Approximately 85 % of all lung cancers are histologically grouped as non-small-cell lung cancer (NSCLC). Besides surgery and chemotherapy, radiotherapy is firmly established as an important modality in curative treatment of localized as well as locally advanced NSCLC and in palliative care. Nevertheless, systemic and localized relapse is frequently observed. Recent developments have led to a more refined typing of advanced NSCLC by incorporating biomarkers of oncogenic pathway activation. This has allowed the successful introduction of "targeted pharmacotherapies" that are better tailored towards biological differences between histologically uniform NSCLC entities. In contrast, radiotherapy still does not take advantage of biological disease heterogeneity, and radiosensitization protocols are empirically derived, rather than based on validated biomarkers.
Against this background, it was hypothesized that an improved understanding of the modulation of the radiotherapy response of NSCLC by signal transduction pathways may open new avenues for the development of more specific protocols to combine radiotherapy with pharmacotherapies. To this end, a systematic assessment of the functional impact of selected regulators of apoptosis, oncogenes, and signal transduction mediators on irradiation-induced cell death was initiated in a small-scale screen of lung cancer models.
Anti-apoptotic members of the BCL-2 family have been selected as the first group of potential biomarkers for the radiotherapy response in NSCLC. BCL-xL as well as MCL-1 conferred resistance against irradiation in A431 cells. Expression of both modulators led to decreased radiation-induced cell death and additionally gave a competitive edge in clonogenic survival in vitro. Studies obtained by radiation therapy of tumor-bearing mice in vivo supported the relevance of BCL-xL for radioresistance in an organismal context. Surprisingly, these findings were not convincingly explained by BCL-xL and MCL-1 mediating radioresistance by inhibition of apoptosis, as radiotherapy induced only negligible amounts of apoptosis. Also no impact of BCL-xL on cell cycle kinetics following irradiation was observed. Studying the influence of BCL-xL on deoxyribonucleic acid (DNA) double-strand break (DSB) repair pathways as a potential effector mechanism revealed that BCL-xL-mediated radioresistance relied on functional homologous recombination repair (HRR) and involved enhanced repair through error-prone alternative end-joining (alt-EJ). This led to the propagation of cells with gross chromosomal aberrations, possibly promoting survival of more resistant and aggressive lung cancer subclones. To circumvent this, combining irradiation with targeted therapies against anti-apoptotic BCL-2 family members was suggested as a useful strategy. Thus, BCL-xL and/or MCL-1 were antagonized on a genetic or functional level. These strategies, including shRNA-mediated knockdown, conditional overexpression of pro-apoptotic BAK, as well as pharmacological treatment with BH3-mimetics, sensitized lung cancer cells to radiotherapy. Based on this, it is proposed to select patients with high expression of the respective drug targets in recent tumor biopsies for clinical proof-of-principle studies combining radiotherapy with pharmacologic antagonists of the BCL-2 family such as Navitoclax.
The signal transduction mediator RAF-1 was identified as the second potential biomarker for the radiotherapy response in NSCLC. Conditional activation of RAF-1 reduced the number of irradiation-induced cell death significantly. Clonogenic survival could not be evaluated as RAF-1 activation itself inhibited colony formation in general, possibly due to induction of a cell cycle arrest or senescence. It was further shown that activation of RAF-1 even after irradiation had still radioprotective effects. The underlying mechanisms remain to be elucidated in technically more appropriate models, in particular in vivo.
In conclusion, two modulators of the radiotherapy response in NSCLC were identified and functionally validated. In addition, targeting non-apoptotic functions of BCL-2 family proteins was nominated as a novel strategy for biologically rational radiosensitization protocols
Hourly Price Forward Curves für Strommärkte
Full text linkIn dieser Arbeit betrachten wir die Konstruktion von Hourly Price Forward Curves (HPFC) für Strompreise. HPFC dienen als Grundlage für viele Energieunternehmen, um den Preis der Stromlieferung auf stündlicher Basis zu ermitteln. HPFC kombinieren Informationen von historischen Spot-Preisen und exogenen Variablen mit Informationen von aktuell verfügbaren Futures-Kontrakten zur Konstruktion einer
Kurve, die einen Preis für Strom mit Lieferung an einem gewissen Punkt in der Zukunft liefert. Zu Beginn der Arbeit vergleichen wir drei unterschiedliche Konstruktionsmöglichkeiten. Zwei Methoden stammen aus der Fachliteratur. Eine weitere, neuartigere Methode basiert auf dem gemeinsamen Optimierungsansatz der
Saisonalität als auch der Anpassung an Futures-Preisen. Ein derartiger Vergleich von unterschiedlichen Methoden ist derzeit nicht in der Literatur vorhanden. Durch den Vergleich erhalten wir einen besseren Einblick in die Vor- und Nachteile der einzelnen Methoden. Diese Vor- und Nachteile sind schwer zu erkennen, betrachtet man nur ein Modell, welches man als Standardmodell der Literatur ansieht.
Dieses Kapitel soll als Überblick und Ausgangspunkt der weitern Forschung dienen.
Wir erstellen kein abschließendes Ranking, da jedes Modell seine individuellen Stärken und Schwächen besitzt. Nach den Analysen der einzelnen Modelle zeigen wir vielmehr, wie man die jeweiligen Stärken extrahiert und zu einem einzigen Modell kombiniert.
Im zweiten Teil der Arbeit betrachten wir die Adjustierungsmöglichkeiten der Kurve, bzw. wie wir die HPFC an beobachtete Futures-Preise anpassen können.
Wir starten mit der Konstruktion einer ganzen Reihe von Price Forward Curves (PFCs) basierend auf den Daten eines Jahres, wobei wir die Saisonalität konstant halten. Durch das Beobachten der Kurvenveränderungen mit der Zeit kommen wir zu
neuen Einsichten hinsichtlich der natürlichen Merkmale der Einstellfunktion. UnserInteresse liegt darin zu erfahren, was passiert, wenn sich der Preis eines bestimmten Produktes ändert oder wenn ein Produkt in mehrere Produkte mit kürzeren Lieferperioden
kaskadiert. Zu diesem Zweck untersuchen wir den Zusammenhang zwischen der PFC und dem individuellen Futures-Produkt. Wir beobachten, dass ein linearer Zusammenhang besteht, wenn die Anzahl der Produkte konstant bleibt. Wir können daher leicht die Wirkung einer Veränderung eines jeden Future-Produkts
auf die Kurve untersuchen, da Linearität bedeutet, dass dieser Effekt unabhängig vom aktuellen Preisniveau der beobachteten Produkte ist. Des Weiteren können wir erkennen, dass für Modelle, bei denen die Anzahl der Parameter von der Anzahl der beobachteten Futures-Produkten abhängt, eine theoretische Arbitrage-Chance
besteht, wenn neue Produkte in den Markt eingebracht werden. Durch die Untersuchung der Änderung von PFCs, falls sich die Future-Preise ändern, erhalten wir neue Informationen, die man durch isolierte Betrachtung der PFC nicht beobachten kann. Solch eine Analyse der PFC in Bezug auf Futures ist bisher nicht unternommen worden. Benth and Paraschiv, 2017 führt eine ähnliche Analyse durch, wobei
Sie eine Menge an konstruierter HPFCs über einen längeren Zeitraum analysieren.
Allerdings betrachten Sie nicht den Zusammenhang zwischen den Futures und den resultierenden Kurven. Stattdessen betrachten Sie die resultierenden Kurven als Random Field und führen statistische Untersuchungen an diesem durch. Später passen Sie ein räumlich-zeitliche dynamisches Modell an diesen Datensatz an.
Im letzten Teil der Arbeit konstruieren wir ein stochastisches Modell für die PFC, welches konsistent mit einer PFC ist, die linear von Futures-Preis abhängt. Die meisten Studien über stochastische Modellierung von Futures-Produkten betrachten nur Produkte mit festgelegten Lieferlängen. Dies steht allerdings nicht im Einklang mit unserer Vorgehensweise. Wenn wir die Verteilung eines vierteljährigen Produktes betrachten wollen, ist es eventuell notwendig, die Summe der drei dazugehörigen monatlichen Produkte zu betrachten. Wir schlagen ein Modell vor, in dem wir die Futures-Preise durch einen Ornstein-Uhlenbeck-Prozess modellieren, bei der die
Verteilung aller dazugehörigen Produkte konsistent ist und zu der wir die PFC konstruieren können. Der Hauptbeitrag in diesem Abschnitt bestehet darin, zu untersuchen, wie sich die Parameter der verschiedenen Prozesse zueinander, zur Saisonalität und zur Anpassungsfunktion verhalten. Ein derartiges Framework, dass aus
einem stochastischen Modell für Future-Produkte besteht, welches sich im Einklang zur PFC befindet, wurde nach unserem Stand der Dinge bisher nicht in der Literatur behandelt. Benth and Paraschiv, 2017 tuen etwas ähnliches, wenn Sie in Ihrer Arbeit das räumlich-zeitlich dynamische Modell an Ihre HPFCs anpassen. Der Unterschied
besteht aber darin, dass Ihr Modell direkt an Daten angepasst ist, während unser Modell eine Transformation des Modells für Futures-Preise beinhaltet, welches die lineare Beziehung ausnutzt.This thesis is about the construction of the hourly price forward curve (HPFC) for electricity prices. The HPFC is the basis for many valuation problems energy companies face, as it determines the price they can take for the delivery of electricity on an hourly level. The HPFC combines the information from historical spot prices as well as other exogenous variables and the information of the currently observed
Futures products to construct a curve giving a price for electricity with delivery at some point in the future. We start the thesis with a comparison of three different methods for the construction of the HPFC, two methods from the literature and one novel method based on a joint optimization approach of both the seasonality pattern
and the fitting to the observed Futures prices. This section is meant as a review section and as the starting point of our further research. Such a comparison between different methods is not currently present in the literature. By comparing the different methods we get a greater insight in the pros and cons of the different methods. These pros and cons are hard to observe while one only consider a single model,
which seems to be the standard from the literature. We do not conclude which of the methods we compare is the best, as they all have their individual strengths and weaknesses. By understanding the individual models we show how we can extract the strengths from each model combining these strengths in one model.
In the second part of the thesis we study the adjustment part of the curve, or how we fit the HPFC to the observed Futures prices. We start by constructing a set of price forward curves (PFCs) for 2015 fitted to Futures prices observed in 2014, resulting in 252 individual curves. We keep the seasonality curve constant for each set of PFCs.
By observing how these curves change in time, we get new insights on what are natural traits of the adjustment function. We are mainly interested in what happens when the price of a certain product is changing, and what happens when a product is cascaded into several products with shorter delivery periods. We therefore investigate
the relationship between the PFC and the individual Futures products and observe this relationship is linear when the number of products remain constant. We can therefore easily investigate the effect a change in each Futures product has on the curve, as the linearity means that this effect is independent of the current price level
of the observed products. We also observe that in models where the number of parameters are dependent on the number of observed Futures products, there exists a theoretical arbitrage opportunity when new products are included in the market. By investigating how the PFCs change when the Futures prices change, we get new
information, which can not be observed when only considering one PFC. Such an analysis of the derivative of the PFC with respect to the Futures prices is currently not present in the literature. Benth and Paraschiv, 2017 do a similar analysis where they analyze a set of constructed HPFCs for a longer time period, but they do not
consider the relationship between the Futures and the resulting HPFCs, they consider the resulting curves as a random field and make a statistical analysis of this random field. They later fit a spatio-temporal dynamical model to this data set. In the last part of our thesis we construct a stochastic model for the PFC which is
consistent with a PFC that is linear with respect to the Futures prices. Most studies on stochastic modeling of Futures products only take into account products with set delivery lengths, but this will not be in accordance to how we price our PFC. If one wants to look at the distribution of a quarterly product, one might in the future need
to consider the sum of three monthly products, while today one can only trade in the quarterly product. We propose a framework where we model the Futures prices by an Ornstein-Uhlenbeck process, where the distributions of all such products are consistent to each other and to how we construct our PFC. The main contributions in this section consist of how the parameters of the different processes compare toeach other, to the seasonality curve and to the adjustment function. Such a framework, where we construct a stochastic model for the different Futures products that is consistent to with respect to how we construct the PFC is to our knowledge not existing in the literature. Benth and Paraschiv, 2017 do something similar when they
fit their spatio-temporal dynamical model to their set of HPFCs, but the difference is that where they fit the model directly to the data. Our model is a transformation of the model for the Futures prices that preserves the linear relationship between the PFC and the observed Futures prices, which we studied in the previous section
Attachment under current – biofilm formation by electroactive bacteria
Full text linkBioelectrochemical systems (BES) are hybrid systems using electroactive bacteria and electrochemical techniques. Solid electrodes serve as electron donor for or acceptor from microorganisms for the production of current and/or the generation of valuable substances.
Research conducted on BES in this thesis ranged from fundamental investigations on microbial attachment to electrodes to the development of electrode materials for advanced reactor concepts.
The first part of this theses was the biochemical analysis of the extracellular polymeric substances (EPS) secreted by G. sulfurreducens under electroactive conditions. G. sulfurreducens was cultivated in MFC-mode on graphite based electrodes polarized to +400 mV vs. Ag/AgCl for 8 d. A maximum current density of 172 ± 29 μA cm-2 was reached after 7 d. Routine methods for the biofilm harvest and the EPS processing were established. Electroactive cultures secreted significantly more EPS compared to cells grown under standard heterotrophic conditions (fumarate respiration). With 116 pg cell-1, the highest amount of EPS was measured for the soluble EPS fraction of G. sulfurreducens using anode respiration, followed by the tightly bound (18 pg cell-1) and loosely bound (11 pg cell-1) fractions of the EPS. Proteins were found to dominate all EPS fractions of the biofilms grown under electrochemical conditions.
The second part was the development of a membrane separated flow cell for the simultaneous electrochemical impedance spectroscopy (EIS) and confocal laser scanning microscopy (CLSM) [Stöckl et al. 2016]. A flow cell made from PEEK was constructed, using a transparent indium tin oxide electrode as working electrode. A fluorescent S. oneidensis was cultivated under MFC conditions. A decrease of the charge transfer (RCT) from 292 kΩ to 120 kΩ was observed with an increased current of 0.52 μA cm-2 after 17 h of operation. The
CLSM images revealed an increasing cell number of S. oneidensis on the WE electrode to a monolayer with 26 cells 100 μm-2 after 17 h under MFC conditions.
As final part a straight forward approach to synthesize magnetic electrode particles allowing the artificial fixation of electroactive bacteria was developed [Stöckl, et al. 2016, DE102014112685A, Frankfurt, Germany]. The microwave assisted synthesis of magnetite was applied for the production of the magnetic electrode particles with activated carbon (PMAG/AC). The surface area is around 300 m2 g-1 and the particle size ranges between 20 and 200 μm. Resting cells of S. oneidensis attached to a maximum concentration of 8 · 10^10 ± 3 · 10^9 resting cells g-1 PMAG/AC. Electrochemical examination revealed that magnetically immobilized PMAG/AC showed a capacitive current response during cyclic voltammetry. Linear sweep voltammetry indicated that particles were stable down to a potential of –680 mV vs.
Ag/AgCl
Die Wirksamkeit von Tai Chi Chuan verglichen mit Usual Care bei chronischen unspezifischen Nackenschmerzen - eine randomisierte kontrollierte Studie mit qualitativen Interviews-
Full text linkChronische unspezifische Nackenschmerzen sind häufig und betreffen durchschnittlich um die 26% der Bevölkerung jedes Jahr. In der vorliegenden Arbeit wurde die Wirksamkeit von Tai Chi Chuan bei 38 Patienten mit chronischen unspezifischen Nackenschmerzen im Vergleich zu einer Usual Care-Gruppe (n=39) untersucht. Die vornehmlich weiblichen Patienten der Tai Chi Chuan-Gruppe erhielten über 12 Wochen eine Trainingseinheit von 75 bis 90 Minuten pro Woche und übten zusätzlich eigenständig zu Hause.
Mittels Fragebögen und individuellem Tagebuch wurde der primäre Zielparameter Schmerzintensität und die sekundären Zielparameter Schmerzen bei Bewegung, Beeinträchtigung durch den Schmerz, Lebensqualität, psychisches- und allgemeines Wohlbefinden, Stress, Haltungsbewusstsein, Zufriedenheit mit der Intervention und Sicherheit erfasst. Ergänzend wurden von den Patienten nach der Intervention Zeichnungen zur Wahrnehmung ihres Nackens erstellt und qualitative Interviews dazu geführt, um individuelle Wirkungen zu berücksichtigen.
Nach dem Kurs hatten die Teilnehmer der Tai Chi Chuan-Gruppe signifikant weniger Schmerzen als die Usual Care-Gruppe (Gruppendifferenz in mm auf der visuellen Analogskala (VAS): -10,5; 95% Konfidenzintervall -20,3; -0,9; P= 0,033). Weitere signifikante Unterschiede fanden sich in den Bereichen Schmerz bei Bewegung, Beeinträchtigung, Lebensqualität und teilweise in der Haltung. Keine Unterschiede fanden sich hingegen im psychischen Wohlbefinden (innere Ruhe, Angst, Depression und Stress) und dem Körperbewusstsein.
Sowohl in den qualitativen Interviews als auch in vorhergehenden Studien zu Tai Chi Chuan zeigen sich zusätzliche Effekte im Bereich des psychischen Wohlbefindens. Es stellt sich unter anderem die Frage nach der Dosis-Wirkungs-Beziehung von Tai Chi Chuan sowie dem nötigen Erfahrungsgrad des Praktizierenden.
Insgesamt erwies sich Tai Chi Chuan im Vergleich zu Usual Care als effektive Behandlungsoption bei Patienten mit chronischen unspezifischen Nackenschmerzen. Die Patienten waren durchweg zufrieden mit der Intervention und es wurden nur wenige leichte unerwünschte Ereignisse berichtet. Tai Chi Chuan kann daher als sinnvolle Alternative konventioneller Nackenübungen betrachtet werden. Weitere Studien sollten unter anderem zur Bestätigung der Befunde und zur Erforschung bislang unbekannter Aspekte wie der Dosis-Wirkungs-Beziehung durchgeführt werden
Cognitive performance changes in chronic kidney disease patients related to cardiovascular risc factors and diseases over a 2-year-follow-up
Full text linkEinleitung. Viele Patienten mit einer chronischen Nierenerkrankung (CKD) weisen kognitive Defizite und gleichzeitig kardiovaskuläre Risikofaktoren und Erkrankungen auf. Wie sich die kognitive Leistung bei CKD-Patienten im zeitlichen Verlauf ändert und welche Rolle dabei kardiovaskuläre Risikofaktoren und Erkrankungen spielen, ist bislang unklar.
Methode. In unserer Studie wurden 120 Probanden (73 Patienten mit CKD, Stadium 3-5D, Alter 64,3 ± 13,6 Jahre und 47 Kontrollpatienten mit vergleichbaren kardiovaskulären Risikofaktoren und Erkrankungen, Alter 62,6 ± 10,2 Jahre) im Rahmen der Studie „New Tools for the Prevention of Cardiovascular Disease in Chronic Kidney Disease“ (NTCVD) bei Baseline und nach 2 Jahren untersucht. Die Nierenfunktion wurde anhand von eGFR beurteilt. Die neuropsychologische Untersuchung bestand aus zehn Tests, die fünf kognitive Bereiche erfassten.
Ergebnisse. Die Nierenfunktion, kardiovaskuläre Risikofaktoren und Erkrankungen sowie kognitive Leistungen blieben innerhalb von 2 Jahren in den beiden Patientengruppen sehr stabil. Der Summenwert für globale kognitive Leistung veränderte sich von Baseline (BL) zum Follow-up (FU) in den beiden Patientengruppen nahezu nicht (z = -0,63 ± 0,76 bei BL vs. z = -0,54 ± 0,79 bei FU, p = 0,113 für CKD-Patienten; z = -0,01 ± 0,59 bei BL vs. z = 0,01 ± 0,70 bei FU, p = 0,862 für Kontrollpatienten). Es gab eine signifikante Verbesserung im kognitiven Bereich „Sprache“ bei CKD-Patienten (z = -0,61 ± 0,85 bei BL vs. z = 0,41 ± 0,94 bei FU, p = 0,008). Das Gesamtcholesterin verringerte sich in den beiden Patientengruppen innerhalb des Untersuchungszeitraums signifikant, die Intima-Media-Dicke nahm in der CKD-Gruppe signifikant ab. Die wichtigsten Prädiktoren für eine Verschlechterung bzw. geringere Verbesserung der globalen kognitiven Leistung in multivariablen Regressionsanalysen waren hohes Alter und hohe kognitive Leistung zum Zeitpunkt der Baseline.
Diskussion. In der NTCVD-Kohorte, die engmaschig untersucht und optimal behandelt wurde, trat keine kognitive Verschlechterung innerhalb von 2 Jahren auf. Unsere Daten betonten die Bedeutung der Auswahl einer geeigneten Kontrollgruppe mit kardiovaskulären Risikofaktoren. Außerdem erlaubten unsere Ergebnisse anzunehmen, dass bei einer optimalen medizinischen Behandlung von CKD-Patienten eine kognitive Verschlechterung im Erkrankungsverlauf vermieden werden könnte
Sensitivität und Spezifität des Screening-Messgerätes ApneaLink® im Vergleich zur Polysomnographie bei gesunden Kindern mit V.a. schlafbezogene Atmungsstörungen und Kindern bzw. Jugendlichen mit chronischen Erkrankungen welche mit einer erhöhten Inzidenz von schlafbezogenen Atmungsstörungen einhergehen
No full textZusammenfassung
Ziel: Das Ziel dieser Studie ist die Untersuchung der Sensitivität und Spezifität des ambulanten Screeninggeräts Apnea Link® im Vergleich zur Polysomnographie bei gesunden Kindern mit V.a. schlafbezogenen Atmungsstörungen und Kindern bzw. Jugendlichen mit chronischen Erkrankungen, welche mit einer erhöhten Inzidenz von schlafbezogenen Atmungsstörungen einhergehen.
Methoden: Apnea Link® ist ein tragbares ambulantes Screeninggerät, um Apnoen, Hypopnoen und Sauerstoff-Desaturationen während der Schlafzeit zu diagnostizieren. Seine Validierung bei Kindern ist Ziel dieser Studie, wohingegen dies mit einem vergleichbaren Gerät bei Erwachsenen bereits erfolgt ist Die Polysomnographie ist der diagnostische Goldstandard zur Auffindung schlafbezogener Atmungsstörungen bei Kindern und Erwachsenen. Während des gesamten Nachtschlafes der 60 geprüften Kinder und Jugendlichen, zwischen 0 und 22 Jahren, führten wir eine parallele Messung von Polysomnographie und Apnea Link durch. Die untersuchten Parameter waren: Gesamtschlafzeit, Apnea-Hypopnoe-Index, durchschnittliche O2-Sättigung (SaO2),minimale SaO2, Schlafzeit mit SaO2 weniger als 90%.
Ergebnisse: Diese Studie inkludiert 60 Patienten, 17 Mädchen und 43 Jungen, gesund oder mit chronischer Erkrankung, mit V.a. schlafbezogene Atmungsstörungen. Die Durchführung der Polysomnographie definiert bei 28 Patienten (47 %) die Diagnose OSA. In den ApneaLink® Messungen zeigten sich 29 Patienten als positiv und 31 als negativ klassifiziert. Die weitere Analyse des ambulanten Screeninggerätes ergab eine Sensitivität und Spezifität von 82 % und 84 %, mit einem negativen und positiven prädiktiven Wert von 84 % und 82 %. Die ApneaLink® Ergebnisse bezogen auf die Spezifität in der Gruppe von Kindern unter 10 Jahren (Spezifität 72 %) sind deutlich schlechter als in den anderen Gruppen, welche ältere Kinder und jugendliche Patienten einschliessen.
Zusammenfassung: Diese Ergebnisse weisen darauf hin, dass ein ambulantes Gerät wie ApneaLink® allein als Screeninginstrument unzureichend ist, um OSA bei Kindern unter einem Alter von 10 Jahren zu entdecken. Andere Screeningmethoden müssen daher in naher Zukunft noch identifiziert werden.Abstract
Purpose: The purpose of this study is to objectify the sensitivity and specificity of the ambulant screening device ApneaLink® in comparison to polysomnography in children with chronic diseases which are correlating with sleep disordered breathing, and healthy children with suspicion upon sleep disordered breathing.
Methods: ApneaLink® is a portable ambulant screening device to diagnose apneas, hypopneas and oxygen desaturations during sleeping time. Its validation in children is issue of this study whereas the same in grown ups is already done. Polysomnography is the diagnostic goldstandard in finding sleep disordered breathing during sleep in children and grown ups. During the hole night sleep of the 60 tested (reviewed) children, between 0 and 22 years, we accomplished a parallel measurement with polysomnography and ApneaLink® on them. The parameters which were investigated: hole sleeping time, apnea-hypopnea-index, average O2 saturation (SaO2), minimal SaO2, sleepingtime with SaO2 under 90%.
Results: This study included 60 patients, 17 girls and 43 boys, which where healthy or with chronical disease, with suspicion of having sleep disordered breathing. Polysomnography results determined 28 patients (47%) with a diagnosis of OSA. ApneaLink® results classified 29 patients as positive and 31 as negative. Further analysis of the positive and negative ambulant screening device results showed a sensitivity and specificity of 82 % and 84 %, with a negative and positive predictive value of 84% and 82%, respectively. Parts of the ApneaLink® results in the group of children under 10 years (specifity 72 %) were quite poorer than in the other groups, which included older children and adolescent patients.
Conclusions: These results suggest that an ambulant device like ApneaLink® alone is insufficient as a screeningtool to detect OSA in children under an age of 10. Other screening methods need to be identified in the near future.
Keywords: ApneaLink®, ambulant screening device, sleep disordered breathing, polysomnography, validatio
Der Einfluss von Lifestylefaktoren auf die Prognose des Mammakarzinoms
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Lifestylefaktoren und deren Einfluss auf diverse Erkrankungen und Erkrankungsverläufe sind derzeit ein wichtiges Thema in unserer Gesellschaft und werden es mit Sicherheit auch in Zukunft bleiben. Ebenfalls von erheblicher gesellschaftlicher Bedeutung ist das Thema Brustkrebs, denn etwa jede achte Frau erkrankt im Laufe ihres Lebens daran. In dieser Arbeit wird untersucht, inwieweit die ausgewählten Lifestylefaktoren die Prognose des Mammakarzinoms beeinflussen. Untersuchungsgrundlage bildet dabei eine umfassende Datenakquise bei 635 erstdiagnostizierten, nicht neoadjuvant therapierten und zum Zeitpunkt der Erstdiagnose im nicht metastasierten Stadium befindlichen Frauen.
Die wichtigsten Ergebnisse werden im Folgenden kurz zusammengefasst: Die zentrale Erkenntnis dieser Arbeit ist, dass zwischen der Einnahme von Betablockern und dem Gesamtüberleben sowie auch dem rezidivfreien Überleben ein signifikanter Zusammenhang besteht. Patientinnen, die keine Betablocker einnehmen, weisen sowohl ein längeres Gesamtüberleben als auch ein längeres rezidivfreies Überleben auf. Ein weiteres, zwar nicht signifikantes, aber dennoch sehr interessantes Ergebnis ist außerdem das Resulat der Analysen hinsichtlich des Zusammenhangs zwischen dem Body-Mass-Index (BMI) und dem rezidivfreien Überleben: Es zeichnet sich ab, dass die Patientinnen mit einem BMI ≤ 30 insgesamt ein längeres rezidivfreies Überleben haben als die Patientinnen, die einen BMI > 30 aufweisen und somit als adipös einzustufen sind. Weitere signifikante Ergebnisse zeigen sich in den durchgeführten Überlebenszeitanalysen, die am ehesten eine direkte Aussage hinsichtlich der Prognose des Mammakarzinoms zulassen, nicht.
Allerdings ergeben sich einige signifikante Zusammenhänge, die einen zumindest indirekten Einfluss auf die Prognose haben könnten beziehungsweise die Erstellung einer Art Profil dieser Frauen ermöglichen. Die Einnahme von Betablockern sowie auch ein BMI oberhalb von 30, die einen negativen Einfluss auf die Prognose des Mammakarzinoms haben, sind häufig bei Patientinnen in einem Alter über 60 Jahren, die sich in einem postmenopausalen Stadium befinden, festzustellen. Gleichzeitig sind diese Frauen häufiger Nichtraucher, trinken seltener Alkohol, nehmen häufiger Metformin ein und haben häufiger eine Hormonersatztherapie durchgeführt.
Insgesamt ist festzuhalten, dass in dieser Arbeit einige signifikante Einflüsse der Lifestylefaktoren auf die Prognose des Mammakarzinoms nachgewiesen werden können
1,1‘-Binaphthyl Based Bis- and Tris-Phosphoric Acids: Syntheses and Application as Fluorescent Chemosensors
No full textDie neuesten Fortschritte bei der Entwicklung von BINOL-basierten Rezeptoren und Organokatalysatoren zeigen, dass die Verwendung mehrerer BINOL-Einheiten eine wirksame Strategie für die Generierung von hoch stereoselektiven Systemen ist. Diese bi- und multidentaten Systeme verfügen nicht nur über zusätzliche chirale Untereinheiten, sondern auch zusätzliche funktionellen Gruppen (z.B. Hydroxy- oder Phosphatgruppen) für Host/Guest-bzw. Katalysator-Substrat-Interaktionen.
Im Rahmen dieser Arbeit wurden chirale BINOL-basierte Phosphorsäuren dargestellt und deren Applikation als Chemosensor untersucht. Der Einsatz von 1,1'-Binaphthyl-monoiodid und verschiedenen Linkern (Y oder Z) ermöglichte die direkte Umsetzung zu Bis- und sogar Tris-Phosphorsäuren. Mit diesem Ansatz wurden fünf Bis-1,1'-binaphthyl-phosphorsäuren (R,R)-1a/b/c/d/e und eine Tris-1,1'-Binaphthylphosphorsäure (R,R,R)-1f erfolgreich synthetisiert.
Die Untersuchung der Bisphosphorsäuren (R,R)-1a/b/c/d als Fluoreszenzsensoren demonstrierte die Selektivität von (R,R)-1d gegenüber Eisenionen (Fe3+), welche zu einem Fluoreszenzquenching führte. Zudem ermöglichte die chirale Eigenschaft der Sensoren eine weitere Untersuchung der Interaktion zwischen Bisphosphorsäuren und dem Analyten mittels CD-Spektroskopie. Diese beiden spektroskopische Methoden (Fluoreszenz und CD) bieten einen dualen Erkennungsmodus für die Sensorapplikation.
In einem zweiten Projekt wurden Bis-/Tris-phosphorsäuren (1a-f) in Kombination mit Ni2 + oder Eu3 + als Fluoreszenzsensoren für chirale Bioanalyten (L-/D-Aminosäuren) angewendet. Hierfür wurde ein Fluoreszenzarray entwickelt, um Analyt-spezifische Fluoreszenzmuster zu generieren. Um die Datenauswertung zu vereinfachen und die Unterscheidungsfähigkeit des Fluoreszenzarrays einzuschätzen, wurden statistische Datenanalysen (PCA und LDA) implementiert. Das Ergebnis zeigte, dass der Array die Art der Aminosäure mit hoher Genauigkeit identifiziert, 99% für L-Aminosäuren und 98% für D-Aminosäuren. Die Fähigkeit des Arrays um 37 verschiedene L- und D-Aminosäuren in einem Satz zu diskriminieren, wurde als befriedigend empfunden, mit nur 93% Genauigkeit. Für diese Anwendung wäre die Einbindung des Enantiomerenpendants der Phosphorsäuren als zusätzliche Sensoren hilfreich.
Neben der Synthese von Bis-/Tris-binaphthylphosphorsäurediestern wurden auch die zugehörigen Phosphorsäuremonoester hergestellt. Die partielle Racemisierung des Binaphtyl-Rückgrats wurde während der Zyklisierung beobachtet, welche zur Bildung von Diastereomeren führte. Diese wurde durch spektroskopische und Röntgen-Kristall-Strukturanalysen bestätigt. Experimentelle und theoretische Studien mit einem Modellsubstrat zeigten, dass sowohl die Racemisierung als auch die Zyklisierung durch Säure katalysiert sind. Hierbei verlief die Zyklisierung schneller als die Racemisierung, da die Energiebarriere der Zyklisierungsreaktion geringer als die Racemisierung ist.
Am Ende dieser Arbeit konnten sechs Isomere von Phosphorsäuremonoestern erfolgreich isoliert und charakterisiert werden. Diese Phosphorsäuren sind die vielversprechenden Verbindungen für den Einsatz in der Katalyse und als Chemosensoren.
Das letzte Projekt war die Synthese von bis-1,1'-Binaphthylaminen zur Generierung von supramolekularen Doppelhelices. Eine modifizierte Syntheseroute, bei der Monoiodbinaphthyl-bis-carboxylsäuren verwendet wurden, wurde erfolgreich zur Herstellung von Monoiodallylamin (R)-86 eingesetzt. Dieser dient als der wesentliche Baustein, der mit verschiedenen Linkern für die Erzeugung von Bis-binaphthylaminen verknüpft werden kann.
Im Rahmen dieser Arbeit wurde über neun Syntheseschritte ein Bis-binaphthylallylamin, verknüpft über einen 1,4-Ethinyl-benzol-Linker, erfolgreich hergestellt. Lediglich der letzte Entschützungsschritt fehlt, um das Endmolekül, das Bis-binaphthylamin zu erzielen. Die Paarung von Bis-binaphthylphosphorsäuren und Bis-binaphthylaminen wird in Zukunft neue Möglichkeiten bieten, komplementäre supramolekulare Doppelhelices zu bilden.The strategy for the synthesis of chiral bis-binaphthyl phosphoric acids involving the use of 1,1’-binaphthyl-monoidide and various linkers (Y or Z) allowed the straightforward synthesis of bis- and even tris-phosphoric acids. In the end, this synthetic approach led to the formation of five bis-1,1’-binaphthyl phosphoric acids (R,R)-1a to (R,R)-1e and one tris-1,1’-binaphthyl phosphoric acid (R,R,R)-1f.
The investigation of the sensing ability of the bis-phosphoric acids (R,R)-1a/b/c/d as fluorescence sensors demonstrated the selective sensing ability of (R,R)-1d towards ferric ions (Fe3+) which led to a fluorescence quenching. Based on the chiral nature of the sensors, we were also able to monitor the interaction of the bis-phosphoric acids with the analytes (metal ions) by CD spectroscopy. Both spectroscopic (fluorescence and CD) methods are providing a dual-mode detection for the sensing application.
In a second project, we applied the bis-/tris-phosphoric acids (1a-f) in combination with Ni2+ or Eu3+ as fluorescence sensors for chiral bioanalytes (L-/D-amino acids). An array-based fluorescence sensing was developed to generate analyte-specific fluorescence patterns and statistical data analyses (PCA and LDA) were implemented to simplify the data evaluation and to estimate the discrimination ability of the fluorescence array. The array showcased the capability to identify the type of amino acid with high accuracy, 99% and 98% for L- and D-amino acids respectively. The ability of the array to additionally discriminate the configuration of amino acids in a set of 37 different L- and D-amino acids -was found to be satisfying, albeit giving only 93% accuracy. For this approach, it might be helpful to include the enantio-counterparts of the phosphoric acids as additional sensors.
In addition to the synthesis of bis-/tris-binaphthyl phosphoric acid diesters, we were also able to furnish the related phosphoric acid monoesters. Partial racemization of the binaphthyl-backbone was observed during the cyclization process leading to a formation of diastereomers of the furane-annelated naphthols, which was confirmed by spectroscopic and X-ray crystal structure analyses. Additional experimental and theoretical studies using a model substrate proved that both racemization and cyclization processes are acid-catalyzed. Since the barrier of the cyclization reaction is lower than the racemization, the cyclization proceeded faster than the racemization.
This work successfully concluded an in-depth investigation of the cyclization and racemization mechanism as well as the isolation and characterization of all six isomeric phosphoric acid monoesters. These phosphoric acids are the highly promising compounds for further use in chemosensing and catalysis.
The modified synthetic route involving the use of mono-iodo binaphthyl bis-carboxylic acids was successfully applied to form the mono-iodo allylamine (R)-86. This serves as an essential building block which can be connected by various linkers for the generation of bis-binaphthyl-amines.
Within the scope of this work, we succeed the formation one bis-binaphthyl-amine with 1,4-ethinyl benzene linker in nine steps. Only the last deprotection step to yield the bis-binaphthyl-amine is still pending. In future, the combination of bis-binaphthyl-phosphoric acids and bis-binaphthyl-amines will provide new possibilities to build complimentary supramolecular double helices
Numerical and experimental investigation of laser-induced cavitation bubbles and induced damage
No full textCavitation has shown its destructive effects on hydro-machinery and has been investigated since last century. Cavitation induced damages have not been very well understood in bulk cavitation. For a better understanding of the cavitation and induced damage, investigations of a single bubble collapse are useful and logical. These investigations allow describing and quantifying the physics of the cavitation bubble collapse near a solid surface and its interaction with the surface material.
The generation of such single bubbles in the water using an electric spark or focused laser beam are well-known experimental methods, which were used in the past and systematic investigations of bubble dynamics near surfaces exist. However, only a few studies addressed the material damage induced by a single bubble collapse. For fluids and materials engineer, quantification of series of physical tests are necessary to have a better idea up to what extent a tiny cavitation bubble can severely induce damage on metals surface. Therefore, the objective of this dissertation is an experimental and numerical investigation of the collapse of a single collapsing cavitation bubble and induced damage on the aluminum surface.
This dissertation presents experiments generating single cavitation bubbles with 3 mm diameter in the water. Cavitation bubbles were generated at various defined relative wall distances to the polished commercially pure aluminum specimen surface. The relative wall distance is a ratio of the distance between the bubble enter to a maximum bubble radius. The collapse of each laser-induced cavitation bubble was captured using a high-speed camera by the backillumination method. A detailed quantitative analysis of the surface damage was performed using 3D profilometry. A single cavitation bubble collapse results in a shallow pit with an average depth of 1 - 3 micrometer. The overall statistics of damage parameters such as pit depth, width and volume found consistent with previous investigations. Some damages obtained were correlated with the corresponding bubble collapse sequences. The image sequences also helped to identify effects of the sample surface edge on collapsing dynamics.
Further, numerical investigations of the three-dimensional flow surrounding a collapsing laserinduced cavitation bubble with an initial radius of 1.45 mm were performed using two different numerical methods. The three-dimensional flow was captured by solving the Navier-Stokes equations. First method accounts for the multiphase flow (water and vapor), the Volume of Fluid (VoF) method was used. The source term of the phase transport equation of the VoF function was based on the Schnerr-Sauer cavitation model developed using the simplified Rayleigh-Plesset equation. The relative wall distance was varied ranging from 0.3 to 3.0. Computed collapse derivatives, impact velocity, impact pressure, and shape of the bubble, such as toroidal shapes of oval impacts agreed favorably to the experimental measurements.
In addition, numerical investigations were performed using the compressible, two-phase Navier-Stokes equations in an Euler-Euler approach with barotropic equations of state. The bubble collapses were compared with the experiments for shapes and collapsing times. The obtained flow characteristics near the surface, such as impact velocities and pressures were also discussed. Further, a microscopic bubble collapse near the surface was also investigated to compute collapse induced wall shear rate and flow around the collapsing bubble. The results of numerical simulations were compared with the existing experimental data. The comparisons have shown a good qualitative and quantitative agreement. Overall, this work gives broad insight towards the investigation of cavitation bubble and induced damage
Tailored Affinity Polymers as Catalysts for Autoproteolysis of Trypsin
No full textMonomer- und Polymersynthesen
Im Rahmen der Dissertation konnte gezeigt werden, dass die Synthesen von verschiedenen Monomeren erfolgreich war. Die Monomer-Bibliothek wurde um insgesamt drei Monomere erweitert. Mit dem Adamantyl-Monomer 25 steht ein weiterer sehr hydrophober Baustein zur Verfügung, der besonders in kleinere Furchen passt. Das TREN-Monomer 26 ermöglicht die Komplexierung anionischer Liganden und das NBD-Monomer 27 dient als neuer Chromophor-Baustein.
Die Steigerung der Ausbeute für das NTA-Monomer 6 konnte nach allen Stufen knapp vervierfacht werden. So war es möglich nun 15.5 % Gesamtausbeute nach allen Stufen zu erreichen. Nach der Monomersynthese folgte die Darstellung von Polymeren zunächst über die im Arbeitskreis etablierte Technik der frei-radikalischen Polymerisation FRP. Diese Technik zeigte sich äußerst robust und lieferte vergleichbare Polymere aus verschiedenen Ansätzen. Die Reproduktion von Polymeren war mithilfe dieser Technik möglich. Der Nachteil dieser Reaktionstechnik ist die fehlende Einstellbarkeit der Polymerlänge und damit auch der Molekularmassenverteilung (PDI 1.35-2.15).
In einem weiteren Projekt wurde eine kontrolliert-radikalische Polymerisationstechnik etabliert. Hierbei handelte es sich um die Atom Transfer Radical Polymerization (ATRP), die eine bessere Kontrolle über die Polymerisationsbedingungen liefert. Allerdings wird bei der klassischen ATRP ein Metallsalz, meist Kupferchlorid, als Katalysator verwendet. Dies macht jedoch die Polymerisation von anionischen Monomeren nahezu unmöglich, da diese das Metallsalz komplexieren und somit dem Katalysezyklus entziehen.
Um diesen Umstand zu umgehen, wurde eine andere Variante der ATRP eingesetzt. Bei der Photo-Electron-Transfer ATRP (PET-ATRP) werden anstatt von Metallsalzen photoaktive organische
Substanzen eingesetzt, die unter Lichteinstrahlung Radikale bilden, die die Polymerisation vorantreiben. Als erfolgreich dargestellter Photokatalysator, der in der Polymerisation eingesetzt werden konnte, ist Phenylphenothiazin zu nennen.
Die Polymerisationen waren erfolgreich und die dargestellten Polymere waren von ihren Eigenschaften nahezu identisch. Die Polydispersitätsindizes waren mit 1.14 bis 1.21 gering, sodass von einer kontrollierten Polymerisation gesprochen werden kann. Die Einstellung der Kettenlänge und damit des Molekulargewichts
war nur bedingt möglich, wofür unterschiedliche Ursachen gelten können. Da das verwendete Glas einen Teil der UV-Strahlen absorbieren kann, wurde eine andere Klasse von Photokatalysatoren dargestellt, die auf 5,10-Dihydrophenazin basieren. Die Polymerisationen mit diesen Photokatalysatoren war nun mit sichtbarem Licht möglich und lieferten gut reproduzierbare Polymere mit einer hervorragenden Kontrolle über die Polymerisation, was sich an den niedrigen PDI von 1.19 bis 1.21 zeigt.
Inhibition der Serinprotease Trypsin durch Polymere
Die Untersuchung der Trypsin-Inhibition erfolgte mit einem sehr robusten Testablauf, der mit unterschiedlichen Puffern und Puffer-Systemen ausgeführt werden kann. Die Assays zeigten das interessantes Phänomen der Substöchiometrie der Trypsin-Inhibition mit Polymeren. Die ermittelten IC50-Werte lagen deutlich unter der 1:1-Stöchiometrie. Dieser Effekt trat mit zunehmender Inkubationszeit verstärkt auf, die benötigte Stoffmenge an Polymer, welche nötig ist um 50 % der vorhandenen Enzyme zu inhibieren, nahm weiter ab.
Mithilfe der CD-Spektroskopie konnte belegt werden, dass Trypsin eine Konformationsänderung in Gegenwart von Polymer durchläuft. Innerhalb von fünf Minuten ist die charakteristische Trypsin-Bande verschwunden. Diese Konformationsänderung war auch bei der Trypsin-Inkubation ohne Polymer zu beobachten, allerdings zu wesentlich späteren Zeiten als mit Polymer (~30 min). Die Änderung der Konformation von Trypsin ist auf die autolytische Aktivität dessen zurückzuführen, es ist sein eigenes Substrat.
In weiteren Analyseverfahren wurde die Gelfiltration und Gelelektrophorese eingesetzt um, einen tieferen Einblick in die entstehenden Fragmente zu erhalten. Für die Gelfiltration war es zunächst unabdingbar, die geeigneten Elutionsbedingungen zu finden, mit der eine Auftrennung der Spaltprodukte möglich ist. Die Chromatogramme zeigten eine Abnahme der Signalintensität des Trypsin-Signals, während gleichzeitig die Intensität von Peptiden im Bereich von etwa 1 bis 12 kDa anstieg.
Die Gelelektrophorese (SDS-PAGE) lieferte ähnliche Ergebnisse. Sie zeigten eine deutliche Beschleunigung der Fragmentbildung in Gegenwart von Polymer. Aufgrund dessen kann auf eine Erhöhung der autokatalytischen Aktivität geschlossen werden, die durch das Polymer katalysiert wird. Die Ergebnisse der nativen Massenspektrometrie zeigen ebenfalls eine beschleunigte Autoproteolyse des Enzyms in Gegenwart von Polymer P1. Die isotherme Titrationskalorimetrie jedoch zeigte keine bestimmbare Wärmetönung einer Trypsinogen-Polymer-Komplexbildung. Alle analytischen Verfahren und Methoden deuten in dieselbe Richtung, dass das Polymer die lokale Konzentration von Trypsin erhöht und damit die Wahrscheinlichkeit der Substratfindung ebenfalls deutlich erhöht, sodass die Trypsin-Moleküle sich gegenseitig am Polymer hydrolysieren.A major complication in pancreatitis, ischemia and cardiac surgery is the enzymatic self-digestion of the gastrointestinal walls. Most digestive enzymes are serine proteases, thus can be generally blocked by unspecific inhibitors such as aprotinin. However, the downsides of such inhibitors are the need of a stoichiometric amount, and the unwanted side-effect to other enzymes (e.g. in blood clotting). An alternative substance class of selective serine protease inhibitors are high-affinity polymers, which carries amino acid-selective side chains. In comparison to the conventional serine protease inhibitors, these polymers show ability to recognize the surface of a given enzyme allowing a highly specific and, in some cases, particularly substoichiometric inhibition.
The aim of this thesis was to investigate such polymer-based enzyme specific inhibitors and the synthesis of more precise high-affinity polymers via controlled polymerization protocols. The special scope laid on Trypsin due to its ability to activate the other pancreatic digestive enzymes. Syntheses of monomers and polymers Within the scope of this thesis the successful synthesis of different monomers could be shown allowing an expansion of existing library by additional three monomers. The Adamantyl monomer 25 is a highly hydrophobic building block that particularly suitable for smaller grooves. TREN monomer 26 enables the complexation of anionic ligands and NBD monomer 27 serves as a new chromophore building block.
A modification of the synthetic procedure for the NTA monomer
increased the overall yield by a factor of four resulted in 15.5% yield of final compound. The polymer syntheses were carried out using the well-established technique of free radical Polymerization (FRP). This technique was extremely robust, the different batches were comparable to their chemical and physical properties. The disadvantage of this reaction type is the lack of adjustability of polymer length and molecular mass distribution leads to higher polydispersity indices (PDI 1.35-2.15).
To overcome the disadvantage of FRP a controlled radical polymerization technique was established in another project. The so-called Atom Transfer Radical Polymerization (ATRP) provides a better control over the polymerization conditions, which is crucial for low PDI and adjustment of polymer length. However, the use of metal catalyst (e.g. cooper chloride) in classical ATRP is not applicable for a polymerization of anionic monomers due to the formation of metal-monomer complexes. Therefore, another variant of ATRP, the photo-electron transfer ATRP (PET-ATRP) was use for the polymerization. This method employs photoactive organic substances instead of metal salts to form radicals under light irradiation hence promote the polymerization. An example of such catalysts, the 10-phenylphenothiazine and 5,10-dihydrophenazine, could be successfully synthesized and employed for polymerization.
The polymers catalyzed by 10-phenylphenothiazine shown almost identical properties, giving rather low PDI between 1.14 to 1.21, so that a controlled polymerization can be mentioned. The other class of photocatalysts based on 5,10-dihydrophenazine allowed polymerization with visible light and proved highly reproducible polymers with excellent control, as evidenced by the low PDI of 1.19 to 1.21.
Inhibition of protease Trypsin by polymers
The trypsin inhibition was investigated using a very robust test procedure that can be performed with various buffers and buffer systems. The assays showed the interesting phenomenon of substoichiometric trypsin inhibition with polymers. This effect increased with longer incubation time and the amount of
polymer required to inhibit 50 % of the existing enzymes decreased further. CD spectroscopy has shown that trypsin undergoes a conformational change in the presence of polymer.
Within five minutes, the characteristic cotton bands of trypsin was no longer observable. Furthermore, this conformational change was also detected in trypsin incubation without polymer, however later than the sample with polymer (~30 min). The change in the conformation of trypsin is due to its autolytic activity.
In further analytical studies/experiments by gel filtration and gel electrophoresis were approached to obtain a deeper insight into the resulting fragments. For gel filtration, it was initially essential to find the appropriate elution conditions with which the cleavage products could be separated. The chromatograms showed a decrease in the signal intensity of the trypsin signal, while at the same time the intensity of peptides increased in the range of about 1 to 12 kDa.
Gel electrophoresis (SDS-PAGE) provided comparable results featuring a significant acceleration of fragment formation in the presence of polymer. This leads to an increase in the autocatalytic activity catalyzed by the polymer. As a result, all experiments pointed in the same conclusion: The polymer enhances the local concentration of trypsin thus significantly increases the probability of finding the substrates. This situation supports the self-hydrolyzation of trypsin molecules on the polymer surface