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Echinocandin resistance and population structure of invasive Candida glabrata isolates from two university hospitals in Germany and Austria
No full textIn dieser Arbeit wurde die Empfindlichkeit gegenüber Antimykotika, die Anwesenheit von FKS-Mutationen und die genetische Struktur von Candida glabrata-Isolaten aus Blutkulturen von zwei unterschiedlichen Krankenhäusern in Deutschland und Österreich untersucht. Die Empfindlichkeitstestung der 64 C. glabrata-Isolate wurde mittels Bouillon-Mikrodilution nach EUCAST und dem Vitek®-2 System durchgeführt. Zusätzlich wurden alle Isolate auf das Vorhandensein einer FKS-Mutation untersucht. Molekulargenetische Untersuchungen wurden mittels Mikrosatelliten-PCR mit drei unterschiedlichen Oligonukleotiden und halbautomatisierter repetitiver sequenz-basierter PCR (rep-PCR) durchgeführt.
Grundsätzlich sollte bei allen C. glabrata-Isolaten, welche aus Blutkulturen isoliert werden, eine Resistenztestung durchgeführt werden. Das Vitek®-2 System ist eine routinetaugliche Alternative für die MHK-Bestimmung von Fluconazol, Amphotericin B und Caspofungin (CAS). Die Resistenztestung für Voriconazol sollte über die Bouillon-Mikrodilution nach EUCAST erfolgen. Anhand der Ergebnisse kann eine adäquate Therapieentscheidung bei einer Candidämie mit C. glabrata getroffen werden. Eine Initialtherapie sollte mit einem Echinocandin begonnen werden. Nur ein C. glabrata-Isolat aus Deutschland zeigte eine Resistenz gegenüber CAS und eine entsprechende Mutation in der Hotspot 1 Region auf dem FKS2-Gen.
Die Diskriminationsstärke der Mikrosatelliten-PCR war höher, als die der rep-PCR (Simpson-Index von 0,94 vs. 0,88). Es zeigten sich prominente Genotypen von Isolaten aus Deutschland und Österreich, allerdings ohne epidemiologische Hinweise nosokomialer Übertragungen. Wir konnten zeigen, dass die Populationsstruktur von C. glabrata hauptsächlich polyklonal mit spezifischen Genotypen und abhängig von der geografischen Lokalisation der Isolate ist.
Obwohl wir eine geringe Inzidenz von Echinocandin-Resistenzen in C. glabrata-Isolaten gefunden haben, sind weitere Studien zur Überwachung epidemiologischer Trends in Europa notwendig. Die genetische Populationsstruktur der C. glabrata-Isolate demonstriert überrepräsentative geographische Genotypen.In this work, the susceptibility of antifungal agents, the presence of FKS-mutations and the population-genetics of Candida glabrata were investigated. C. glabrata isolates from blood cultures were taken from two different sampling sites, the University Hospital Essen and the University Hospital Vienna for analysis. The susceptibility testing of a total of 64 C. glabrata isolates were carried out after EUCAST, using the microdilution method as well as by the use of Vitek®-2 System. In addition, each isolate FKS-mutations were investigated. Genetics were investigated by molecular-biological tools, microsatellite PCR including three oligonucleotides and by half-automated repetitive sequenced-based PCR (rep-PCR).
The aim of this study was to identify resistances in the tested isolates against fluconazole, amphotericin B, caspofungin and voriconazole. The above mentioned methods were tested on efficiency for this purpose. After comparison of all methods, the Vitek®-2 System is recommended for susceptibility testing including the determination of minimum inhibitory concentration (MIC) of fluconazole, amphotericin B and caspofungin. In contrast, the susceptibility against voriconazole should be tested in a microdilution, as recommended by EUCAST. On behalf of these results, an initial therapy could be started, mostly recommended using an echinocandin. Only one isolate (1.5 %) was detected with a hotspot mutation in the FKS2-gene, resulting in a resistance against caspofungin.
The analysis of the molecular methods revealed higher discriminatory power for the microsatellite-PCR compared to the rep-PCR (Simpson-Index 0.94 vs. 0.88). Prominent genotypes were detected in isolates from both hospitals. However, epidemiological, no nosocomial route of transmission could be detected. We could show that the population structure of C. glabrata is mainly polyclonal with specific genotypes, depending on the geographical origin of the isolate.
In conclusion, we found weak incidence of echinocandin resistance in C. glabrata. However, further epidemiological screening in Europe is recommended. The population structure of the C. glabrata isolates shows the overrepresented geographical genotypes
A data decomposition method for stepwise migration of complex legacy data
No full textFrüher oder später erreichen die Wartung und Weiterentwicklung der bestehenden IT-Kernsysteme in vielen Unternehmen ihre Grenzen. Aus Kostengründen und Gründen immer weiter steigender Anforderungen an die Leistungsfähigkeit solcher Systeme müssen diese Legacy-Systeme durch moderne IT-Kernsysteme abgelöst werden. Datenmigration ist hier ein unausweichlicher Bestandteil solcher Umstiege, wobei unterschiedliche Strategien verfolgt werden können. Eine stufenweise Datenmigration ist eine der bekanntesten Strategien, die oft wegen ihrer geringen Risiken und hohen Flexibilität eingesetzt wird: Die gesamte Menge des Datenvolumens wird in mehrere Datenmigrationstranchen aufgeteilt, die anschließend in individuellen Migrationsstufen in das neue System migriert werden. Der Schlüssel für eine erfolgreiche iterative Datenmigration
ist entsprechend die Strategie für die Dekomposition der Daten in geeignete Datentranchen.
Diese Arbeit präsentiert eine Strategie für die Dekomposition der Daten, bei der die gesamte Datenmenge eines komplexen monolithischen Legacy-Systems in unabhängige Datenmigrationstranchen aufgeteilt wird. Jede Tranche umfasst
nur die Daten, die im Rahmen einer Migrationsstufe während eines Downtime-Fensters des Systems migriert werden. Im Gegensatz zu anderen Ansätzen, die eine Datenmigration auf einer sehr hohen Abstraktionsebene beschreiben, werden in dieser Arbeit detailliert konzeptionelle Elemente und Heuristiken für die Dekomposition der Daten in unabhängige Datenmigrationstranchen vorgeschlagen. Die Datendekompositionsstrategie dieser Arbeit wurde dabei im Rahmen
von zwei unterschiedlichen Fallstudien evaluiert. Die zweite Fallstudie davon war eines der europaweit größten Datenmigrationsprojekte im Gesundheitssektor der letzten Jahre, das die Migration von mehreren Millionen von Kunden-Geschäftsobjekten beinhaltet.Sooner or later, in almost every company, the maintenance and further development of large enterprise IT applications reaches its limit. From the point of view of cost as well as technical capability, legacy applications must eventually be replaced by new enterprise IT applications. Data migration is an inevitable part of making this switch. While different data migration strategies can be applied, incremental data migration is one of the most popular strategies, due to its low level of risk and high flexibility: The entire data volume is split into
several data tranches, which are then migrated in individual migration steps. The key to a successful migration is the strategy for decomposing the data into suitable tranches. This work presents an approach for data decomposition where the entire data volume of a monolithic IT enterprise application is split into independent
data migration tranches. Each tranche comprises the data to be migrated in one migration step, which is usually executed during the application’s downtime window. Unlike other approaches, which describe data migration in a highly abstract way, specific heuristics for data decomposition into independent data packages are proposed here. The data migration approach described here was evaluated in two case studies, one of which was one of the largest migration projects in the European healthcare sector in last years, comprising millions of customer records
Oberflächenmodifizierung von Bipolarplatten für Brennstoffzellen mittels Plasmabehandlung
No full textFuel cells are regarded as modern and promising alternative energy sources, therefore they have earned scientific interest. Proton exchange membrane fuel cells, which are of main interest for research and development in ZBT (Duisburg), typically consist of two
electrodes – bipolar plates, separated by a proton exchange membrane. During the process of fabrication of graphite/polypropylene composite bipolar plates the surface of bipolar plates is enriched by polypropylene significantly reducing the electrical conductivity and thus the efficiency of the fuel cells. Surface conductivity can be improved by plasma treatment. In this work a plasma source by IPLAS was used in a remote mode. This device allows to vary a lot of parameters to find the treatment conditions suitable for carbon bipolar plates.
It is shown how plasma treatment removes polymer from the surface. The most suitable experimental parameters for this task are found. The removal of polypropylene from the surface of bipolar plates is corroborated by the measurements using FTIR spectroscopy method. Furthermore, it is shown by Raman spectroscopy that graphite
on the surfaces of the samples exposed in plasma changed its structure from nanocrystalline to polycrystalline. Fewer interfaces between the crystals lead to the reduction of electron scattering and hence the conductivity of the plasma treated samples is higher than the conductivity of the untreated ones.
The etching effect on the surface is correlated with the plasma chemistry, what can be observed by optical emission spectroscopy. Various changes of surface chemistry and also morphology and topography of the surface after the plasma treatment are described and explained.
The measurements of area specific resistance of bipolar plates showed that the electrical properties of bipolar plates for fuel cells were uccessfully improved by plasma treatment. It is demonstrated that plasma treatment by air at atmospheric pressure is an efficient method to improve the electrical conductivity of bipolar plates.Brennstoffzellen werden im Allgemeinen als eine moderne und vielversprechende alternative Energiequelle angesehen, weswegen sie ein großes wissenschaftliches Interesse erhalten haben.
Brennstoffzellen, dessen Erforschung und Produktion ein Schwerpunkt
im ZBT ist, bestehen aus zwei Bipolarplatten, welche durch die
Protonen-Austausch-Membranen voneinander getrennt sind. Bei der Herstellung von Bipolarplatten auf der Basis von Grafit/Polypropylen wird die Oberfläche mit Polypropylen angereichert, was zu einer signifikanten Verringerung der elektrischen Leitfähigkeit und somit des Wirkungsgrades der Brennstoffzelle führt. Es ist möglich die Oberflächenleitfähigkeit mit der Hilfe einer Plasmabehandlung zu verbessern. In dieser Arbeit wurde eine Plasmaquelle der Firma IPLAS verwendet, bei welcher die Probe im
Remote-Bereich positioniert werden kann.
Es wird gezeigt, wie die Plasmabehandlung das Polymer von der Oberfläche entfernt. Für diesen Zweck werden die besten Parameter bestimmt. Die Entfernung des Polypropylens wird durch Messungen mittels FTIR Spektroskopie nachgewiesen. Weiterhin wird mittels Raman Spektroskopie gezeigt, dass der Grafit an der Oberfläche seine Struktur
von Nanokristallin zu Polykristallin ändert. Weniger Korngrenzen führen zu einer Vergrößerung der elektrischen Leitfähigkeit der plasmabehandelten Bipolarplatten.
Die Mechanismen des Plasmaätzen stehen in Verbindung mit der chemischen Zusammensetzung des Plasmas, was mithilfe der optischen emissions- Spektroskopie beobachtet werden kann. Eine Vielzahl von Änderungen der Oberflächenchemie, Morphologie und Topografie nach der Plasmabehandlung werden aufgezeigt und beschrieben.
Die Messung des flächenspezifischen Widerstandes zeigen, dass die elektrischen Eigenschaften der Bipolarplatten für die Anwendung in Brennstoffellen erfolgreich durch das Plasmaätzen verbessert werden konnten. Es wird gezeigt, dass Plasmabehandlung mit Luft unter Atmosphärendruck eine effiziente Methode darstellt, um die elektrische Leitfähigkeit zu verbessern
A spectral Least Squares collocation method on triangular elements and its application for the solution of elliptic and Navier-Stokes equations
No full textIn dieser Arbeit haben wir eine spektrale Least-Squares Kollokationsmethode auf Dreieckslementen entwickelt.
Als Kollokationspunkte wurden die Feketepunkte für die Polynomgrade N = 3, 6, 9, 12 verwendet. Für die Approximation der gesuchten Lösung wurden die orthonormalen Dubinerpolynome als Ansatzfunktionen ausgewählt. Um die höhere Regularitätsbedingung der gesuchten Lösung, die für die Anwendung der Methode der kleinsten Quadrate benötigt wird, herabzusetzen, wurden Hilfsfunktionen eingeführt. Die Anwendung der Kollokationsbedingungen zusammen mit Rand- und Interfacebedingungen führte zu einem überbestimmten Gleichungssystem, welches mit der Methode der kleinsten Quadrate effizient gelöst werden konnte.
Durch die Anwendung der hier vorgestellten Methode auf Stokes- und Navier-Stokes-Probleme wird die LBB-Bedingung umgangen. Somit konnten wir für die Approximation der Geschwindigkeitskomponenten und des Druckes Polynome gleichen Grades verwenden.
Die Anwendung unserer Methode auf das Poisson-Problem und die Konvektions-Diffusions-Gleichung lieferte exponentielle Konvergenz für glatte Lösungen. Für die in den letzten beiden Kapiteln betrachteten Stokes- und Navier-Stokes-Probleme konnten wir dieses Verhalten ebenfalls nachweisen. Zur Zeitdiskretisierung des instationären Problems wurde ein BDF-Verfahren der Ordnung zwei benutzt. Unsere numerischen Ergebnisse bestätigen, dass hier ein Verfahren zweiter Ordnung vorliegt und unsere Methode auch für zeitabhängige Probleme sehr gute Ergebnisse liefert.
Für das im letzten Beispiel betrachtete Driven-Cavity-Problem erhalten wir sehr gute Lösungen für unterschiedliche Reynolds-Zahlen. In diesem Beispiel konnten wir zeigen, dass unsere Methode die Bedingung zur Massenerhaltung sehr gut erfüllt.In this thesis we developed a Least Squares Collocation method using triangular elements to solve elliptic and Navier-Stokes equations.
The Fekete points of the triangle were used as collocation nodes for polynomial degrees N = 3, 6, 9, 12. We used the orthonormal Dubinerpolynomials as trial functions to approximate the unknown exact solution. To reduce the higher regularity requirements of the Least Squares method, the governing equations are transformed to an equivalent first-order system.
The collocation conditions, the boundary conditions and the interface conditions lead to an overdetermined system. This System can be solved efficiently by Least Squares methods.
The application of our scheme to Stokes- and Navier-Stokes equations circumvents the Ladyzhenskaya-Babuska-Brezzi condition (inf-sup stability condition). Therefore we are able to employ polynomials of the same degree for the velocity components and for the pressure.
Our numerical simulations in Chapter 3 and 4 verify the spectral convergence property for smooth solutions of elliptic equations. In Chapter 5 and 6 we demonstrate spectral convergence for smooth solutions to the Stokes- and Navier-Stokes problems.
For the time integration of the unsteady problems we used the second order BDF scheme.
It can be observed that our scheme performs very good and our numerical results confirm that it is of second order in time.
In Chapter 6 we succesfully applied our scheme to the driven cavity flow problems for various Reynolds numbers. For this example we confirmed exellent conservation of mass
Upscaling of the laser-based nanoparticle synthesis for heterogenous catalysis
No full textDie vorliegende Arbeit behandelt die Optimierung der Prozesskette von einem Targetmaterial zu einem heterogenen Katalysator auf Basis von geträgerten Nanopartikeln, die bis zum heutigen Stand der Technik in einzelnen diskontinuierlichen Prozessschritten realisiert wird. Dabei bestand das Hauptziel und Motivation in der Realisierung einer vollkontinuierlichen Prozesskette, die die laserbasierte Partikelherstellung, die Optimierung der Nanopartikelgröße und deren Abscheidung auf einem Trägermaterial berücksichtigt sowie durch eine Wirtschaftlichkeitsbetrachtung der gesamten Prozesskette ergänzt wird.
Im ersten Abschnitt der Partikelerzeugung konnte auf Basis eines Drahtes als Abtragsmaterial ein Aufbau realisiert und entwickelt werden, in dem eine vollkontinuierliche Herstellung von Nanopartikeln (NP) erreicht werden kann. Dabei wurde mittels mechanistischer Untersuchungen das Verständnis über den Partikelentstehungsmechanismus während des Drahtabtrags erweitert. Aufgrund der Kavitationsblasenlimitierung beim Drahtabtrag wurde gleichzeitig eine Optimierung der Durchflusskammer realisiert und mit dieser für Goldnanopartikel eine Produktivität im g/h-Maßstab sowie ein laserleistungsspezifischer Produktivitätsrekord erreicht. Im letzten Teil dieses Abschnittes konnte eine Gesetzmäßigkeit hergeleitet werden, welche auf eine Erweiterung des Neuenschwander-Modells basiert und mit der die Abtragsrate eines bestimmten Materials über die Materialparameter vorhergesagt werden kann. Die thermischen Effekte des Nanosekundenlasers wurden dazu integriert, wodurch eine deutlich bessere Korrelation zu den Produktivitätsdaten erhalten werden konnte.
Im zweiten Teil konnte eine Optimierung der Fragmentierungseffizienz von Goldnanopartikeln erreicht und so ein Fortschritt zur Realisierung der kontinuierlichen Partikeloptimierung erzielt werden. So wurde schon innerhalb einer Passage durch die Reduzierung der optischen Weglänge innerhalb der Fragmentierungsdurchflusskammer von 5 auf 4 mm eine vollständige Partikeloptimierung, eine Reduzierung der Partikelgröße sowie eine Erhöhung des Massenanteils an Nanopartikeln kleiner als 5 nm erreicht. Damit konnte gezeigt werden, dass die Prozesskette bis zu diesem Schritt im Falle von Au-NP vollkontinuierlich umgesetzt werden kann.
Im dritten Teil konnte erstmals eine kontinuierliche Partikelabscheidung von Edelmetallnanopartikeln auf oxidischen (TiO2) sowie kohlenstoffbasierten Trägermaterialien erreicht und so die kontinuierliche Herstellung von laserbasierten heterogenen Katalysatoren realisiert werden. Hierzu wurde ein kontinuierlich arbeitendes System auf Basis eines statischen Mischers entwickelt. Die Charakterisierung des statischen Mischers hat gezeigt, dass die Verweilzeit der Komponenten ausreicht, um eine quantitative Adsorption zu erreichen und die hergestellten Katalysatoren mit denen im Batchprozess gleichwertig sind. Im letzten Abschnitt behandelt die Arbeit den ökonomischen Aspekt der laserbasierten Synthese von heterogenen Katalysatoren sowie der einzelnen Prozessschritte. So konnte in diesem Kapitel gezeigt werden, dass die laserbasierte Synthese mit den in dieser Arbeit verwendeten ns-Lasern, im Vergleich zur nasschemischen Methode (NP-Konzentration von 800 mg/l) ab einer NP-Menge von 236 g wirtschaftlicher ist.
Allem in allem konnte gezeigt werden, dass die Kosten laserbasierter heterogener Katalysatoren mit kommerziell angebotenen Katalysatoren mithalten können und somit die Prozesskette auch aus wirtschaftlicher Hinsicht vielversprechend ist. Damit konnte diese Arbeit erstmals zeigen, dass die laserbasierte Prozesskette, die Prozesskette beginnend bei der Laserablation, über die Laserfragmentierung bis hin zur Trägerung der Kolloide auf einem Trägermaterial und damit die Herstellung zum fertigen heterogenen Katalysator vollkontinuierlich umgesetzt werden kann und somit ein Grundstein für die Etablierung laserbasierter Katalysatoren in die Industrie gelegt werden konnte.The present work deals with the optimization of the process chain to generate heterogeneous catalysts based on the laser ablation process. The main aim of the work was the realization and implementation of the process chain in a fully continuous way. The work is divided into four parts, in which the first three parts address the particle generation, particle size optimization and the particle deposition. Moreover, in the last part an economy evaluation of the whole process chain was carried out.
In the first part of the particle generation chapter a fully continuous ablation process based on a wire as ablating material were developed and realized. In addition to the development of the setup, the dynamics of the process have been investigated by mechanical studies, which expanded the understanding of the ablation process of the wire in a limited liquid jet. Due to the limitation of the wire ablation process caused by the cavitation bubble, a simultaneous optimization of the flow chamber was realized. With this chamber, a nearly continuous ablation process is feasible with nanoparticle (NP) productivities in the g/h scale as well as a laser power-specific nanoparticle productivity record (for gold nanoparticles (Au-NPs)). Based on the obtained productivity data, in the last part of this section a mathematical model could be developed. With this law, the removal rate of a certain material can be predicted. Therefore, the material parameters should be known and are necessary to calculate the ablation efficiency for a variety of materials. This law is based on an optimized expansion of the Neuenschwander model, which was postulated for material removal of picosecond laser in air. The thermal effects of the nanosecond laser were integrated in this model and thus a much better correlation with the productivity results was obtained.
In the second part, the fragmentation efficiency of Au-NPs was increased and thus a progress to a fully continuous particle optimization could be achieved. A complete particle optimization and a particle size reduction under 5 nm within one passage has been achieved by reducing the optical path length of the fragmentation flow chamber from 5 to 4 mm. Thus, it could be shown that the process chain in case of Au-NPs can be implemented fully continuously up to this step.
In the third part, a continuous production of laser-based heterogeneous catalysts could be realized for the first time. For this purpose, a continuous system was developed in this work, which is based on a static mixer. Characterization of the static mixer has shown that the residence time of the components is sufficient to achieve a quantitative adsorption on the supporting material. In comparison to the conventionally prepared catalysts in a batch process, microscopic and electrochemical investigations have shown that they are qualitatively equivalent.
In the last section, the work deals with the economic analysis of the laser-based synthesis of heterogeneous catalysts as well as the economy evaluation of the individual process steps. Thus, it was shown in this chapter that the laser-based synthesis with the ns lasers used in this work compared to wet-chemical method (NP concentration of 800 mg/l) is more economic above a NP amount of 236 g. Furthermore, it was shown that the continuous operation of particle optimization as well as deposition process for larger quantities are significantly more economic. All in all, it could be shown that the costs of laser-based heterogeneous catalysts can keep up with commercial catalysts and thus the process chain is also acceptable from an economic point of view.
Overall, for the first time, this work has shown that the laser-based process chain right up to the synthesis of heterogeneous catalyst can be fully continuously implemented and a g/h scale in NP production can be reached
Individualization-oriented supervision and assistance in human-centered cognitive technical systems
No full textWith the rapid development of computer technologies and programming techniques, intelligent machines have significantly changed the ways humans live and work recently. The term "cognitive technical system (CTS)" has been used by many researchers referring to an embedded computer system equipped with human-like cognitive capabilities. These cognitive capabilities may enable the system to perceive from the environment, to learn from the interactions with humans to reason and plan according to knowledge, and even to act adaptively to human individual preferences. Within the interactions with a CTS, humans are taking increasing responsibilities as a participant or a supervisor. A major challenge of such human-centered CTS is how to aid humans in an individual and adaptive way since human individuals distinguish from each other by their different understandings of the interactions.
In this thesis, a novel implementation for individualized supervision and assistance in the interactions between humans and CTS is focused. The underlying approach of the implementation is the Situation-Operator Modeling (SOM). The basic idea of the approach is to assume that changes in the real world can be described as a sequence of scenes and actions. The scenes are described by the term "Situations" and actions by "Operators''. The interactions between humans and CTS can then be demonstrated as logical sequences of situations connected by operators like a network, which is defined as an action space. The identification of the current situation in the action space can be used for supervision and assistance.
Considering the human individual behavioral differences, it is necessary to represent the distinctions using a situation. Hence, the characteristics, which are the basic components of a situation, are categorized as individualizable and nonindividualizable ones. The influences of individual behavioral differences on interactions between humans and CTS can then be indicated from the selection of operators depending on the individualizable characteristics. For a better understanding of the implementation, the scenario of a lane changing maneuver is used in this work as an example.
Based on the concept of automated driving supervision represented using SOM, the analysis starts with experiments in a simulated virtual driving environment to collect data of the test drivers. All test drivers possess a driver's license so that the experiment can be measured in a realistic way. In the evaluation of experiments, selected measurements have shown the existence of their correlations to the driver's individual behavioral differences.
These correlations can be described using a driver individual behavioral region (IBR). Different statistical approaches are used to represent and illustrate the IBR, including Time-to-Collision, bivariate boxplot, and nonparametric probability density estimation methods. The comparison of the methods shows that both bagplots and the contour diagram based on bivariate kernel density estimation are capable to construct the IBR, as well as to detect the abnormal behaviors of humans.
The result of this thesis enriches the SOM-based representation by taking the individualizable characteristics under consideration. The implementation with the scenario of lane changing maneuver as an example has shown the capability of detecting and representing the IBR of a driver and the possibility to realize an individualized supervision and assistance in the interactions between humans and CTS.Durch die schnelle Entwicklung in den letzten Jahren der Computertechnologien und der Programmiertechniken haben intelligente Maschinen die Art und Weise des menschlichen Lebens und des menschlichen Arbeitens vor einiger Zeit deutlich geändert.
Der Begriff eines „kognitiven technischen Systems“ (auf Englisch „cognitive technical Systems“, abgekürzt CTS) ist von vielen Forschern verwendet worden, die sich auf ein systemintegriertes Rechnersystem beziehen, welches menschenähnliche kognitive Fähigkeiten besitzt. Diese kognitiven Fähigkeiten ermöglichen die Wahrnehmung der Umwelt, das Lernen aus den Interaktionen mit Menschen, die erkenntnisbasierte Vernunft und Planbarkeit, und das adaptive Handeln auf die individuellen Bevorzugungen. Während der Interaktionen mit einem CTS sind die Menschen in zunehmendem Maße Teilnehmer oder Betreuer der kooperativen Aufgaben. Eine große Herausforderung für solche menschzentrierte CTS ist es, die Menschen aufgrund ihrer unterschiedlichen Grade an Verständnis des Systems individuell und adaptiv unterstützen zu können.
Diese Arbeit konzentriert sich auf eine neuartige Umsetzung zwecks einer individualisierten Überwachung und Unterstützung in den Interaktionen zwischen Menschen und CTS. Hierzu wird eine zugrundeliegende Modellstruktur, der Situation-Operator Modellbildung (abgekürzt SOM) Ansatz, verwendet. Es wird im Ansatz angenommen, dass die Veränderungen in der realen Welt als eine Abfolge von Szenen und Handlungen beschrieben werden können. Die Szenen und die Handlungen werden mit den Begriffen „Situationen“ und „Operatoren“ beschrieben. Die Interaktionen zwischen Menschen und CTS können dann als logische Abfolgen der Situationen dargestellt werden, die miteinander wie ein Netzwerk durch Operatoren verbunden sind. Dieses Netzwerk ist definiert als Handlungsraum. Die Erkennung der jeweils aktuellen Situation im Handlungsraum kann zur Überwachung und Unterstützung genutzt werden.
Unter Berücksichtigung der menschlich individuellen Verhaltensunterschiede des Menschen ist es notwendig, diese Unterschiede mit einer Situation darzustellen. Daher können die Grundkomponenten einer Situation und die Merkmale als individualisierbar und nichtindividualisierbar gekennzeichnet werden. Der Einfluss individueller Verhaltensunterschiede auf die Interaktion zwischen Menschen und CTS kann dann mit der Auswahl der Operatoren in Abhängigkeit von den individualisierbaren Merkmalen angezeigt werden. Zum besseren Verständnis der Umsetzung werden Szenarien von einem Spurwechselmanöver als Beispiel in dieser Arbeit verwendet.
Die Analyse basiert auf dem Konzept der automatisierten Fahrerüberwachung, das mit SOM dargestellt wird. Dazu werden Fahrversuche mit Testfahrern in einer simulierten und virtuellen Umgebung durchgeführt, um Daten zum Spurwechsel-manöver zu sammeln. Alle Testfahrer verfügen über einen Führerschein, damit die Fahrversuche realistisch durchgeführt werden können. Anhand der Auswertung der Probedaten zeigen ausgewählte Messungen die Existenz der Zusammenhänge zwischen den Daten sowie die individuellen Verhaltens-unterschiede der Fahrer.
Diese Zusammenhänge können mit einer individuellen Verhaltensregion (auf Englisch „individual behavioral Region“, abgekürzt IBR) beschrieben werden. Verschiedene statistische Methoden werden verwendet, um IBR zu beschreiben und zu illustrieren, wie z. B. Time-to-Collision, bivariate Boxplot und nichtparametrische Wahrscheinlichkeitsdichteschätzung. Aus dem Vergleich zwischen den Methoden wird ersichtlich, dass der bivariate Boxplot und das Konturdiagramm der bivariaten Kerndichteschätzung verwendet werden können, um die IBR darzustellen. Die Messwerte, die abnormale Verhaltensweisen repräsentieren, können auch mit den Methoden gekennzeichnet werden.
Das Ergebnis dieser Arbeit bereichert das SOM-basierte Konzept für die Fahrer-überwachung und Fahrerassistenz unter Berücksichtigung und Einsätze der individualisierbaren Merkmale. Die IBR kann mithilfe statistischer Methoden für die Szenarien des Spurwechselmanövers dargestellt werden
Microgel particles as model colloids for removal of mycoplasma by membranes
No full textBiologische Kontaminationen durch Bakterien und Viren gehören zu den zentralen Herausforderungen in der biopharmazeutischen Industrie. Besonders die Abtrennung von pleomorphen, deformierbaren und gesundheitsschädlichen Mykoplasmen stellt in diesem Zusammenhang kein triviales Trennproblem dar. So konnte gezeigt werden, dass einige Mykoplasmen unter bestimmten Filtrationsbedingungen sogar derzeitig kommerziell verwendete 0,1 μm klassifizierte Sterilfiltermembranen penetrieren können. Daher besteht ein hoher Bedarf speziell für dieses Trennproblem optimierte Hochleistungsmembranen zu entwickeln. Ein wesentliches Problem besteht in diesem Zusammenhang darin, dass die Verwendung von lebenden Mykoplasmen in Filtrationsstudien aufgrund der hierfür benötigten aufwendigen Kultivierung und Handhabung als kosten- und zeitintensiv zu bewerten ist, wodurch die Entwicklung solcher Membranen signifikant erschwert wird. In dieser Arbeit wurde daher die Entwicklung von weichen synthetischen Modellkolloiden angestrebt, welche zu realen Mykoplasmen analoge Eigenschaften aufweisen. Diese Materialien sollen in Filtrationsstudien zur Analyse der wirkenden Trennmechanismen verwendet werden. Zudem wird perspektivisch angestrebt diese synthetischen Partikel als Modellsubstanz im Bereich der Qualitätssicherung der Membranproduktion zu verwenden.
In dieser Forschungsarbeit wurden weiche Mikrogele mittels der inversen Miniemulsionspolymerisation von Acrylamid und Acrylat basierten funktionalen Comonomeren und N,N’- Methylenbis(acrylsäureamid) synthetisiert, wobei letzteres als Vernetzer verwendet wurde. Der Einbau von funktionalen Monomeren erlaubte die Einstellung der elektrokinetischen Eigenschaften, die Bildung von spezifischen Bindungsstellen (bspw. primäre Amine) und die direkte oder nachträgliche Markierung dieser Partikel mit Fluoreszenzfarbstoffen. Durch gezielte Variation des Vernetzeranteils konnten die Quellung dieser Materialien in Wasser beeinflusst und deren mechanische Eigenschaften justiert werden. Die Variation des polymeren Feststoffgehalts hatte hingegen einen direkten Einfluss auf die mittlere Größe der erzeugten Miniemulsionströpfchen und beeinflusste zusätzlich ebenfalls die späteren mechanischen Eigenschaften der hieraus synthetisierten Mikrogele. Im Zuge dieser Arbeit wurde eine ganze Bibliothek von Mikrogelen mit verschiedenen Eigenschaften entwickelt, von denen bspw. zwei über eine gleiche Größe (180 nm) und gleichzeitig stark abweichende Deformierbarkeiten verfügten. Es konnte zudem gezeigt werden, dass diese Modellpartikel zu realen Mykoplasmen analoge Oberflächen- und mechanische Eigenschaften aufweisen.
Ein wesentliches Problem bei der Verwendung dieser Modellpartikel in realen Filtrationsstudien besteht in der geringen realen Belastung solcher Sterilfiltermembranen in der biopharmazeutischen Industrie, wodurch sehr geringe Konzentrationen quantifiziert werden müssen. Klassische Markierungsoptionen (bspw. Fluoreszenzfarbstoffe) bieten in diesem Zusammenhang keine ausreichende Nachweisbarkeit. Aus diesem Grund wurde in dieser Arbeit eine neuartige Markierung der Mikrogele mit geeigneten DNA-Fragmenten entwickelt, welche anschließend mittels der quantitativen Polymerasekettenreaktion quantifiziert werden konnten.
Im letzten Teil dieser Arbeit wurden die erstellten Modellkolloide in dead-end Filtrationsstudien an einem Endfilter einer derzeit kommerziell verwendeten Sterilfiltermembran eingesetzt. Hierbei wurde der Einfluss des applizierten Transmembrandrucks, die Partikelbelastung, die Deformierbarkeit der Partikel und der Einfluss des Rührens auf die Filtration und das Fouling untersucht. Im Verlauf der Filtrationen führte die Ablagerung von Mikrogelen zunächst zur Blockierung von Poren und anschließend zur Bildung eines klassischen Filterkuchens, welcher gegen Ende der Filtration durch die Rückvermischung beeinflusst wurde. Es konnte gezeigt werden, dass die untersuchten Parameter den Verlauf der genannten Phasen beschleunigten oder verlangsamten. Es konnte bspw. gezeigt werden, dass sehr weiche Mikrogele die Membran bei sehr hohen Transmembrandrücken (2 bar) signifikant penetrierten und damit die Bildung eines Filterkuchens an der Oberseite der Membran verzögerten. Obwohl diese Erkenntnisse für alternative Applikationen, wie die Mikrofiltration von hochkonzentrierten Mikrogeldispersionen, eine hohe Relevanz aufweisen, muss konstatiert werden, dass in dieser Studie keine neuen Erkenntnisse hinsichtlich der Abtrennung solcher weichen Kolloide bei zur Sterilfiltration vergleichbaren Konzentrationen gewonnen werden konnten. Jedoch liefert diese Arbeit einen signifikanten Beitrag zur Entwicklung geeigneter Modellpartikel und damit zur Erlangung eines umfassenden Verständnisses der Abtrennung von realen Mykoplasmen mit Sterilfiltermembranen.Biological contaminants such as bacteria and viruses are among the most important challenges in the current biopharmaceutical industry. In particular, the separation of highly pleomorphic, deformable and infectious bacteria like mycoplasma with current polymeric sterile filtration membranes cannot guarantee full protection under all filtration conditions. It is known that some mycoplasma species can even penetrate state of the art 0.1 μm rated sterile filtration membranes. Consequently, there is a very high demand for high performance membranes, specifically optimized for this separation problem. However, working with living mycoplasma is rather expensive, laborious and time-consuming. Therefore, this work was focusing on the development of soft synthetic model colloids mimicking all critical properties of real mycoplasma. These materials should enable an easy and fast analysis of the filtration process and may ultimately be used as tool for quality assurance in field of membrane production.
In this study soft sub-micron sized microgels were synthesized via inverse miniemulsion polymerization of acrylamide, acrylate based functional comonomers and N,N’-methyl- enebiscarylamide, with the latter acting as coss-linker. The incorporation of functional monomers allows tailoring the electrokinetic properties, the formation of specific binding sites (e.g. primary amines) and direct or subsequent labeling with fluorescent dyes. The variation of the cross-linker content allowed to tune the swelling of these materials in water and influenced by that their mechanical properties. The variation of the polymeric solid content allowed to tune the droplet size and influenced additionally the mechanical properties of the later microgels. In the end, a fully characterized set of different microgels was developed, including two microgel types with about the same size (180 nm) but different deformability. It was shown that these model colloids are able to mimic all critical properties of real mycoplasma to a large extent.
It turned out that the quantification of synthetic microgels with existing labeling techniques (e.g. fluorescence dyes) is insufficient when it comes to the quantification of ultra low concentrations of contaminants, as it is common for real sterile filter applications. Therefore, a novel labeling method was developed, offering advanced detection limits by using quantitative polymerase chain reaction for the quantification of DNA-labeld microgels.
In the last part of this work different modell colloids were used in dead-end filtration studies using the endfilter of a state of the art sterile membrane filter. Here, the influences of the applied transmembrane pressure, the particle challenge, the deformability of the model particles and the effect of the stirring on the microfiltration process and the microgel deposition progression were investigated. During the course of the filtrations the deposition of microgels first lead to pore blocking, followed by the formation of a classical cake layer, which matured in the end of the filtration when the feed was stirred. It was found that these different filtration phases were accelerated or delayed in dependency to the mentioned influencing parameters. For example, super soft microgels penetrated the membrane at high transmembrane pressures (2 bar) to a very high extent, delaying the formation of a self-rejection cake layer. Although these results might be relevant for the microfiltration of highly concentrated microgel dispersions, it must be confessed that there is still a lack of knowledge when it comes to low concentrated feed streams, as it is relevant for sterile filter applications. However, this work is one step further on the way to a comprehensive understanding of separation mechanism of mycoplasma by sterile filter membranes
A comparative molecular analysis of viral DDB1-binding proteins in the context of their immune evasive properties
No full textFür Viren ist es von entscheidender Bedeutung, den Restriktionsfaktoren der Wirtszelle entgegenzuwirken, um eine effiziente Replikation zu ermöglichen. Zahlreiche Viren kodieren für akzessorische Proteine, mit denen sie das zelluläre DNA damage-binding Protein 1 (DDB1) zweckentfremden und assoziierte Cullin Ubiquitin-Ligase-Komplexe zum proteasomalen Abbau von antiviralen Restriktionsfaktoren immunevasiv ausnutzen. Das Ziel dieser Arbeit war es, die Funktionen verschiedener viraler DDB1-interagierender Proteine, deren Zielproteine sowie die zweckentfremdeten Komplexe zu untersuchen. Dazu wurden Immunpräzipitationsstudien durchgeführt und Interaktionspartner mittels Massenspektrometrie identifiziert und vergleichend quantifiziert. Im Fokus der Untersuchung standen dabei das MCMV-kodierte Protein pM27, dessen homologe Proteine pE27, pR27 (beide RCMV) und pUL27 (HCMV) sowie die viralen Proteine Vpr (HIV-2), Vpx (HIV-2), das HBV-kodierte Protein HBx und dessen Woodchuck Hepatitisvirus-Homolog WHx. Als Negativkontrollen bzw. Außengruppe dienten EGFP und das HCMV-kodierte Protein pUL42, welches mit einer anderen Ubiquitin-Ligase (Itch) interagiert. Die Analyse des pM27-Interaktionsspektrums bekräftigte das gegenwärtige immunevasive Funktionsmodel von pM27, da sowohl DDB1, Cullin 4A und STAT2 vorzufinden waren. Eine weiterführende Analyse der Interaktion zwischen pM27 und verschiedenen N- und C-terminalen Verkürzungsmutanten von STAT2 zeigte, dass sowohl N- als auch C-terminale Bereiche von STAT2 mit pM27 kopräzipitieren. Des Weiteren wurde auch Xpo7 in dem pM27- Interaktionsspektrum gefunden und Cul4B und Ncoa5 als neue Interaktionspartner identifiziert. Ncoa5 und Xpo7 wurden unter Infektionsbedingungen validiert. Zusätzlich konnten zahlreiche beschriebene Interaktionen bestätigt und teilweise auf homologe und/oder paraloge Proteine übertragen werden. So wurde die bekannte Interaktion von HBx mit Spindlin-1 auf die viralen Homologe WHx7 und WHx8 und die zellulären Paraloge Spindlin-2, und -3 ausgeweitet. Eine vermutete, aber nicht experimentell bestätigte Interaktion von Vpr mit Bax konnte dokumentiert werden. Der Vergleich der Interaktionsspektren enthüllte überdies große Unterschiede sowohl in der generellen Interaktion als auch der Interaktionsstärke der viralen Proteine mit DDB1 und Cullin 4A/B. Zwar korrelierten die Interaktionsspektren in hohem Maße mit der phylogenetischen Verwandtschaft, jedoch zeichnete sich auch eine Überschneidung der DDB1-interagierenden Proteine verschiedener Virusfamilien ab. Für das HIV-2-kodierte Protein Vpx wurde der NF-κB-Transkriptionsfaktor p65/RelA als neuer Interaktionspartner identifiziert und diese Interaktion auf ihre funktionelle Relevanz hin untersucht. Dabei zeigte sich eine potente Inhibition des NF-κB-Signalwegs durch Vpx. Des Weiteren zeigte sich, dass eine Mutation von Vpx, welche die DDB1 Interaktion destabilisiert, diesen NF-κB-Antagonismus beeinträchtigte.
Zusammengenommen konnte in dieser Arbeit die Interaktionsspektren von neun verschiedenen viralen akzessorischen Proteinen identifiziert und verglichen werden, wobei zahlreiche bekannte Interaktionen die Validität dieser Analyse unterstrichen und die Bestimmung der Funktion der Interaktion zwischen Vpx und p65/RelA die Relevanz der neu gefundenen Interaktionspartner verdeutlicht.To allow efficient viral replication, viruses have to overcome cellular restriction factors. Several viruses encode accessory proteins which exploit DDB1-containing Cullin ubiquitin ligase complexes as essential co-factors to mediate proteasomal degradation of antiviral restriction factors. To establish a comprehensive understanding of the function of different viral DDB1-binding proteins, their targets and the complexes assembled by these viral proteins, immuno-affinity precipitations (IP) were performed and the retrieved proteins were identified and quantified by mass spectrometry. The interactomes of the MCMV-encoded protein pM27 and its homologous proteins pE27, pR27 (both RCMV-encoded) and pUL27 (HCMV-encoded) as well as the viral proteins Vpr (HIV-2-encoded), and Vpx (HIV-2-encoded), HBx (HBV-encoded) and its woodchuck hepatitis virus homolog WHx were identified, analysed and compared. Empty plasmids and the HCMV-encoded protein pUL42, which binds the unrelated ubiquitin ligase Itch, served as negative controls and outgroup, respectively. The analysis of the pM27 interactome underlined the current model of pM27 function, since DDB1, Cullin 4A, as well as STAT2 were co-purified with pM27. The interaction between pM27 and STAT2 was further investigated by using a panel of N- and C-terminal STAT2 truncation mutants. The analysis revealed that pM27 specifically co-precipitates both N- and C-terminal fragments of STAT2. Additionally, also Xpo7 was retrieved with pM27 and Cul4B and Ncoa5 were identified as new interaction partners of pM27. The interactions with Xpo7 and Ncoa5 were validated under authentic infectious conditions. The analysis of the viral interactomes further confirmed previously described interactions and extended several known interactions to homologous and paralogous proteins. For example, the known interaction between HBx and Spindlin-1 was extended to the viral homologous proteins WHx7 and WHx8 and to the cellular paralogous proteins Spindlin-2 and -3. An anticipated interaction between Vpr and Bax, which was experimentally not proven so far, could be documented for the first time. The comparison revealed considerable differences concerning the interaction with DDB1 and Cullin 4A/B in terms of the general ability as well as the strength of interaction. On a global level, the correlation of the interactomes fitted well with the phylogenetic relationship of the proteins but also highlighted a considerable overlap between the DDB1 interactors of non-related viruses. As a proof of principle, the biological relevance of one newly identified interaction was further investigated. The NF-κB transcription factor p65/RelA co-precipitated with the HIV-2-encoded protein Vpx. This interaction resulted in an impaired NF-κB signaling. Additionally, a Vpx mutant which lacks the ability to interact with DDB1 was impaired in its ability to antagonize the NF-κB signaling.
Taken together, the interactions of nine different viral accessory proteins were identified and compared. The confirmation of numerous previously described interactions underlined the validity of this analysis and the determination of the biological function of the interaction between Vpx and p65/RelA highlighted the relevance of the newly found interaction partners
Influence of adenovirus-specific immune responses on adenovirus-based immunization
No full textAd5-basierte Impfvektoren werden aufgrund ihrer hohen Immunogenität geschätzt, obwohl diese gleichzeitig ihren klinischen Nutzen limitieren kann. Bei Studien im Friend Virus-Modell wurde beobachtet, dass nach Immunisierung mit Ad5.Leader-Gag, der für das FV Leader-Gag-Protein mit dem darin enthaltenen, immundominanten CD8+ T Zell-Epitop GagL85-93 kodiert, keine CD8+ T Zellantworten induziert werden. Die Immunisierung mit einem Leader-Gag-kodierenden DNA-Plasmid resultierte hingegen in der Induktion GagL85-93-spezifischer CD8+ T Zellantworten, während in einem weiteren Experiment keine GagL85-93-spezifischen CD8+ T Zellen detektiert werden konnten, wenn das Plasmid neben GagL85 93 die beiden adenoviralen CD8+ T Zell-Epitope DBP418-426 und Hexon486-494 kodierte. Diese Ergebnisse unterstrichen einen suppressiven Effekt adenoviraler Epitope auf die Induktion Transgen-spezifischer CD8+ T Zellantworten, der in dieser Arbeit näher untersucht wurde.
Während das H2 Db-restringierte DBP418 426 keinen negativen Einfluss auf die Induktion GagL85-93(H2 Db)-spezifischer CD8+ T Zellen hatte, wurde GagL85-93 vor allem durch das H-2Dd-restringierte Hexon486-494-Epitop dominiert. Da in H2 Db/b-Mäusen keine Immundominanz des Hexon486 494-Epitops über GagL85-93 festgestellt wurde, ließ sich auf die Konkurrenz aktivierter CD8+ T Zellen schließen. Durch Co-Immunisierung mit IL2- oder IL23-kodierenden DNA-Plasmiden konnte die Hexon486-494-bedingte Suppression GagL85 93-spezifischer CD8+ T Zellen partiell aufgehoben werden. Im Gegensatz dazu resultierte weder die Co-Immunisierung mit IL2- oder IL23-kodierenden Ad5-Vektoren, noch die Immunisierung von H2-Db/b-Mäusen mit Ad5.Leader-Gag in der Induktion GagL85 93-spezifischer CD8+ T Zellen. Dies wurde dem Vorkommen weiterer dominanter Epitope im Ad5-Vektor beigemessen und konnte mittels ELISpot-Assay bestätigt werden. Mithilfe der OVA-abgeleiteten Epitope Y3, Q4 und T4 wurde zudem gezeigt, dass eine Immunisierung mit schwächeren Transgen-kodierten Epitopen in stärkeren Ad5-spezifischen CD8+ T Zellantworten resultierte.
Neben Vektor-induzierten Immunantworten wird die Effektivität Ad5-basierter Vektoren durch die weit verbreitete Ad5-Prä-Immunität beeinträchtigt. In Ad5-prä-immunen Mäusen konnten demgemäß nach Immunisierung mit Ad5.TxnGagL keine GagL85-93-spezifischen CD8+ T Zellen induziert werden. Eine Publikation über den Anstieg Transgen-bindender Antikörpertiter in Ad5-prä-immunen Mäusen widersprach jedoch einer vollständigen Eliminierung des Ad5-Vektors durch neutralisierende Antikörper und deutete auf fortlaufende Transgen-Expression hin. In eigenen Experimenten wurde kein negativer Einfluss Ad5-spezifischer CD4+ oder CD8+ T-Zellen auf die Induktion Transgen-spezifischer CD8+ T Zellantworten nachgewiesen, während GagL85-93-spezifische CD8+ T Zellantworten nach dem Transfer von Plasma aus Ad5-prä-immunen Mäusen inhibiert wurden. Weitere Versuche zeigten, dass Ad5-bindende Antikörper die Induktion Transgen-spezifischer CD8+ T Zellen nicht beeinträchtigten und eine Rolle bei der erhöhten Antikörperinduktion spielen könnten.
Aufgrund ihrer phylogenetischen Unterschiede zu Ad5 wird angenommen, dass seltene Adenovirus-Typen von Ad5-neutralisierenden Antikörpern nicht beeinträchtigt werden. In dieser Arbeit wurden daher Vektoren basierend auf den seltenen Adenovirus-Typen Ad48 und Ad50 als Alternativen zu Ad5 evaluiert. Ad48- und Ad50-basierte Vektoren waren nur hinreichend zur Induktion Transgen-spezifischer CD8+ T Zellantworten geeignet. Durch Immunisierung mit Ad48.Leader-GagC1K oder Ad50.Env konnte dennoch ein vergleichbarer Schutz vor einer FV Infektion erzielt werden, wie nach der Immunisierung mit dem entsprechenden Ad5-Konstrukt. Dieser Schutz basierte vermutlich auf der Induktion von CD4+ T Zell- und Antikörperantworten. Die Immunisierung mit Ad48 und Ad50-Vektoren induzierte allerdings Vektor-neutralisierende Antikörperantworten, die gegen beide Typen kreuzreaktiv waren. Prä-Immunität gegen Ad5 beeinflusste die Immunisierung mit Ad48-Vektoren nicht negativ. Im Gegensatz dazu war die Effektivität Ad50-basierter Vektoren in Ad5-prä-immunen Mäusen, vermutlich aufgrund kreuzreaktiver Antiköper, ähnlich eingeschränkt, wie die von Ad5-basierten Vektoren.
Anti-Vektor-Immunität kann sowohl in Form von Vektor-induzierter Immunität als auch von Prä-Immunität gegen Ad5 maßgeblich den Ausgang Adenovirus-basierter Impfungen beeinflussen. Die Ergebnisse dieser Arbeit unterstreichen die Notwendigkeit einer gründlichen Charakterisierung des Immunogens, sowie des Impfvektors bei der Entwicklung Adenovirus-basierter Vakzinierungsstrategien für die Anwendung im Menschen.Immunization vectors based on an adenovirus type 5 (Ad5) backbone are valued for their high immunogenic potential, a characteristic which simultaneously limits their clinical use. Immunization studies in the murine Friend retrovirus (FV) model have shown that FV Leader-Gag protein delivered by Ad5 did not lead to induction of CD8+ T cell responses against the known immunodominant epitope, Leader-Gag-derived GagL85 93. In contrast, immunization with a DNA plasmid expressing Leader-Gag protein led to the induction of GagL85-93-specific CD8+ T cell responses. A second immunization study demonstrated that this induction of GagL85-93-specific CD8+ T cells was abrogated if the DNA plasmid encoding GagL85-93 also expressed the adenovirus epitopes Hexon486-494 and DBP418-426. These results suggested that adenoviral CD8+ T cell epitopes may have an inhibitory effect on the induction of transgene-specific CD8+ T cells, and it is this hypothesis which is explored in this thesis.
We were able to demonstrate that while the presence of H 2Db-restricted DBP418-426 did not have an effect on the induction of GagL85-93-specific CD8+ T cells, the GagL85 93(H-2Db) response was dominated by that of the H 2Dd-restricted Hexon486 494 epitope. However, no Hexon486-494-dependent suppression of GagL85 93-specific CD8+ T cells was observed in H2-Db/b mice, suggesting that competition is occurring on the level of the responding CD8+ T cells. Co-immunization with either IL2- or IL23-encoding DNA plasmids was able to partially restore induction of GagL85 93-specific CD8+ T cells in the presence of Hexon486 494. In contrast, neither co-immunization with IL2- or IL23-encoding Ad5 vectors, nor immunization of H2-Db/b mice with Ad5.Leader-Gag led to induction of GagL85-93-specific CD8+ T cell responses. This difference was attributed to the presence of other dominant Ad5-derived epitopes in the vector, which were verified by ELISpot assay. When less immunogenic OVA-derived epitopes Y3, Q4 and T4 were employed, enhanced induction of vector-specific CD8+ T cell responses following immunization was also observed.
In addition to interference by vector-induced immune responses, the efficacy of Ad5 vectors is greatly impaired by widespread pre-existing immunity against Ad5. This phenomenon can be observed by the complete lack of a GagL85 93-specific CD8+ T cell response to immunization with Ad5.TxnGagL in Ad5-pre-immune mice. However, increased binding antibody titers have also been reported in experiments using Ad5-pre-immune mice, contradicting the suggestion of vector neutralization and indicating possible ongoing transgene expression. Work presented here demonstrates that adoptive transfer of CD4+ or CD8+ T cells from Ad5-pre-immune mice showed no inhibitory effect on the induction of GagL85 93-specific CD8+ T cells, whereas GagL85 93-specific CD8+ T cell responses were abrogated after transfer of Ad5-pre-immune plasma. Adoptive transfer of Ad5-binding antibodies did not have a detectable effect on the induction of CD8+ T cells, therefore suggesting a role for Ad5-binding antibodies in enhancement of transgene-specific antibody titers in Ad5 pre-immune mice.
Based on phylogenetic differences between rare adenovirus types and Ad5 it is commonly assumed that vectors based on rare types are not subject to Ad5-specific immune responses. We therefore characterized and evaluated vectors based on adenovirus 48 and 50 and compared them to Ad5. Vectors based on both types were less immunogenic than Ad5 in most experiments and failed to induce transgene-specific CD8+ T cell responses. Only immunization with Ad48.Leader-GagC1K or Ad50.Env resulted in protective immune responses comparable to those induced by Ad5, which were dependent on the induction of CD4+T helper cells and humoral immune responses. Both, Ad48 and Ad50, induced vector-specific neutralizing antibodies which were cross-reactive against each other. Interestingly, vectors based on Ad48 were not influenced by pre-existing immunity against Ad5, whereas efficacy of Ad50-based vectors was impaired in Ad5-pre-immune mice to a similar extent as with Ad5 itself.
The work presented here further elucidates the influence of vector-induced immunity on vaccine responses, as well as the effect of pre-existing immunity against Ad5 on adenovirus-based immunization. These results highlight the importance of thorough immunogen and vector characterization during the development of vaccine regimens targeted for use in humans
Koordinationsaspekte des Supply Chain Managements für Ersatzteile
No full textA malfunctioning or failed part in a machine must be replaced as soon as possible with the same or a similar functioning part. On the one hand, it is required to have enough parts in stock to address customer requirements and avoid expensive downtimes and on the other hand, capital gets tied up in the form of non-revenue generating inventories. Finding the balance between servicing customers and reducing inventory costs is an imminent struggle for organisations large and small. This study aims at categorising spare parts into groups based on their characteristics like replenishment lead time, functional importance, unit costs etc. so as to determine the ‘optimal’ inventory policy for each group. Simulation optimisation methodology is developed for this problem of the two conflicting interests of service level and total costs and is implemented using MATLAB software. The program proposes the best inventory policy for all spare parts within a group and at the same time suggests the respective inventory policy parameters for each part within the group. The methodology is illustrated using an example with self-generated spare parts data. The thesis thus develops a structured approach to managing spare parts and helps to move from intuition-based to data-based inventory management and ordering behaviour for spare parts, that in some cases may cost millions of Euros.Eine fehlerhaftes oder ein versagendes Teil in einer Maschine muss so schnell wie möglich mit demselben oder einem ähnlich funktionierenden Teil ersetzt werden. Auf der einen Seite ist kundenseitig gefordert, genügend Teile auf Lager zu haben, um kostenintensive Maschinenstillstandszeiten zu vermeiden und auf der anderen Seite wird dadurch Kapital ohne Generierung von Umsatz in Form von Lagerbeständen gebunden. Die Balance, den Anforderungen des Kundenservices und gleichzeitig der Reduktion von Lagerbestandskosten zu genügen, ist eine große Herausforderung für kleine wie große Unternehmen. Diese Studie zielt auf die Kategorisierung von Ersatzteilen in Gruppen ab, basierend auf Charakteristika wie Wiederbeschaffungszeit, funktionale Bedeutung und Stückkosten, um so die "optimale" Lagerbestandspolitik je erstellter Gruppe zu bestimmen. Die Methodik der simulationsbasierten Optimierung wird für das Problem von den beiden in Konflikt stehenden Interessen von Service Level und Gesamtkosten entwickelt und durch die Software MATLAB umgesetzt. Das Programm schlägt die beste Lagerbestandspolitik für alle Ersatzteile innerhalb einer Gruppe vor und empfiehlt gleichzeitig die entsprechenden Parameter der Lagerbestandspolitik für jedes Teil innerhalb einer Gruppe. Die Methodik wird anhand eines Beispiels von selbst generierten Ersatzteil-Daten dargestellt. Der Ansatz stellt eine strukturierte Vorgehensweise für die Handhabung von Ersatzteilen dar und trägt zu einen Übergang von einer intuitiven zu einer datenbasierten Lagerbestandshandhabung sowie des Bestellverhaltens für Ersatzteile bei