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Effects of a systemic inflammation on visceral pain perception and pain processing: a fMRI-study
No full textDie viszerale Hyperalgesie ist Kernsymptom gastrointestinaler Erkrankungen, insbesondere der funktionellen Syndrome, wie dem Reizdarmsyndrom, deren Pathophysiologie noch nicht umfassend geklärt ist. Klinische sowie tier- und human-experimentelle Befunde deuten auf eine ätiologische Relevanz immunologischer Prozesse, etwa im Rahmen einer niedrigschwelligen, systemischen Immunaktivierung hin. In dieser Studie wurde die Hypothese untersucht, dass eine experimentell induzierte systemische Immunaktivierung zu einer viszeralen Hyperalgesie sowie einer veränderten neuralen Verarbeitung viszeraler Reize führt, insbesondere im Bereich des präfrontalen, des primär- und sekundär-sensorischen und des anterioren cingulären Kortex, der anterioren und posterioren Inselrinde und in Kerngebieten des Thalamus. In einem randomisierten, doppelblinden und Placebo-kontrollierten Studiendesign wurden N=26 männliche, gesunde Probanden mittels funktioneller Magnetresonanztomografie untersucht, wobei N=14 Probanden intravenös eine niedrige Dosis Lipopolysaccharid (LPS, 0,4 ng/kg) zur Induktion einer systemischen Immunaktivierung und N=12 Probanden Placebo erhielten. Mittels druckgesteuerter rektaler Distensionen wurden viszerale Schmerzreize appliziert. Die viszeralen Schmerz-schwellen sowie die blood-oxygen level dependent (BOLD)-Antwort auf viszerale Distensionen wurden vor (Baseline) und zwei Stunden nach der LPS- bzw. Placeboapplikation gemessen. Während der Studie erfolgten wiederholte Blutabnahmen zur Bestimmung der Plasmakonzentrationen von proinflammatorischen Zytokinen (TNF-alpha, Interleukin-6) und Cortisol. Den Erwartungen entsprechend ließ sich eine viszerale Hypersensitivität im Sinne reduzierter Schmerzschwellen bei Probanden der LPS-Gruppe nachweisen. In der Analyse der BOLD-Daten ergaben sich signifikant stärkere Aktivierungen der posterioren Inselrinde, des dorsolateralen präfrontalen Cortex (DLPFC), des anterioren midcingulären Cortex (aMCC) und des sekundär-somatosensorischen Cortex bei Probanden der LPS-Gruppe. Es fanden sich zudem signifikante Korrelationen zwischen der Interleukin-6-Konzentration im Plasma und einem stärkeren BOLD-Signal im Bereich des DLPFC sowie zwischen TNF-alpha-Konzentrationen im Plasma und stärkerem BOLD-Signal in den Regionen des DLPFC und des aMCC. Diese Ergebnisse deuten auf eine veränderte zentralnervöse Schmerzverarbeitung während einer experimentell induzierten systemischen Immunaktivierung hin. Insbesondere scheinen sensorisch-diskriminative sowie die Homöostase aufrecht erhaltende Zentren vermehrt involviert zu sein. Diese Ergebnisse können zu einem weiteren Verständnis der zentralnervösen Mechanismen der Schmerzverarbeitung während einer systemischen Immunaktivierung und potentiell der pathophysiologischen Mechanismen gastrointestinaler Schmerzen beitragen
Agenda-driven case management
No full textIm Gegensatz zu Routinetätigkeiten lassen sich wissensintensive Geschäftsprozesse – also Prozesse mit einem hohen Anteil an wissensintensiven Tätigkeiten, die von sogenannten Wissensarbeitern durchgeführt werden – nur schwer durch IT unterstützen. Das liegt vor allem daran, dass über den konkreten Lösungsweg und die dafür benötigten Daten nichts oder nur wenig im Vorfeld bekannt ist. Zwei wesentliche Ursachen hierfür sind, dass erstens der Ablauf von sehr vielen Parametern abhängig ist und dass zweitens diese Parameter sich auch über die Zeit verändern können. Solche Prozesse lassen sich unter anderem bei Trägern von Sozialleistungen oder in der privaten Versicherungswirtschaft beobachten. Dort steuern als Case Manager bezeichnete Wissensarbeiter komplizierte Leistungsfälle und koordinieren erforderliche Maßnahmen so, dass die Leistungen wirtschaftlich und bedarfsgerecht erbracht werden. Case Manager sind aufgrund ihrer Erfahrung, ihres breitgefächerten Fachwissens und der starken Vernetzung mit anderen Experten in der Lage, die wesentlichen Parameter der Prozesse zu erkennen, deren Veränderung stets nachzuverfolgen und den Ablauf entsprechend anzupassen.
Wie in der Dissertation gezeigt wird, können wissensintensive Prozesse nicht mit den herkömmlichen Methoden des Process Mining analysiert und mit Workflow-Managementsystemen unterstützt werden. Deshalb werden neue Konzepte und alternative Ansätze vorgestellt und erprobt, um solche Prozesse analysierbar zu machen und Case Manager bei deren Ausführung zu unterstützen. Die zentralen Beiträge der Dissertation sind ein Metamodell mit den adCM-Grundkonzepten, ein Konzept zur anwendungsübergreifenden Protokollierung der Aktivitäten eines Case Managers unter Berücksichtigung des Metamodells (Monitoring), eine Methode zur Messung von Ereignisprotokollkomplexität, eine Methode zur Erhebung von Wissen über den Prozess auf Grundlage der Ereignisprotokolle (Discovery) und eine Werkzeugarchitektur zur operativen Unterstützung von Wissensarbeitern, um das Wissen über den Prozess kontextbezogen bereitzustellen
Konforme Blöcke assoziiert zu verdrehten Gruppen
No full textGeometrische Darstellungtheorie erlaubt es uns zu einer einfachen und einfach zusammenhängenden algebraischen Gruppe G über einem Körper und einer positiven ganzen Zahl ein Vektorbündel, genannt Garbe der konformen Blöcke, über M_g, dem Stack, welcher Kurven von Geschlecht g parametrisiert, zu assoziieren. In dieser Doktorarbeit verallgemeinern wir diese Konstruktion indem wir die Gruppe G durch eine verdrehte Gruppe, die von Überlagerungsdaten abhängt, ersetzten. Den Methoden von Looijenga benutzend beweisen wir darüber hinaus, dass die Haupteigenschaften des klassischen Bündels der konforme Blöcke auch in dieser allgemeineren Situation gelten. Insbesondere beschreiben wir den WZW Zusammenhang, die sogenannte Fortsetzung von Vacua und die Fusionsregeln.Geometric representation theory allows to associate to each simple and simply connected algebraic group G over a field and to a positive integer, a vector bundle, called the sheaf of conformal blocks, over M_g, the stack of curves of genus g. This thesis generalizes this construction to the situation in which G is replaced by a twisted group which depends on covering data. Using the methods described by Looijenga in the untwisted case, we prove that the main features of the classical sheaf of conformal block still hold in this more general setting. In particular we describe the WZW connection, the propagation of vacua and the fusion rules
Influence of cold working on the fatigue behavior of austenitic high interstitial steels
No full textDie Kombination von bereits bekannten und neuen Erkenntnissen erweitert den Wissensstand für funktionelle Werkstoffe, die komplexen Beanspruchungen ausgesetzt werden. Die besonders guten mechanischen, chemischen und physikalischen Eigenschaften von austenitischen hochinterstitiell legierten Stählen (AHIS) machen diese zu funktionellen Werkstoffen und sind der Grund für den vielfältigen Einsatz in verschiedenen Bauteilen und Anwendungsgebieten.
Für die konstruktive Auslegung von Bauteilen spielen insbesondere die mechanischen Eigenschaften der Werkstoffe eine wichtige Rolle. Während AHIS im lösungsgeglühten Zustand die quasistatischen und zyklischen mechanischen Eigenschaften von konventionellen FeCrNi-Austeniten deutlich übertreffen, gilt dies im kaltverfestigten Zustand lediglich für die quasistatischen mechanischen Eigenschaften. Die Steigerung der mechanischen Festigkeit mittels Kaltverformung ist bei AHIS für die quasistatischen mechanischen Eigenschaften förderlich, jedoch nicht für die zyklischen Eigenschaften wie z. B. die Dauerfestigkeit. Ziel dieser Arbeit ist, den Einfluss von Kaltverformung auf die zyklischen mechanischen Eigenschaften von AHIS zu erklären.
Im Rahmen dieser Arbeit wurden AHIS im kaltverformten Zustand mit interstitiellen Legierungsanteilen (C+N-Gehalt) von 0,85 – 1,07 Gew% untersucht. Die Kaltverformung erfolgte über definiertes Längsrecken der Proben. Mit Hilfe von quasistatischen Zugversuchen und totaldehnungskontrollierten uniaxialen Zug-Druck-Ermüdungsversuchen konnten die quasistatischen und zyklischen mechanischen Eigenschaften der untersuchten AHIS gemessen werden. Anschließend wurden die beanspruchten Proben im Lichtmikroskop, REM (EBSD) und TEM untersucht.
Die quasistatischen Festigkeiten der untersuchten AHIS wurden mittels Kaltumformung sowie steigenden interstitiellen Legierungsanteilen C+N erhöht. Entgegen der quasistatischen mechanischen Eigenschaften im kaltverformten Zustand, wurden mit erhöhtem interstitiellen C+N-Gehalt die zyklischen mechanischen Eigenschaften der AHIS verschlechtert. Die ausgeprägte Versetzungs- sowie Mischkristallverfestigung der AHIS Werkstoffe im kaltverformten Zustand führt zu einer hohen Anzahl an Sekundärrissen an der Probenoberfläche und im Probeninneren. Auffällig ist, dass viele Sekundärrisse entlang von persistenten Lüdersbändern zu erkennen sind.
Auch wenn die zyklischen mechanischen Eigenschaften von AHIS mittels Kaltverformung nicht deutlich verbessert werden können, wird die Robustheit gegenüber Schäden erhöht. Die hohe Anzahl an Sekundärrissen führt zur Entspannung und Rissverzweigung in den AHIS und somit zu einer verlängerten Lebensdauer im Bauteil.The combination of already known and new knowledge makes it easier to understand and design functional materials like austenitic high interstitial steels (AHIS). AHIS are functional metals because of their advantageous mechanical, chemical and physical material properties. These properties are the main reason, why AHIS are used for diverse applications in different industrial domains.
Especially mechanical properties of materials play an essential role for technical design of applications. In solution annealed state AHIS show better monotonic and cyclic strength than conventional FeCrNi-steels. In cold worked state only the monotonic strength is better than FeCrNi-steels. The endurance limit doesn’t increase in the same ratio as the yield strength in cold worked AHIS.
In this study, the influence of cold working on the fatigue behaviour of AHIS with C+N- content of 0.85 – 1.07 wt-% was investigated. The specimens were cold worked by a defined strain rate. After cold working the specimens were fatigued by total strain controlled fatigue tests at room temperature. Monotonic and cyclic mechanical properties e.g. tensile strength and endurance limit of AHIS were measured by means of mechanical testing.
After mechanical testing the samples were investigated using optical microscopy, SEM including EBSD and TEM.
The monotonic strength of AHIS increases with cold working and increasing content of the interstitial alloying elements C+N. Cold working and an increasing content of interstitial alloying elements C+N have an opposite effect on the endurance limit of AHIS. With increasing content of interstitial alloying elements C+N and increasing cold working state the cyclic strength e.g. endurance limit decreases in AHIS.
The distinct ability of dislocation hardening and solid solution hardening of AHIS promotes the formation of secondary cracks at the surface and in the bulk of the specimens. Most secondary cracks were found along persistent Lueders bands.
The advantage of cold worked AHIS is the higher robustness against damage. A high amount of secondary cracks leads to relaxation within the material and permits crack branching. Thus, the lifetime of the AHIS material and component can be extended
Maßgeschneiderte Protein Inkapsulierung in einen DNA Käfig mittels geometrisch angeordneter supramolekularer Wechselwirkung
No full textIm Rahmen dieser Dissertation wurden verschiedene Aspekte der DNA-Nanotechnologie, Biologie und der supramolekularen Chemie miteinander verknüpft und zur Anwendung gebracht.
Die Arbeit kann in drei Teilbereiche unterteilt werden:
(i) Das Designen eines geeigneten hexagonalen turbularen DNA-Käfigs mittels der Software CaDNAno2, dessen räumliche Dimensionen zur Immobilisierung des Proteins DegP in seinen unterschiedlichen Oligomerisierungs-Zuständen entsprechen musste.
(ii) (ii) Die Synthese eines Oligonukleotid-Heptapeptid-Konjugates, welches supramolekular an die PDZ1 Domäne des Zielproteins bindet.
(iii) (iii) Das Laden des Proteins in den Käfig mit anschließendem Versuch der gerichteten Freisetzung des Proteins.
Der DNA-Origami-Käfig wurde mittels der Software CaDNAno2 als einlagiges, turbuläres und hexagonales DNA-Röhrchen mit einem inneren Radius von 20 nm und einem äußeren Radius von 23 nm entworfen und erfolgreich realisiert. Die einzelnen Seitenwände des Käfigs wurden durch jeweils speziell entworfene Oligonukleotide miteinander verknüpft, so dass zum einen die Orientierung der Seitenflächen zum Zentrum der Kavität (6p120 und 6p240) determiniert werden konnte, (vgl. Kapitel 3.2.1 und 3.2.2) und zum anderen durch eine flexible Verbindung der Seitenflächen mittels drei Thyminen eine zufällige Orientierung (6p180) der Seitenflächen zum Zentrum der Kavität vorlag. Zusätzlich wurde jede Seitenfläche mit der Option entworfen, mit null, ein, zwei oder drei (insgesamt 0cA1, 6cA1 oder 18cA1) orthogonal herausragenden Oligonukleotiden (Protruding-Arme), die als Verlängerung von zentral liegenden Oligonukleotiden zu sehen sind, ausgestattet zu werden. Die Protruding-Arme dienen als Träger für die mit Peptiden modifizierten komplementären Oligonukleotid-Liganden (Kapitel 3,3), welche wahlweise mit Fluorescein (Flc-A1-DPMFKLV) oder TAMRA (TAMRA-A1-DPMFKLV) ausgestattet waren. Mittels eines Biotin-modifizierten Liganden konnte durch Zugabe von Streptavidin die korrekte Formation der Konstrukte 6p120, 6p180 und 6p240 durch Gel-Elektrophorese und Raster-Kraft-Mikroskopie (AFM) bestätigt werden. Messungen durch das Transmissions-Elektronen-Mikroskop (durchgeführt von Pascal Lill am MPI in Dortmund im Rahmen seiner Masterarbeit) und der dynamischer Lichtstreuung bestätigten ebenfalls die korrekte Formation in Lösung. Unter Berücksichtigung des antiproportionalen Verhältnisses der Diffusionsrate durch den Käfig zur Größe des Proteins wurde der DNA-Origami-Komplex so geplant, dass das 12-mer des Proteins DegP bevorzugt binden sollte.
Die Synthese des Peptidfragmentes der Liganden erfolgte mittels Festphasenpeptidsynthese nach Standardbedingungen. Die N-terminale Aminogruppe der Peptidsequenz konnte direkt in eine Maleimide Funktion überführt werden (Kapitel 6.5.2.8.2). Ohne die Verwendung eines üblichen Crosslinkers konnten Thiol-modifizierte Oligonukleotide über eine kovalente Bindung an das Maleimid gebunden werden. Dieser erfolgreich etablierte Weg stellt somit eine universelle Methode dar, N-terminale Peptide direkt an Thiol-modifizierte Oligonukleotide zu binden. Eine Charakterisierung der Konjugate erfolgte anschließend mittels MALDI-TOF.
Das Laden diverser DegP Protein-Varianten (vgl. Kapitel 3.1, Tabelle 1) erfolgte nur in Anwesenheit des Peptid-Liganden (vgl. Kapitel 3.4.3), was die Selektivität der Methode erfolgreich demonstrierte und unspezifische Wechselwirkungen ausschloß. Das spezifische und erfolgreiche Binden an die DNA-Nano-Käfige konnte mittels interner Totalreflexionsfluoreszenzmikroskopie durch Überlagerung der Fluoreszenzsignale in Einzelmolekül-Experimenten bestätigt werden (durchgeführt durch die AG Birkedal, Aarhus Universität). Nach statistischer Auswertung der AFM-Bilder konnte gezeigt werden, dass eine Präferenz zur Immobilisierung von 12-meren im Verhältnis 1 : 2.2 : 1.3 für DegP6, DegP12 und DegP24 vorlag, was der Zielsetzung bezüglich der Selektivtät entsprach. Durch das Assemblieren eines 6p120 Käfigs mit einer unterschiedlichen Anzahl an Protruding-Armen (vgl. Kapitel 3.4.3.5) und dementsprechend mit einer unterschiedlichen Anzahl von Liganden konnte gezeigt werden, dass zum einen ein Ligand ausreicht, um ein Protein (DegP6) erfolgreich zu immobilisieren und zum anderen ein proportionales Verhältnis zwischen Ladungseffiziens und der Anzahl der Protruding-Arme besteht. Um den positiven Effekt einer hohen lokalen Konzentration der Peptid-Liganden auf die Bindeeffiziens der Proteine zu zeigen, wurden die DNA-Käfige mit den jeweiligen Ausrichtungen der Protruding-Arme (6p120, 6p180 und 6p240, vgl. Kapitel 3.4.3.4) und gleicher Anzahl der Liganden mit DegP12/24A488SA versetzt und mittels eines Vergleiches der Intensität des Fluorescein-Signals die höchste Bindeeffiziens im Verhältnis 8 : 1.4 : 1 (6p120: 6p180 : 6p240) für die Käfige mit nach innen-orientierten Liganden bestimmt. Nach dem erfolgreichen Immobilisieren des Proteins innerhalb der Kavität des Käfigs wurde anschließend eine Freisetzung des Proteins durch einen Austausch des zum Protruding-Arm nicht vollständig komplementären, mit Fluorophoren markierten Peptid-Liganden durch ein vollständig komplementäres Oligonukleotid versucht. Der erfolgreiche Austausch der markierten Liganden konnte mittels Gel-Elektrophorese gezeigt werden, jedoch nicht unter vollständiger Freisetzung des Proteins. Eine verbesserte Freisetzung konnte trotz Änderung der Nettoladung des Proteins ebenfalls nicht erreicht werden (vgl. Kapitel 3.4.3.8).
Zusammenfassend kann festgehalten werden, dass zum ersten Mal ein Protein durch schwache supramolekulare Interaktionen innerhalb einer DNA-Origamistruktur immobilisiert werden konnte. Diese Proteine konnten ohne chemische Veränderung nur aufgrund der räumlichen Nähe der Peptid-Liganden, die an die PDZ1-Domänen der Proteine bindeten, und der hohen lokalen Konzentration innerhalb der Kavität durch multivalente Wechselwirkungen mit geringer Reichweite im Käfig gehalten werden.
Die Bedeutung der Oberflächenladung der Proteine für die Immobilisierung innerhalb der Kavität bedarf noch weiterer Untersuchungen. Ein Indiz für diese Bedeutung liefern die Versuche mit dem molekularen Tweezer, welche an die Lysine an der Oberfläche der Proteine bindet und deren positive Ladung abschirmt. Folglich führt dies zur Abschwächung der unspezifischen Wechselwirkungen zwischen den Proteinen und dem Käfig, so dass diese erfolgreich geladen werden konnten.
Die analogen Ergebnisse der Experimente mit einer weiteren Struktur eines offenen Prismas im HoneyComb-Design (vgl. Kapitel 1.2.3) werden in Kapitel 8 gezeigt, da diese keine neuen, bzw. nur die bisherigen Ergebnisse bestätigende Resultate erbracht haben.During this PhD project, aspects of DNA nanotechnology, biology and supramolecular chemistry have been merged.
This work can be divided into three main parts: (i) the design of a suitable tubular DNA cage, which is able to encapsulate all different oligomers of DegP; (ii) the synthesis of a DNA-hepta-peptide conjugate, which binds non-covalently to the PDZ1 domain of the target protein and (iii) the loading of the protein.
The DNA origami cage was successfully designed and realized as a single-layer hexagonal DNA prism with an inner radius of 20 nm and an outer radius of 23 nm. Using special spatial staples strands for the face-to-face connections, the orientation of the faces towards the cavity could be programmed (6p120 and 6p240). Alternatively, stochastically oriented faces (6p180) were obtained using three thymines as flexible hinges (see chapter 3.2.1 and 3.2.2). Additionally, each face was equipped with zero, one, two or three orthogonal protruding arms (for a total of 0cA1, 6cA1 or 18cA1 arms, respectively). These arms were used for hybridization with DNA-peptide conjugates equipped with optional fluorophores (chapter 3.3). Correct formation of the different designs (6p120, 6p180 and 6p240) was proven by AFM and gel electrophoresis, after adding streptavidin to the biotinylated ligands. TEM characterization (performed by Pascal Lill at the MPI in Dortmund) and dynamic light scattering confirmed the correct dimensions of the DNA structures in solution.
The peptide sequence DPMFKLV was synthesized via solid phase peptide synthesis under standard coupling conditions. Transforming the N-terminal amino group of the peptide directly into a maleimide function allowed reaction with the thiol group of an oligonucleotide without the use of any crosslinking agents. This successful method represents a general method to link the terminal amino-group of a peptide to a thiol bearing oligonucleotide. Purification via HPLC allowed characterization of the DNA-DPMFKLV ligands per MALDI-TOF.
Loading of diverse DegP proteins (compare chapter 3.1, table 1) only took place in the presence of the A1-DPMFKLV ligands, demonstrating the validity of the encapsulation strategy (compare chapter 3.4.3). Successful and specific binding was shown at the single-molecule level using total internal reflection fluorescence (TIRF) microscopy, (performed by AG Birkedal, Aarhus University). Statistical evaluation of AFM images revealed preferential encapsulation of the DegP12 protein, with a ratio of 1.3 : 2.2 : 1 for the DegP6, DegP12 and DegP24, respectively. Loading experiments performed with DegP6A633SA and cages with a different number of PAs (see chapter 3.4.3.5) and a correspondingly different number of A1-peptide ligands, showed that one A1-DPMFKLV ligand is sufficient for encapsulation of the protein, with a loading efficiency proportional to the number of ligands. DNA origami cages with identical number of ligands but different orientations of the PAs (6p120, 6p180 and 6p240, see chapter 3.4.3.4) were loaded with DegP12/24A488SA. Gel electrophoresis analysis showed a highest binding efficiency for the 6p120 design in a ratio of 8 : 1.4 : 1 for the 6p120-, 6p180- and 6p240-designs, respectively, thus indicating the importance of a high local concentration of peptide ligands. After successful encapsulation of the protein, experiments to release the protein from the cage were performed, using single strand displacement reactions. Disappearance of the fluorophore signals from the cage sample showed successful displacement of the ligands; however, without releasing the protein. Variation of the pH of the solution and its ionic strength did not result in any beneficial effects (see chapter 3.4.3.8).
To sum up, it could be shown that a protein can be encapsulated within a DNA origami cage by weak non-covalent supramolecular interactions without any previous chemical treatment of the protein. The arrangement of a distinct number of peptide ligands in the vicinity of the corresponding binding sites on the protein surface allowed modulation of local concentration effects and multivalent short-range interactions in a single system.
The importance of the net charge of the protein for encapsulation within the cavity of the DNA nanochamber and the different binding efficiencies observed for distinct fluorophores, require further investigation. Evidence for the important role of the net charge is the successful loading of the DegP12 protein in presence of molecular tweezers, targeting the lysine residues on the surface of the protein.
Results of analogue experiments performed with a second DNA cage, (HoneyComb design, see chapter 1.2.3) are shown in chapter 8
Multivalent Ligands with anion-binding motif as stabilizers for protein-protein-interactions and as transfection vectors
No full textIm Fokus der vorliegenden Promotionsarbeit standen die Entwicklung und Untersuchung multivalenter Liganden als Stabilisatoren von Protein-Protein-Interaktionen (PPI) und als künstliche Gentransfektionsvektoren. Über molekulare Erkennungsprozesse sollten die biologischen Zielstrukturen supramolekular adressiert werden. Die Liganden sind dendritisch aufgebaute, polykationische Peptide. Als Grundgerüst wurden Lysine miteinander verknüpft, um zwei-, drei- oder vier-armige Verbindungen zu generieren. Als Seitenarme wurden verschiedene Peptidsequenzen bestehend aus Lysin, Tryptophan, Phenylalanin und Arginin, die über Glycin mit dem Grundgerüst verbunden wurden, verwendet. Das Guanidiniocarbonylpyrrol (GCP) sollte zusätzlich als künstliches Anionen-Bindungsmotiv verwendet werden. Für die Untersuchung der multivalenten Liganden als Modulatoren von Protein-Protein-Interaktionen wurde als Ziel die Wechselwirkungen zwischen dem 14-3-3ζ-Protein mit C-RAF und dem Tau Protein gewählt. Mittels Fluoreszenzpolarisations-Experimenten, DLS, nativer PAGE, ITC und SPR wurden die künstlichen Liganden untersucht. Insgesamt konnte erstmals durch Kombination von Multivalenz mit einer künstlichen Erkennungseinheit eine neue Klasse von Liganden vorgestellt werden, die die Interaktion zweier Proteine (14-3-3ζ/C-RAF und 14-3-3ζ/Tau Protein) stabilisiert. Es konnte nachgewiesen werden, dass auf die Stabilisierung sowohl die Multivalenz der Liganden als auch das auf Anionen-Erkennung angepasste GCP-Bindungsmotiv einen maßgeblichen und gewinnbringenden Einfluss nehmen. Die Untersuchungen der synthetischen Liganden im letzten Teil dieser Arbeit bezogen sich auf die Bindung von DNS und den Transport von genetischem Material ins Zellinnere. Dafür wurden die multivalenten Liganden mittels DLS, EB-Verdrängungsassays, ITC, AFM und Transfektionsexperimenten untersucht. Mit den hier vorgestellten multivalenten Liganden konnte eine neue Verbindungsklasse nicht-viraler Genfähren identifiziert werden. Die Transfektionsexperimente zeigen eindrucksvoll, dass nur die GCP-tragende Verbindung Zellen transfizieren kann. Somit kann ein Ligand durch den Einbau einer künstlichen Erkennungseinheit maßgeblich verbessert werden. Die Verwendung des GCP-Bindungsmotivs stellt daher ein gewinnbringendes Werkzeug für Weiterentwicklung von Transfektionsvektoren dar. Anhand der Arbeiten wurde das große Potential rational entworfener, multivalenter Liganden, die die künstliche Anionen-Erkennungseinheit GCP tragen, eindrucksvoll aufgezeigt. Eine Erhöhung der Bindungsmultivalenz in Kombination mit dem künstlichen Anionen-Bindungsmotivs sorgte sowohl für eine verbesserte Stabilisierung der PPI als auch für eine erhöhte Transfektionseffizienz der entwickelten Vektoren.The research focus of this thesis was centered on the development and investigation of multivalent ligands as stabilizers of protein protein interactions (PPI) and as artificial gene transfection vectors. Biological targets should be addressed supramolecular due to molecular recognition processes. These ligands are polycationic peptides built dendritically. As a scaffold several lysines were linked to obtain two-, three- or four-armed compounds. As sidechains different peptide sequences were used containing lysine, tryptophane, phenylalanine and arginine, which were connected to the scaffold via glycine as a linker. Additionally guanidiniocarbonylpyrrole (GCP) was used as an artificial anion binding motif. For the investigation of multivalent ligands as modulators of protein protein interactions the interaction between lightly acidic 14-3-3ζ protein and C-RAF or Tau Protein were chosen. By the use of fluorescence polarisation experiments, DLS, native PAGE and SPR the ligands were tested to influence the interactions. For the first time, however, a new class of ligands were introduced combining multivalency with an artificial recognition unit to stabilize the interation of two proteins (14-3-3ζ/C-RAF and 14-3-3ζ/Tau Protein). It was proven that the stabilisation effect was influenced essentially and advantageously by both multivalency of the ligands and especially the artificial and well designed anion binding motif GCP. In the last part of this thesis, the examinations of the synthetic ligands involved DNA binding properties and the ability to transport genetic material into cells. Thus the ligands were tested in DLS, EB-displacement assays, ITC, AFM and transfektion experiments. With the examination of the multivalent ligand a new class of non-viral gene delivery system was identified. Transfection experiments showed impressively only GCP-containing ligand to transfect cells. Thus, ligands could be improved essentially by the integration of artificial recognition units. The use of binding motif GCP is a powerfull tool for the development of transfection vectors. On the basis of these results demonstrate impressively the great capability of rational designed, multivalent ligands, which include the artificial anion recognition unit GCP. Increasing the binding valency of the ligand combined with the GCP-moiety improved both the stabilisation effect on PPIs as well as the transfection efficiency of the developed vectors
Transient responses in reverberation chambers during testing with pulsed sinus signals
No full textDie Dissertation beschäftigt sich mit transienten Einschwingvorgängen in Modenverwirbelungskammern, welche auf Basis verschiedener Messreihen in zwei Modenverwirbelungskammern unterschiedlicher Baugröße untersucht werden. Hierzu werden pulsmodulierte Sinussignale in beide Kammern eingespeist und durch Änderung der Rührer-, sowie Antennenpositionen zwei große Datensätze erzeugt.
Auf dieser Grundlage werden die transienten Einschwingvorgänge zunächst für Einschalt- und Ausschaltvorgänge der Signalquelle unter Berücksichtigung der statistischen Eigenschaften einer allgemeinen Modenverwirbelungskammer eingehend untersucht.
Aufgrund der hohen Güte einer Modenverwirbelungskammer kommt es im Mittel zu langen Einschwingzeiten nach Schaltvorgängen der Signalquelle. Dies erschwert den Betrieb für EMV-Messungen mit gepulsten Signalen geringer Pulsbreite. Es wird eine Vorkonditionierung der Eingangssignale erarbeitet, mit dem die Flankensteilheit der Pulse innerhalb der Kammer erhöht wird, ohne die Güte oder die statistischen Eigenschaften der Modenverwirbelungskammer ändern zu müssen. Der Vergleich mit dem herkömmlichen Verfahren, Absorber in die Kammer einzufügen, zeigt, dass die Vorkonditionierung weniger Eingangsleistung benötigt und zusätzlich das Problem der maximal zulässigen Beladung umgeht.This dissertation is about the transient responses to pulsed signals in reverberation chambers based on measurements in two reverberation chambers of different sizes. Pulse-modulated sinus signals are coupled into both chambers and two large measurement-databases are generated through variation of stirrer and antenna positions.
With this foundation first the transient responses to the turn-on and turn-off sequences of the signal source are analyzed considering the statistical characteristics of common reverberation chambers.
Due to the high quality factor of reverberation chambers the rise- and fall-times following the switching of the signal source are long. This makes EMC-measurements with pulsed signals of short pulse-width difficult. A pre-conditioning of the input signals coupled to the reverberation chamber is developed, increasing the slew rate of the pulses inside the chamber without changing the quality factor or the statistical characteristics of the reverberation chamber. The comparison to the usual practice of adding absorbers to the chamber shows, that the pre-conditioning requires significantly less power and circumvents issues with the maximum loading of reverberation chambers
Neuartige peptidische Ligandenkonjugate zur Hemmung der pathologischen Aggregation von Amyloid-beta bei Morbus Alzheimer
No full textEine Störung in der Proteinfaltung kann zur Bildung von extrazellulären ungeordneten Aggregaten und amyloiden Fibrillen führen. Diese Aggregatbildungen und toxischen Ablagerungen sind symptomatisch für viele Proteinfehlfaltungskrankheiten, wie z.B. Morbus Alzheimer, Morbus Parkinson oder Chorea Huntington. Bei der Alzheimerschen Krankheit führt eine Sekundärstrukturänderung der Aß-Monomere von einer alpha-helikalen in eine ß-faltblattreiche Struktur zur Bildung kleiner neurotoxischer Aggregate und folglich zur Entstehung von unlös-lichen Aß-Fibrillen. Bis heute spielen deshalb das Aß-Peptid und die Ver¬hinderung seiner unkontrollierten Aß-Aggregation zu kleinen Oligomeren und Fibrillen eine zentrale Rolle für die Entwicklung wirkungsvoller Therapeutika gegen die Alzheimerschen Krankheit.
Im Rahmen dieser Arbeit wurden neue Liganden entwickelt, die mit dem Aß-Peptid interagieren und seine Aggregation beeinflussen konnten. Es wurden zwei unterschiedliche Ligandenarten (D3-Liganden und Aminopyrazolliganden) synthetisiert, um später eine syner-gistische Wirkung beider Liganden zusammen zu erzielen. Die beiden Ligandentypen wechselwirkten auf unterschiedliche Weisen mit Aß und konnten somit die Aggregation auf verschiedene Wege verändern: Die D3-Peptidliganden fungierten als spezifische Aß-Erkennungseinheiten, trimere Aminopyrazolliganden wiesen hingegen eine ß-faltblattbrechende Aktivität gegenüber fehlgefalteten Peptiden auf.
Eine Besonderheit dieser Arbeit lag darin, nicht nur effektive neue Liganden herzustellen, sondern diese auch durch eine Thiolbindung auf ligandenfreie, biokompatible Goldnanopartikel zu immobilisieren und so funktionsfähige kleine Biokonjugate zu erhalten, die auf ihre inhibierende Wirkung gegenüber der pathologischen Aggregation des Aß-Peptids untersucht werden konnten. In Kooperation mit der Technischen Chemie wurden mittels Laserablation kleine, monodisperse Nanopartikel (d = 7 nm) in wässriger Lösung produziert, die mit verschiedenen Ligandenkonzentrationen und Ligandenmischungen funktionalisiert werden konnten. Bei monofunktionalen Konjugaten konnte durch eine Variation in der Ligandenkonzentration die Ligandendichte auf der Nanopartikeloberfläche gesteuert werden. Es konnten stabile Konjugate hergestellt werden, deren Goldoberfläche mit der maximalen Ligandenbelegung (418:1 Liganden-zu-Nanopartikel-Verhältnis, max. an die Oberfläche gebundene Liganden: 126 Trp-D3-Liganden, 161 Trim_5+-Liganden) gesättigt wurden und durch die mehrfach positive Einzelladung auch eine deutlich positive Gesamtladung aufwiesen. Alternativ dazu wurden sehr geringe Ligandenmengen (4 Liganden pro Nanopartikel) eingesetzt, so dass noch die negative Goldnanopartikeloberfläche die Gesamtladung des Konjugats dominierte und ein stabiles, anionisches Konjugat hergestellt werden konnte.
Weiterhin konnten bifunktionale Konjugate durch eine Mischung der beiden Ligandentypen auf der Goldoberfläche erhalten werden. Die getesteten Mischungsverhältnisse der Liganden waren 1:1, 1:10 und 10:1. Zusätzlich zu den bifunktionalen Konjugaten, bei denen die beiden Ligandentypen nebeneinander auf dem Nanopartikel immobilisiert vorlagen, wurde eine neue Hybridverbindung aus beiden Ligandentypen (Liganden hintereinander geknüpft) synthetisiert und auf die Partikel gebracht.
Die synthetisierten Liganden und ihre Goldnanopartikelkonjugate wurden auf ihre Wechselwirkung mit dem Aß-Peptid getestet. Es wurde der Einfluss der Substanzen unter anderem auf die Aß-Sekundärstruktur (CD, ThT), die Morphologie der Aß-Fibrillen (TEM, AFM) und auf die Größenverteilung von Aß-Aggregaten unter verschiedenen Inkubationsbedingungen mittels DGZ untersucht. Die Aggregate konnten bei der Kombination aus DGZ/ELISA nach ihrer Masse und Form aufgetrennt und quantifiziert werden. Es wurde die Aggregationshemmung der Substanzen gegenüber synthetischem Aß und in Zellkultur auch gegenüber in vivo exprimiertem Aß erforscht.
Durch die hier angewandten unterschiedlichsten Methoden konnte die Wirkung der hergestellten Liganden, bzw. der Konjugate auf die verschiedenen Aß-Spezies und bei unterschiedlichen Inkubationsbedingungen untersucht werden: So wurden die Substanzen in einigen Experimenten (ThT, CD, DGZ/ELISA) vor der Inkubation zu monomerem Aß gegeben, so dass diese die Aß-Aggregation direkt zu Beginn der Fibrillogenese inhibieren bzw. beeinflussen konnten. In anderen Experimenten, z.B. in AFM-Untersuchungen war eine Vorinkubation des Aß-Peptids notwendig. Die Substanzen wurden zu den vorgeformten Fibrillen gegeben, so dass hier nicht nur eine Inhibierung der darauffolgenden Aß-Aggregation, sondern hauptsächlich eine Desaggregation, bzw. Auflösung der Fibrillen erfolgte.
Die Affinität der Liganden gegenüber Aß zeigte allerdings durchgängig in allen Experimenten, dass sie durch die Immobilisierung auf Goldnanopartikel signifikant gesteigert werden konnte (teilweise um das 7-fache erhöht). Durch Messungen der Thioflavin T-Fluoreszenz konnte die Menge an Aß-Fibrillen in Lösung bestimmt werden. Hier konnten alle getesteten Substanzen eine Reduktion des ß-Faltblattgehalts erreichen. Bei den freien Einzelsubstanzen zeigte Trim_8+ selbst in sehr geringen Konzentrationen überragende inhibierende Eigenschaften. Ein Gemisch aus beiden Substanzen (D3_5+ und Trim_5+) konnte die Aß-Aggregation ebenfalls effizient inhibieren. Es konnte eine synergistische Wirkung der beiden Verbindungen beobachtet werden. Die Immobilisierung der Liganden auf Nanopartikel führte bei allen Substanzen jedoch zu einer enorm gesteigerten aggregationsinhibierenden Wirkung, teilweise bis zu einer 53-fachen Verstärkung. Trotz der sehr starken Ergebnisse in den ThT-Untersuchungen musste hierbei berücksichtigt werden, dass bei dieser Methode nur eine Reduzierung des Fibrillenanteils gemessen werden konnte. Demnach wurden hier keine Substanzen identifiziert, die die wichtigen neurotoxischen Oligomeren reduzieren konnten. Es musste ebenfalls gewährleistet werden, dass die Bindungsstellen von Aß für Thioflavin T zugänglich waren. Sobald die Epitope allerdings aufgrund der verschiedenen Aß-Strukturen oder durch Bindung von anderen Molekülen an die Fibrillen unzugänglich waren, konnte dies zu falsch negativ Ergebnissen führen.
Es konnte außerdem eine Auflösung bzw. Veränderung der pathologischen ß-Faltblattstruktur durch alle untersuchten Verbindungen beobachtet werden. So war in CD-Experimenten nachweisbar, dass die Liganden die Konformation des Aß-Peptids effektiv destabilisierten. Auch hier wurde eine gesteigerte Wirksamkeit durch Immobilisierung der Liganden erzielt (sowohl bei mono- als auch bei bifunktionalen Konjugaten). Allerdings hing die Effektivität der Liganden von ihrer Wirkdauer ab. Die CD-Spektroskopie lieferte grundsätzlich nur Informationen über eine Konformationsänderung der Peptide ohne allerdings eine konkrete Aussage über die vorliegenden Aß-Spezies in der Probe tätigen zu können.
In AFM-Bildern führten monofunktionale Au/D3-Konjugate zu einer Veränderung in der Morphologie der Aß-Fibrillen, wodurch sich kürzere Fibrillenfragmente bildeten. Bifunktionale Konjugate konnten den Fibrillenanteil, im Gegensatz zu den monofunktionalen Konjugaten, um den Faktor 3.2 herabsetzen. Allerdings zeigten die Ergebnisse der Mikroskopieuntersuchungen nur die Aß-Spezies, die zuvor auch auf der Substratoberfläche absorbierten. Diese Ergebnisse spiegelten möglicherweise nicht die gesamte Aß-Verteilung in Lösung wider.
In DGZ/ELISA-Untersuchungen hatten die Konjugate stets eine stärkere Wirkung als die freien Liganden. Die Selektivität der D3-Derivate für oligomeres Aß blieb auch nach der Immobilisierung auf der Goldnanopartikeloberfläche erhalten. Ebenfalls zeigten die D3-Derivate eine starke Wirkung auf größere Aß- Fibrillen und konnten diese auch nach längerer Inkubationszeit erfolgreich reduzieren. Allerdings führte ein Stabilisierungsversuch der Konjugate mit BSA zu einer Verschlechterung der Ergebnisse und schien die Interaktion zwischen Liganden und Aß durch die BSA-Proteinen zu behindern.
Mit der Kombinationsmethode DGZ/ELISA wurden die Aß-Spezies nach Aggregatgröße und Form aufgetrennt. So konnte in den Fraktionen durch Bestimmung der Aß-Menge untersucht werden, welche Aß-Formen von den Substanzen spezifisch unterdrücken werden konnten. Der Antikörper erkannte hierbei nicht einzelne Aß-Spezies, sondern konkret die Aß-Sequenz 1-16 des Peptids, so dass hier alle Aß-Strukturen detektiert werden konnten. Allerdings sollte auch hier sichergestellt sein, dass diese Sequenz des Aß-Peptids dem eingesetzten Antikörper zugänglich war. Demnach wäre eine Denaturierung der Aß-Spezies in den Fraktionen vor dem ELISA sinnvoll, so dass der Antikörper nicht durch ungünstige Aggregatformationen an seiner Bindung gehindert werden kann.
Die ersten Tests mit in vivo exprimiertem Aß bestätigten auch in Zellkulturexperimenten eine gesteigerte Wirkung nach der Immobilisierung der Liganden auf die Goldnanopartikel: Es wurden wesentlich geringere Konzentrationen an kleinen neurotoxischen Aß-Aggregaten und N-terminal verlängerten Monomeren gebildet. Keine der getesteten Substanzen war zytotoxisch. Eine Optimierung des D3-Peptids zu D3-(SG)7C führte als monofunktionales Konjugat zu einer Erhöhung in der Wechselwirkung mit Aß. In ThT-Experimenten konnte das neue Derivat die Aß-Aggregation stärker inhibieren, bzw. das Fluoreszenzsignal nahezu auslöschen. Allerdings konnte die kürzere D3-Variante in bifunktionalen Experimenten bessere Ergebnisse erzielen: Die Kombination aus D3_5+ und Trim_5+ zeigte sowohl in ThT-, als auch in CD-Untersuchungen stärkere Wechselwirkungen mit Aß als D3-(SG)7C mit Trim_5+.
Schlussendlich zeigten sich bei allen Experimenten jedoch eindeutige Trends: So konnte zusammenfassend festgestellt werden, dass alle neuen Liganden durch Immobilisierung auf Nanopartikel stets eine gesteigerte Wirkung in den durchgeführten Versuchen aufzeigten. Zu-sätzlich konnten erste bifunktionale Konjugate hergestellt werden, bei denen zum Teil eine synergistische Wirkung beider Liganden auf der Nanopartikeloberfläche beobachtet werden konnte. Im Rahmen dieser Arbeit konnten demnach erste erfolgreiche Ansätze für multifunktionale und multivalente Nanokonjugate für den Einsatz in Proteinfehlfaltungsprozessen gefunden werden
Experimentelle Endotoxämie beim Menschen: Geschlechterunterschiede in der inflammatorischen und neuro-endokrinen Reaktion
No full textIn der vorliegenden Arbeit wurden Geschlechterunterschiede in der inflammatorischen und neuroendokrinen Reaktion auf eine experimentelle Endotoxämie beim Menschen untersucht. Hierzu wurde eine akute systemische Immunreaktion mithilfe von niedrig dosiertem Endotoxin (Lipopolysacharid (LPS), 0,4 ng/ kg Körpergewicht) in gesunden Männern und Frauen induziert. Es konnte gezeigt werden, dass der weibliche Organismus in vivo während einer akuten systemischen Entzündungsreaktion mit einer stärker ausgeprägten Freisetzung der pro-inflammatorischen Zytokine Tumornekrosefaktor-α (TNF-α) und Interleukin-6 (IL-6) reagiert. Als Folge auf die intravenöse Injektion von LPS kam es zu einer Zunahme der Zustandsangst, zu einer negativen Verschiebung der Stimmungsparameter sowie zu einer Zunahme der Symptome des Sickness Behaviors, jedoch ohne signifikante Geschlechterunterschiede. Nichtsdestotrotz konnten signifikante Unterschiede in der neuroendokrinen Reaktion nachgewiesen werden. So reagierten die weiblichen Probanden mit einer höheren Sezernierung von Cortisol und Prolaktin als die männlichen. Der Noradrenalin und der Dehydroepiandrosteron (DHEA) Spiegel veränderte sich hingegen in beiden Geschlechtern ohne signifikante Unterschiede. Die Hypothese, dass die erhöhte pro-inflammatorische Immunantwort zeitgleich mit einem stärker ausgeprägten Sickness Behavior einhergeht, konnte nicht bestätigt werden. Auch die nachgewiesenen geschlechterspezifischen Unterschiede in der neuroendokrinen Immunantwort lieferten keine eindeutige Erklärung für die unterschiedlich verlaufende inflammatorische Immunantwort oder die fehlenden Unterschiede in der neuropsychologischen Reaktion. Ferner zeigte die ex vivo Untersuchung der Immunzellen auf geschlechtsspezifische Unterschiede in der Sensitivität gegenüber glukokortikoiden und adrenergen Rezeptor-Agonisten keine signifikanten Unterschiede. Zusammenfassend stellen die Befunde dieser Arbeit dar, dass es gravierende Geschlechterunterschiede in der akuten inflammatorischen und neuroendokrinen Immunantwort gibt. Diese spiegeln sich jedoch nicht in den neuropsychologischen Reaktionen wieder. Die Daten deuten darauf hin, dass der weibliche Organismus über kompensatorische Mechanismen verfügt, die der stärkeren inflammatorischen Immunantwort entgegenwirken und so Unterschiede in den neuropsychologischen Reaktionen unterbinden
Einige neue Fälle der Breuil-Schneider Vermutung
Get PDFLet F and E be two finite extensions of Q_p such that E is large enough. Let r be a Galois representation of absolute Galois group of F with coefficients in E. In 2013 Caraiani, Emerton, Gee, Geraghty, Paškūnas and Shin have constructed an E -Banach representation V (r) of GL_n(F). The authors have hypothesized that the representation V(r) corresponds to Galois representation r under hypothetical p-adic Langlands correspondence. In this work, we show that, under certain assumptions on r, the locally algebraic vectors of V (r) are isomorphic to an irreducible locally algebraic representation. This locally algebraic representation can be determined explicitly via the classical local Langlands correspondence and the knowledge of the Hodge-Tate weights of the Galois representation. From this we can derive new cases of the Breuil-Schneider conjecture.Seien F und E zwei endliche Erweiterungen von Q_p so dass E groß genug ist. Sei r eine Galois-Darstellung der absoluten Galois Gruppe von F mit Koeffizienten in E. Im Jahr 2013 Caraiani, Emerton, Gee, Geraghty, Paškūnas und Shin haben einen E-Banach Darstellung V(r) von GL_n(F) konstruiert. Die Autoren haben vermutet, dass die Darstellung V(r) der Galois-Darstellung r unter hypothetischer p-adische Langlands Korrespondenz entspricht. In dieser Arbeit zeigen wir, dass, unter bestimmten Annahmen auf r, die lokal algebraischen Vektoren von V (r) sind isomorph zu einer irreduziblen lokal algebraischen Darstellung. Diese lokal algebraische Darstellung kann explizit über die klassische lokale Langlands-Korrespondenz und die Kenntnis der Hodge-Tate Gewichte der Galois-Darstellung bestimmt werden. Daraus können wir neue Fälle für die Vermutung von Breuil-Schneider ableiten