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Binding free energy calculations and molecular dynamics simulations on complexes of viral proteases with their ligands
No full textEin Ziel der biomolekularen Modellierung ist die Berechnung der Affinität
deltaG von Liganden an Proteine, insbesondere Enzyme. Das Spektrum der Methoden, die zu diesem Zweck entwickelt wurden, reicht von theoretisch genauen aber aufwändigen Verfahren zu einfachen, eher qualitativen Verfahren. Während letztere häufig empirische Scoring-Funktionen und eine einzelne Struktur als Eingabe verwenden, wird für kompliziertere Methoden der möglichst vollständige Konformationsraum eines Protein-Ligand-Komplexes benötigt. Dieser wird mit Sampling-Verfahren wie der Molekulardynamik (MD) durchmustert.
In dieser Promotionsarbeit sollten Verfahren zur Berechnung von deltaG, insbesondere Varianten der Molecular Mechanics Poisson-Boltzmann Surface Area (MMPBSA) Methode, getestet und nach Möglichkeit weiterentwickelt werden. Desweiteren sollte die Auswirkung bestimmter Resistenzmutationen auf Struktur und Dynamik von Proteinen mit unterschiedlichen Maßen aus MD Simulationen heraus erfasst werden.
Der erste Schritt der quantitativen Modellierung mit MD ist die Beschreibung der Moleküle durch die Parametrisierung eines Kraftfelds. Anhand des sulfatierten Tyrosins wurde eine solche molekulare Parametrisierung für ein Nicht-Standard-Molekül durchgeführt. Sodann wurden Varianten der tendenziell weniger aufwändigen MMPBSA-Methode getestet im Hinblick auf ihre Konvergenz und ihre Eignung zur Bestimmung genauer deltaG-Werte oder zumindest verschiedene Enzym-Ligand-Komplexe in eine richtige Rangfolge gemäß ihrer deltaG-Werte zu bringen. Die Varianten unterscheiden sich durch verschiedene Solvatisierungsmodelle und Methoden zur Berechnung der Entropie. Als molekulares Referenzsystem wurden Mutanten der HIV Protease
im Komplex mit Wirkstoffen verwendet, da es hierzu experimentelle
Daten gibt, mit denen die berechneten Werte verglichen werden können.
Am anderen Ende des methodischen Spektrums liegt die aufwändige Thermodynamische Integration (TI). Bei einer guten Kraftfeldparametrisierung sollte TI in der Lage sein, deltaG-Effekte in der Größenordnung weniger kJ/mol quantitativ zu bestimmen. Dies wurde anhand der Mutante L76V der HIVProtease, die für einige Wirkstoffe zu einer Resensitivierung (erhöhte Affinität) führt, getestet. Schließlich sollten MD-Simulationen verwendet werden, um die molekularen Effekte von Mutationen der NS3/4A-Protease des humanen Hepatitis C Virus auf die Bindung von Liganden (Substrat, Inhibitoren) zu verstehen.A major aim of biomolecular modelling is the calculation of binding affinities deltaG of ligands to proteins, especially enzymes. The spectrum of methods that has been developed for this task ranges from theoretically exact but expensive to more simple and qualitative ones. While the latter are often empirical scoring functions using one single structure as an input, the more complex methods require the preferably complete conformational space of a protein-ligand complex which can be sampled using methods such as molecular dynamics (MD).
The intention of this thesis was to test and further develop methods for
the calculation of deltaG, in particular variants of the molecular mechanics
Poisson-Boltzmann surface area (MMPBSA) method. Furthermore, the effects of specific resistance mutations on the structure and dynamics of proteins should be determined using different metrics on MD simulation data.
The first step to quantitative modelling using MD is the description of the
molecules by parameterizing a forcefield. Such a molecular parameterization was performed for the non-standard amino acid sulpho-tyrosine. Subsequently, variants of the less expensive MMPBSA method were tested with regard to their ability to converge and determine deltaG estimates or at least establish the correct ranking of deltaG values for a set of enzyme-ligand complexes. Different solvation models and procedures to calculate the entropy have been used. As a molecular reference system, mutants of the HIV protease complexed with inhibitors were used. For these systems, experimental data are available to which the calculated values can be compared. At the other end of the methodological spectrum is the more expensive thermodynamic
integration (TI). With a proper forcefield parameterization, TI should
be able to quantitatively determine deltaG effects in the order of a few kJ/mol. This was tested on the HIV protease mutation L76V which is known to lead to a resensitivation (increased affinity) for some drugs. Eventually, MD simulations were used to understand the molecular effects of mutations of the NS3/4A protease, an enzyme of the human hepatitis C virus, on the binding of ligands (substrate, inhibitors)
Alternativer Risikotransfer zur Solvabilitätssteuerung in Schadenversicherungsunternehmen
No full textDie passive Rückversicherung ist in der Schadenversicherung ein etabliertes Verfahren zum Transfer versicherungstechnischer Risiken. In zunehmendem Maße werden entsprechende Risiken in der Schadenversicherung jedoch mit den Verfahren des „Alternativen Risikotransfers“ (ART) auch auf Risikoträger außerhalb der Erst- und Rückversicherungsmärkte übertragen. Die häufigsten Verfahren des Alternativen Risikotransfers sind einerseits derivative Instrumente (z. B. Insurance Swaps oder Insurance Optionen), zum anderen die wohl bekanntesten Schuldtitel mit bedingter Kapitalrückzahlung (z. B. Cat Bonds). Ein entscheidender Faktor zur Nutzung von Alternativem Risikotransfers durch Versicherungsunternehmen ist dabei die aufsichtsrechtliche Behandlung und Erfassung derartiger Transaktionen.
Ziel der Arbeit ist daher eine ganzheitliche Untersuchung zu Möglichkeiten und Grenzen der Solvabilitätssteuerung mittels Verfahren des Alternativen Risikotransfers in der deutschen Schadenversicherung. Ansatzpunkt der Untersuchung ist die aufsichtsrechtliche Anerkennung und Erfassung von ART-Transaktionen bei der Ermittlung der Solvenzkapitalanforderungen an ein Versicherungsunternehmen. Hierzu werden sowohl bestehende Aufsichtsnormen als auch Entwicklungen der Versicherungsaufsicht gemäß Solvency II (Standardmodell und Interner Modellansatz) untersucht und die Einsatzmöglichkeiten von ART-Verfahren mit Fallstudien verdeutlicht
Investigation of optically switchable azo-layers
No full textIn der vorliegenden Arbeit wurden optisch schaltbare Azoschichten in verschiedenen Modifikationen untersucht. Dabei wurde den bekannten Modifikationen Guest/Host, Seitenkettenpolymer, amorphes Glas eine weitere, nämlich aus der Gasphase abgeschiedene, polykristalline Molekülschichten, hinzugefügt.
Im Falle von Guest/Host-Systemen konnten die zeitlichen Verläufe der Modulationstiefen Delta_n(t) (Brechungsindex) und Delta_h(t) (Oberflächenrelief) für duale Gitter nach dem Pietsch’schen Modell aus gemessenen Beugungswirkungsgraden während und nach holographischem Einschreiben bestimmt werden. Durch ein Modell basierend auf der Trans-Cis-Trans-Photoisomerisierung wurde der Brechungsindexanteil erklärt. Für andere Materialsysteme (Seitenkettenpolymere, konzentrierte Schichten) ist die Anwendung einer unabhängigen Messmethode für Delta_h(t) erforderlich (in-situ-AFM).
Konzentrierte Schichten mit hohem Azoanteil konnten erstmals aus verschiedenen kommerziell erhältlichen Azofarbstoffen vom Typ Pseudostilben hergestellt werden. Stellvertretend wurden diese ausführlich am Beispiel Dispers Rot 1 (DR1) untersucht. Dabei entstehen durch Aufdampfen polykristalline Schichten mit hoher Oberflächenrauhigkeit. Durch eine kontrollierte elektrostatische Aufladung des Substrats konnte eine orientierende Wirkung von Ladungsmustern gezeigt werden. Die Kristallinität wurde mittels Röntgenbeugung nachgewiesen. Zur Bestimmung einer Vorzugsorientierung der Kristallite wurde ein optisches Verfahren mittels Faserspektrometer entwickelt.
Homogene Bestrahlung in die Absorptionsbande des Moleküls bewirkt einen Phasenübergang aus dem polykristallinen Zustand in den amorphen. Dabei findet eine Glättung der Schichten statt, was zu geringeren Streuverlusten bei optischen Messungen führt. Die benötigte Strahlungsenergie pro Flächeneinheit liegt für den Glättungsprozess mit E/A > 28,1 kJ/cm2 weit über dem Wert für die Strukturumwandlung (E/A <= 4,8 kJ/cm2). Der Brechungsindex einer weit entwickelten Probe liegt bei n = 1,66, allerdings sind Sättigungswerte aufgrund der erforderlichen hohen Strahlungsenergien pro Flächeneinheit bisher nicht erreicht worden.
Der Energieaufwand zur holographischen Erzeugung von Oberflächengittern in DR1-Schichten kann durch chemische Nachentwicklung und Anwendung einer positiven Koronaentladung in Luft verringert werden. Dabei finden in unbeleuchteten Oberflächenbereichen chemische Lösungs- und Ätzvorgänge statt, die zu einer Vergrößerung der Modulationstiefe und im Falle der chemischen Entwicklung im Acetonbad zu einer zusätzlichen Glättung führen. Die optische Effizienz der Gitter wird auf diese Weise gesteigert.
Die optische Schaltbarkeit des Moleküls wurde für die Entwicklung von Bauteilen aus dem Bereich der Integrierten Optik genutzt. Reversible Brechungsindexgitter in Guest/Host-Systemen dienten zum Aufbau eines opto-optischen Schalters. Eine optische Faser konnte photomechanisch senkrecht zu einer auf ihren Kern aufgedampften Azoschicht verbogen werden. Statische Oberflächenreliefgitter in DR1-Schichten fanden Verwendung beim Aufbau eines Gitterkopplers für einen PaMS-Schichtwellenleiter. Ein Verfahren basierend auf Laserstrahlschreiben und anschließender thermischer oder chemischer Entwicklung wurde zum Aufbau eines DR1-Streifenwellenleiters vorgeschlagen.Different films of optically switchable azo-dyes have been investigated. In addition to the well-known systems like guest/host, side-chain polymer or amorphous glass, a new modification, polycrystalline layers of vacuum vapour deposited molecules, has been added.
Measuring the diffraction efficiency during and after holographic recording, the time-dependent modulation Delta_n(t) (refractive-index) and Delta_h(t) (surface relief grating) for dual gratings could be determined in case of guest/host systems following Pietsch’s theorie. The part of the refractive index could be explained by a model based on the trans-cis-trans photoisomerization. For other systems (side-chain polymers, concentrated layers), the development of an independent set-up for measuring Delta_h(t) is needed (in-situ AFM).
Concentrated layers with high azo-amount have been fabricated for the first time using azo-dyes from the type: pseudostilbene. Detailed investigations have been performed for the molecule disperse red 1 (DR1). Polycrystalline layers with high surface roughness are fabricated by vacuum vapour deposition. These could be oriented by electrical surface charges on the substrate. The crystallinity was measured by x-ray diffraction. To proof a preferred orientation of the crystallites a method using an optical fibre spectrometer has been developed.
A phase-transition from the polycrystalline to the amorphous state could be obtained by homogenous illumination in the absorption-band of the molecule. At the same time the sample’s surface roughness and the optical loss due to scattering decreases. The energy per unit of area used for the smoothing-process is higher than the energy used for the phase transition (cp. E/A_sm. > 28,1 kJ/cm2, E/A_p.t. <= 4,8 kJ/cm2). The refractive index of a well developed sample is n = 1,66. However, because of the high amount of the process-energy saturation values could not be achieved.
The E/A-values required for the generation of surface relief gratings in layers of DR1 could be decreased significantly using a chemical development process or the application of a corona-field. Thereby the chemical solution of the layer and etching-processes in unexposed surface-areas lead to an increase of the modulation depth. An additional smoothing of the surface occurs in case of the chemical development. The optical efficiency can be increased by these methods.
The potential of the molecule as an optical switch has been used for the realization of different applications. Reversible refractive-index gratings in guest/host-polymers serve as an opto-optical switch. An optical fibre has optically been bended perpendicular to the direction of an azo-layer evaporated on top of its core. A static surface relief grating was used as a coupler for a PMS-waveguide. A method based on laser-beam-recording has been proposed for the fabrication of a DR1-strip-waveguide
Development of a conceptual graphical user interface framework for the creation of XML metadata for digital archives
No full textThis dissertation is motivated by the DFG sponsored Jonas Cohn Archive digitization project at Steinheim-Institut whose aim was to preserve and provide digital access to structured handwritten historical archive material highlighting New Kantian philosophy scattered in the correspondence, diaries and private journals kept by and written to and by Jonas Cohn.
The dissertation describes a framework for processing and presenting multi-standard digital archive material. A set of standard markup schema and semantic bibliographic descriptions have been chosen to illustrate the multiple standard and hence semantic heterogeneous digital archiving process. The standards include Text Encoding Initiative (TEI), Metadata Encoding and Transmission Standard (METS) and Metadata Object Description Schema (MODS). The chosen standards best illustrate the structural contrast between the systematic archive, digitized archive and digitized text standards. Furthermore, combined digital preservation and presentation approaches offer not only the digitized texts but also metadata structured variably sized images of the archive documents enabling virtual visualization. State of the art applications focus solely on either one of the structural areas neglecting the compound idea of a virtual digital archive.
The content of this work describes the requirements analysis for managing multi-structured and therefore multi-standard digital archival artefacts in textual and image form. In addition to the architecture and design, an infrastructure suitable for processing, managing and presenting such scholarly archives is sought for recognition as a digital framework useful for the preservation and access to digitized cultural resources. The proposed solution therefore includes the instrumentation of a conglomerate of existing and novel XML technology for transformations based in a centralized application. The archive can then be managed via a client-server application thereby focusing archival activities on structured data collection and information preservation illustrated in the dissertation process by the:
• Development of a prototype data model allowing the integration of the relevant markup schema
• Implementation of a prototype client server application handling archive processing, management and presentation and based on the data model already mentioned
• Development and implementation of a role archive access user interface
Furthermore as an infrastructural development serving expert archivists from the humanities, the dissertation explores methods of binding the existing XML metadata creation process to other programming languages. In doing so, one opens further for channels simplifying the metadata creation process by integrating the use of graphical user interfaces. To this end the java programming language, its swing and AWT graphical user interface libraries, associated relational persistency and enterprise client server architecture resemble a suitable environment for integrating XML metadata into main stream computing. Hence the implementation of Java XML Data Binding as part of the metadata creation framework is part and parcel of the proposed solution.Diese Arbeit geht hervor aus dem von der DFG geförderten Projekt zu Digitalisierung des Jonas Cohn Archivs im Steinheim-Institut, dessen Ziel es ist, eine strukturierte Auswahl von Handschriften des Philosophen Jonas Cohns in digitaler Form zu bewahren und den Zugang zu ihnen zu erleichtern.
Die Dissertation beschreibt ein Rahmenwerk für die digitale Verarbeitung und Präsentation digitalisierter Archivinhalte und ihrer Metadaten, strukturiert anhand von mehr als einem Beschreibungsstandard. Eine Auswahl von Standard Markup Schemata und bibliographisch semantischen Beschreibungen wurde getroffen, um die Problematik darzustellen, die aus der Berücksichtigung mehrerer Standards und damit aus semantischer Heterogenität des Digitalisierungsprozesses entsteht. Diese Auswahl umfasst unter anderem die Text Encoding Initiative (TEI), Metadata Encoding and Transmission Schema (METS) und Metadata Object Description Schema (MODS) als Beispiele für Beschreibungsstandards. Diese Standards sind am besten geeignet, die strukturellen und semantischen Unterschiede zwischen den Standards eines systematisch und semantisch zu digitalisierenden Archivs darzustellen. Zusätzlich verbindet der Ansatz die digitale Bewahrung und Präsentation von digitalisierten Texten und von Metadaten strukturierter Bilder der Archivinhalte. Dies ermöglicht eine virtuelle Präsentation des digitalen Archivs. Eine große Zahl bekannter Digitalisierungsanwendungen folgt nur einer der beiden Strukturierungsziele Bewahrung und Präsentation, wodurch der Ansatz eines vollständig virtuellen digitalen Archivs vernachlässigt wird.
Der Schwerpunkt dieser Arbeit ist die Beschreibung einer Managementinfrastruktur für die Erfassung und Auszeichnung von Multi-Standard Metadaten für digitale Handschriftensammlungen. Zusätzlich zu der Architektur und dem Design wird nach einer geeigneten Infrastruktur gesucht für die Erfassung, Verarbeitung und die Präsentation wissenschaftlicher Archive als digitales Rahmenwerk für den Zugang zu und die Bewahrung von Kulturbesitz.
Die hier vorgeschlagene Lösung sieht deshalb die Nutzung bestehender und neuer XML Technologien vor, verknüpft in einer zentralen Anwendung. So wird im Rahmen der Dissertation die Strukturierung des Archivs mittels einer Client-Server-Anwendung betrieben und die Bewahrungsmaßnahmen als Prozess herausgearbeitet. Die Arbeit verfolgt mehrere Zielsetzungen:
• Die Entwicklung eines prototypischen Datenmodells mit der Einbindung relevanter Markup Schemata
• Die Implementierung einer prototypischen Client Server Anwendung für die Bearbeitung, Erfassung und Präsentation der Archive anhand des beschriebenen Datenmodells
• Die Entwicklung, Implementierung und Bewertung einer Benutzerschnittstelle für die Interaktion mit dem Rahmenwerk anhand einer Expertenevaluation
Untersuchung der dynamischen Adsorption an Kfz-Innenraumfiltern
No full textKfz-Innenraumfilter reinigen die der Fahrerkabine zugeführte Außenluft von Partikeln und gasförmigen Verunreinigungen. Die Abscheidung der gasförmigen Verunreinigungen erfolgt durch Adsorption an einer dünnen Schicht Aktivkohlegranulat, die meistens zwischen Stütz- und Trageschichten des Filters eingebettet ist. Kfz-Innenraumfilter werden zum qualitativen Vergleich ihrer adsorptiven Eigenschaften gemäß der Norm ISO 11155, Teil 2, von 2009 mit dem Titel „Road vehicles- Air filters for passenger compartments- Part 2: Test for gaseous filtration“ getestet. Über das dynamische Abscheideverhalten von Kfz-Innenraumfiltern im praktischen Einsatz ermöglichen derartige Filtertests aber allenfalls Prognosen. Im Einsatz sind die Filter ständig wechselnden Umgebungsbedingungen (Temperatur und relative Luftfeuchte) und Schadstoffkonzentrationen ausgesetzt, die die Adsorptionskapazität beeinflussen und zur Desorption von zuvor abgeschiedenen Gasen führen können. Zur Charakterisierung der Prozesse bei der Kfz-Innenraumfiltration wurde die dynamische Adsorption der organischen Komponenten Toluol und n-Butan in feuchter Luft als Trägergas eingehend untersucht. Hierzu wurden bei verschiedenen für die Kfz-Innenraumfiltration relevanten Temperaturen und relativen Luftfeuchten und verschiedenen Eingangskonzentrationen mit der Festbettmethode Durchbruchskurven ermittelt. Die umfangreichen Versuchsreihen bildeten die Basis dafür, das Adsorptionsgleichgewicht und die Kinetik der jeweils binären Adsorptionssysteme zu charakterisieren. Die Unterschiede zwischen den Adsorptiven n-Butan und Toluol wurden herausgearbeitet und detailliert beschrieben. Mit den ermittelten Parametern zum Adsorptionsgleichgewicht und zur Adsorptionskinetik wurde der Adsorptionsprozess mathematisch beschrieben und die Durchbruchskurven durch dünne Schüttungen von Aktivkohle erfolgreich berechnet
Klinische Nachuntersuchung von Revisions-Knie Endoprothesen
No full textDie Zahl der Implantation primärer Kniegelenksprothesen steigt von Jahr zu Jahr. Auch die Patienten, die sich einem solchen Eingriff unterziehen werden zunehmend jünger. Abhängig davon steigt ebenso die Zahl an Wechseloperationen für solche Endoprothesen.
In dieser Dissertation wurden deshalb 49 Patienten mit insgesamt 50 Knieendoprothesen- Revisionsoperationen und einem mittleren Follow-Up von 40 Monaten in einer Querschnittsstudie klinisch und radiologisch nachuntersucht. Das Studienkollektiv rekrutierte sich aus einem Patientengut von 168 Patienten, die in den Jahren 2001-2009 mit dem Operationen- und Prozedurenschlüssel 5-823 (Revision, Wechsel und Entfernung einer Endoprothese am Kniegelenk) in der Orthopädischen Universitätsklinik der Universität Duisburg-Essen operiert wurden. Das Durchschnittsalter der Patienten betrug 72,6 Jahre.
Es wurden vornehmlich die Stammdaten, der Knee Society Score und Function Score, die Röntgenbilder vor der Revision und die der Nachuntersuchung statistisch ausgewertet. In den Ergebnissen zeigte sich die aseptische Lockerung in 54%, die Instabilität in 14% und die Fehlstellung und Fehlpositionierung in 12% der Fälle als häufigste Ursache für die Revisionsoperation. Der Knee Society Score verbesserte sich nach der Wechseloperation signifikant von 44,96 Punkten auf 72,82 Punkte (p=0,041), der Function Score verbesserte sich signifikant von 51,33 auf 73,43 Punkte (p=0,014). Die Auswertung der Röntgenbilder ergab keine Korrelation zwischen der Bewertung des Knee Society Score oder Function Score mit der radiologischen Befundung. Die Revisionsoperation führte zu einer erheblichen klinischen Beschwerdebesserung der Patienten. Bis zu der Einführung eines einheitlichen nationalen Endoprothesenregisters in Deutschland wird die Wichtigkeit von Studien wie dieser bestehen bleiben
Sequence optimization of a synthetic bifunctional protein by multi-criteria genetic algorithms
No full textDiese Arbeit beschreibt die erfolgreiche Vereinigung der aktiven Regionen zweier unterschiedlichen Protein zu einem bifunktionalem. Ein einfacher Austausch kodierender Strukturen in ein neues Protein führt ggf. zu einer erhöhten Instabilität wodurch die Funktion des Proteins nicht mehr garantiert werden kann.
Um diese Probleme zu eliminieren und die Stabilität des Proteins wieder zu gewährleisten wird die Aminosäurensequenz computergestützt basierend auf physikalischen und chemischen Eigenschaften rekonstruiert. Indem nicht die Aminosäurensequenz sondern die Eigenschaften der Aminosäuren für die Optimierung verwendet werden, konnte der Rechenaufwand soweit minimiert werden, dass Genetische Algorithmen effizient eingesetzt werden können.
Neben den elektrostatischen Eigenschaften wird die Sekundärstruktur, die Hydrophobizität und das Molekulargewicht zum in einem angepassten Genetischen Algorithmus für die Optimierung verwendet. Ziel der Optimierung ist es, diese Eigenschaften zu einer Referenz hin zu Optimierungen, in diesem Fall die Z-Domäne. Somit wird die räumliche Struktur der Z-Domäne in das neue Protein übertragen, neuen Funktionen bleiben jedoch weiterhin erhalten.
Es werden vier unterschiedliche Methoden verwendet, um die Ergebnisse aus der Optimierung durch den Genetischen Algorithmus zu verfeinern und zu verifizieren. So wird die große Nummer an Sequenzen, die als Ergebnis der Optimierung vorliegen, auf wenige vielversprechende eingeschränkt. Neben Vorhersagen der Proteinstabilität durch GROMACS und ERIS Simulationen werden auch die Bindeeigenschaften der neuen Sequenzen mittels BrownDye und AMBER genauer untersucht. Manuelle und computergestützte Vergleiche zwischen nicht optimierten Ausgangssequenz und den Optimierungsergebnissen zeigen klar den Vorteil der Optimierung durch den Genetischen Algorithmus. Neben einer vergleichbaren Stabilität der Kandidaten im Vergleich zur Z-Domäne sind auch die Bindeeigenschaften des neuen Proteins zu denen der Wildtypen vergleichbar.The Thesis describes how to successfully combine the active regions of two distinct proteins into one bifunctional one. Simply exchanging a piece of the protein with a sequence coding for a new specific function comes to a rise of protein instability. With that protein stability and thus the functions of it cannot be guaranteed anymore.
To challenge these problems and regain protein stability, the amino acid sequence was computationally reconstructed by using its physical and chemical properties. By not using the amino acid sequence itself to optimize the protein, it was possible to lower the computational costs. With that, an effective use of genetic algorithm was possible. Secondary structure, hydrophobicity, molecular weight of the amino acids as well as the electrostatic properties of the protein were optimized using a adapted genetic algorithm
implementation. Target of the optimization was to match these properties to a reference protein, in this case the z-domain. In a result, the overall structure of the z-domain was transferred to the new protein but its new binding properties were conserved. Four different methods have been used to refine and test the results of the genetic algorithm and the large number of resulting individuals was elaborated to the most stable ones with best conserved binding properties. Beside a stability prediction using GROMACS simulation
and ERIS stability prediction BrownDye and AMBER were used to examine the candidates binding affinities. Numerous manual and computer supported comparisons between the optimized and non-optimized sequences clearly showed the benefit of the genetic algorithm optimization. In addition comparable binding properties in respect to the binding sites wild types have been observed at the optimized sequences during analysis
Analysis of the primary tumor and blood based “Real-Time-Liquid Biopsy”
No full textTrotz Fortschritten in der Behandlung erleiden mehr als 50% der Patientinnen mit Ovarialkarzinom ein Rezidiv, wobei 15 % der Fälle platinresistent sind, was meist jedoch nur retrospektiv erkannt wird. In diesem Zusammenhang war Ziel dieser Dissertation, neue primärtumor- sowie blutbasierte Biomarkerkonzepte im Hinblick auf Platinresistenz und Prognose zu etablieren. Dies wurde zunächst im Rahmen einer primärtumorbasierten LOH-Analyse an vier tumorbiologisch relevanten chromosomalen Regionen realisiert. In diesem Zusammenhang erwies sich LOH proximal zum M6P/IGF2R-Lokus als neuer Biomarkerkandidat für die Tumorzelldisseminierung in das KM. Da Tumorgewebe jedoch nur einmal zum Zeitpunkt der Primärdiagnose zur Verfügung steht und sich nicht für ein Therapiemonitoring eignet, wurden nachfolgend experimentelle Strategien zur Biomarkeridentifikation auf ein blutbasiertes System transferiert. In diesem Sinne wurde die Methodik der primärtumorbasierten LOH-Detektion auf zirDNA im Blutserum der Patientinnen übertragen. Im Rahmen einer zusätzlichen Fraktionierung der zirDNA in HMF bzw. NMF, konnte die Sensitivität der LOH-Detektion deutlich verbessert werden. Des Weiteren zeigte sich nach Chemotherapie eine signifikante Reduktion des zirDNA Gehaltes in der NMF, jedoch nicht in der HMF. Diese Befunde implizierten, dass tumorassoziierte DNA in der Zirkulation vermutlich niedermolekularen Charakter aufweist. Somit könnte die Fraktionierungsmethodik eine selektive Untersuchung tumorassoziierter DNA im Blut erlauben. Ferner wurde LOH am PTEN-Lokus bzw. proximal zum M6P/IGF2R-Lokus als neuer blutbasierte Biomarker für die Tumorzelldisseminierung in das KM sowie für ein verkürztes OS beschrieben. Ergänzend wurde das Profil zirkulierender miRNA im Serum von Ovarialkarzinompatientinnen analysiert. In diesem Zusammenhang konnte miR-1246 im Vergleich zu Normalspenderinnen als signifikant hochreguliert identifiziert werden. Interessanterweise wurde während der experimentellen Phase dieser Dissertation durch eine Kooperationsgruppe gezeigt, dass der miR-1246 Detektionsassay eine starke Kreuzreaktivität mit RNU2-1f im Serum aufweist. Somit war das beobachtete miR-1246 Signal mit großer Wahrscheinlichkeit auf RNU2-1f und nicht auf miR-1246 zurückzuführen. Im Weiteren konnte ein signifikanter Zusammenhang zwischen der RNU2-1f Expression im Serum und dem FIGO-Stadium bzw. dem verbleibenden Tumorrest nach Operation beschrieben werden. Ferner identifizierte eine persistierende bzw. neu erworbene RNU2-1f Positivität nach Chemotherapie eine Patientinnengruppe mit tendenziell verkürztem OS. Dies ist die erste Beschreibung einer nicht kodierenden RNA, die als blutbasierter Biomarker für das Ovarialkarzinom fungieren könnte. Abschließend wurde auf die immunomagnetische Isolation bzw. molekulare Charakterisierung intakter ZTZ aus dem Blut fokussiert. Es konnte bereits gezeigt werden, dass die Präsenz von ZTZ im Blut vor Operation bzw. nach Chemotherapie mit einem verkürzten OS korrelierte. Weiterführend sollte die Hypothese überprüft werden, inwieweit der beobachtete prognostisch-negative Einfluss der ZTZ im Blut auf einen platinresistenzassoziierten Phänotyp dieser Zellen zurückzuführen sein mag. Daher wurde die Expression der DNA-Reparatur Endonuklease ERCC1, die bereits mit Platinsensitivität ovarieller Tumoren in Verbindung gebracht werden konnte, in ZTZ untersucht. ERCC1-Positivität wurde mit einer Inzidenz von 36 % vor Operation und 35% nach Chemotherapie beobachtet, interessanterweise auch in 30% der Patientinnen, die gemäß AdnaTest OvarianCancer, als ZTZ-negativ galten. Ein statistischer Zusammenhang zwischen der ERCC1-Expression und klinisch definierter Platinsensitivität ergab sich nicht, jedoch zeigte sich bei Patientinnen mit persistierend ERCC1-positiven ZTZ ein signifikant verkürztes DFS bzw. OS. Diese Befunde sprechen für eine Implementierung von ERCC1 in die ZTZ-Analyse und beschreiben ERCC1 als möglichen klinisch relevanten Biomarker, der Patientinnen mit besonders schlechter Prognose identifizieren könnte bzw. die Notwendigkeit einer Therapieänderung voraussagen mag. Des Weiteren konnte gezeigt werden, dass ZTZ von Ovarialkarzinompatientinnen zu etwa 14% EMT- bzw. stammzellassoziierte Marker exprimieren. Dies wurde auch bei Patientinnen beobachtet, die gemäß AdnaTest OvarianCancer ZTZ-negativ galten, was für die Heterogenität der ZTZ im Blut spricht. Die Detektion sowie das zielgerichtete Vorgehen gegen stammzellähnliche ZTZ könnte von großer klinischer Relevanz sein, da diese ZTZ-Subgruppe bereits mit Therapieversagen und Rezidiventwicklung in Verbindung gebracht wurde.
Zusammenfassend konnte die vorliegende Dissertation einen relevanten Beitrag zur Etablierung neuer primärtumorbasierter Biomarkerkonzepte für das Ovarialkarzinom liefern und die Hypothese unterstützen, dass Patientinnenblut im Sinne einer „Real-Time-Liquid-Biopsy“ genutzt werden könnte.Despite advances in treatment, more than 50% of patients with epithelial ovarian cancer will experience recurrence. Moreover, resistance to platinum based chemotherapy occurs in about 20% of cases and can only be assessed retrospectively during post-chemotherapy follow-up. In this regard, intention of this PhD thesis was to identify novel biomarkers, predicting therapy response and prognosis.
This was initially realized by a primary tumor based LOH-analysis at four ovarian cancer relevant chromosomal regions. In this context, allelic loss proximal to the M6P/IGF2R locus was revealed as a novel biomarker candidate, predicting tumor cell dissemination into the bone marrow (BM). Given that primary tumor tissue is available uniquely by resection and does not allow therapy monitoring, experimental strategies for biomarker identification were subsequently transferred to a blood based context. In this regard, methods for primary tumor based LOH-detection were transferred to circulating DNA (cirDNA) in the blood serum of ovarian cancer patients. Fractionation of cirDNA into high- and low molecular weight fraction (HMWF, LMWF) broadly improved sensitivity of LOH-detection in the blood and cirDNA content in the LMWF but not in the HMWF significantly decreased after chemotherapy. These data implied that tumor-associated cirDNA in the circulation might primarily be of low molecular weight character and that cirDNA fractionation technique could allow selective analysis of tumor related DNA in the blood. Moreover, LOH at the PTEN-locus and proximal to M6P/IGF2R were suggested as novel blood based biomarkers for tumor cell dissemination into the BM and a reduced overall survival (OS).
In addition to this approach, the profile of circulating microRNA in the blood of ovarian cancer patients was analyzed. In this context, miR-1246 was found to be significantly overexpressed in the blood of cancer patients compared to healthy donors. Interestingly, during the experimental stage of the experiments, a cooperation group showed that the miR-1246 detection assay was highly cross-reactive with U2 small nuclear RNA fragments (RNU2-1f). Consequently, the observed miR-1246 signal in the circulation was likely derived from RNU2-1f than from miR-1246. Circulating RNU2-1f levels at primary diagnosis paralleled the tumor stage, whereas RNU2-1f expression after chemotherapy correlated with residual tumor burden left after surgery. Moreover, persisting or newly acquired RNU2-1f positivity after chemotherapy trended to identify a patient group with reduced OS. This is the first report, suggesting a small non coding RNA as blood-based biomarker for ovarian cancer patients.
Finally, experimental strategies focused on the immunomagnetic isolation and molecular characterisation of circulating tumor cells (CTC) in the blood. In this regard, the presence of CTC before surgery and after chemotherapy was previously ascertained to predict a reduced overall survival. Continuatively, it should be investigated, whether negative prognostic impact of CTC may arise from a cellular phenotype being associated with platinum resistance. In this regard, we assessed expression of Excision repair cross-complementing rodent repair deficiency, complementation group 1 (ERCC1) in CTC, which takes part in the DNA nucleotide excision repair pathway and has already been described as a primary tumor-based biomarker for platinum resistance in ovarian cancer. ERCC1-positivty rate was 36% before surgery and 35% after chemotherapy. Interestingly, 30% of patients with positive CTC-status, according to AdnaTest OvarianCancer, were positive for ERCC1-expression. No association between clinically defined platinum resistance and ERCC1-positivity was observed. However, patients with persistently positive ERCC1-expression in paired blood samples before surgery and after chemotherapy had a significantly decreased OS and DFS. Thus, implementing ERCC1 expression in CTC analysis of patients may identify a subgroup of ovarian cancer patients with worse prognosis. Apart from this, ERCC1 might serve as a valuable biomarker for monitoring disease to possibly change treatment in case of ERCC1-persistent CTC. Moreover, the expression of EMT- and stem cell associated transcripts was demonstrated in 14% of ovarian cancer patients. This was also observed in case of CTC-negative patients, suggesting the heterogeneity of CTC in the blood. Given that stem cell like CTC may be associated with therapy failure and recurrence of ovarian carcinomas, detecting and targeting of these cells could be of prior interest for the clinic.
Conclusively, this PhD-thesis contributed to the identification of novel primary tumor based biomarker concepts for ovarian cancer and corroborates the hypothesis that the patient’s blood could be utilized in terms of a “Real-Time-Liquid-Biospy”
Characterization of stress tolerance and metabolic capabilities of acidophilic iron-sulfur-transforming bacteria and their relevance to Mars
No full textIn the last decades, our neighboring planet Mars has received much attention as one of the most promising targets close to Earth on which life may have developed in the past or might even exist at present. Recent NASA and ESA missions have provided detailed information on the physical and geochemical environment of Mars that can help to identify potential habitats and organisms that could be able to grow with the energy sources present on the planet. Due to the abundance of iron and sulfur minerals on Mars, iron-sulfur transforming microorganisms are considered likely models for putative Martian life forms (e.g. Amils et al. 2007; Fernández-Remolar et al. 2005; Nixon et al. 2012). For this study, two species of acidophilic iron-sulfur bacteria were chosen: the chemolithoautotrophic Acidithiobacillus ferrooxidans and the spore-forming Sulfobacillus thermosulfidooxidans. The goal of this thesis was to study their metabolic capacities, especially regarding the ability to grow with in situ resources that could be expected on Mars, and their tolerance to environmental stress conditions. A subsurface environment was assumed as the most likely habitat in these experiments, because it has a higher probability for liquid water, can provide different sources of energy for lithotrophic metabolism, and afford protection from the harsh surface physical conditions.
It was shown that acidophilic iron-sulfur bacteria such as A. ferrooxidans may play an important role in iron redox cycling on Mars, as they can both oxidize ferrous iron (Fe2+) using O2 as an electron acceptor, and reduce ferric iron (Fe3+) using H2, which could be generated by several processes in the subsurface of Mars. The threshold for aerobic respiration in the experiments with A. ferrooxidans and S. thermosulfidooxidans was 0.05% of dissolved O2. Oxygen partial pressure in the Martian atmosphere was too low to yield any measurable iron oxidation activity of A. ferrooxidans after 1 week of incubation in Mars gas at low pressure (15 hPa). However, abiotic processes in the subsurface involving the interactions of liquid water with iron-bearing minerals could generate O2 in sufficient quantities. Furthermore, A. ferrooxidans was incubated on two synthetic mixtures of Mars regolith minerals under aerobic and anaerobic conditions. Growth was observed with either O2 as an external electron acceptor or H2 as an external electron donor, and minerals provided not only Fe2+ and Fe3+ for energy gain, but probably also other essential nutrients for lithoautotrophic growth. The bacteria also seemed contribute to the reductive dissolution of Fe3+-containing minerals like goethite and hematite, which are characterized by a high thermodynamic stability.
Because the Martian environment is not a static one, but will exhibit fluctuations in physical conditions, potential life forms would have to cope with stress factors like desiccation, high salt concentrations, low temperature, and radiation. A set of viability indicators was used to compare the effect of the stress conditions on different aspects of cellular viability such as reproduction, metabolic activity, and integrity of cellular compounds (membrane, DNA, rRNA). Reproductive ability (culturability) of A. ferrooxidans after exposure to different stressors was often more severely affected than other markers of cell viability such as iron oxidation activity, membrane integrity, and rRNA integrity, which might suggest that cells entered a viable-but-nonculturable state. At low temperatures (4°C), A. ferrooxidans did not grow, but remained metabolically active, pointing to a state of maintenance metabolism. Based on culturability, A. ferrooxidans and S. thermosulfidooxidans exhibited only moderate tolerance to most of these stress factors. However, desiccation tolerance was improved if the cells were kept under low oxygen tension, grown as a biofilm, or embedded within an external matrix of compatible solutes such as sucrose and trehalose. Freezing tolerance was also improved by the addition of compatible solutes and growth as biofilms. A. ferrooxidans and S. thermosulfidooxidans survived one week under simulated Martian surface conditions (6 hPa, -20°C, 0.13% O2) in the form of dried biofilms. Thus, the conditions of the Martian surface (especially low temperature and low oxygen pressure) were favorable to the survival of cells. Although A. ferrooxidans was sensitive to UV-C radiation (F10 = 29 J/m2) ample shielding is provided already by shallow layers of dust (especially containing Fe3+) or by upper cell layers in a biofilm. Comparing the average ionizing radiation dose on Mars with the tolerance of A. ferrooxidans (D10 = 46 Gy), a population of these bacteria could remain viable in the shallow subsurface (0-3 m) of Mars for up to 105 years In sufficient depths, organisms would be protected from surface radiation and could persist even longer if intermittent maintenance metabolism and repair are possible.
The acidophilic iron-sulfur bacterium A. ferrooxidans can be considered a probable member of a potential Martian food web based on its metabolic capacities
Pricing Energy, Weather and Emission Derivatives under Future Information
No full textThe aim of this thesis mainly consists in the computation of risk-neutral option prices for energy, weather, emission and commodity derivatives, whereas we innovatively take future information – which we assume to be available to well-informed market insiders – into account via several customized enlargements of the underlying information filtrations. In this regard, we inter alia derive European as well as exotic option price formulas for electricity derivatives such as traded at the European Energy Exchange EEX, for example, but yet under the incorporation of forward-looking information about possible future electricity spot price behavior. Furthermore, we provide both utility-maximizing anticipating portfolio selection procedures and optimal liquidation strategies for electricity futures portfolios yielding minimal expected trading costs under forward-looking price impact considerations. Moreover, we correlate electricity spot prices with outdoor temperature and treat a related electricity derivatives pricing problem even under additional temperature forecasts. In this insider trading context, we also derive explicit expressions for different types of temperature futures indices such as usually traded at the Chicago Mercantile Exchange CME, for instance, and provide various pricing formulas for options written on the latter. Additionally, we construct optimal positions in a temperature futures portfolio under forecasted weather information in order to hedge against both temporal and spatial temperature risk adequately. Further on, we treat the pricing of carbon emission allowances, such as commonly traded in the European Union Emission Trading Scheme EU ETS, but under supplementary insider information on the future market zone net position. In this context, we propose two improved arithmetic multi-state approaches to model the ‘length of the market net position’ more realistically than in existing models. By the way, throughout this work we frequently discuss customized martingale compensators under enlarged filtrations and related information premia associated to our specific insider trading frameworks. Finally, we invent nonlinear double-jump stochastic filtering techniques for generalized Lévy-type processes in order to (theoretically) calibrate the emerging incomplete market models