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Time-resolved transport spectroscopy of coupled 2D-0D-systems
No full textDiese Arbeit untersucht die elektronische Niveaustruktur selbstorganisierter InAs-Quantenpunkte über die Tunnelkopplung an ein zweidimensionales Elektronenreservoir. Im Fokus stehen dabei neben den Vielteilchen-Grundzuständen der bis zu sechsfach besetzbaren Quantenpunkte auch die angeregten Zustände mit ein- und zweifacher Besetzungszahl, also die des Quantenpunkt-Wasserstoffs bzw. Heliums. Die Dynamik des Tunnelvorgangs aus den Quantenpunkten heraus kann hier zum ersten mal gezielt genutzt werden, um das Anregungsspektrum der Wasserstoff- und Helium-Konfigurationen für die ersten drei Schalen (s, p und d) herauszufiltern. Die beobachteten Schalenabstände lassen sich dabei in guter Näherung mit einem einfachen Modell für die Additionsenergien der Einteilchen-Zustände, aus den Vielteilchen-Grundzuständen ableiten.
Ein Vergleich von Lade- und Entladedynamik der Grundzustände ermöglicht darüber hinaus eine Aufschlüsselung der Entartung beim Auffüllen der ersten sechs Elektronen. Ohne Zuhilfenahme eines Magnetfeldes kann hier gezeigt werden, dass das einschließende Potential der Quantenpunkte eine Asymmetrie aufweist, die zu einer Aufhebung der Entartung in der p-Schale der Quantenpunkte führt. Durch eine Messung des Tunnelstroms bei einem angelegten Magnetfeld kann diese Anisotropie durch eine Deformation der Wellenfunktion in den Quantenpunkten bestätigt werden. Hierbei zeigt sich auch, dass die Quantisierung des Elektronenreservoirs, mit Bewegungsfreiheitsgraden senkrecht zur Tunnelrichtung, beim Übergang nicht vernachlässigt werden kann. Quer zur Tunnelrichtung kann der Fermi-Impuls der Elektronen im Reservoir dabei nur schlecht von den, im Impulsraum lokalisierten, Grundzuständen der Quantenpunkte aufgenommen werden.
Im Experiment dient das Elektronengas nicht nur als Elektronenreservoir, sondern auch als Detektor der Ladung in den Quantenpunkten, die sich zeitaufgelöst als Verringerung der Leitfähigkeit beobachten lässt. In dieser Arbeit wird gezeigt, dass die Ladung der Quantenpunkte ausschließlich durch Abschirmung auf die spannungsgesteuerte Ladungsträgerdichte im Elektronengas wirkt und ein Einfluss auf die Beweglichkeit durch Streuung an geladenen Quantenpunkten vernachlässigt werden kann. Des weiteren wird gezeigt, dass sich das Elektronengas als schneller, wie auch als empfindlicher Detektor gegenüber etablierten Methoden eignet. So kann das Auslesen der Ladungsinformation in den Quantenpunkten mit einer Zeitauflösung von 3 ns demonstriert und getrennt auflösbare Subensembles innerhalb einer Probe mit 100 Quantenpunkten detektiert werden.The electronic structure of self-assembled InAs quantum dots is investigated via the coupling to a two-dimensional electron reservoir. Apart from the many-electron ground states of the quantum dots, which can be charged with up to six electrons, this work is also focused on the excited states of the one- and two-electron configurations, i.e. quantum dot hydrogen and helium. For the first time, the dynamics of the electron emission processes are used to filter the excited level spectrum with respect to the occupation number to clearly resolve the s-, p- and d-shells for the hydrogen and helium configurations. A simple model, which takes the addition energies of the many-particle ground states into account, gives good agreement to the observed separation between the shells.
Furthermore, a comparison of the charging and discharging dynamics of the ground states allows to break down the degeneracy of states for the first six electrons filling the s- and p-shells. Without the need for a magnetic field it can be shown, that the confining potential of the quantum dots exhibits a significant asymmetry, lifting the degeneracy for the four states in the p-shell, leaving only spin degeneracy. From a measurement of the tunneling current in an applied magnetic field this anisotropy can be confirmed as a deformation of the wave functions in the quantum dots. In this context it is also shown, that the confining potential of the electrons in the reservoir, which allows freedom of movement only perpendicular to the tunneling current, also affects the transition probability, as the high Fermi momentum does not fit well into the localized ground state of the quantum dots.
In the experiment the electron gas is not only used as reservoir, but also as a detector for the charge in the quantum dots, which can be observed as a drop in conductivity during the tunneling process. The effect of the charged quantum dots on the conductivity is shown to arise solely from screening the field-effect induced carriers in the electron gas while any scattering effects can be neglected. Furthermore, it is shown that the detection via conductance is fast as well as sensitive in comparison to established methods such as capacitance spectroscopy. It is demonstrated, that the charge in the quantum dots can be read-out within 3 ns and sub-ensembles in a sample with 100 dots can be resolved separately
Identifizierung neuer Genprodukte mit einem Einfluss auf humane hämatopoetische Stamm- und Vorläuferzellen
No full textHämatopoetische Stammzellen (HSZ) besitzen die Fähigkeit zur Selbsterneuerung und sind in der Lage, Vorläuferzellen hervorzubringen, die in spezialisierte Zellen differenzieren können. Die Mechanismen, welche die Selbsterneuerung versus Differenzierung steuern, sind bis heute weitgehend unbekannt.
Mit dem Ziel, neue Gene zu identifizieren, deren Genprodukte an den Prozessen der Selbsterneuerung und Differenzierung von primitiven humanen Hämatopoetischen Stammzellen beteiligt sind, wurden im Vorfeld dieser Arbeit Genexpressionsanalysen von unterschiedlichen hämatopoetischen Zellpopulationen angefertigt. Es konnten Gene identifiziert werden, die spezifisch in primitiven hämatopoetischen Zellfraktionen exprimiert werden. In dieser Arbeit wurde der Einfluss ausgewählter Gene auf die Dynamik von CD34+ und CD133+ Populationen in HSZ untersucht. Zu diesem Zweck wurden die Kandidatengene in lentivirale Plasmide kloniert und stabil in frisch isolierten CD34+ Zellen überexprimiert. Im weiteren Verlauf wurden die Anteile der CD34+ und CD133+ Populationen durchflusszytometrisch über 14 Tage dokumentiert. Es konnten 8 Transkriptionsfaktoren identifiziert werden, die nach ihrer Überexpression die Populationskinetik im Vergleich zu den Kontrollen veränderten. Hierzu gehören die Gene BHLHB2, CEBPD, KLF4, SNAI2, SOX2, SOX9, SOX11 und ZNF281.
Zellschicksalsanalysen von Nachkommen einzelner primitiver HSZ deuten darauf hin, dass die Entscheidung der Selbsterneuerung versus Differenzierung möglicherweise durch asymmetrische Zellteilungen reguliert wird. Es wurden bislang vier Proteine identifizieren, die in ca. 20% sich teilender humaner HSZ asymmetrisch segregieren. Zwei dieser Proteine, CD53 und CD63, gehören zur Familie der Tetraspanine. In dieser Arbeit wurde nach Möglichkeiten gesucht, solche asymmetrischen Zellteilungen in lebenden Zellen verfolgen zu können. Zu diesem Zweck wurden verschiedene Tetraspanin-eGFP Fusionsproteine generiert und durchflusszytometrisch, proteinbiochemisch sowie immunzytochemisch validiert. Es stellte sich heraus, dass CD63-eGFP Fusionsproteine sich am besten zur optischen Nachverfolgung asymmetrischer Zellteilungen von CD34+ Zellen eignen. Weiterhin wurde beobachtet, dass die Überexpression von CD9-, CD81-, CD82- und CD151-eGFP Fusionsproteinen zur Bildung von atypischen Vesikeln führte. CD37a-, CD81- und CD151-eGFP Fusionsproteine kolokalisierten sowohl mit dem frühen, als auch mit dem späten endosomalen Kompartiment
A contribution to standard development in university teacher education
No full textDie Überprüfung und Entwicklung der Qualität der Lehrerbildung in Deutschland ist in den letzten Jahren verstärkt in den Fokus der Bildungsforschung gerückt. Von bildungspolitischer Seite werden Standards für die Bildungswissenschaften sowie inhaltliche Vorgaben für die Fächer und Fachdidaktiken in die Hochschulen getragen. Gemeinsam bestimmen sie fundamentale Ziele der universitären Lehrerbildung. Eine substanzielle Beschreibung des Wissens, das Absolventinnen und Absolventen, insbesondere innerhalb der fachdidaktischen Lehrveranstaltungen, erwerben sollen, kann damit allerdings nicht angenommen werden. Hier knüpft die vorliegende Arbeit mit dem Ziel an, Elemente chemiedidaktischen Wissens der universitären Lehrerbildung zu bestimmen. Im Rahmen der durchgeführten Interviewstudie mit Vertretern aus erster und zweiter Phase der Lehrerbildung, werden theoretisch abgeleitete Facetten fachdidaktischen Wissens präzisiert, so dass schließlich ein Katalog von 65 Standards für die chemiedidaktische universitäre Lehrerbildung abgeleitet werden kann. Diese Standards liefern Ansatzpunkte nicht nur für die inhaltliche Gestaltung der Lehre. Sie können künftig für die Qualitätsentwicklung chemiedidaktischer Lehrerbildung genutzt werden, indem sie als Referenz für die Entwicklung entsprechender Testinstrumente herangezogen werden können. Neben der inhaltsbezogenen Differenzierung des chemiedidaktischen Wissens, kann durch den qualitativ-inhaltsanalytischen Auswertungsprozess abgeleitet werden, dass die Entwicklung eines reflexiven Habitus bei den Studierenden zu den Kernaufgaben der ersten Phase der Lehrerbildung zählt. Wissenschaftlich fundiertes fachdidaktisches Wissen sowie Reflexionsfähigkeit können angehende Lehrerinnen und Lehrer in ihrem Professionalisierungsprozess unterstützen, um den komplexen beruflichen Anforderungen gerecht werden zu können.Over the last years, evaluating the quality and effectiveness of teacher education has become an important field of educational research. Existing standards for teacher preparation as well as subject-related requirements contribute to the description of goals that future teachers should have achieved before they enter the preparatory service. However, the description of knowledge of chemistry-related didactics remains unspecific and is still not sufficient. The present study aims at bridging the gap by defining facets of pedagogical content knowledge more precisely. Therefore, teacher educators of the first and the second phase were interviewed. The deduced 65 standards for chemistry teacher education can be used in order to enhance teacher education programs. Besides, they offer a framework for the development of prospective test instruments that can be applied for the examination of chemistry university teacher education. Additionally, the qualitative interview analysis pointed out that prospective teachers should develop reflective faculty in order to deal adequately with the complex tasks of the professional field
The relationship between work-systems which are guided by goal-orientation (result-oriented systems) and the working conditions of employees
No full textBei dieser Forschungsarbeit geht es darum, den Wandel in den Arbeitsbedingungen von Beschäftigten und die damit einhergehenden Regulierungserfordernisse aufzuzeigen. Im Vordergrund stehen flexible und selbstorganisierte Formen der Arbeitsorganisation und der Leistungssteuerung von Beschäftigten. Hierzu gehört u.a. das Arbeiten im Rahmen von kennziffernorientieren Zielvereinbarungen, in Projekten oder in Profitcentern. Empirische Studien hierzu sind zwar zahlreich, beziehen sich aber meist nur auf bestimmte Branchen (wie z. B. IT-Unternehmen, Pflegebereich, Finanzdienstleistungen). Breite empirische Studien zu neuen Formen der Arbeits- und Leistungssteuerung und ihre Auswirkungen auf die Arbeitsbedingungen von Beschäftigten liegen so gut wie gar nicht vor. Diese Forschungslücke will dieses Promotionsvorhaben schließen. Die Forschungsfrage lautet, ob sich er-gebnisorientiert gesteuerte Arbeitssysteme auch branchenübergreifend auf die Arbeitsbedingungen von Beschäftigten auswirken. Wenn ja, dann stellt sich die Frage, ob konventionelle Regulierungen und Möglichkeiten zum Schutz der Beschäftigten (Arbeitsschutzgesetz, betriebliche Interessenvertretung) den Gestaltungsanforderungen ergebnisorientiert gesteuerter Arbeitssysteme gerecht werden. Mit Hilfe einer breit angelegten Befragung in 1.700 deutschen Betrieben mit Betriebsratsvertretung ist dieser Frage nachgegangen worden. Die Befunde zeigen, dass Belegschaften in Betrieben mit ergebnisorientierten Arbeitsbedingungen tatsächlich höherem Arbeits- und Leistungsdruck ausgesetzt sind. Es zeigt sich auch, dass die bestehenden Regularien kaum greifen, um den wachsenden Arbeitsdruck in den Betrieb eindämmen zu können. Damit ergeben sich große Schwierigkeiten, Arbeitsbedingungen, die mit ergebnisorientiert geführten Arbeitssystemen in Verbindung stehen, zu regulieren. Sowohl der gesetzliche und betriebliche Arbeits- und Gesundheitsschutz als auch die betriebliche Interessenvertretung stoßen mit ihren bisherigen Möglichkeiten an ihre Grenzen.This dissertation deals with the intensification of work for employees and the associated regulatory requirements. The main focus will be on flexible and self-organized forms of work organization and performance management of employees. Such forms include, among other points, work in the framework of goal-settings with measurable performance data, in teams or projects or in profit centres. What characterizes these work forms is the fact that the performance of employees is no longer measured just about the labour effort (like work-ing time), but increasingly about the measurable results (such as economic targets), in per-formance or other success indicators (result-oriented systems). The research question is whether, compared across sectors, result-oriented work systems do affect working condi-tions of employees or not. If yes, then the question arises whether conventional regulations and possibilities to protect workers (labour protection laws, workplace representation) can cope with the new design requirements in the event of result-oriented work systems. This question has been investigated by using a wide-ranging survey in 1,700 German compa-nies with works council representatives. The findings show that employees in companies with result-oriented working systems are indeed exposed to higher working pressure and, therefore, to higher levels of mental stress.
The findings also show that this phenomenon is difficult to regulate. Both the statutory and company health and safety regulations, as well as institutional representation of interest at the workplace, are operating with their present possibilities at their limits. The existing regu-lations are far from being well-equipped in order to curtail growing work strain. Limitations of working time or break rules are little observed by many employees, mostly due to the as-pect of “self-interest”: in relation to achieving economic targets and high levels of work in-tensification, workers have a greater interest in achieving their working goals than interrupt-ing their working process in order to relax (as health and safety regulations would recom-mend). Also legal work protection regulations can achieve their objectives only with difficul-ty. However, the workplace representation is also overwhelmed, as the findings represent. Consequently, many works councils feel themselves increasingly powerless.
This study may contribute to a better understanding of the interactions between work, per-formance, regulation and health
Studies about Cecropin P1 - an antimicrobial peptide
No full textAntimikrobielle Peptide sind in allen Lebewesen verbreitete Peptide, welche ein breites Wirkspekt-rum gegen Bakterien, aber auch Pilze, Parasiten und Viren besitzen. Ihre Toxizität ist meist spezifisch und die Gefahr der Resistenzbildung im Vergleich zu medizinisch angewendeten Antibiotika gering. Dies macht sie für die medizinische Forschung und Anwendung sehr interessant. Um diese Peptide rational pharmakologisch zu optimieren ohne die Vorteile der AMPs gegenüber der Antibiotika ein-zubüßen, müssen der grundlegende Mechanismus der AMP-Bakterien-Interaktion entschlüsselt und die für die Toxizität nötigen Eigenschaften der Peptide identifiziert werden.
Innerhalb dieser Arbeit wurde das Peptid Cecropin P1 aus dem Spulwurm des Schweins ausgewählt, welches spezifisch mit bakteriellen Membranen interagiert und Bakterien lysiert. Für die Charakteri-sierung der Struktur und Dynamik mittels NMR-Spektroskopie wurde das synthetische Cecro-pin P1-Gen in einen pET-SUMO-Vektor mit His-tag kloniert, in E. coli C43 15N-markiert exprimiert und das Peptid anschließende über eine His-tag-Affinitätschromatografie gereinigt. Die erstmals durchge-führte NMR-spektroskopische Analyse des Cecropin P1 in wässriger Umgebung ergab das Bild eines monomeren Peptides mit einer überwiegend α-helikalen amphipathischen N-terminalen Hälfte und einer im Vergleich dazu flexibleren unstrukturierten C-terminalen Hälfte mit einer hydrophoben Se-quenz. Auffällig ist dabei, dass der flexible Bereich nahe des Glycins an Position 21 beginnt, was da-rauf hindeutet, dass Cecropin P1 den Insektencecropinen mit ihrer α-Helix-„Gly-Pro-Gelenk“-α-Helix-Struktur in Membranumgebung ähnlicher ist als bisher angenommen.
Weiterhin wurden Cecropin P1-Varianten entworfen um systematisch die Rolle der Hydrophobizität und Länge des hydrophoben Bereichs im C-terminalen Abschnitt von Cecropin P1 für die Toxizität in E. coli zu untersuchen. Die Toxizität der Cecropin P1 Varianten wurde dafür über die Ermittlung der minimalen inhibitorischen Konzentration (MIC) im laborintern etablierten Microplate Broth Dilution-Test abgeschätzt und zusätzlich mit einer Dreifach-Fluoreszenzfärbung näher charakterisiert. Diese Art der Charakterisierung lässt Aussagen über die totale Zellzahl, Viabilität und Membranintegrität der E. coli-Zellen nach Inkubation mit den Peptiden zu. Die größte Toxizität hatten hier Peptide mit einem 45 bis 55 % hydrophoben C-Terminus. Die Substitution der hydrophoben Aminosäuren an Position 22 bis 27 durch andere hydrophobe Aminosäuren ergab zwar eine identische MIC, veränder-te jedoch die Kinetik der Toxizität. Eine Verlängerung und Verkürzung der hydrophoben Sequenz im C-terminalen Bereich des Cecropin P1 um weitere hydrophobe Aminosäuren führte zu einer Vermin-derung der Toxizität. Dabei war eine Verkürzung um 2 Aminosäuren noch genauso toxisch wie das Wildtyp-Cecropin P1, die Verlängerung um 2 Aminosäuren verringerte die Toxizität signifikant. Die Arbeiten zeigen, dass weiterführende Studien zur Kinetik der Toxizitätswirkung der einzelnen Cecro-pin P1-Varianten und Visualisierung mit Hilfe der Fluoreszenzmikroskopie einen noch detaillierteren Einblick in den Toxizitätsmechanismus des Cecropin P1 geben könnten. Die erstmalige Expression von Isotopen-markiertem Cecropin P1 erlaubt zudem eine strukturelle und auch dynamische Analyse des Cecropin P1 mit Hilfe der NMR-Spektroskopie in verschiedenen Membransystemen und ermög-licht den Interaktionsmechanismus von Cecropin P1 mit Biomembranen detailliert zu untersuchen.Antimicrobial peptides are common in all living organisms. They have broad-spectrum activity against bacteria, fungi, parasites and viruses. Their toxicity is specific and the development of resistances less probable compared to conventional antibiotics. These characteristics make the medical use of anti-microbial peptides a matter of interest. For this reason the peptides have to be pharmacologically optimized without losing their benefits. Therefore it is reasonable to get insights into the molecular basis of peptide-membrane interaction mechanism and the determinants of the toxicity.
Here Cecropin P1 from the porcine round worm Ascaris suum was chosen, which is known to interact with bacterial membranes and finally causes lysis of bacteria. To enable the structural and dynamical characterization of the peptide the synthetic gene encoding Cecropin P1 was cloned into a pET-SUMO vector with a His-tag, afterwards the 15N-labeled peptide was expressed in E. coli C43 and purified via immobilized metal ion affinity chromatography.
First NMR-spectroscopy studies on Cecropin P1 in an aqueous environment indicate a monomeric peptide with an N-terminal α-helical structured part and a comparatively more flexible unstructured C-terminal half including a hydrophobic sequence. The enhanced flexibility starts around the con-served glycine at position 21, which is part of the flexible hinge in the helix-hinge-helix structure well known for the Cecropins of insects. This suggests a higher structural similarity of Cecropin P1 to the Cecropins of insects as expected.
Furthermore Cecropin P1 variants were designed to analyze the relevance of hydrophobicity and length of the hydrophobic sequence of the C-terminal part of the peptide for the toxicity in E. coli.
The toxicity of the variants was quantified with an established microplate broth dilution assay, which results in a minimal inhibitory concentration (MIC) of the peptide needed to completely kill the bac-teria. Additionally a triple fluorescence staining of bacteria incubated with peptide variants which gives information about total cell number, viability and membrane integrity was used to characterize the toxicity in detail. Cecropin P1 variants with 45-55 % hydrophobic C-terminus were most toxic, while the substitution of the hydrophobic amino acids 22-27 with different hydrophobic amino acids led to an identic MIC but altered kinetics of toxicity. Elongation with additional hydrophobic amino acids and shortening of the hydrophic C-terminal sequence of Cecropin P1 resulted in a decreased toxicity.
These experiments indicate, that future studies on the kinetics of toxicity of the Cecropin P1 variants and visualization of bacteria threatened with peptide via fluorescence microscopy could give deeper insights into the mechanism of toxicity of Cecropin P1. For the first time 15N-labeled Cecropin P1 was produced and enables a structural and dynamical characterization of the peptide with different membrane models, which facilitates the detailed analysis of peptide-membrane interaction
Insights into the role of metal ions
No full textDie vorliegende Arbeit untersucht die Frage: Welche Wirkung haben Metall-Ionen auf die Struktur, Dynamik und Wechselwirkungen des Proteins ShhN, der N-terminalen Signal- Domäne von Sonic Hedgehog? Zur Beantwortung wurden molekulare Strukturen von ShhN mit verschiedenen Computer-gestützten Methoden analysiert. Die Analysen sagen einige überraschende Eigenschaften von ShhN vorher.
Zuerst legen die Analysen nahe, dass ShhN eine Zink-Protease ist, deren katalytisches Zentrum durch die Bindung von Calcium-Ionen reguliert wird. Speziell ändert die Bindung des zweiten Calcium-Ions die Konformation des Zink-Zentrums und beeinflusst so vermut- lich die Bindung des Substrats. Diese Konformationsänderung kaskadiert vom Calcium- Ion zum katalytisch Zink-Zentrum über mehrere Residuen und destabilisiert die Substrat- Bindestelle und das Zink-gebundene katalytische Wasser-Molekül. Änderungen des elek- trostatischen Potenzials um das Zink-Zentrum in Abhängigkeit von der Calcium-Bindung weisen hin auf eher unpolare Substrate, z.B. den C-Terminus von ShhN. ShhN könnte also ShhN-Moleküle abbauen, und auf diese Weise seinen Konzentrationsgradienten än- dern. Die Implikationen des beschriebenen neuartigen Mechanismus der Schaltung von ShhN über Calcium-Ionen für die biologische Funktion des Proteins sind noch weitgehend unverstanden, und erfordern weitere Forschung.
Die Flexibilität von ShhN-Monomeren und -Dimeren hängt stark ab von der Zahl der gebun- denen Calcium-Ionen. Im Besonderen sind die Calcium-bindenden Schleifen von ShhN davon betroffen. ShhN-Dimere werden stabilisiert durch das Cardin-Weintraub-Motiv am N-Terminus und durch Wechselwirkungen mit hydrophoben Residuen an der Schnittstelle zwischen den Monomeren. Die schwächere Konservierung von I48 in Wirbeltieren kön- nte ein Hinweis sein auf eine wichtige Rolle dieses Residuums in der Oligomerisierung von ShhN. Die Nähe von Calcium-Ionen zur Dimerisierungs-Region sorgt für ein positives elektrostatisches Potenzial und könnte so die Bindung von Proteoglykanen fördern. Ins- gesamt wird ein Modell der Multimerisierung von ShhN vorgeschlagen, das über mehrere Kontrollmechanismen verfügt, die experimentell getestet werden sollten.The present work studies the effect of metal ions on the structure, dynamics and inter- actions of the protein ShhN, the N-terminal signaling domain of Sonic Hedgehog. To accomplish this task, molecular structures of ShhN proteins were analyzed with a set of computational methods, revealing new features of ShhN proteins.
The results suggest that, ShhN is an enzyme with a zinc catalytic center that is regulated by the binding of the calcium ions. Explicitly, the binding of the second calcium ion involves a conformational change that is accompanied by a significant perturbation of the putative catalytic center, possibly affecting substrate stabilization. The dragging of E127 towards the calcium center implies the pulling of H135 with it and the disruption of the hydrogen bond between G128 and H141. Besides, the distance between residues E177 and H135 increases and therefore, the well-defined position of the catalytic water molecule is lost destabilizing the zinc environment. Electrostatic potential differences among calcium states suggest the possible binding of nonpolar substrates. One of the predictions is that ShhN autodegradates tuning its own concentration gradient. This possibility does not rule out, of course, the existence of other mechanisms that govern ShhN concentration gradient. The novel switching mechanism proposed could have many implications in the biological function of HhN proteins, but these are not well understood and require further research.
Both ShhN monomers and dimers show a flexibility pattern that strongly depends on the number of calcium ions. Specially, calcium binding loops reflect this behavior. The Cardin- Weintraub motif located within the N-terminal of ShhN proteins together with buried hydrophobic residues at the interface lead to an stable complex that enhances ShhN dimerization. The lower degree of conservation of I48 in vertebrate homologs might indicate that this is a hot spot residue with an important role in ShhN oligomerization. The presence of the calcium ions at the dimeric interface can promote ShhN-proteoglycan interactions providing a large positively charged region which is the ideal scenario for the binding of these molecules.
Taken all together, a multimerization model where different levels of interaction can control the way that ShhN multimers form is proposed. However, this model has yet to be tested
Funktionelle Charakterisierung potenzieller Exportsignale und Interaktionen innerhalb der IAP-Familie
No full textApoptose ist ein stark regulierter Prozess, welcher von einer Vielzahl pro- und antiapoptotischer zellulärer Proteine reguliert wird. Neben den pro-apoptotischen Caspasen spielen hier die anti-apoptotischen Mitglieder der IAP (Inhibitors of Apoptosis Proteins) -Familie eine wichtige Rolle. Sie sind hochkonserviert und wurden neben den Vertebraten auch in Insekten und Hefen beschrieben (Crook et al. 1993). Im Menschen konnten bislang acht Mitglieder dieser Familie identifiziert werden, von denen Survivin und XIAP die am besten untersuchten IAPs sind, da ihnen essentielle Funktionen im Verlauf der Karzinogenese zugesprochen werden (Dohi 2004, Mehrotra et al. 2010). Auf Grund seiner postulierten antiund pro-apoptotischen Eigenschaften ist mit Livin ein weiteres IAP in den Fokus der Tumorforschung gerückt (Boaz Nachmias 2003). Abgesehen von seiner Funktion als Apoptose-Inhibitor ist Survivin im Verlauf der Zellteilung für eine korrekte Verteilung der Chromosomen verantwortlich, in dem es als Teil des CPC für dessen Anlagerung an die Zentromere sorgt. Dies geschieht über ein hydrophobes Leucin-reiches Exportsignal (NES), welches in der Sequenz von Survivin verankert ist. Dadurch wird die Interaktion mit dem Exportrezeptor Crm1 ermöglicht, welche für die Bindung des CPC an die Chromosomen essentiell ist (Knauer et al. 2007). Wie für Survivin sind auch für XIAP nicht nur regulatorische Prozesse innerhalb der Apoptose beschrieben. XIAP ist ebenso involviert in die Aktivierung von Nf-κB, JNK und die Aufrechterhaltung des Kupfer-Metabolismus (Galbán und Duckett 2009). Anlässlich dieser Multifunktionalität sollte im ersten Teil dieser Arbeit XIAP auf das Vorhandensein eines NES hin untersucht werden, welches ein wichtiger Bestandteil für die Ausführung seiner zellulären Aufgaben ist.
Dabei konnte durch LMB-Behandlung und die daraus folgende Akkumulation im Zellkern in der Tat auf die Existenz eines NES in XIAP geschlossen werden. Durch in silico-Sequenzanalysen und mittels Mikroinjektionsexperimenten sowie umfassenden molekularbiologischen und biochemischen Analysen wurde dies nicht nur bestätigt, sondern
weist sogar auf eine mögliche kombinatorische Wirkung von mehreren potenziellen NES in XIAP hin. Während Interaktionsstudien indes die Abhängigkeit des intrazellulären Transports von einer möglichen Wechselwirkung mit Survivin nahezu ausschließen konnten, deutet die
publizierte intranukleäre Akkumulation von XIAP in Verbindung mit XAF1 auf eine Interaktion dieser beiden Proteine hin (Peter Liston und Tamai 2001). Das in dieser Beziehung neu beschriebene NES in XAF1 kann in diesem Zusammenhang ebenfalls zum nukleären Export von XIAP beitragen. So könnte würde die Exportinhibition durch LMB nicht nur den Transport von XIAP selbst, sondern darüber hinaus auch von XAF1 einschränken. Weitere Untersuchungen könnten klären, ob die Translokation von XAF1 ebenfalls von einer Interaktion mit Crm1 abhängt und welchen Einfluss eine siRNA-basierte Verminderung der XAF1-Expression auf die subzelluläre Lokalisation von XIAP hat und umgekehrt. Um besser zu verstehen, wie Survivin als Apoptose-Inhibitor agiert, wurden im Rahmen dieser Arbeit mögliche Wechselwirkungen mit anderen IAPs untersucht. Anhand von Ko-Immunpräzipitationsanalysen konnte erstmalig gezeigt werden, dass Survivin neben der bereits beschriebenen Interaktion mit XIAP auch an Livin zu binden vermag. Um die funktionelle Relevanz dieser Interaktion verstehen zu können, wurde zunächst die proapoptotische Eigenschaft von Livin genauer untersucht. Dabei wurde bestätig, dass u.a. Caspase-3 für die proteolytische Spaltung von Livin verantwortlich ist und so das proapoptotisch wirkende C-terminale Fragment entsteht, welches in einer perinukleären
Ringstruktur im endoplasmatischen Retikulum akkumuliert (Boaz Nachmias 2003, Nachmias et al. 2007). Weiterführende Versuche wiesen eine stärkere Bindung von Survivin an die Cterminale Livin-Variante als an den Wildtyp nach. Dies deutet vermehrt auf eine antiapoptotische
Wirkweise von Survivin hin, welche über die pro-apoptotische Eigenschaft von tLivinlong vermittelt wird. Dies führte zu der Hypothese, dass eine Hochregulation von Survivin und Livin in frühen Phasen der Tumorentwicklung, zu einer Stabilisierung von Livin durch Survivin führt und es so nicht in mehr seine pro-apoptotische Form gespalten werden kann. Einen Hinweis darauf gab die Kotransfektion von Livin und Caspase-3 in Survivin konstitutiv exprimierenden A431-Zellen, in denen Livin im Vergleich zu den entsprechenden parentalen Zellen, nicht mehr prozessiert wurde und seinen anti-apoptotischen Phänotyp beibehielt. Die Prozessierung von Livin wird normalerweise durch Caspase-3 vermittelt, welche wiederum durch die Überexpression von Survivin gehemmt werden kann. Weiterführende Experimente sollten sich neben der Aufklärung der Apoptoseinduzierenden Mechanismen der C-terminalen Spaltform von Livin im ER und mit der Analyse zellulärer Vitalität in Abhängigkeit der transfizierten Livin-, Survivin- und Caspase-3-Konstrukte beschäftigen. Zusammenfassend konnte diese Arbeit neue Einblicke in die pro-apoptotische Wirkung von Livin geben und durch die Entdeckung einer bislang unbekannten Interaktion mit Survivin
einen neuen Aspekt in dessen biologischer Funktion aufdecken. Des Weiteren wurden erste Hinweise auf die Existenz eines Exportsignals in der Sequenz von XIAP sowie auf eine relevante, bisher unbekannte Verbindung zu XAF1 gewonnen. Dies eröffnet nun neue Wege
im Verständnis der Multifunktionalität von XIAP.The process of apoptosis is a tightly controlled mechanism which is regulated by a high number of different pro- and anti-apoptotic cellular proteins. Besides the pro-apoptotic Caspases, the highly conserved family of intracellular inhibitors of apoptosis proteins (IAPs) play an important role. Eight members have been identified in humans so far, yet they are also found in insects, yeast and a wide range of vertebrates (Crook et al. 1993). Due to their pivotal role in the carcinogenesis, Survivin and XIAP are the two best studied IAPs (Dohi 2004, Mehrotra et al. 2010). However, due to its ability to act as both anti- and pro-apoptotic factor during early stages of apoptosis, the small IAP Livin has also come into focus of many cancer related studies (Boaz Nachmias 2003). Besides its function as an inhibitor of apoptosis, Survivin plays also an important role during mitosis as part of the CPC ensuring the correct distribution of the chromosomes. This is mediated via an intrinsic hydrophobic, leucine-rich export signal (NES) in Survivin, which is essential for interaction with the export receptor Crm1 and the tethering of the CPC to the centromeres (Knauer et al. 2007). Similar to Survivin, also XIAP is not merely known as
a regulator of apoptosis. It is also involved in several processes like NF-κB and JNK activation and the maintenance of copper metabolism (Galbán und Duckett 2009). Due to this multifunctionality, the first part of this work aimed to define whether XIAP might contain a so far unknown NES and to evaluate its localization and possible importance for the proper cellular function of XIAP. LMB-treatment of Hela cells transiently transfected with pc3-XIAPWT-GFP resulted in a significant protein accumulation in the nucleus. This served as a first hint for the existence of NES in XIAP. In silico sequence analyzes and microinjection experiments in combination with comprehensive molecular and biochemical methods not only confirmed the existence of the predicted export signal, but also pointed towards a possible combinatorial effect of several potential NES in XIAP. Whereas interaction studies nearly excluded the possibility of an
interdependence of intracellular transport and an interaction with Survivin, the published nuclear accumulation of XIAP connected with XAF1 indeed indicates an interaction between these two proteins (Peter Liston und Tamai 2001). In this context, the newly described NES in
XAF1 could also contribute to the nuclear export of XIAP. Accordingly, inhibition of nuclear export by LMB would not only affect the transport of XIAP itself but also nuclear export of XAF1. To achieve a better understanding of how Survivin acts as an apoptosis regulator, we
investigated its possible interplay with other IAP-members. In immunoprecipitation experiments we could demonstrate for the first time that there is not only an interaction between Survivin and XIAP but also between Survivin and Livin. In order to clarify the functional relevance of this interaction, at first, Livin’s pro-apoptotic property was investigated
in more detail. It could be confirmed that Caspase-3 is responsible for the proteolytical cleavage of Livin into its pro-apoptotic C-terminal fragment, which accumulates in a ring-like structure around the nucleus corresponding to the endoplasmic reticulum (Boaz Nachmias 2003, Nachmias et al. 2007). Ensuing experiments showed a higher binding affinity of Survivin to the C-terminal variant compared to the wildtype. This points to an additional anti-apoptotic activity of Survivin, which is mediated via the formation of tLivinlong. This in turn raises the hypothesis of a correlated protein up-regulation of Survivin and Livin in early stages of tumor development, where Survivin might stabilize Livin by binding and thus prevents it from cleavage into its assumed pro-apoptotic truncated C-terminal form. This hypothesis could be
verified by co-transfection experiments showing that Livin was processed into its pro-apoptotic form when transfected together with Caspase-3 in parental A431 cells but not in cells stably overexpressing Survivin, which in turn is able to inhibit Caspase-3. In summary, the results of this work could give new insights into the pro-apoptotic effects mediated by Livin and via the discovery of a so far unknown interaction with Survivin
unravel a new aspect in its biological function. Additionally, data hint towards the existence of a nuclear export signal in XIAP and support a so far unknown connection to XAF1. This now paves the way to better understand the multifunctionality of XIAP
Multiobjective Optimization of the Power Flow Control of Hybrid Electric Power Train Systems within Simulation and Experimental Emulation Applications
No full textIn this thesis, the power flow control of hybrid electric power train systems is discussed using the focus of multiobjective optimization goals and related algorithms, based on different control optimization methods, are developed and applied within simulation and experimental environments. Based on the basic relations of hybrid power train systems, an improved technique for the experimental realization and evaluation of these systems is developed and the related Hardware-in-the-Loop (HiL) hybrid electric power train emulation system is demonstrated.
Hereby, it is shown that this emulation system technique is suitable to be applied for a more generalized view of the power train structures (consideration of the components as power sources, sinks, transmission elements, storage elements etc.) and its power flow control. The principal applicability of the system is demonstrated using the example of a hybrid electric vehicle as well as other system technologies such as hybrid hydraulic power trains and wind energy conversion systems.
The core of the thesis is the discussion, development, application, and evaluation of power flow control optimization algorithms. Hereby, the considered power flow control techniques of the power train are realized with respect to a multiobjective framework using the example of drivability, fuel economy, and component life time as system requirements to be optimized during the operation.
From this requirements, a multiobjective control optimization problem results consisting of a suitable combination of the known control goals power management, energy management, and lifetime management is realized. After a discussion about the principal influences of the power flow control on the different performance properties, the application of different control optimization techniques is discussed. Hereby, the example of a fuel cell/supercapacitor-based hybrid electric power train system including braking energy recovery is used.
As control optimization methods, parameter optimization techniques are applied at first. Hereby, an embedded-online optimization based on a Golden Section search and an offline optimization based on Global Optimation methods are discussed and applied. Furthermore, direct optimization techniques based on Dynamic Programming (DP) and Model Predictive Control (MPC) are realized. Subsequently, an Instantaneous Optimality (IO)-based technique, which consists of a lookup table-based Time-Invariant Feedback Controller technique, is developed. It becomes clear that all methods leads to suitable results and significant improvement of the control performance. A concluding overview of the methods and its strengths and weaknesses dependent on the application is provided.In dieser Arbeit wird die Leistungsflussregelung bei hybridelektrischen Antriebssystemen mit dem Schwerpunkt der Mehrkriterienoptimierung diskutiert. Hierbei werden geeignete Algorithmen, basierend auf verschiedenen Stellgrößenoptimierungsmethoden, entwickelt und in Simulationen sowie in experimentellem Umfeld angewendet.
Aufbauend auf die Grundzusammenhänge hybrider Antriebssysteme wird eine weiterentwickelte experimentelle Umgebung zur Untersuchung und Bewertung vorgestellt und der entsprechende Hardware-in-the-Loop (HiL)-Versuchsstand zur Emulation entsprechender Systeme demonstriert.
Diese Emulationstechnik erlaubt eine generalisierte Betrachtung von Antriebssystemstrukturen (Betrachtung der Komponenten als Quellen, Senken, Übertragungselemente, Speicher etc.) und der entsprechenden Leistungsflussregelung.
Den Hauptteil dieser Arbeit bildet die Diskussion sowie die Entwicklung, Anwendung und Bewertung von Algorithmen zur Optimierung der Leistungsflussregelung hybridelektrischer Antriebssysteme. In diesem Zusammenhang erfolgt eine mehrkriterielle Betrachtung und Bewertung des Antriebssystems in Hinblick auf die Dynamik, die Kraftstoffökonomie und die Komponentenlebensdauer.
Das hieraus resultierende mehrkriterielle Optimierungsproblem der Stellgrößenfolge kann hierbei als Überlagerung von Leistungs-, Energie- und Lebensdauermanagement aufgefasst werden. Basierend auf den Haupteinflüssen der Leistungsflussregelungen auf verschiedene Systemeigenschaften erfolgt die Entwicklung, Anwendung, Bewertung und Diskussion verschiedener Stellgrößenoptimierungsmethoden und -algorithmen. Diese werden am Beispiel eines Brennstoffzellen/Supercap-basierten hybridelektrischen Antriebssystems mit Bremsenergierekuperation demonstriert.
Zur Optimierung der Leistungsflussregelung werden als erstes Parameteroptimierungstechniken vorgestellt, wobei eine Embedded-online-Optimierung basierend auf der Methode des Goldenen Schnitts sowie eine Offline-Optimierung unter Verwendung von globalen Optimierungsalgorithmen diskutiert und angewendet werden. Nachfolgend werden direkte Stellgrößenoptimierungstechniken vorgestellt, wobei die Verfahren der Dynamischen Programmierung und des Modelprädiktiven Reglers realisiert werden. Abschließend wird die Entwicklung und Anwendung eines Algorithmus basierend auf der momentanen Optimalität (Instantaneous Optimality) diskutiert, welcher aus einem kombinierten Geschwindigkeits-Prädiktionsalgorithmus und vordefinierten Kennfeldern für die Regelung besteht.
Die verwendeten Methoden werden vergleichend gegenübergestellt und gemäß ihrer Stärken und Schwächen bewertet
Denstiy functional calculations of doped zinc oxide
No full textIn dieser Arbeit wurde die Dotierung von ZnO-Materialien mit der Dichtefunktionaltheorie (DFT) untersucht. Es wurden verschiedene DFT-Funktionale angewendet, um die Unterschiede und Fehler herauszufinden. Aufgrund des großen Interesses an p-leitendem ZnO-Material und der uneinheitlichen Aussagen in der Forschungsliteratur bezüglich der Möglichkeiten des Erreichens der p-Leitfähigkeit
durch die Stickstoffdotierung liegt der Fokus dieser Arbeit auf den Untersuchungen des N-Defekts in ZnO. Darüber hinaus wurde auch die n-Dotierung von dem ZnO-Festkörper untersucht. In diesem Fall wurden die Aluminium- und Bor-Defekte verglichen.A big interest currently exists in finding p-type conductivity in ZnO. The literature on this subject being rather controversial whether nitrogen can lead to p-conductivity or not. This study is focused on the N defect in ZnO performing extensive calculations based on density functional theory (DFT) using different functionals. In adition, the n-type conductivity for the case of aluminium and boron defects was also studied. I start with the determination of the most stable lattice site at which the nitrogen impurity can be incorparated in ZnO. The N
impurity was found the most stable species under the usual growth conditions.
This knowledge about the most stable incorporation site provides the justification for the experimentalists’ assignment of their observed deep charge transfer level (0/−) to the NO impurity. Therefore, I focus on the NO impurity in various ZnO structures
Studies on the implementation of CEACAM1-binding particles for diagnostic imaging of prostate cancer
No full textProstatakrebs stellt in Deutschland und in Europa mit ca. 60000 Neuerkrankungen im Jahr die häufigste Krebserkrankung bei Männern dar[3,4] und ist für ca. 10 % aller krebsassoziierten Todesfälle verantwortlich.[3,5] Für eine erfolgreiche Tumorbehandlung ist eine gesicherte Diagnose im sehr frühen Anfangsstadium der Krebsentwicklung erforderlich. Zu Beginn der Krebsentwicklung kann der Tumor noch ohne ein eigenes Versorgungssystem wachsen. Sobald er aber eine bestimmte Größe überschreitet muss er zum weiteren Wachstum ein eigenes Gefäßbett initiieren. Deshalb ist der Nachweis einer Neubildung von Blutgefäßen (Neoangiogenese) seit einiger Zeit im Fokus der Krebs-Diagnoseentwicklung. Diese Diagnostik sollte nicht-invasiv, kostengünstig und schnell durchführbar sein. Diese Voraussetzungen werden zurzeit nur von der Ultraschalldiagnostik erfüllt. Im Falle der Prostata-Diagnose werden Mikropartikel zur Kontrastverstärkung eingesetzt. Deren Verwendung, als molekulare Markersysteme zur zuverlässigen Darstellung des mikrovaskulären Tumorgefäßbetts, ist jedoch bisher nicht über tierbasierte in vivo Studien hinausgegangen, wie die aktuelle „Molecular Imaging and Contrast Agent Database (MICAD)“ des National Center for Biotechnology Information (US) zeigt.[153]
Unsere Arbeitsgruppe identifizierte in vorangegangenen Studien CEACAM1 als Neoangiogenesemarker in Endothelzellen in neugebildeten Tumorblutgefäßen.[41] Eine spezifische Markierung dieses Proteins mit ultraschallgeeigneten Partikeln stellt ein neues molekulares Markersystem zur Visualisierung des Tumorgefäßbetts im Tumor-Frühstadium mittels Ultraschall dar. Daher wurde zunächst das kommerziell erhältliche Ultraschallkontrastmittel SonoVue [SV] der Firma Bracco mit einem in unserer Arbeitsgruppe entwickelten CEACAM1-spezifischen Antikörper beladen, um ein solches Markersystem zu generieren. Allerdings stellten sich dabei die [SV] Partikel, aufgrund ihrer geringen Stabilität und des Fehlens einer kovalenten Bindungsmöglichkeit für Antikörper, als gänzlich ungeeignet heraus. Die Bindung erfolgte hier lediglich über Adsorption. Eine solch gering affine Bindung ist aber für Anwendungen in der Angiologie, wo starke Scherkräfte auftreten, nicht ausreichend. Aus diesem Grund wurden weitere kommerziell erhältliche Partikel mit dem CEACAM1-spezifischen Antikörper beladen und analysiert. Eine Bindung an Protein G Partikel sollte hierbei die korrekte Ausrichtung der Antikörper sicherstellen. Die Bindung über das Biotin-Streptavidin System mit weiteren Partikeln gewährleistete dagegen die Flexibilität der Antikörper. Beide Systeme ermöglichten zudem kovalent ähnlichen Bindungscharakter. Für die Untersuchung der Bindungseigenschaften dieser CEACAM1-bindenden Partikel sollte als in vitro Testsystem die Endothelzelllinie eines Angiosarkoms der Kopfhaut (AS-M.5) eingesetzt werden, da diese unter anderem CEACAM1+ sind. Bei deren Verwendung bestand jedoch keine Möglichkeit, den Grad der unspezifischen Bindung CEACAM1-bindender Partikel zu analysieren. Daher wurde zunächst in einem in vitro Testsystem mit einer humanen CEACAM1 stabil transfizierten HeLa Zelllinie gearbeitet. Als Kontrolle und zum Nachweis unspezifischer Bindung stand somit die HeLa Wildtyp Zelllinie zur Verfügung. In unserer Arbeitsgruppe stand zusätzlich eine HeLa Zelllinie mit stabil transfizierten CEACAM8 zur Verfügung, welches normalerweise ausschließlich auf Granulocyten expremiert wird. Des Weiteren wird CEACAM8 nicht nur an Zell-Zell Kontaktstellen, sondern auch vermehrt apikal expremiert[85,86]. Zusätzlich ist es über eine GPI-Verankerung und nicht wie CEACAM1 transmembran an der Zellmembran gebunden, wodurch CEACAM8 eine höhere laterale Beweglichkeit in der Zellmembran besitzt[87]. Die erhaltenen Ergebnisse zeigten jedoch, dass weder die Art der Membranverankerung noch die Lokalisation der Proteine einen Einfluss auf die Bindung antikörperbeladener Partikel hatte. Diese Zelllinie wurde daher ebenfalls zur parallelen Entwicklung einer Isotypenkontrolle zu den CEACAM1-bindenden Partikeln genutzt. Neben den [SV] Partikeln erwiesen sich auch die eingesetzten Roti-MagBeads Protein G [RPGB] Partikel der Firma Carl Roth aufgrund ihrer unspezifischen Bindung für die geplanten Anwendungen als nicht geeignet. Diese war so stark ausgeprägt, dass die Ergebnisse der Kontrollen nahezu identisch zu den Versuchsergebnissen waren. Die Targestar [TS] Partikel der Firma Targeson, die Dynabeads® M-280 Streptavidin [SDB] der Firma Invitrogen und die Protein G MicroBeads [MPGB] der Firma Miltenyi ergaben hingegen vielversprechende positive Resultate. So zeigten diese drei Partikelarten eine eindeutige antikörpervermittelte Bindung und lediglich bei den [SDB] Partikeln einen vernachlässigbaren unspezifischen Bindungsanteil. Allerdings können [MPGB] Partikel für ultraschallbasierte Diagnostik nicht verwendet werden, da Nanopartikel im Ultraschall nicht detektierbar sind.[89] Sie könnten jedoch bei Fragestellungen im Bereich von MRT-Untersuchungen eingesetzt werden. Für weiterführende Untersuchungen im in vitro Testsystem mit AS-M.5 Zellen sollten daher die vielversprechenden [TS] Partikel, welche speziell für in vivo Ultraschalluntersuchungen entwickelt wurden, und die [SDB] Partikel verwendet werden. Hierbei würden sich die [SDB] Partikel als Kontrollmarkersystem bei in vitro Untersuchungen anbieten. Trotz der eindeutigen Ergebnisse müssten die Partikel zur weiteren Verwendung modifiziert werden, da sie aufgrund ihrer Größe von Makrophagen erkannt und durch das Retikuloendotheliale System (RES) entfernt werden könnten.[134] Eine Maskierung zum Beispiel durch das Verwenden von Polyethylenglycolen würde dies verhindern.[125,135,136] Des Weiteren würden das Kopplungsprotein Streptavidin und das Fc-Fragment des gebundenen Antikörpers in humanen Anwendungen Immunogenität hervorrufen.[126,144] Diese Immunogenität aufgrund des Fc-Fragments könnte durch die Verwendung der F(ab)2-Fragmente umgangen werden, wobei die Beladung der Partikel über bivalente Crosslinker erfolgen müsste. Dadurch würde eine kovalente ortsspezifische Bindung erreicht und gleichzeitig der Einsatz eines Kopplungsproteins vermieden werden. Der Einsatz von Polyethylenglycolen mit entsprechenden reaktiven Endgruppen als Crosslinker würde zudem die Flexibilität und damit die Antigenerkennung aufrecht halten.[125]
Zusammenfassend lässt sich sagen, dass die Ergebnisse dieser Arbeit den ersten Schritt bei der Etablierung CEACAM1 bindender Partikel für die bildgebende Diagnostik des Prostatakarzinoms darstellen. Dieses System würde sich sehr gut in die molekularen Markersysteme der „Molecular Imaging and Contrast Agent Database (MICAD)“ einfügen.[153]Prostate cancer is the most common cancer in men with about 60000 incidences per year in Germany and Europe and it is one of the leading causes of cancer-related death in men. [3,4,5] A very early confirmed diagnosis of prostate cancer is the basis for a successful cancer therapy. The reason for this is that tumors can develop only over a certain size, if they manage to initiate its own vascular bed. Therefore, detection of new blood vessels formation (neoangiogenesis) is the focus of novel cancer diagnosis strategies. Such diagnosis should be non-invasive, cost-efficient and easy realizable. Currently, this is only achieved by ultrasonication based detection systems. In the case of prostate cancer diagnosis micro particles are used for contrast enhancement of neoangiogenesis. But the application of micro particles as a molecular marker system in reliable visualization of the micro vascular bed of tumors is not yet beyond the point of animal in vivo studies, as documented by the current „Molecular Imaging and Contrast Agent Database (MICAD)“ of the National Center for Biotechnology Information (US).[153] In previous studies our group identified CEACAM1 as a novel marker for neoangiogenesis in endothelial cells of new-formed blood vessels. Thus, combining anti CEACAM1 antibodies with ultrasound detectable particles would lead in a new molecular marker system to visualize early stage tumor vessels via ultrasound. Hence, the goal of this work was the development of such a marker system by coupling specific anti CEACAM1 antibodies to a commercial available ultrasound contrast agent. The used antibodies were developed in our group previously. The first particle used was the commercial available ultrasound contrast agent SonoVue [SV]. But due to their low stability and the lack of covalently antibody coupling sites the [SV] particles were proven as not suitable for our application. The binding of antibodies to [SV] particles was achieved via adsorption only. Such low affine binding would not be sufficient for applications in angiology, where strong shear forces appear. Due to these results other commercial available particles were used for coupling CEACAM1 specific antibody in addition. The advantage of these other particles was the possibility to have a nearly covalent binding which was reached by using protein G particles and biotin particles. Hereby the use of protein G particles should guarantee the correct binding direction of the antibodies without influencing their functionality and biotin particles provided flexibility. To analyze the binding properties of the antibody loaded particles a CEACAM1+ endothelial cell line of an angiosarcoma of the scalp (AS-M.5) should be used as in vitro test system. In addition, HeLa wild type, HeLa-CEACAM1 and HeLa-CEACAM8 cell lines were used to identify particles with nonspecific binding. The differences between the two proteins CEACAM1 and CEACAM8 is their membrane localization and the kind of membrane binding. CEACAM1 is transmembrane anchored whereas CEACAM8 is membrane-bound via a GPI-anchor. Thus, in contrast to CEACAM1 CEACAM8 has a higher lateral mobility and is localized not only at cell-cell contact areas but also apical. [85,86,87] Due to the differences of the target proteins CEACAM1 and CEACAM8 it could be shown that neither the membrane anchorage nor the localization of the target protein had any influence on particle binding properties. In addition this cell line was used for parallel development of isotype control particles, resulting that the control particles were characterized in an analog test system like the normal particles. The achieved results demonstrated that next to the [SV] particles the used Roti-MagBeads Protein G [RPGB] particles of Carl Roth Company were not suitable for our applications as well. These particles had shown such high unspecific binding that the results of the control were more or less identical to the normal test results. In contrast, Targestar [TS] particles from Targeson, Dynabeads® M-280 Streptavidin [SDB] from Invitrogen and Protein G MicroBeads [MPGB] from Miltenyi were showing promising results. At all these different particles a distinct antibody mediated cell binding could be observed and only [SDB] particles showed negligible unspecific binding. Anyway, the usage of [MPGB] particles in ultrasonic based diagnostics would not be appropriate. Because of their size they would not be detectable by ultrasound. [89] Therefor they may be used in MRT applications. For prospective in vitro research with AS-M.5 cells [TS] and [SDB] particles should be used, in which [SDB] particles serve as a control marker system. Nevertheless a further development of both particles is required. Because of their size they can be identified by macrophages and removed by the reticuloendothelial system (RES), [134] which could be avoided by using a polyethylene glycol masking for example. [125,135,136] Another problem of the favored [TS] and [SDB] particles is caused by the coupling protein Streptavidin on the one hand and the Fc-fragment of the bound antibody on the other hand. These proteins would lead to an immunogenic reaction in human applications. [126,144] A simple way to overcome these problems is by the usage of F(ab)2-fragments, whereupon specific coupling to the particles could be achieved via a bifunctional Crosslinker. Polyethylene glycols with appropriate reactive groups could serve as crosslinker for this application, because simultaneously masking of the particles and flexibility for antigen recognition are given. [125]
In summary the results of this work provide the first step of establishing CEACAM1 binding particles as a marker in molecular imaging of prostate cancer. This kind of system would extend the list of molecular marker systems as mentioned in the „Molecular Imaging and Contrast Agent Database (MICAD)“.[153