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Untersuchungen zum Einfluss und zur Bioverträglichkeit von Perfluordekalin-gefüllten Poly(laktid-co-glykolid)-Mikrokapseln in einem Modell der Ratte
No full textSeit Jahrzehnten wird intensiv an der Entwicklung artifizieller Sauerstofftransportsysteme zur routine- und notfallmäßigen Versorgung von Patienten geforscht. Bis heute konnte sich kein Produkt, das bei einem signifikanten Erythrozytenverlust eine adäquate Gewebeoxygenierung aufrechterhalten kann, für humanmedizinische Anwendungen in Europa durchsetzen.
In der vorliegenden Arbeit wurden der Einfluss und die Bioverträglichkeit von soliden und Perfluordekalin (PFD) gefüllten Mikrokapseln untersucht. Zur Synthese der Kapselwand wurde Poly(laktid-co-glykolid) verwendet, während die Beschichtung der Mikrokapseln mit Polyethylenglykol erfolgte. Der Einsatz dieser beiden Materialien ist vor allem bei der
Entwicklung artifizieller Wirkstofftransporter verbreitet, wenngleich die bisher infundierten Mengen, im Vergleich zu den Dosierungen die im Rahmen dieser Arbeit appliziert wurden, sehr gering waren. Neben der beachtlichen Menge der infundierten Kapseln wurde zu deren Synthese außerdem ein für Kapselsysteme bisher kaum eingesetzter Emulgator
(Polyvinylalkohol) verwendet. Für die Untersuchung der Effekte von beiden Kapseltypen und dem Emulgator wurden anästhesierten Ratten jeweils 10 ml/kg Körpergewicht der versuchsgruppenabhängigen Lösungen in 60 min bzw. 30 min über die Femoralvene infundiert. Alle Tiere überlebten ausnahmslos eine Infusion beider Kapseltypen,
wenngleich am Ende des Versuchs massive Gewebeschädigungen unabhängig von dem jeweiligen Kapseltyp auftraten; unter anderem indiziert durch signifikant erhöhte Plasmaenzymaktivitäten. Zudem entwickelten die Tiere unabhängig von dem infundierten Kapseltyp eine moderate Azidose. Noch während der Infusionsphase der PFD-gefüllten
Mikrokapseln kam es zu einem transienten systemischen Blutdruckabfall. Dieser wurde vermutlich durch vasoaktive Substanzen verursacht, die zum Einen durch eine Aktivierung des Komplementsystems, zum Anderen durch mechanische Scherkräfte freigesetzt wurden. Der eingesetzte Emulgator beeinflusste weder systemische Parameter, noch
konnten bei der histologischen Untersuchung Gewebeschädigungen festgestellt werden. Die PFD-gefüllten Mikrokapseln wiesen mit rund einer Stunde eine gegenüber den soliden Mikrokapseln längere intravasale Halbwertszeit auf. Die Abnahme unterlag, unabhängig von dem infundierten Kapseltyp, einer dosisunabhängigen Kinetik erster Ordnung.
Prinzipiell konnte gezeigt werden, dass eine Infusion beider Kapseltypen möglich ist, jedoch mit zum Teil schwerwiegenden Nebenwirkungen einhergeht. Die Mikrokapseln besitzen das Potential, um nach Umsetzung gezielter Modifikationen weiter untersucht zu werden
Zufriedenheit, Preispräferenzen und Zahlungsbereitschaft von Privatkunden in Netzindustrien: Empirische Befunde und methodische Grundlagen
No full textIn Deutschland sind etliche Netzindustrien, in denen Güter und Dienstleistungen unter Rückgriff auf Netzinfrastruktur(komponent)en produziert und vermarktet werden (z.B. Telekommunikations- und Energiewirtschaft), durch Liberalisierungsanstrengungen und eine damit verbundene Wettbewerbsintensivierung gekennzeichnet. Zudem sind die im Telekommunikations- (z.B. Sprachverbindung, Internetzugang) bzw. Energiesektor (z.B. Versorgung von privaten Haushalten mit Strom, Messung und Abrechnung der verbrauchten Strommenge) abgesetzten Produkte hinsichtlich wesentlicher Leistungsmerkmale weitgehend homogen und damit von den Nachfragern austauschbar. Diese Massenmarktkonstellation erschwert es Anbietern, sich mit ihren Produkten wesentlich von Leistungen der Konkurrenz zu differenzieren und so dauerhaft Wettbewerbsvorteile aufzubauen. Unternehmen auf solchen Märkten stehen daher vor der Aufgabe, ihre Leistungen stärker auf die Bedürfnisse ihrer Bestands- sowie potenziellen Kunden auszurichten. Entsprechend haben in der wissenschaftlichen betriebswirtschaftlichen Forschung Wahrnehmungen und Einstellungen von Privatkunden in Netzindustrien wie Zufriedenheit, Preispräferenzen und Zahlungsbereitschaft (ZB) in den letzten Jahren zunehmende Beachtung gefunden
Installation of an optically accessible four-stroke engineand characterizing measurements
No full textVerbrennungsmotoren leisten im alltäglichen Leben unschätzbare Dienste und sind ein Garant für zuverlässigen Waren- und Personentransport. Durch die zu ihrem Betrieb verwendeten, meist fossilen Brennstoffe werden jedoch Emissionen des klimaschädigenden Gases Kohlendioxid freigesetzt. Außerdem werden im Verlauf der Verbrennung weitere gasförmige Substanzen, wie Stickoxide, Kohlenmonoxid und unverbrannte Kohlenwasserstoffe gebildet, die sowohl die Umwelt als auch den Menschen schädigen. Daher besteht eines der vorrangigen Ziele bei der Entwicklung moderner Motoren in der Verringerung des Verbrauchs und in der Realisierung möglichst schadstoffarmer Brennverfahren.
Der im Rahmen dieser Arbeit aufgebaute, in Betrieb genommene und charakterisierte Einzylinder-Viertaktmotor kann durch seine vielfältigen optischen Zugänge sowie seinen flexiblen Aufbau zur Entwicklung effizienter und schadstoffarmer Brennverfahren eingesetzt werden. Er verfügt sowohl über einen ringförmigen optischen Zugang zum Brennraum als auch über ein Kolbenfenster, wodurch insgesamt der größte Teil des Brennraumes für optische Untersuchungen zugänglich wird. Durch zusätzliche endoskopische Zugänge können neue endoskopische Messtechniken erprobt und mit den großflächigen optischen Zugängen unter gleichen
Randbedingungen verglichen werden. Vielseitige Einstellmöglichkeiten und verschiedene Kraftstoffeinspritzsysteme ermöglichen die Nachbildung aktueller und die Entwicklung neuer Brennverfahren zur eingehenden optischen Untersuchung, wobei die optischen Messungen durch Indizierung des Zylinder-, Saugrohr- und Abgasdrucks sowie umfangreiche Betriebsgrößenmessungen ergänzt werden.
Zur Charakterisierung des Motors wurden Untersuchungen zum Brennfortschritt in einem fremdgezündeten Betriebspunkt anhand des von der Flamme emittierten Chemilumineszenzsignals (OH*) sowie anhand laserinduzierter Fluoreszenz (LIF) von im Laufe der Kompression und Verbrennung gebildetem Formaldehyd (CH2O) durchgeführt. Weiterhin wurde ein für eine schadstoffarme Verbrennung besonders interessanter selbstzündender Betriebspunkt realisiert und mit endoskopischen Messungen des OH*-Signals sowie der CH2OFluoreszenz untersucht. Hierbei konnte die Entstehung und der Abbau von CH2O im Verlauf des gesamten Zyklus beobachtet und zusätzlich Emissionsquellen unverbrannter Kohlenwasserstoffe im Brennraum identifiziert werden. Zur Charakterisierung der verwendeten Direkteinspritzdüse wurden sowohl mit Hilfe der großflächigen optischen Zugänge als auch mit Hilfe der endoskopischen Zugänge Streulichtmessungen am Kraftstoffspray durchgeführt und verglichen.Combustion engines are of invaluable importance for the reliable transportation of goods and passengers in everyday life. However, due to the fossil fuels used for their operation, leading to the release of climate-damaging carbon dioxide emissions. Additionally, during the process of combustion, other gaseous substances like nitric oxides, carbon monoxide and unburned hydrocarbons which are harmful both to the environment and human beings are formed. For these reasons, the reduction of fuel consumption as well as the development of combustion processes with as low pollutant production as possible are predominant targets in the development of modern combustion engines.
Due to its excellent optical accessibility and operational flexibility, the optically accessible engine which was built up, commissioned and characterized within the scope of this work is capable to contribute to the development of efficient and low emission producing combustion processes. To allow for optical access to the combustion chamber, the engine is equipped with both an annular optical access and a piston window, thus enabling the assessment of most regions within the combustion chamber. Furthermore, additional endoscopic accesses allow for the testing of newly developed endoscopic measurement techniques and for a comparison of the results with findings obtained by large scale optical investigations under the same operating boundary conditions. Due to various possible operational settings of the engine hardware and the possibility of applying different fuel injection systems, the reproduction of state of the art combustion processes as well as the development of new techniques for subsequent optical assessment are possible, while all these investigations are supplemented by indication measurements of the cylinder, intake and exhaust pressures as well as numerous measurements of the operating conditions.
For characterization of the engine, investigations of flame propagation in a spark‒ignited operation mode were conducted using the chemiluminescence signal (OH*) emitted by the flame as well as laser induced fluorescence (LIF) of formaldehyde (CH2O) occurring during compression and ignition. Moreover, a low pollutant producing self ignition operation mode was implemented and investigated with endoscopic assessment of the OH*-signal and CH2O-fluorescence. In the scope of these measurements, the formation and consumption of CH2O could be observed during the whole combustion cycle and sources of unburned hydrocarbons in the combustion chamber could be identified. In order to characterize the utilized direct injection fuel injector, comparative light scattering measurements of fuel spray using the large scale optical accesses and endoscopic measurements were conducted
Design, Synthese und Potential
No full textZiel der Arbeit war es ein allgemeines biomimetisches Konzept bzw. Design für Rezeptoren zu entwerfen, die in der Lage sind, ausgewählte biologische Substrate, auf Grundlage der in natürlichen Bindungsstellen vorkommenden Prinzipien, in Wasser zu binden. Das entwickelte Rezeptorkonzept ist nicht nur für ein einziges Substrat oder eine Substratgruppe maßgeschneidert. Vielmehr verwirklichen Konzept und Synthesestrategie eine einfache strukturelle Anpassung des Rezeptors an verschiedene Substrate, durch den Austausch oder Einbau unterschiedlicher bindender funktioneller Gruppen. Nach der Entwicklung der Synthesestrategie und synthetischer Realisierung wurde eine Einschätzung des Potentials des Rezeptorkonzepts durch erste Bindungsstudien mit ausgewählten Substraten - Polynukleotiden, Nukleotiden und Zuckern - vorgenommen. Die in Lösung und an der Festphase synthetisierten ein- bis dreiarmigen peptidischen Rezeptoren besitzen das Potential zur Bindung von Polynukleotiden. Ein in zusätzlichen Bindungsstudien detaillierter untersuchter Rezeptor bindet neben Polynukleotiden auch Nukleotide und sogar Zucker in Wasser
Model-based operator guidance in interactive, semi-automated production processes
No full textThis contribution focuses on the task of guiding and supervision of technical processes realized by human operators. The review of publications of the last decades discloses that especially technical processes with strong interconnection of human operator and manufacturing process are not adequately addressed by the evolved automation approaches. Integrating human process knowledge and experience into the resulting automation system is still a major concern. Besides the introduction of automation in a handcrafting process that is increasing the overall system complexity, the design of the human-machine interface
to the automation system is of central importance. Within this thesis, the trade-off between manual manufacturing and automation is addressed by a semi-automation approach. The application example is the no-bake molding process, a mold manufacturing process for casts that is traditionally handmade. Within this process the human operator plays a central role (i.e. knowledge and expertise), whereas the (intelligent) automation is carrying out physical operation, which is guided and supervised by the human operator. This is achieved by experimentally identified quality representing process variables that allow for in-process feedback to the human operator. Process guiding assistance is given using a formalization approach of the human-automation-interaction. By deducing situative information of interest from the resulting human-automation-system model with respect to the current process goal, the established process model is used for supervision and assistance of the overall process. The design of the human-machine-interface is based on a detailed analysis of the handcrafted process and is realized as a direct, intuitively usable, marker-based interaction technique. The integrated human-automation-system and the corresponding human-machine-interface with process guidance assistance functionality is initially evaluated. The results are discussed for the future work with respect to the individual, human operator-specific process understanding and process reproducibility.Diese Arbeit befasst sich mit Fachkraftaufgaben in der Führung und Überwachung von technischen Prozessen. Die Übersicht der Publikationen der letzten Jahrzehnte eröffnet, dass insbesondere technische Prozesse mit enger Verknüpfung von Mensch und Herstellungsprozess bei den entwickelten Automatisierungsansätzen nicht hinreichend berücksichtigt werden. Die Integration von Prozesswissen und -erfahrung in das resultierende Automatisierungssystem bleibt eine offene Fragestellung. Neben der Einführung von Automation in Handarbeitsprozesse, die die Komplexität des Gesamtsystems erhöhen, ist die Gestaltung der Mensch-Maschine-Schnittstelle zum Automatisierungssystem von zentraler Bedeutung. Der Konflikt zwischen Handarbeit und Automatisierung wird in dieser Arbeit durch die Einführung einer Teilautomatisierung gelöst. Das Anwendungsbeispiel ist das Kaltharzverfahren, ein traditionell in Handarbeit bewältigter Herstellungsprozess für Gussformen. In diesem Prozess spielt die Fachkraft eine zentrale Rolle (z. B. durch ihr Prozesswissen und ihre Expertise), während die (intelligente) Automatisierung –geführt und überwacht durch die Fachkraft– anfallende physische Aktionen ausführt. Dies wird durch experimentell ermit-
telte qualitäts-beschreibende Prozessgrößen erreicht, die eine in-prozess Rückführung zum Bedienpersonal ermöglichen. Prozessführungsassistenz ist basierend auf die Formalisierung der Mensch-Automation-Interaktion gegeben. Durch die Bestimmung von situativen Informationen hoher Wichtigkeit aus dem resultierenden Mensch-Automation-System Modell bezogen auf das aktuelle Prozessziel, wird das bestehende Prozessmodell zur Überwachung und Prozessführungsassistenz des Gesamtprozesses genutzt. Die Gestaltung der Mensch-Maschine-Schnittstelle basiert auf einer detaillierten Analyse des Handarbeitsprozesses und
ist als direkte, intuitiv bedienbare, markerbasierte Interaktionstechnik realisiert. Das integrierte Mensch-Automation-System sowie die zugehörige Mensch-Maschine-Schnittstelle inklusive Prozessführungsassistenzfunktionen wurden initial evaluiert. Die erzielten Ergebnisse werden hinsichtlich des individuellen, fachkraftabhängigen Prozesswissens und der Reproduzierbarkeit für den Ausblick diskutiert
Biocompatibility of perfluorocarbon-based artificial oxygen carriers
No full textBis heute ist die Entwicklung künstlicher Blutersatzstoffe ein Forschungsgebiet von größtem Interesse, da aufgrund der demogafischen Entwicklung und der abnehmenden Spendebereitschaft der Bevölkerung in Zukunft mit einem zunehmenden Mangel an Blutkonserven zu rechnen ist. Die Verfügbarkeit künstlicher Sauerstoffträger wäre sowohl für die routinemäßige Versorgung von Patienten als auch für die präklinische Notfallversorgung von Schwerstverletzten von größter Bedeutung.
In der vorliegenden Arbeit erfolgte eine in vitro- und in vivo-Charakterisierung neuartiger künstlicher Sauerstoffträger auf Perfluorcarbon-Basis in Form von PFD-gefüllten PLGA-, PACA- und Albumin-Kapseln. Im Rahmen der in vitro-Charakterisierung wurde die Keimfreiheit und die mikrobielle Stabilität der Kapselsuspensionen überprüft sowie deren Einflüsse auf die dynamische Viskosität von Blut untersucht. Zudem wurde ein in vitro-Assay zur Messung der Sauerstoffkapazitäten der Kapselsuspensionen etabliert. Im Rahmen der in vivo-Charakterisierung wurde die biologische Verträglichkeit der neuartigen künstlichen Sauerstoffträger im Rattenmodell untersucht. Neben der Evaluation toxikologischer Effekte wurden die Einflüsse der Kapselsysteme auf die Mikrozirkulation und die Integrität von Organstrukturen analysiert. Darüber hinaus wurden die intravasalen Halbwertszeiten und die in vivo-Verteilung der neuartigen künstlichen Sauerstoffträger bestimmt.
Eine Lagerung der Kapselsuspensionen war ohne Zusatz von Konservierungsstoffen möglich, was eine Grundvoraussetzung für klinische Anwendungen ist. Bei den Messungen der dynamischen Viskositäten von Blut zeigte sich, dass für PFD-haltige künstliche Sauerstoffträger im Allgemeinen Trägerlösungen mit einem möglichst geringen Salzanteil wie z. B. 5%ige Albumin-Lsg. gewählt werden sollten. Bezüglich der Sauerstoffkapazitäten hätten prinzipiell alle untersuchten Kapseltypen, bei einer ausreichend hohen Kapselkonzentration, das Potenzial als künstliche Sauerstoffträger zu fungieren. Eine 64 Vol.-%ige Albumin-Kapselsuspension weist zum jetzigen Entwicklungsstand sogar höhere Sauerstoffkapazitäten auf als ein bereits zugelassenes Präparat auf Perflourcarbon-Basis. Darüber hinaus übertrifft die 64 Vol.-%ige Albumin-Kapselsuspension ein Erythrozytenkonzentrat hinsichtlich der bereitgestellten Sauerstoffmenge im Organismus.
Schwerwiegende Nebenwirkungen wie eine transiente Hypotension, Störungen der Mikrozirkulation und Organschädigungen nach intravenöser Infusion der PLGA- und PACA-Kapseln widersprechen jedoch einem Einsatz in der Notfallmedizin, so dass die therapeutische Relevanz dieser Kapseltypen zum jetzigen Stand der Entwicklung fraglich ist.
Nach intravenöser Infusion der Albumin-Kapseln manifestierten sich filtrationsbedingte Kapselakkumulationen in der Milz. Alles in allem überzeugte diese in 5%iger Albumin-Lsg. suspendierten Kapseln aber durch eine sehr gute biologische Verträglichkeit und eine im Vergleich zu anderen nicht oberflächenmodifizierten Nanokapseln lange intravasale Halbwertszeit. Ein Einsatz der PFD-gefüllten Albumin-Kapseln als künstliche Sauerstoffträger im Rahmen der präklinischen Notfallversorgung kann aufgrund der Untersuchungen in dieser Arbeit insgesamt als therapeutisch relevant eingestuft werden.Because of the opponent steady decrease in blood donation and the demographic trend, a strong rise of the blood supply of the population is to anticipate in the future. Therefore, the development of artificial blood substitutes is in the focus of sciences. The disposability of artificial oxygen carriers would be a matter not only for the routine patient care but also for the preclinical care of severely injured.
The present work was to investigate in vitro and in vivo studies on novel perfluorocarbon-based artificial oxygen carriers in terms of PFD-filled PLGA, PACA and albumin capsules. Within the scope of the in vitro studies, the microbial stability of the capsule suspensions was approved and their influence on the dynamic blood viscosity was discovered. Moreover, the establishment of an in vitro assay allowed the measurement of the oxygen capacities of the capsule suspensions. The performed in vivo studies enabled the examination of the biocompatibility of the different PFD-filled capsules in rats. In addition to the evaluation of toxicological effects, the capsule’s influences on the microcirculation and the integrity of organ structures were investigated. Furthermore, the intravascular half-life and the biodistribution pattern of the capsules were determined.
Storage of the capsule suspensions did not require any supplementary preserving agents to protect from microbial contamination displaying an essential prerequisite for further clinical development. In the course of the measurement of the dynamic blood viscosities it turned out, that a saline-free carrier solution such as the 5% albumin solution should be used to suspend PFD-based artificial oxygen carriers. With regard to the oxygen capacities, all investigated capsules could serve as potential artificial oxygen carriers if adequate concentrations are used. A 64% albumin capsule suspension possesses even higher oxygen capacities than a perfluorocarbon emulsion that is already approved in different countries. Furthermore, the oxygen amount that can be supplied by the 64% albumin suspension in vivo betters the oxygen release of a red blood cell concentrate.
After intravenous administration of PLGA and PACA capsules severe side effects, such as a transient hypotension, disorders in microcirculation and organ damage, occurred contradicting the use in paramedicine. Hence, the therapeutic relevance of the PLGA and PACA capsules must be contested at present.
Intravenous infusion of albumin capsules caused accumulations in spleenic tissue being attributed to spleenic filtration, but altogether, albumin capsules exhibited a good biocompatibility and a comparatively long intravascular half-life. Due to the studies conducted in the present work, the therapeutic potential of the PFD-filled albumin capsules as artificial oxygen carriers in paramedicine could be proved
The functional relationship between Inhibitor-3, SDS22, and PP1 in the process of bipolar spindle attachment
No full textThe identification of bipolar kinetochore-microtubule attachments is essential for proper progression through mitosis. This is achieved by dynamic Aurora B-mediated phosphorylation of its targets at the kinetochore. Centromere-localized Aurora B phosphorylates kinetochore proteins in a tension-dependent manner, thereby destabilizing wrong kinetochore-microtubule attachments, which are without tension. PP1-mediated dephosphorylation of Aurora B substrates at kinetochores, which are under tension and thereby pulled out of the reach of Aurora B, leads to stabilization of kinetochore-microtubule attachments. Targeting of PP1 to the kinetochore by KNL1 and SDS22 (as well as CENP-E and KIF18A) is thought to regulate PP1 activity at the kinetochore in mammalian cells. However, the exact mechanism of PP1 regulation by SDS22 remained unclear so far, as contradictory data exist concerning the kinetochore-localization of SDS22 and its relevance for the activity of Aurora B on metaphase chromatin. Furthermore, in yeast, also Iinhibitor-3 (I3), which builds a trimeric complex with PP1-SDS22, is known to be relevant for PP1-mediated counteraction of the Aurora kinase.
In this thesis, we resolved the contradictory data, published on SDS22 and we provided additional information, which clarifies its role in PP1 regulation. Furthermore, we elucidated the function of I3 in mammalian cells. Our data demonstrate that SDS22 does not localize to kinetochores quantitatively and also does not function as a targeting subunit of PP1. Moreover, we find that SDS22 is required for PP1-mediated counteraction of Aurora B activity. However, increased levels of SDS22 at kinetochores inhibit PP1 activity. From these data we conclude that SDS22-bound PP1 is inactive, although SDS22 is required for PP1 activity. Therefore, we suggest that SDS22 may act as a general chaperone, stabilizing inactive PP1 for re-activation. Furthermore, we show for the first time that I3 is required for proper chromosome congression and PP1-mediated counteraction of Aurora B in mammalian cells. Our data indicate that I3 ensures localization of active PP1 to KNL1 by restricting SDS22 localization to KNL1-bound PP1. Increased SDS22 localization to kinetochore-bound PP1 due to I3 knockdown causes not only metaphase defects, but also leads to anaphase defects and persistence of active Aurora B on anaphase chromatin. Additionally, our data provide initial hints that the mechanism of PP1-SDS22 sequestration by I3 could be regulated via phosphorylation of I3 during mitosis. Finally, investigating the function of I3 and SDS22 provides a basis for exploring the functional link between I3-PP1-SDS22 and p97-p47/p37, which were found to interact physically.Die Bildung und Identifikation von bipolaren Kinetochor-Mikrotubuli-Verbindungen ist essentiell für den erfolgreichen Verlauf der Mitose. Beides wird erreicht durch die Aurora B abhängige Phosphorylierung von Kinetochor-Proteinen. Am Zentromer lokalisiertes Aurora B phosphoryliert seine Kinetochor-lokalisierten Substrate wenn Kinetochor-Mikrozubuli-Verbindungen nicht unter Spannung stehen. Dadurch wird erreicht, dass falsche Kinetochor-Mikrotubuli-Verbindingungen, die nicht unter Spannung stehen, destabilisiert werden. Kinetochore, die durch bipolare Verbindung mit Mikrotubuli unter Spannung stehen, können von dem, am Zentromer lokalisierten, Aurora B nicht mehr erreicht werden, wodurch PP1-abhängige Dephosphorylierung der Kinetochor-Substrate favorisiert wird. Aufgrund von Experimenten in Säugerzellen wird angenommen, dass die Aktivität von PP1 am Kinetochor über dessen Lokalisierung durch SDS22 (als auch KNL1, CENP-E, und KIF18A) reguliert wird. Der genaue Mechanismus ist bisher jedoch ungeklärt, da widersprüchliche Daten bezüglich der Lokalisierung von SDS22 und des Einflusses von SDS22 auf die Aktivität von Aurora B publiziert wurden. Zusätzlich haben Experimente in Hefe gezeigt, dass auch Inhibitor-3 (I3), welches einen trimeren Komplex mit PP1 und SDS22 bildet, für das antagonistische Wechselspiel von PP1 und Aurora B benötigt wird.
In dieser Arbeit wurden die Widersprüche bezüglich der Lokalisierung und Funktion von SDS22 aufgeklärt, sowie weitere Erkenntnisse gewonnen, die neue Schlussfolgerungen über die Rolle von SDS22 auf PP1 erlauben. Des Weiteren wurde die Funktion von I3 in Säugerzellen aufgeklärt. Diese Ergebnisse zeigen, dass SDS22 nicht quantitativ an den Kinetochoren lokalisiert und es auch nicht die Lokalisierung von PP1 zu den Kinetochoren reguliert. Jedoch ist SDS22 für ein funktionierendes Wechselspiel von PP1 und Aurora B am Kinetochor essentiell, auch wenn sich eine erhöhte Lokalisierung von SDS22 an den Kinetochor inhibierend auf die Aktivität von PP1 auswirkt. Dies führt zu der Schlussfolgerung, dass SDS22-gebundenes PP1 inaktiv ist, trotzdem aber SDS22 für PP1 Aktivität benötigt wird, woraus sich die Hypothese ergibt, dass SDS22 die Funktion eines Chaperons zur Stabilisierung inaktiven PP1s übernimmt, welches zur Reaktivierung von inaktivem PP1 benötigt werden könnte. Desweiteren wird erstmalig gezeigt, dass auch I3 für die erfolgreiche Bildung einer Metaphase Platte und für ein funktionierendes Wechselspiel von PP1 und Aurora B in Säugerzellen erforderlich ist. Die Daten belegen zusätzlich, dass I3 die Bindung von aktivem PP1 an KNL1 durch die Restriktion der Lokalisierung von SDS22 an KNL1-gebundenes PP1 sichert. Eine Störung der Lokalisierung von SDS22 verursacht nicht nur Defekte in Metaphase, sondern auch in Anaphase, da Segregationsdefekte und persistierendes aktives Aurora B auf Anaphase Chromatin gefunden wurde. Die Ergebnisse liefern darüber hinaus erste Hinweise auf eine Regulierung I3 abhängiger Sequestrierung von PP1-SDS22 durch Phosphorylierung von I3 in Mitose.
Schließlich vereinfacht die Entschlüsselung der Funktionsweise von SDS22 und I3 die weitere Suche nach der funktionellen Verbindung zwischen den, physikalisch interagierenden Komplexen I3-PP1-SDS22 und p97-p47/p37
Relevanz der Survivin-Acetylierung für dessen biologische Funktion
Get PDFSurvivin belongs to the inhibitor of apoptosis protein family and is also a regulator of mitosis as it is a member of the chromosomal passenger complex (CPC). While it is not expressed in differentiated adult tissue (Adida et al., 1998), it was found to be upregulated
in virtually all types of human cancers (Ambrosini et al., 1997; Adida et al.,2000). Its overexpression is associated with resistance of tumors against chemo- and radiotherapy, frequent recurrences and decreased patient survival (Engels et al., 2007; Capalbo et al., 2007; Xu et al., 2014; Chen et al., 2014). Thus, Survivin is a potential target for cancer therapy. In order to develop strategies for the therapeutic inhibition of
Survivin, the mechanisms underlying its dual role have to be clarified in detail. While Survivin fulfills some of its cellular tasks as a homodimer (Pavlyukov et al., 2011), other functions require the monomer (Jeyaprakash et al., 2007). A further layer of complexity
is introduced by the fact that Survivin shuttles between the nucleus and the cytoplasm as it is able to passively diffuse into the nucleus and is actively exported by the solublereceptor CRM1 (Rodriguez et al., 2002; Knauer et al., 2006). The mechanisms regulating Survivin’s functions, its localization as well as its dimerization state are still
not completely resolved and a matter of scientific disagreement. Recently, Wang et al. (2010b) reported that acetylation of Survivin at lysine 129 facilitates its dimerization, thus causing an accumulation of the protein in the nucleus as only the monomer is able to interact with CRM1 for nuclear export. As lysine acetylation has emerged as
a major post-translational modification capable of altering the functions and interactions of proteins, it is conceivable that Survivin’s function might be regulated by the acetylation of any of its 16 lysine residues. Thus, as a preliminary work to our study, which aimed to identify further acetylation sites in Survivin and the effect of a potential acetylation on some of Survivin’s functions,
we first set out to verify the findings obtained by Wang et al. (2010b). Accordingly, we cloned the four SurvK129 mutants investigated in their study and characterized them performing comprehensive molecular and structural analyses. Wang et al. (2010b)
reported a facilitated nuclear export and a reduced tendency to form dimers for the SurvK129E mutant, which they refered to as a mimicking mutant for Survivin unmodified at K129. They also claimed that this mutant was comparable to the SurvK129R
mutant bearing a lysine to arginine mutation typically introduced to mimic an unmodified lysine. In contrast to their results, we found that SurvK129E is unique among the analyzed SurvK129 mutants and not comparable to SurvK129R. Taken together, our results suggest that the effects observed for SurvK129E are not caused by the lack
of acetylation at K129, but might be due to the emergence of a potential high-affinity export signal by the exchange of a positively charged lysine with a negatively charged
glutamate at position 129. Moreover, our findings indicate that acetylation of Survivin at K129 impairs dimerization rather than facilitating it. Furthermore, we wanted to find out whether Survivin acetylated at K129 is involved in mitosis. Our analyses indeed indicate that acetylated Survivin might be incorporated into the CPC.
Finally, potential further acetylation sites within the Survivin protein were identified by in situ acetylation prediction. Fifteen Survivin mutants were cloned in which probably
acetylated lysine residues were either mutated to arginine or to glutamine in order to mimic an unmodified or an acetylated lysine residue. These mutants were analyzed accordingly to the SurvK129 mutants in order to reveal potential effects on Survivin’s
cellular and mitotic localization as well as on its dimerization. However, the characterization of the mutants could not identify lysine residues potentially involved in Survivin regulation. Nevertheless, we could show that, although K90 is located within Survivin’s
classical export signal, its acetylation is unlikely to affect the protein’s dimerization.
In summary, our results indicate that further comprehensive studies are required in order to understand the complex regulation of Survivin’s various functions and the role that lysine acetylation plays in it.Survivin gehört zur Proteinfamilie der Apoptose-Inhibitoren, ist aber als Mitglied des chromosomalen Passenger-Complexes (CPC) ebenso an der Regulation der Mitose beteiligt. Während es in differenziertem, adulten Gewebe nicht exprimiert wird (Adida et al., 1998), wurde eine Hochregulation in nahezu allen humanen Krebsarten nachgewiesen (Ambrosini et al., 1997; Adida et al., 2000). Seine Überexpression steht in Verbindung mit der Resistenz von Tumoren gegen Chemo- und Strahlentherapie, einem häufigen Wiederauftreten von Tumoren und einer verringerten Überlebenszeit der Patienten (Engels et al., 2007; Capalbo et al., 2007; Xu et al., 2014; Chen et al., 2014).
Demzufolge stellt Survivin ein mögliches Angriffsziel für die Krebstherapie dar. Die Entwicklung von Strategien zur therapeutischen Inhibition von Survivin setzt jedoch ein grundlegendes Verständnis der molekularen Mechanismen, die seiner Doppelfunktion zugrunde liegen, voraus. Seine duale Rolle führt Survivin innerhalb der Zelle teilweise als Monomer, zum Teil aber auch als Homodimer aus. Survivin ist zudem in der Lage, zwischen Zellkern und Cytoplasma hin und her zu wandern, indem der durch den Exportrezeptor CRM1 vermittelte, aktive Export aus dem Kern der passiven Diffusion
entgegenwirkt (Rodriguez et al., 2002; Knauer et al., 2006). Die Mechanismen, welche die Funktion, Lokalisation und Dimerisierung von Survivin regulieren, konnten bisher nicht vollständig aufgeklärt werden und sind Gegenstand kontroverser wissenschaftlicher
Diskussionen. Einer Studie von Wang et al. (2010b) zufolge fördert die Acetylierung von Survivin an Lysin 129 dessen Dimerisierung. Dies führt zu einer Ansammlung des Proteins im Zellkern, da nur das Survivin-Monomer an den Exportrezeptor CRM1
binden kann. Da die Lysin-Acetylierung zudem als eine bedeutende post-translationale Modifikation gilt, welche die Funktionen und Interaktionen von Proteinen beeinflussen kann, ist eine Regulation von Survivin durch die Acetylierung einiger seiner 16 Lysin-
Reste durchaus denkbar.
Zunächst wurden zur Verifizierung der Ergebnisse von Wang et al. (2010b) die dort verwendeten vier SurvK129-Mutanten kloniert und mittels umfassender molekularer
und struktureller Analysen charakterisiert. Wang et al. (2010b) beschreiben einen erleichterten Kernexport sowie eine verringerte Dimerisierungstendenz der SurvK129EMutante,
welche in dieser Studie als an Lysin 129 nicht modifizierbar charakterisiert wird. Auch sei diese Mutante vergleichbar mit der SurvK129R-Mutante, die eine Lysinzu-Arginin-Mutation trägt, welche typischerweise zur Nachahmung eines unmodifizierten
Lysins eingeführt wird. Im Gegensatz zu Wang et al. (2010b) konnten wir zeigen, dass SurvK129E einzigartig unter den betrachteten SurvK129-Mutanten und nicht vergleichbar
mit SurvK129R ist. Insgesamt weisen unsere Ergebnisse darauf hin, dass die Effekte, die für die SurvK129E-Mutante beobachtet wurden, nicht durch die fehlende Acetylierung an K129, sondern durch die Entstehung eines möglichen Exportsignals mit einer hohen Affinität zu CRM1 hervorgerufen werden könnten. Die Erhöhung
der Affinität des möglicherweise bestehenden, schwachen Exportsignals käme dabei durch den Austausch des positiv geladenen Lysins an Position 129 durch ein negativ
geladenes Glutamat zustande. Darüberhinaus deuten unsere Erkenntnisse eher aufeine Beeinträchtigung als auf eine Begünstigung der Dimerisierung durch die Acetylierung an K129 hin.
Im Rahmen unserer Untersuchungen zur Rolle von acetyliertem Survivin in der Mitose deutete sich weiterhin an, dass im CPC gebundenes Survivin acetyliert vorliegen könnte.
Weitere mögliche Acetylierungsstellen innerhalb von Survivin wurden durch eine in situ Acetylierungsvorhersage identifiziert. Darauf basierend wurden 15 Survivin-Mutanten kloniert, in welchen mit hoher Wahrscheinlichkeit acetylierte Lysin-Reste zu Arginin
oder Glutamin mutiert wurden, um entweder ein unmodifiziertes oder ein acetyliertes Lysin zu imitieren. Diese Mutanten wurden analog zu den SurvK129-Mutanten analysiert, um mögliche Effekte auf die zelluläre und mitotische Lokalisation sowie die Dimerisierung von Survivin nachzuweisen. Anhand dieser Untersuchungen konnten
allerdings keine Lysin-Reste identifiziert werden, welche eine tragende Rolle in dessen Regulation spielen. Allerdings ist davon auszugehen, dass eine Beeinträchtigung der Dimerisierung durch die Acetylierung von Lysin 90 unwahrscheinlich ist, obwohl sich dieses innerhalb des klassischen Exportsignals von Survivin befindet.
Zusammenfassend implizieren unsere Ergebnisse, dass weitere umfassende Studien nötig sind, um die komplexe Regulation der verschiedenen Funktionen von Survivin und insbesondere die Rolle der Lysin-Acetylierung im Detail zu verstehen
Proteolyse und ATP-unabhängige Disaggregation von Tau Aggregaten durch die humane Serin-Protease HTRA1
No full textMechanismen der Proteinqualitätskontrolle gewährleisten die korrekte Faltung, Lokalisation und Mengen der zellulären Proteine und sichern dadurch die Intaktheit des Proteoms. Wenn dies nicht in ausreichendem Maß gelingt, kann es zur vermehrten Fehlfaltung von Proteinen kommen, was den Verlust ihrer normalen Funktionsweise und die Ansammlung unlöslicher Aggregate zu Folge haben kann. Enzyme der Proteinqualitätskontrolle katalysieren die Faltung von neu synthetisierten und Rückfaltung beschädigter Proteine, den proteolytischen Abbau alter, geschädigter oder fehlgefalteter Proteine, oder das Auflösen von Aggregaten mit folgender Rückfaltung oder Proteolyse. Insbesondere der letztere Prozess, die
Disaggregation, stellt besondere Anforderungen an die beteiligten Enzyme, da Proteinaggregate sehr stabile Komplexe sind, deren Auflösung und Proteolyse nach bisherigem Wissensstand den Einsatz chemischer Energie aus der Hydrolyse von ATP erfordert.
HtrA Proteasen sind in ATP unabhängige, hochkonservierte Serinproteasen, deren Rolle für die Proteinqualitätskontrolle in vielen Spezies nachgewiesen und detailliert untersucht werden konnte. Die humanen HtrAs erfüllen offenbar vielfältige Funktionen, da sie mit vielen grundlegenden zellulären Prozessen assoziiert sind, z.B. mit Zellmigration, Wachstum und Apoptose. Eine Assoziation von HTRA1 mit Proteinablagerungen in der Alzheimerschen Krankheit (AD), sowie die durch HTRA1 katalysierte Proteolyse des Mikrotubuli-assoziierten
Proteins Tau, das in AD Aggregate ausbildet, ließen eine Rolle von HTRA1 in der Proteinqualitätskontrolle humaner Zellen vermuten. Ziel der vorliegenden Arbeit war es daher, den biochemischen Mechanismus des Abbaus von Tau, insbesondere von amyloiden
Tau Aggregaten durch HTRA1 zu charakterisieren, da die Proteolyse von Tau Aggregaten eine Möglichkeit darstellt, wie neuronale Zellen sich vor schädlichen Effekten dieser Ablagerungen schützen könnten.
Es konnte hier gezeigt werden, dass neben löslichem Tau auch verschiedene Formen von Tau Aggregaten durch rekombinantes HTRA1 proteolytisch abgebaut werden konnten. Dies
galt auch für solche Aggregate, die spektroskopischen und rasterkraftmikroskopischen Untersuchungen zufolge den fibrillären, mit neurodegenerativen Prozessen assoziierten Tau-
Aggregaten entsprachen. Aufgrund dieser Beobachtungen wurde vermutet, dass HTRA1 eine Disaggregaseaktivität aufweist, die das Auflösen von stabilen Tau Aggregaten ermöglicht und damit dazu beiträgt, dass auch aggregiertes Tau durch HTRA1 proteolysiert
werden kann. Mithilfe von Ultrazentrifugation und Rasterkraftmikroskopie konnte schließlich gezeigt werden, dass eine proteolytisch inaktive HTRA1-Mutante Tau Fibrillen auflösen
konnte. Diese Disaggregation ermöglichte außerdem einen erleichterten proteolytischen Abbau von Tau Aggregaten nach anschließender Zugabe von proteolytisch aktivem HTRA1.
Die massenspektrometrische Analyse der proteolytischen Spaltprodukte verdeutlichte, dass durch die Disaggregation insbesondere diejenigen Bereiche des Tau Proteins vermehrt
hydrolysiert wurden, die sich in dem schwer zugänglichen Kern befanden. Somit konnte ein Modell vorgeschlagen werden, demzufolge HTRA1 eine ATP unabhängige Disaggregaseaktivität besitzt, die es der Protease ermöglicht, nach Auflösung der festen
Struktur des Kerns der Aggregate auch zu den Bereichen Zugriff zu bekommen, die vermutlich zu der Persistenz von amyloiden Aggregaten unter pathologischen Bedingungen
beitragen. Experimente mit HTRA1 Mutanten, deren PDZ Domäne mutiert oder deletiert war, lassen eine Rolle der PDZ Domäne im Prozess der Disaggregation vermuten. Allerdings ist der genaue Mechanismus und das Ausmaß der Beteiligung der PDZ Domäne noch
unklar, da auch ohne diesen Teil des Enzyms eine Disaggregation möglich war, wenn auch mit weniger deutlichem Effekt auf die anschließende Proteolyse durch aktives HTRA1.
In Zellkulturexperimenten konnte nachgewiesen werden, dass rekombinantes HTRA1 von kultivierten humanen Zellen aufgenommen wurde und im Zytoplasma mit seinem Substrat
Tau kolokalisierte. Dies zeigt zum Einen einen möglichen Weg auf, mit Hilfe dessen das sezernierte HTRA1 Protein auch intrazellulär zur Verfügung gestellt werden könnte. Zum Anderen eröffnete dieses Phänomen die Möglichkeit, in einem experimentellen Modell der
intrazellulären Tau Aggregation die Mengen an zytoplasmatischem HTRA1 zu manipulieren. Diese Vorgehensweise wurde genutzt um zu zeigen, dass HTRA1 nicht nur in vitro, sondern auch in humanen Zellen Tau Aggregate disaggregieren und proteolysieren konnte, da
erhöhte Mengen an intrazellulärem, proteolytisch inaktivem, sowie auch aktivem HTRA1 zu einer Verminderung der Menge an Tau Aggregaten führten.
Zusammenfassend lässt sich also festhalten, dass anhand der hier dargelegten experimentellen Daten ein Mechanismus der Proteinqualitätskontrolle für HTRA1 nachgewiesen wurde, der nicht nur das bis hierher bekannte Repertoire der HtrA Proteasen
erweitert, sondern auch einen neuartigen Mechanismus der ATP-unabhängigen Disaggregation zeigt. HTRA1 vereinigt also Protease- und Disaggregasefunktionen in einem Enzym und kann folglich als ein neuer Faktor der Proteinqualitätskontrolle betrachtet werden, der ein interessantes Ziel pharmazeutischer Intervention in neurodegenerativen Erkrankungen wie beispielsweise AD darstellen könnte
Vision-Based Control of Flexible Robot Systems
No full textThis thesis covers the controlling of flexible robot systems by using a camera as a measurement device. To accomplish the purpose of the study, the estimation process of dynamic state variables of flexible link robot has been examined based on camera
measurements. For the purpose of testing two application examples for flexible link have been applied, an algorithm for the dynamic state variables estimation is proposed.
Flexible robots can have very complex dynamic behavior during their operations, which can lead to induced vibrations. Since the vibrations and its derivative are not all measurable, therefore the estimation of state variables plays a significant role in the state feedback control of flexible link robots. A vision sensor (i.e. camera) realizing a contact-less measurement sensor can be used to measure the deflection of flexible robot arm. Using a vision sensor, however, would generate new effects
such as limited accuracy and time delay, which are the main inherent problems of the application of vision sensors within the context. These effects and related compensation approaches are studied in this thesis. An indirect method for link
deflection (i.e. system states) sensing is presented. It uses a vision system consisting of a CCD camera and an image processing unit.
The main purpose of this thesis is to develop an estimation approach combining suitable measurement devices which are easy to realize with improved reliability. It includes designing two state estimators; the first one for the traditional sensor type
(negligible noise and time delay) and the second one is for the camera measurement which account for the dynamic error due to the time delay. The estimation approach is applied first using a single link flexible robot; the dynamic model of the flexible link is derived using a finite element method. Based on the suggested estimation approach, the first observer estimates the vibrations using strain gauge (fast and complete dynamics), and the second observer estimates the vibrations using vision data (slow dynamical parts). In order to achieve an optimal estimation, a proper combination process of the two estimated dynamical parts of the system dynamics is described. The simulation results for the estimations based on vision measurements show that the slow dynamical states can be estimated and the observer can compensate the time delay dynamic errors. It is also observed
that an optimal estimation can be attained by combining slow dynamical estimated states with those of fast observer-based on strain gauge measurement.
Based on suggested estimation approach a vision-based control for elastic shipmounted crane is designed to regulate the motion of the payload. For the observers and the controller design, a linear dynamic model of elastic-ship mounted crane incorporating a finite element technique for modeling flexible link is employed. In order to estimate the dynamic states variables and the unknown disturbance two state observers are designed. The first one estimates the state variables using camera measurement (augmented Kalman filter). The second one used potentiometers measurement (PI-Observer). To realize a multi-model approach of elastic-ship mounted crane, a variable gain controller and variable gain observers are designed. The variable gain controller is used to generate the required damping to control the system based on the estimated states and the roll angle. Simulation results show that the variable gain observers can adequately estimate the states and the unknown disturbance acting on the payload. It is further observed that the variable gain controller can effectively reduce the payload pendulations. Experiments are conducted using
the camera to measure the link deflection of scaled elastic ship-mounted crane system.
The results shown that the variable gain controller based on the combined states observers mitigated the vibrations of the system and the swinging of the payload.
The presented material above is embedded into an interrelated thesis. A concise introduction to the vision-based control and state estimation problems is attached in the first chapter. An extensive survey of available visual servoing algorithms that
include the rigid robot system and the flexible robot system is also presented. The conclusions of the work and suggestions for the future research are provided at the last chapter of this thesis