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Development of a hermetically encapsulated microsystem pressure sensing system for use as a biosensor in aqueous media
No full textDie Entwicklung immer kleinerer MEMS (Micro-Electro-Mechanical-Systems) - Sensoren mit funktionellen Oberflächen bietet die Möglichkeit, diagnostische und therapeutische Aufgaben im menschlichen Körper in Form von Implantaten zu übernehmen.
Damit elektronische Bauteile eines Implantates vor Feuchtigkeit und das umgebende biologische Gewebe vor schädlichen Einflüssen der Elektronik geschützt werden können, sind medizinisch zugelassene mikroelektronische Implantate wie Hirnstimulatoren oder Cochlea Implantate in der Regel mit einer Verkapselung aus dickwandigen Materialschichten wie Titan oder Keramik versehen. Diese dickwandigen Verkapselungen limitieren jedoch die Miniaturisierung des Sensorimplantats und verhindern, dass sensitive Bereiche der Chipoberfläche für die Messgröße frei zugänglich sind. Die direkte Interaktion einer sensitiven Komponente mit der zu erfassenden Umgebung ist somit nicht möglich, obwohl gerade diese Eigenschaft für Biosensoren eine Funktionsvoraussetzung ist.
Mikrosystemtechnische Drucksensor-ASICs (Application Specific Integrated Circuits) nutzen in der Regel unabhängig vom Messprinzip eine verformbare Membran um den vorliegenden Druck zu detektieren. Bei einer dickwandigen Einhausung muss somit gewährleistet werden, dass eine Druckänderung außerhalb des Gehäuses an den Sensor-ASIC im Inneren weitergegeben wird. In vielen industriellen Anwendungen wird hierfür eine dünne metallische Membran als Medientrennung und eine Ölfüllung des Gehäuses zur Druckübertragung genutzt. Speziell die Realisierung einer hinreichend großen Druckübertragungs¬membran ist für medizinische Implantate aufgrund der benötigten starken Miniaturisierung meist nicht zu realisieren.
Das für diese Arbeit genutzte kapazitive Drucksensorsystem bestand aus zwei ASICs, welche für den Betrieb elektrisch miteinander verbunden sein mussten. Ein ASIC war der Drucksensor und der zweite ASIC diente zur Kommunikation und besaß neben einem Speicher für Kalibrationsdaten auch einen Temperatursensor. Da das Drucksensorsystem kabelgebunden war, wurde außerdem eine Durchführung hergestellt, um den hermetischen Sensoraufbau und die Leitungs-verbindung zu trennen.
Ziel der Arbeit war ein Drucksensorsystem, welches durch eine sehr dünne Passivierungs-Schicht hermetisch dicht verkapselt ist. Es könnte somit direkt in einer korrosiven Umgebung, wie z.B. im menschlichen Körper arbeiten ohne dabei Schaden zu nehmen oder messtechnisch beeinflusst zu werden. Diese Passivierungsschicht musste dünn genug sein, damit die ursprünglichen Membraneigenschaften des ASICs nicht verändert wurden und trotzdem einen dauerhaften Schutz boten. Sie wurde außerdem nicht auf Einzel-Chips sondern auf Systemebene abgeschieden, da es aus zwei ASICs bestand. Bei der Auswahl eines geeigneten Verfahrens, um diese Schichten aufzubringen, war somit die Möglichkeit ein dreidimensionales Objekt zu passivieren elementar, da die gesamte Oberfläche des Sensorsystems geschützt werden musste.
In dieser Arbeit wurde das Drucksensorsystem durch einen Atomic Layer Deposition (ALD) Schichtstapel aus 50 nm Aluminiumoxid (Al2O3) und 50 nm Tantalpentoxid (Ta2O5) verkapselt um eine durchgehende Passivierungsschicht auf der Oberfläche zu erhalten.
Für die gewählte Abscheidung lag die Prozesstemperatur bei 275 °C. Die thermische Ausdehnung der genutzten Materialien musste daher aufeinander abgestimmt sein, um Risse in der Passivierung während des Abkühlprozesses zu verhindern. Für den Verguss und für die Montage der ASICs bzw. der Durchführung wurde ein Polyimid-Epoxy-Composite genutzt, welches die Prozesstemperaturen ohne Degradation überstand. Zur Vorbereitung der kritischen Bereiche der Bauelemente, wie Chipkanten bzw. Bonddrähte, wurden diese vor der ALD-Beschichtung ebenfalls mit dem Polyimid-Epoxy-Composite behandelt.
Der entwickelte medienstabile Drucksensor wurde im Rahmen dieser Dissertation messtechnisch vollständig charakterisiert. Die Messungen wurden in physiologischer Kochsalzlösung (NaCl 0,9%) durchgeführt. Neben den Druckmessungen wurden auch Alterungstests in einer feuchten Umgebung durchgeführt. Diese Tests halfen, eine Prognose über die Haltbarkeit der Passivierung aufzustellen.
Als eine erste Anwendung wurde das Sensorsystem genutzt, um den Quelldruck eines Hydrogels zu erfassen. Das Hydrogel diente als Messumformer (Transducer), welcher den äußeren Stimulus in einen Quelldruck umwandelt. Diese Quelldruckänderung wurde durch den medienstabilen Drucksensor detektiert.
Das von einem Forschungspartner bereitgestellte Hydrogel reagiert sowohl bei Ionenkonzentrationsänderungen als auch bei Temperaturänderungen sensitiv. Im Rahmen der Dissertation wurden erfolgreich erste Messungen des medienstabilen Drucksensors im Hydrogel durchgeführt und es konnten Quelldruckänderungen bei beiden Stimuli erfasst werden.
Als potentieller Bio- bzw. Chemosensor stand die Messung einer Ionenkonzentration im Fokus einer Machbarkeitsstudie, welche reproduzierbar durchgeführt werden konnte.The development of smaller MEMS (Micro-Electro-Mechanical-Systems) sensors with functional surfaces offers the possibility to perform diagnostic and therapeutic tasks in the human body in the form of implants.
Medically approved microelectronic implants, e.g. brain stimulators or cochlear implants, usually use an encapsulation of thick layers of material, such as titanium or ceramic. The encapsulation protects electronic components of an implant from moisture, but it also protects the surrounding biological tissue from influences of the electronics. However, this thick-walled encapsulation limits the miniaturization of the sensor implant and prevents that sensitive areas of the chip surface are freely accessible to the measurand. But this property is a function prerequisite for biosensors.
Microsystem-based pressure sensor-ASICs (Application Specific Integrated Circuits) usually use a deformable membrane to detect the present pressure, independently of the measurement principle. In a thick-walled enclosure it must be ensured, that the pressure change outside the housing is transferred to the sensor ASIC inside. For this purpose a thin metal membrane is used in many industrial applications as a media separation and an oil filling of the housing for pressure transmission. It is usually impossible to achieve the realisation of a large pressure transfer membrane for medical implants due to the required high miniaturization.
The capacitive pressure sensor system used for this work consisted of two ASICs, which had to be connected electrically in order to operate. The second ASIC was used for communication and also includes a memory for calibration data and a temperature sensor. Since the pressure sensor system was also wired, a feed-through was developed to separate the hermetic structure and the sensor connection line.
The aim of the work was to develop a pressure sensor system which is encapsulated hermetically with a very thin passivation layer. It could work directly in a corrosive environment, such as the human body without any damage or measurement influences. This passivation layer had to be thin enough that the original membrane properties of the ASICs were not changed, while maintaining a permanent protection. It was not deposited on single chips either, but on the system level consisting of two ASICs. When choosing a suitable deposition method, the ability to apply these layers on three-dimensional objects was an essential factor. The whole surface of the sensor system must be protected.
In this work, the pressure sensor system was encapsulated by an atomic layer deposition (ALD) stack of 50 nm aluminium oxide (Al2O3) and 50 nm tantalum pentoxide (Ta2O5) to get a continuous passivation layer on the surface.
The process temperature for the selected deposition amounted to 275 °C. The thermal expansion of the used materials must be coordinated, in order to prevent cracks in the passivation during the cooling process. For the casting and assembling of the ASICs but also for the feed-through a polyimide-epoxy-composite was used which survived the process temperatures without degradation. The preparation of the critical areas of the components, such as edges or chip bonding wires, were pre-treated with the polyimide-epoxy-composite before the ALD deposition.
In this thesis, the developed media stable pressure sensor has been fully characterized by measurement. The measurements were carried out in physiological saline solution (NaCl 0.9%). In addition to the pressure measurements also aging tests were carried out in a humid environment. These tests are performed to predict the durability of the passivation set up.
In a first application, the sensor system was used to detect the swelling pressure of a hydrogel. The hydrogel was used as a transducer, which converts the external stimulus in a swelling pressure. This swelling pressure change has been detected by the media stable pressure sensor.
The hydrogel which was provided by a research partner and is sensitive to temperature and ionic concentration changes.
As part of the thesis first measurements of the media stable pressure sensor has been successfully carried out in the hydrogel and the swelling pressure changes are recorded for both stimuli.
For the use as a potential bio- respectively chemical-sensor, the measurement of ion concentration was in the focus of a feasibility study, which could be performed reproducibly
Expression and amplification of HER2 and molecular markers of signal activation in the advanced or metastatic lung carcinoma
Full text linkDie Arbeit beleuchtet die Bedeutung des Signalmoleküls HER2 im Rahmen der intrazellulären Signalweiterleitung sowie seine Bedeutung als prognostischer bzw. prädiktiver Marker im fortgeschrittenen bzw. metastasierten Adenokarzinom der Lunge.This study focusses on the relevance of HER2 as one component of the intracellular signal pathways as well as its significance as a predictive and prognostic marker in the advanced or metastatic adenocarcinoma of the lung
The role of CEACAM1 during bacterial-induced colitis
Full text linkCEACAM1 stellt auf Grund seiner diversen Expression in Epithelien, Endothelien und Zellen des Immunsystems ein interessantes Molekül in der CEA-Superfamilie dar. Phylogenetische Studien belegen, dass CEACAM1 auf Grund seiner konservierten Expression in über 27 unterschiedlichen Spezies ein zentrales Mitglied dieser Proteinfamilie sein könnte. Das wissenschaftliche Interesse resultiert aus Studien die für CEACAM1 eine Funktion bei immunregulatorischen Prozessen belegen konnten, wodurch weitere Analysen vor allem in Hinblick für die Entwicklung neuer therapeutischer Maßnahmen von besonderem Wert sein könnten. So belegen Untersuchungen für CEACAM1 bei der Tumorgenese, in Abhängigkeit von Art und Stadium des Tumors, ein heterogenes Expressionsprofil oder aber in Zusammenhang mit chronisch-entzündlichen Darmerkrankungen, eine erhöhte Expression (Morales et al. 1999; Donda et al. 2000; Costello et al. 2005).
In dieser Arbeit erfolgte darauf aufbauend erstmals die funktionelle Analyse von CEACAM1 in dem Modell der bakteriell-induzierten Kolitis. Dabei konnte eine erhöhte Suszeptibilität für die bakteriell-induzierte Kolitis in Folge einer CEACAM1-Defizienz nachgewiesen werden, die sich in einer massiven Pathologie, sowohl auf makroskopischer, als auch histologischer Ebene äußerte. Dabei scheint neben dem hämatopoetischen auch das nicht-hämatopoetische Kompartiment involviert zu sein. In Einklang mit der beachtlichen Expression von CEACAM1 auf intestinalen Epithelzellen und der Funktion der intestinalen Barriere bei der Abwehr von exogenen Pathogenen, konnten Analysen im Rahmen der Arbeit eine erhöhte intestinale Permeabilität in Folge der genetischen CEACAM1-Defizienz nachweisen. Weitere Analysen lassen ferner auf einen möglichen Zusammenhang mit einer reduzierten α-Defensin 5 Expression schließen.
Die durchflusszytometrischen Analysen des hämatopoetischen Kompartimentes zeigten, sowohl in Ceacam1-/--Tieren, als auch WT-Tieren die charakteristische Th1- und Th17-vermittelte Immunreaktion nach Infektion mit C. rodentium. Entgegen der beschriebenen Funktionen von CEACAM1 auf intestinalen CD4+ T-Zellen ist seine Funktion auf intestinalen CD8+ T-Zellen nur wenig beschrieben. In der vorliegenden Arbeit konnte daher erstmals ein hyper-inflammatorischer Charakter von CD8+ T-Zellen anhand einer erhöhten Expression von CD69, vor allem aber reduzierter
Expression der inhibitorischen Moleküle PD-1 und CTLA-4 in Ceacam1-/--Mäusen, als Reaktion auf C. rodentium beschrieben werden.
Zusammenfassend weisen die Ergebnisse in dieser Arbeit darauf hin, dass die Defizienz von CEACAM1 einen modulatorischen Einfluss auf die intestinale Barriere, vermutlich über die Regulation von anti-mikrobiellen Proteinen, in Folge der Infektion mit C. rodentium besitzen könnte. Ferner kann der hyper-reaktive Phänotyp von CD8+ T-Zellen im Modell der C. rodentium induzierten Kolitis möglicherweise für die schwere Pathologie in Ceacam1-/--Tieren verantwortlich sein. Diese Hypothese wird durch die reduzierte Pathologie von Ceacam1-/--Tieren mit depletiertem CD8+ T-Zellkomparti-ment in Folge der Infektion, bestärkt.CEACAM1, an interesting molecule in the CEA-superfamily shows a diverse expression in epithelia, endothelial and immune cells. Phylogenetic studies have shown that CEACAM1 might be central in this diverse protein family due to its conserved expression in over 27 different species. Increasing scientific interest results from studies that showed beside its function as a cell adhesion molecule a central role in immunoregulatory processes. For example, studies confirmed an inverse expression profile of CEACAM1 during tumorigenesis, depending on the type and stage of the tumors. Furthermore, elevated levels of CEACAM1 during inflammatory bowel diseases (IBD) highlight CEACAM1 as a potential target for the development of new therapeutical interventions (Morales et al. 1999; Donda et al. 2000; Costello et al. 2005).
This thesis deals for the first time with the functional analysis of CEACAM1 in the model of bacterial-induced colitis. Consequence of the CEACAM1 deficiency was an increased susceptibility to C. rodentium induced colitis shown by a severe pathology, on both the macroscopic as well as the histological level. In addition to the hematopoietic compartment, the non-hematopoietic compartment appears to be involved. In agreement with the remarkable expression of CEACAM1 on intestinal epithelial cells and the function of the intestinal barrier in the defense of exogenous pathogens, analyzes identified an increased intestinal permeability due to the genetically deleted CEACAM1 expression. Further analyzes also suggest a possible association of CEACAM1 with the expression of antimicrobial peptides shown by the reduced α-defensin 5 expression resulting in its absence.
The flow cytometric analyzes of the CD4+ T cell compartment highlight the characteristic Th1 and Th17-mediated immune response in both Ceacam1-/- and WT-animals to the infection with C. rodentium. In contrast to the reported function of CEACAM1 on intestinal CD4+ T cells, obtained from different animal models, however, only a few studies are available concerning the function of CEACAM1 on intestinal CD8+ T cells. Interestingly in response to the infection of Ceacam1-/--mice with C. rodentium, CD8+ T cells showed in line with an increased CD69 expression, an over all reduced expression of the inhibitory molecules PD-1 and CTLA-4 indicating for a hyper-inflammatory phenotype.
In conclusion, the results of the present work indicate that infection with C. rodentium of CEACAM1-deficient mice may have modulatory effect on the intestinal barrier, presumably via regulatory effects on the expression of antimicrobial peptides. Furthermore, the appearance of hyper-reactive CD8+ T cells could be responsible for the severe pathology seen in Ceacam1-/- animals during the bacterial induced colitis without affecting the bacterial load. This hypothesis is strengthened by the overall reduced pathology occurring in Ceacam1-/- mice depleted of CD8+ T cells during the C. rodentium challenge
Large Eddy Simulation der Nanopartikel Synthese aus Spray-Flammen
Full text linkThe presented work focuses on the development of a multiscale and multiphysics simulation approach for the prediction of nanoparticle synthesis from turbulent flames and spray flames. The models proposed and applied for the description of the flow-, spray-, combustion- and particle dynamics are formulated for the large eddy simulation methodology. The presented global Simulation approach is independent of the material system and has been used to investigate the synthesis of silica (SiO2) and iron-oxide (Fe2O3) particles from spray flame pyrolysis processes with hexamethyldisiloxane and ironpenthacarbonyl as precursors. An Eulerian-Lagrangian-Eulerian approach has been used to model the gas-, spray- and particle phases respectively. To describe combustion, an existing flamelet generated manifold approach (FGM) combined with the artificially thickened flame method (ATF) was modified to account for (a) spray combustion and (b) to account for spray combustion of three feed Systems - due to the fact that most spray pyrolysis reactors feature such a set-up. Two mixture fractions and one joint reaction progress variable are used as control variables in the combustion model. In contrast to the standard FGM approach, which is based on one Bilger mixture fraction, two element mass fractions are used as control variables to describe the mixture composition. During the flamelet calculations, the chemistry of the precursor was considered in the determination of the thermo-chemical quantities, which were stored in multidimensional look-up tables as functions of the control variables. The general dynamics equation in continuous form, a population Balance equation that describes the evolution of particle from gas phase synthesis, is approximated by (a) a simple monodisperse model, (b) a more advanced bimodal model and (c) a detailed sectional model. While the sectional model considers the formation of particles by nucleation and their growth by coagulation, the monodisperse and bimodal models consider additionally the coalescence of particles. The formation of particles from the gas phase was determined during the flamelet calculations and stored as a nucleation source term in the look-up tables.
In the first part of the study, the suitability and validity of the flamelet generated manifold approach combined with the artificially thickened flame method was examined and demonstrated for a well investigated lab-scale spray flame burner operated with ethanol and air. Secondly, the well known monodisperse population balance equation model was applied to study the formation of silica particles from a spray flame pyrolysis reactor operated with ethanol, hexamethyldisiloxane, methane and oxygen. The findings of this study raised the question how well the monodisperse model is suited to describe simultaneously nucleation, coagulation, sintering and mixing as These processes occur simultaneously in turbulent flames. Therefore, the suitability, performance and validity of the three particle models has been demonstrated for a case with simultaneous nucleation, coagulation, coalescence and mixing of particle populations with different histories. Due to the lack of time resolved measurements of particle properties and particle size distributions, a generic test case was used and modified for the aforementioned studies. In the final part of this thesis, the global simulation approach has been used to investigate the formation of silica particles from spray flame pyrolysis in a lab-scale reactor and for the synthesis of iron-oxide particles from a pilot-scale reactor. The simulation results were (a) shown to be in reasonable agreement with the experiments, (b) to help to improve the understanding of the underlying processes and (c) to improve the processes in the investigated reactors.Die präsentierte Arbeit befasst sich mit der Entwicklung eines Multiskalen und Multiphysik Simulationsansatzes zur Beschreibung der Nanopartikelsynthese aus turbulenten Flammen und
Spray Flammen. Die vorgeschlagenen und angewandten Modelle zur Beschreibung der Gasphasenprozesse, der Sprayprozesse, sowie der Verbrennung und der Partikeldynamik sind für das Large
Eddy Simulation Verfahren ausgedrückt. Der vorgestellte globale Simulationsansatz ist unabhängig vom Materialsystem und wurde genutzt, um die Siliziumoxid (SiO2) und Eisenoxid (Fe2O3) Synthese aus Spray Flammen mit Hexamethyldisiloxan und Eisenpentacarbonyl als Präkursoren zu Untersuchen.
Zur Modellierung der Gasphase, Sprayphase und der Partikelphase wurde ein Euler-Lagrange-Euler Ansatz gewählt. Zur Beschreibung der Gasphasenverbrennung wurde ein existierender "Flamelet Generated Manifold" Ansatz (FGM) kombiniert mit einem "Artificial Thickened Flame" Model (ATF) modifiziert um (a) Spray Flammen und (b) Systeme mit mehreren Strömen beschreiben zu können da die meisten Spraysynthese Reaktoren auf den zuvor genannten Mehrstromsystemen basieren. Zwei Mischungsbrüche und eine Verbrennungsvortschrittsvariable wurden in dem entwickelten Verbrennungsmodell als Kontrollparameter genutzt. Im Gegensatz zum Standard FGM Model, in dem der Mischungsbruch nach Bilger zum Einsatz kommt, wurden in dieser Arbeit zwei Elementarmassenbrüche zur Beschreibung der Gemischzusammensetzung eingesetzt. Der Einfluss der Präkursorchemie auf die thermochemischen Größen wurde während der Tabellengenerierung berücksichtigt. Die thermochemischen Größen wurden in einer mehrdimensionalen
Tabelle als Funktionen der Kontrollparameter gespeichert. Die "General Dynamics Equation" in kontinuierlicher Form, eine Populationsbilanzgleichung zur Beschreibung der Partikelsynthese
aus der Gasphase, wurde mit (a) einem simplen monodispersen Modell, (b) einem weiterentwickelten
bimodalen Modell und (c) einem detaillierten sektionalen Modell approximiert. Während das sektionale Modell die Partikelerzeugung durch Nukleation und das Partikelwachstum durch
Koagulation berücksichtigt, ist im monodispersen und bimodalen Modell zusätzlich Koaleszenz berücksichtigt. Die Partikelerzeugung aus der Gasphase wurde während den Flamelet Berechnungen
ermittelt und als Nukleationsquellterm in den Tabellen gespeichert.
Im ersten Teil der Arbeit wurde die Eignung und die Validität des Flamelet Generated Manifold Ansatz's gekoppelt mit dem Artificial Thickened Flame Modell anhand einer gut untersuchten
Ethanol-Luft Spray Flamme im Labormaßstab untersucht und nachgewiesen. Danach, wurde das namhafte monodisperse Populationsbilanzgleichung-Modell genutzt um die Siliziumoxid-Synthese aus einem Spraypyrolyse-Reaktor betrieben mit Ethanol, Hexamethyldisiloxan Methan und Sauerstoff zu untersuchen. Die Ergebnisse dieser Studie führten zu der Frage, wie gut das monodisperse Modell geeignet ist, die gleichzeitig stattfindenden Prozesse Nukleation, Koagulation, Koaleszenz und Mischen in turbulenten Flammen zu Beschreiben. Daher wurden die Tauglichkeit und Validität von drei Populationsbilanzmodellen für Fallstudien mit parallel ablaufender Nukleation,
Koagulation, Koaleszenz und Mischung von Partikelpopulationen mit unterschiedlichen Historien untersucht und demonstriert. Auf Grund fehlender zeitaufgelöster Messungen von Partikeleigenschaften und Partikelgrößenverteilungen wurde ein generischer Testfall basierend auf einem veröffentlichen Referenzfall erzeugt und genutzt, um die zuvor genannte Studie durchzuführen.
Im finalen Abschnitt der Arbeit wurde der globale Simulationsansatz zur Beschreibung und Untersuchung der Siliziumoxid-Synthese aus einem Reaktor im Labormaßstab sowie der Eisenoxid-Synthese aus einem Reaktor im Versuchsmaßstab angewandt
Interaktionsanalyse der Hypoxie-induzierbaren Transkriptionsfaktoren HIF-2α und ARNT unter Berücksichtigung der Einflussnahme durch den HIF-2α-Liganden N-(3-Chloro-5-fluorophenyl)-4-nitrobenzo[c][1,2,5]oxadiazol-5-amine und verschiedener HIF-2α-Mutationen
Full text linkUnter Hypoxie werden die sog. Hypoxie-induzierbaren Transkriptionsfaktoren (HIFs) in Zellen aktiviert, die im Zellkern an die DNA binden und eine Genexpression auslösen. HIFs sind in verschiedene physiologische (z. B. Embryogenese) und pathophysiologische Prozesse (z. B. das Tumorwachstum und die Metastasierung) involviert (Lisy und Peet 2008).
In dieser Arbeit wurden Interaktionen von HIF-Untereinheiten durch Messung des Fluoreszenz-Resonanz-Energietransfers (FRET) in lebenden humanen Osteosarcom-Zellen U2OS untersucht. Dafür wurden die U2OS-Zellen mit fluoreszenzmarkierten Fusionsplasmiden, die für HIF-Untereinheiten codieren, transfiziert. Für eine FRET-Messung wurde eine CFP (cyan fluorescent protein)- und eine YFP (yelow fluorescent protein)-gekoppelte HIF-Untereinheit verwendet.
Das primäre Ziel des Promotionsprojekts war die Wirkung der Verbindung N-(3-chloro-5-fluorophenyl)-4-nitrobenzo[c][1,2,5]oxadiazol-5-amine, die als ein selektiver HIF-2α-Antagonist befunden wurde (Scheuermann et al. 2013), auf die HIF-2α / ARNT-Interaktion zu prüfen. In dieser Arbeit konnte keine Inhibierung der Dimerisierung von HIF-2α und ARNT durch FRET-Messungen in lebenden Zellen festgestellt werden. Der Fluoreszenz-Resonanz-Energietransfer konnte detektiert werden und war spezifisch für zwei interagierende Proteine.
Mit Hilfe der Co-Immunpräzipitations-Analyse, einer Methode zur Untersuchung von Protein-Protein-Interaktion in vitro, wurde eine Reduktion der Komplex-Bildung zwischen HIF-2α und ARNT, jedoch keine komplette Unterbrechung des Komplexes, nach Zugabe des HIF-2α-Antagonisten detektiert.
Zusätzlich wurde der Einfluss von verschiedenen Mutationen in der HIF-2α-Untereinheit auf die Dimerisierung mit ARNT untersucht. Nur ein unspezifisches FRET-Signal (Random FRET) wurde bei der Messung der Interaktion von HIF-2α-Untereinheit, die drei Punktmutationen in der PAS-B-Domäne (Gln322Glu, Met338Glu, Tyr342Thr) enthielt, und ARNT detektiert. Ebenfalls führte die Deletion der ganzen PAS-Domäne in der HIF-2α-UE zur Inhibierung der Komplex-Bildung mit ARNT. Dagegen beeinträchtigte eine Punktmutation (Cys138Tyr) in der HIF-2α-PAS-A-Domäne sowie die Deletion von Thr870 die HIF-2α / ARNT-Interaktion nicht.
Das spezifische FRET-Signal konnte auch zwischen den Transkriptionsfaktoren HIF-1α und HIF-2α sowie HIF-2α und HIF-2α gemessen werden. Die Co-IP-Ergebnisse lieferten eine Bestätigung der HIF-2α / HIF-2α-Interaktion.Hypoxia-inducible transcription factor (HIF) complexes regulate expression of genes responsible for cellular adaptation to hypoxia. HIFs are heterodimers and consist of a labile, O2-sensitive α-subunit and a stable β-subunit (also known as aryl hydrocarbon nuclear translocator, ARNT). Both subunits belong to the family of basic helix-loop-helix (bHLH) proteins containing a Per-ARNT-Sim (PAS) domain (Semenza et al. 1997).
Under hypoxia, HIF-α subunits translocate from the cytoplasm to the nucleus and form active HIF α / ARNT heterodimers which bind to DNA and induce transcription of hundreds of genes, e. g. transcription of endothelial growth factor (VEGF), erythropoietin, or glucose transporter (Fandrey et al. 2006).
The major aim of this research project was to investigate the impact of the compound N-(3-chloro-5-fluorophenyl)-4-nitrobenzo[c][1,2,5]oxadiazol-5-amine, published as the selective HIF-2α antagonist (Scheuermann et al. 2013), on the interaction mode of HIF-2α and ARNT in living cells.
Additionally, the effects of mutations or deletions in the HIF-2α subunit on its interaction with ARNT were analyzed. Moreover, the interaction of HIF-1α and HIF-2α was examined, hypothesizing an interplay between these two subunits.
To analyze molecular interactions of HIF subunits, Fluorescence Resonance Energy Transfer (FRET) microscopy was applied. For that purpose different plasmid constructs, fused to either enhanced cyan fluorescent protein (ECFP) or enhanced yellow fluorescent protein (EYFP) were transfected into human osteosarcoma cells U2OS. The FRET measurements were performed in living U2OS cells under normoxic conditions (21% O2 and 5% CO2).
Distinct FRET signals were detected in transfectants containing HIF-1α and ARNT which are known to form active heterodimers (Semenza et al. 1997). Only unspecific FRET characteristic for non-interacting proteins was observed in cells overexpressing the HIF subunits HIF-2α without PAS domain and ARNT, and also HIF-2α PAS B triple-point mutant (Gln322Glu, Met338Glu, Tyr342Thr) and ARNT.
Our FRET measurement results could not validate the disruption of HIF-2α / ARNT interaction by the compound N-(3-chloro-5-fluorophenyl)-4-nitrobenzo[c][1,2,5]oxadiazol-5-amine in living cells. A distinct FRET signal, typical for interacting proteins, could be detected. However, the co-immunoprecipitation analysis showed a little reduction of the complex formation of HIF-2α and ARNT after addition of the compound. Nevertheless, both FRET measurements and co-immunoprecipitation analysis validated no disruption of the complex formation.
It should be taken into account that the FRET measurement findings resulted from living cells incubated under intact natural conditions.
Hypothesizing an interplay between HIF-1α and HIF-2α, FRET was measured in transfectants overexpressing these two proteins and a FRET signal could be detected. Moreover, the expression of HIF-1 target gene CA-IX was significantly reduced after overexpression of HIF-2α. However, the overexpression of the transcriptionally inactive HIF-2α subunit lacking its DNA binding domain bHLH did not impede the mRNA expression of CA-IX. Both co-immunoprecipitation assays applied in this research did not clearly show an interaction between HIF-1α and HIF-2α. In contrast, the interaction of two HIF-2α subunits could be shown by co-immunoprecipitation assays.
Fandrey J., Gorr T. A., Gassmann M. (2006): Regulating cellular oxygen sensing by hydroxylation. Cardiovascular Research 71 642–651
Scheuermann T. H., Li Q., Ma H. W., Key J., Zhang L., Chen R., Garcia J. A., Naidoo J., Longgood J., Frantz D. E., Tambar U. K., Gardner K. H., Bruick R. K. (2013): Allosteric Inhibition of Hypoxia Inducible Factor-2 with Small Molecules. Nature Chemical Biology 9 271-276
Semenza G. L., Agani F., Booth G., Jo Forsythe J., Iyer N., Jiang B. H., Leung S., Roe R., Wiener C., Yu A. (1997): Structural and functional analysis of hypoxia-inducible factor 1. Kidney International 51 553-55
Geldpolitik in China: Friktionen in Finanzieller Intermediation und die Kosten der Sterilisation
Full text linkThis paper implements frictions in financial intermediation into a small open economy DSGE model. The model is designed to recreate key aspects of the Chinese economy during the financial crisis of 2008 and the ensuing worldwide economic contraction caused by the crisis. Simulations of external foreign interest rate shocks show a significant reduction in the aggregate deviation from monetary policy targets when financial intermediation is introduced. The reduction is further enhanced when current Chinese macroprudential regulations are taken into account. The assessment of the simulations suggests that the Chinese financial sector and its relationship to the central bank could play a major role in enhancing the sustainability of the current monetary policy stance adopted by Mainland China
PVDF ultrafiltration membranes with tailored separation performance by using PEO-b-PMMA diblock copolymers
Full text linkIn dieser Arbeit wurde das amphiphile Diblock Copolymer Polyethylenoxid-block-Polymethylmethacrylat (PEO-b-PMMA) hergestellt und sein Einsatz als funktionelles Additiv in Ultrafiltrationsmembranen aus Polyvinylidenfluorid (PVDF) untersucht. Ursprünglich sollte das Copolymer ausschließlich die Hydrophilie der Membranoberfläche erhöhen, wodurch eine Verringerung des Foulings während des Betriebs erwartet wurde. Dieser erwartete Nutzen wurde durch Foulingexperimente mit Blumenerdeextrakt überprüft, wobei bestätigt werden konnte, dass die Bestandteile des Extraktes erheblich weniger an Membranen haften konnten, die das Copolymer enthielten, als an vergleichbaren Membranen ohne Copolymer. Eine nahezu vollständige Regenerierung sehr stark von Fouling beeinträchtigter Membranproben, die das Copolymer enthielten, war in kurzer Zeit und nur durch Spülen mit Wasser möglich.
Zusätzlich wurde herausgefunden, dass es möglich ist Copolymermizellen zu erzeugen, wenn der PEO Block durch spezielle Metallsalze komplexiert wird. Bei Zugabe dieser Salze und geringer Mengen Wasser konnten mittels dynamischer Lichtstreuung (DLS) sowie Rheologie deutliche Anzeichen für die Ausbildung von Mizellen gefunden werden, die nicht erhalten wurden, wenn andere Salze verwendet wurden. Dieses Verhalten wurde daraufhin durch Protonen-Kernspinresonanzspektroskopie (1H-NMR) weiter untersucht. Es wurde beobachtet, dass alle Salze, die in den vorangegangenen Experimenten die Bildung von Mizellen auslösen konnten, selektiv einen Komplex mit dem PEO Block bildeten, was anhand einer Tieffeldverschiebung des PEO Peaks zu erkennen war. Gleichzeitig wurde eine Verbreiterung des Peaks beobachtet, die für die Bildung von Mizellen mit einem PEO Kern erwartet wurde. Bei Zugabe von Lithiumbromid, einem Salz, durch das die Bildung von Mizellen nicht ausgelöst werden konnte, wurde hingegen beobachtet, dass Komplexe mit beiden Blöcken gebildet wurden. Eine Peakverbreiterung trat hierbei nicht auf. Aus den Experimenten wurde geschlossen, dass die selektive Komplexierung des PEO Blocks als zusätzliche Triebkraft für die Bildung von (PEO-Kern, PMMA-Korona) Mizellen fungierte, die ansonsten in einem nicht-selektiven Lösemittel nicht gebildet worden wären.
Zu Beginn der Arbeit wurde vermutet, dass eine Mikrophasenseparation des Copolymers innerhalb der Gießlösung oder während des Ausfällungsprozesses die Eigenschaften der daraus resultierenden Membran verbessern könnte, zum Beispiel durch eine gleichmäßigere Struktur der selektiven Schicht oder eine höhere Porosität. Aus diesem Grund wurde zu Gießlösungen neben dem Blockcopolymer auch bis zu 1 % verschiedener Metallsalze hinzugegeben. Es wurden Salze genutzt, die nach den DLS Experimenten Mizellen erzeugen können (besonders CuCl, FeCl2), aber auch solche, die dies nicht konnten (z.B. LiBr).
In allen Fällen, in denen Salze verwendet wurden, die Mizellen erzeugen können, wurde eine Verschiebung des Molecular Weight Cut-Off (MWCO) und in den meisten Fällen eine Steigerung der Filtrationsleistung der Membran beobachtet. Dieser Effekt war von der Konzentration des Salzes abhängig, so dass über die Wahl des Salzes und seiner Konzentration gezielt Membranen mit einem bestimmten MWCO hergestellt werden konnten. Dies könnte sehr interessant für eine industrielle Anwendung sein, da so mit sehr geringem Aufwand Membranen für spezifische Trennaufgaben optimiert werden können.
In einem weiteren Teilgebiet der Arbeit wurde die Möglichkeit untersucht, die Selbstanordnung von PEO-b-PMMA für die Herstellung von Membranen mit sehr enger Porengrößenverteilung und maximaler Porendichte in der selektiven Schicht zu nutzen. Mittels AFM Aufnahmen konnten erste Nachweise einer erfolgreichen Selbstanordnung an der Oberfläche der Proben gefunden werden, die Herstellung von funktionsfähigen Membranen mit den gewünschten Eigenschaften gelang jedoch nicht. In this work, poly(ethylene oxide)-block-poly(methyl methacrylate) (PEO-b-PMMA) diblock copolymers were established as functional additive for polyvinylidene fluoride (PVDF) ultrafiltration (UF) membranes, originally with the intention to increase their hydrophilicity and thereby decrease fouling. Additionally, however, it was found that copolymer micelles can be induced by complexing the PEO block of PEO-b-PMMA with specific metal salts. The formation of micelles as function of specific solution compositions was characterized in dynamic light scattering and rheology experiments; the formation of PEO-metal ion complexes as well as the position of PEO in the core of the micelles were shown via proton nuclear magnetic resonance (1H-NMR) spectroscopy.
Integration of micelle-forming compositions into typical PVDF-based casting solutions for UF membranes could lead to a higher surface porosity and a more regular barrier pore structure through microphase separation during the nonsolvent induced phase separation process used for membrane preparation. It was found that membranes containing small amounts of PEO-b-PMMA show a significantly higher permeance than membranes made from an otherwise equal casting solution without the copolymer, while maintaining the solute rejection properties. By using different types and amounts of metal salts to complex the PEO block it was possible to tailor the molecular weight cut-off of the membranes between 30 kDa and 110 kDa. Fouling studies in lab-scale cross-flow filtration cells showed an increased relative flux recovery compared to membranes without the functional copolymer additive.
In another part of the thesis, the self-assembly of PEO-b-PMMA was investigated. In compliance with earlier DLS experiments, ordered structures were only observed in the presence of specific salts
Ultrasensitive surface-enhanced Raman-spectroscopy using taylor-made nanoparticles and nanoantennas
Full text linkFür die schwingungsspektroskopische Charakterisierung von Molekülen mittels oberflächenverstärkter Raman-Spektroskopie wurden maßgeschneiderte nanoskopische Strukturen zur Verstärkung des Raman-Signals eingesetzt – Nanopartikel und Nanoantennen.
Die Synthese und Nanofabrikation von maßgeschneiderten Nanopartikeln und Nanoantennen sowie die mikroskopische und spektroskopische Untersuchung der optischen Eigenschaften der
Nanostrukturen in unterschiedlichen Anwendungsbereichen ist Gegenstand dieser Arbeit. Im ersten Teil der Arbeit werden zwei verschiedene Nanopartikelsysteme betrachtet. Durch
die kontrollierte Synthese von sternenförmigen Nanopartikeln (Goldnanosternen) wurde die Anzahl und Form der Zacken gezielt variiert. Die katalytische Aktivität der Goldnanosterne
verschiedener Morphologie ist anhand einer chemisch getriebenen Modellreaktion mittels zeitaufgelöster Raman-Spektroskopie analysiert worden. Aus den Ergebnissen konnte ein möglicher Reaktionsmechanismus für den nötigen Elektronentransfer entwickelt werden. Des Weiteren wurde eine schnelle und reproduzierbare Syntheseroute von Gold/Gold-Kern/Satellitenpartikeln mit durchstimmbaren plasmonischen Eigenschaften elaboriert. Die Raman-spektroskopische Charakterisierung der molekular-funktionalisierten Gold/Gold-Kern/Satellitenpartikeln zeigte die effiziente Verstärkung des inelastisch gestreuten
Lichtes dieser Partikel. Damit besitzen die Partikel ein großes Potential für die spätere Anwendungen im Bereich der Nanodiagnostik.
Im zweiten Teil dieser Arbeit werden Untersuchungen zu den optischen Eigenschaften von metallischen und dielektrischen Nanoantennen gezeigt. Im besonderen handelt es sich
um Goldnanoantennen-Dimere und Siliziumnanoantennen-Dimere. Für die Nanofabrikation von metallischen Goldnanoantennen-Dimeren mittels Elektronenstrahllithographie sind zwei Verfahren für die Herstellung von Nanoantennen mit einem Abstand von wenigen Nanometern entwickelt worden. Die polarisationsaufgelösten Streuspektren einzelner Nanoantennen ließen Rückschlüsse auf die nanoskopische Struktur der Antennen zu. Daneben ermöglichte eine homogene molekulare Funktionalisierung der Probe die
Berechnung der Verstärkungsfaktor von einzelnen dielektrischen Siliziumnanoantennen-Dimeren für die oberflächenverstärkte Raman-Streuung und Fluoreszenz an demselben molekularen System. Weitergehend wurden aus einem theoretischen Vergleich mit
Goldnanoantennen-Dimeren sowie aus der Bestimmung der spektroskopischen Temperatur der Antennen die Vor- und Nachteile der Siliziumnanoantennen-Dimere diskutiert.The vibrational spectroscopic characterization of molecules by surface-enhanced Raman-scattering requires nanoscopic structures to enhance the Raman-signal, like nanoparticles or nanoantennas. The synthesis and nanofabrication of taylor-made nanoparticles
and nanoantennas for different applications is presented. All presented nanostructures were microscopically and spectroscopically analysed on ensemble and on single particle level.
In the first part the examination of two different kinds of nanoparticles, a star-like and a assembly of smaller and a bigger nanoparticle, is shown. The catalytic activity of gold nanostars
using a chemical driven model reaction recorded by time-resolved Raman-spectroscopy was determined. The reaction speed depends on the sharpness and the number of their tips. Based on the obtained results, a reaction meachnism for the required electron transfer has been proposed. Furthermore a fast, scalable and reproducable synthesis of gold/gold-core/satellite particles with tunable plasmonic properties was elaborated. The detailed Raman-spectroscopic
characterization of the molecularly functionalized gold/gold-core/satellite particles showed an efficient enhancement of the inelastic scattered light. Therefore these particles posses a large
potential for applications in nanodiagnostics. In the second part of this work the optical properties of metallic and dielectric nanoantennas is
presented. For the nanofabrication of gold nanoantenna dimers with a gap of a few nanometer two processes using electron beam lithography were developed. Polarisation-resolved scattering
spectra of these nanoantennas enabled to draw conclusions about the nanoscopic structure. Besides it was possible, to determine the enhancement factors for SEF and SERS on single homogeneous molecularly functionalized silicon nanoantenna dimers. Using a theoretical approach, the experimental and theoretical data was compared, including experimentally derived spectroscopic temperatures on single silicon nanoantenna dimers. This enables to contrast and discuss the advantages and disadvantages of dielectric nanoantennas to theoretical modelled gold nanoantennas
Investigation of the dynamic of polymers near surfaces via fluorescence correlation spectroscopy and Foerster energy transfer
No full textIm Rahmen dieser Arbeit wird ein eigener Mikroskopaufbau vorgestellt, welcher die Fluoreszenzkorrelationsspektroskopie und die Fluoreszenzlebenszeitsmessung vereint und diese an Oberflächen direkt als Ensemblemessung ermöglicht. Aus der Fluoreszenzlebenszeit können mittels Försterenergietransfers dabei Abstandsverteilungen im Bereich weniger Nanometer ermittelt werden. In dem Aufbau werden Proben mit niederenergetischen gepulsten Lasern in Totalreflexion beleuchtet, so dass die resultierende evaneszente Welle ca. 100~nm in die Probe eindringt, wodurch FLCS an der Oberfläche ermöglicht wird. Mit dem neuartigen TIR-FLCS Aufbau können somit Informationen über Diffusion als auch Struktur von Molekülen unter Einfluss von Oberflächen parallel erfasst werden.
Trotz einer Vielzahl an Untersuchung ist die Art der Beeinflussung von Polymerdynamik durch Oberflächen und deren Dimension noch nicht geklärt. Mittels des TIR-FLCS wird die molmassenabhängige Diffusionsdynamik von Polyethylenglycol in Anwesenheit von silanisierten Glasoberflächen untersucht und diese in Bezug zu den theoretischen Diffusionsmodellen von Rouse und Zimm gesetzt. Hierfür werden die Polymere als Ensemble in Lösung und auf der Oberfläche adsorbiert betrachtet. In der Nähe der silanisierten Oberflächen wird neben der Diffusion des adsorbierten Polymer und des freien gelösten Polymers eine dynamische Interphase zwischen Oberflächendiffusion und der Diffusion frei beweglichen Polymermoleküle in Lösung gefunden. Während letztere Zimm-Dynamik aufweisen, zeigt sich für die oberflächenahe Diffusion ein Rouse-artiges Verhalten. Zur Aufklärung der Struktur des Polyethylenglycols wurde das Polymer endständig mit zwei verschiedenen Fluoreszenzfarbstoffen markiert und mittels Försterenergietransfers erstmalig im Ensemble nahe der Oberfläche untersucht. Es zeigt sich hierbei eine Erhöhung des End-zu-End Abstandes der Polymere an den Propyl- und Aminopropylsilanoberflächen, wodurch sich die geänderte Dynamik teilweise begründen lässt.In this work a homemade microscope setup will be introduced, which combines the methods of fluorescence lifetime with fluorescence correlation spectroscopy and adapts these to ensemble measurements near surfaces. By the means of the Förster energy transfer, fluorescence lifetime can be used to derive distance distribution over the range of a few nanometers. In the presented setup, samples will be illuminated in a total reflection angle with low-energy pulsed lasers. This results in an evanescent wave penetrating about 100~nm into the sample, which enables FLCS near the surface. With the novel TIR-FLCS setup data on diffusional and structural dynamics near surfaces can be gathered simultaneously.
Even though there are numerous investigation on the type and extend of the influence of surfaces on polymer dynamics, it is still not sufficiently resolved. The molecular weight-dependent diffusional dynamics of polyethylene glycol will be examined in the vicinity of silanized glass surfaces and compared to the theoretical models of Rouse and Zimm. To achive this, the polymers will be measured as ensemble in solution and adsorbed on various surfaces. Between the diffusion of adsorbed polymer and the free diffusion of polymer in solution, a transitional interphase can be found on silanized surfaces. While the diffusion of polymers in solution scales as predicted by Zimm, the near surface diffusion shows Rouse behavior. For the structural investigation of polyethylene glycol, the polymer was labelled terminally with two different fluorescent markers, and, for the first time, measured Förster energy transfer near surfaces in an ensemble. Polymers on propylsilane and aminopropylsilane surfaces exhibit an increase in their end-to-end distances, which partially explains their change in diffusional dynamics
Least-squares finite element methods with applications in fluid and solid mechanics
No full textDie Least-Squares Finite Element Methode (LSFEM) weckt seit Jahren zunehmendes Interesse als eine alternative Methode zur Lösung partieller Differentialgleichungen (PDG) mechanischer Problemstellungen. Die Methode bietet im Vergleich zur bekannten Galerkin Variationsmethode einige Vorteile: Eine einheitliche mathematische Konstruktion von Systemen erster Ordnung für alle PDG-Arten, positiv-definite und symmetrische Systemmatrizen, sowie einen a posteriori Fehlerschätzer ohne zusätzlichen Rechenaufwand. Diese Vorteile gelten auch für Differentialgleichungen mit nicht selbst- adjungierten Operatoren wie den inkompressiblen Navier-Stokes Gleichungen. In der vorliegenden Arbeit wird die LSFEM zur Lösung der stationären, inkompressiblen Stokes und Navier-Stokes Gleichungen, sowie zur Lösung von Problemen der dynamischen Festkörpermechanik im Bereich kleiner Verzerrungen genutzt. Hierzu werden neben wichtigen Aspekten der Implementierung auch einige numerische Beispiele gezeigt. Ein Feld der Anwendungen ist die Durchströmung dreidimensionaler poröser Strukturen. Darüber hinaus werden adaptive Vernetzungsalgorithmen untersucht. Besonderer Fokus liegt auf Formulierungen in den unabhängigen Größen Spannung und Geschwindigkeit. Diese können für eine auf der LSFEM basierende Fluid-Struktur Interaktion (FSI) Implementierung genutzt werden. Der vorgeschlagene LSFEM-FSI Ansatz beruht auf der Idee einer monolithischen Kopplung, bei der die Interaktionsbedingungen durch eine konforme Diskretisierung in geeigneten Sobolev Räumen inhärent erfüllt sind. In numerischen Beispielen wird die Funktionsweise der Methode unter Berücksichtigung kleiner Verzerrungen gezeigt.The least-squares finite element method (LSFEM) arouses interest as an alternative method for solving partial differential equations (PDEs) with respect to mechanical problems in recent years. The method offers several advantages compared to the well-known principals of Galerkin variational methods: A unified mathematical procedure in constructing first-order systems to all types of PDEs, it leads to positive definite and symmetric system matrices as well as it offers an a posteriori error estimator without additional costs. These advantages hold for differential equations with not self-adjoint operators like the incompressible Navier-Stokes equations, too. In this work, the LSFEM is applied to the steady incompressible Stokes and Navier-Stokes equations as well as to the equations of small strain elastodynamics. The aim is to investigate the accuracy and performance of different formulations, which were proposed for the fluid and solid problems. Several numerical testings are investigated, besides discussing implementation aspects. The simulation of fluid flow through 3D porous structures is one field of applications considered in this thesis. Furthermore, adaptive meshing strategies are examined. A special focus is on formulations in terms of stresses and velocities as primary fields, which can be used in a least-squares FEM based fluid-structure interaction (FSI) approach. The proposed LSFEM-FSI approach relies on the idea of solving the interaction in a monolithic manner, with an inherent fulfillment of the interaction conditions due to the conforming discretization of the stresses and velocities in suitable Sobolev spaces. Numerical testings of the LSFEM-FSI in the small strain regime are provided