Repository of the University of Rijeka, Department of Biotechnology
Not a member yet
715 research outputs found
Sort by
Molekularna mehanika i molekularna dinamika u regulaciji metilacije DNK u ljudskim stanicama
No full textSignificance: DNA methylation is a fundamental mechanism of functional organization of the human
genome. The inhibitors and activators of DNA methylation can be used in tissue engineering by
cellular reprogramming and in analysis of functional organization of human genome. Numerous
studies have described design of inhibitors of DNA methylation but no study so far has described
design of activators of DNA methylation. In this study we analyze unusual 30 fold increase in activity
of human DNA methyltransferase (Dnmt1) by inosine containing DNA substrate in hope that such
approach can lead us to design of novel mechanism based activators of DNA methylation
Results: Using available crystal structures of Dnmt1 with hemimethylated substrates we have
prepared in silico Dnmt1 in complex with hemimethylated DNA substrate that contains inosine or
guanine bases at the target site. The prepared structures have been analyzed using steered
molecular dynamics protocols. We find that consistent with experimental activity studies Dnmt1 just
like the bacterial enzyme M.HhaI can stabilize its active site loop in closed position by hydrogen
bonding between Gly1234 and the amino group on guanine base at the target site. The inosine base
does not contain an amino group and it cannot support the active site loop in its closed position.
Surprisingly we also find that with guanine base at the target base substrate DNA forms guanineguanine
base pair that can stabilize catalytic complex and decrease the product release rates. The
same complex is not stable when guanine is replaced with inosine, and therefore the product release
step is much faster with an inosine base pair.
Conclusions: We have found that activation of DNA methyltransferase Dnmt1 by inosine containing
substrate depends on unusual guanine-guanine base pair that can be observed only with mammalian
Dnmt1 but not with simpler bacterial enzymes such as M.HhaI.Značaj: Metilacija DNK je temeljni mehanizam u funkcionalnoj organizaciji ljudskog genoma.
Inhibitori i aktivatori metilacije DNK mogu se koristiti za stanično reprogramiranje u regeneraciji
tkiva, kao novi lijekovi, ili u bazičnim istraživanjima funkcionalne organizacije ljudskog genoma. Veliki
broj studija predstavio je razvoj inhibitora metilacije DNK, međutim do sada niti jedna studija nije
predstavila razvoj aktivatora metilacije DNK. U ovom radu analiziramo molekularne mehanizme koji
uzrokuju do 30 puta veću aktivnost bakterijskih i ljudskih DNK metiltransferaza na DNK supstratima u
kojima je baza gvanin zamijenjena bazom inozin.
Rezultati: Koristeći dostupne kristalne strukture pripremili smo in silico Dnmt1 komplekse s DNK
supstratima koji sadrže inozin ili gvanin na ciljnom mjestu. Razlike u silama interakcije između Dnmt1
i pripremljenih DNK supstrata analizirali smo numeričkim simulacijama navođene molekularne
dinamike, te izračunom površinskih elektrostatskih polja. Simulacije su pokazale da sukladno
eksperimentalnim rezultatima, Dnmt1 može slično kao i bakterijski enzim M.HhaI stabilizirati petlju
aktivnog mjesta u zatvorenoj poziciji stvaranjem vodikovih veza s gvaninom u ciljnom mjestu. Slične
stabilizacijske veze ne mogu se stvarati s inozinom što vodi do bržeg raspada katalitičkog kompleksa i
bržeg oslobađanja produkta katalize. Nadalje, zamjena gvanina sa inozinom vodi do raspada
jedinstvenog gvanin:gvanin baznog para koji stabilizira katalitički kompleks kod ljudske Dnmt1, ali ne
postoji kod bakterijskog enzima M.HhaI. Brzi raspad jedinstvenog inozin:inozin kompleksa je glavni
razlog zašto ljudski enzim u usporedbi s bakterijskim enzimima pokazuje i do 5 puta veću aktivaciju s
DNK supstratima koji sadrže inozin na ciljnom mjestu.
Zaključak: Otkrili smo da aktivacija DNK metiltransferaze Dnmt1 pomoću supstrata koji sadrži inozin
ovisi o neuobičajenom gvanin:gvanin baznom paru koji je prisutan u DNK vezanoj u Dnmt1 sisavaca,
ali ne i kod bakterijskih enzima poput M.HhaI
CONSTRUCTION OF A PLASMID VECTOR FOR INSERTION OF TARGET SEQUENCES INTO HSV-1 GENOME
No full textRazvojem BAC mutageneze otvoren je novi put manipulacije velikih genoma virusa, uključujući Herpesviridae. Stabilnost, lakoća manipulacije i veliki kapacitet BAC vektora unutar Escherichie Coli označili su prekretnicu omogućivši različite modifikacije, od točkastih mutacija, do insercije i delecije virusnih ili stranih gena. Kako bi imali bolji uvid u replikaciju HSV-1 i njegovo širenje tijekom infekcije, in silico i metodama molekularnog kloniranja, konstruirali smo rekombinantni virus u kojem je EGFP (engl. enhanced green fluorescent protein) ekspresijska kazeta ugrađena u intergensku regiju između sekvenci UL3 i UL4. „En passant“ mutagenezom, jednostavnom i efikasnom lambda Red rekombinacijskom tehnikom, generirali smo HSV-1 LD-pINS i HSV-1 LD-EGFP rekombinantne viruse u dva ključna koraka. U prvom koraku, linearizirane rekombinacijske kazete pInserter-MCS i pInserter-EGFP integrirane su homolognom rekombinacijom u ciljano mjesto HSV-1 pozitivnom selekcijom na kanamicin (BAC LD-pIns-KAN, BAC LD-EGFP-KAN). U drugom koraku, I-SceI endonukleaza pocijepala je mjesto prepoznavanja stvarajući dvostruke lomove DNA (engl. double strand brakes, DSB). Susjedne duplicirane sekvence, prisutne na krajevima dsDNA, poslužiile su kao novi substrat za drugu homolognu rekombinaciju, koja je rezultirala gubitkom kanamicina (BAC LD-pIns, BAC LD-EGFP). Uspješnost ugradnje EGFP ekspresijske kazete u genom HSV-1 potvrdili smo metodom fluorescentne mikroskopije i western blotom. HSV-1 LD-EGFP inficirane stanice i bez prisustva promotora emitiraju dovoljnu razinu fluorescencije potrebne za praćenje virusne replikacije in vitro. Odmicanjem od središta virusnog plaka, gdje je EGFP fluorescencija inficiranih stanica najjače izražena, fluorescencija značajno opada. Ovim radom uspostavili smo jednostavan i izravan sustav kontinuiranog praćenja HSV-1 infekcije in vitro te otvorili mogućnost njegove primjene i na druge HSV-1 sojeve. Daljni napori našeg laboratorija biti će usmjereni ka adaptaciji vektora pInserter-MCS za primjenu npr. miRNA „sponge“ tehnologije kojom bi se razjasnila uloga miRNA u virulenciji.Developement of BAC mutagenesis has opened a new avenue for the manipulation of large virus genomes, including Herpesviridae. Stability, relatively simple manipulation and large insert size of BAC constructs within the Escherichia Coli has marked a turning point enabling various modifications like point mutations, insertions and deletions of viral or foreign genes. To better understand the replication of HSV-1 and its spread during infection, in silico and with molecular cloning methods, we constructed a recombinant virus in which EGFP (enhanced green fluorescent protein) expression cassette was inserted into the intergenic region between sequences UL3 and UL4. With „En passant“ mutagenesis, a simple and efficient lambda Red recombination technique, we have generated HSV-1 LD-pINS i HSV-1 LD-EGFP recombinant viruses in two key steps. In the first step, linearized recombination cassettes pInserter-MCS and pInserter-EGFP were inserted via Red recombination into target site using kanamycin positive selection (BAC LD-pIns-KAN, BAC LD-EGFP-KAN). In the second step, I-SceI endonuclease cleaved at its recognition site and created a double strand brakes, DSB. The adjoining duplicated sequences, present at the ends of dsDNA, served as the new substrate for second Red recombination, resulting in loss of kanamycin (BAC LD-pIns, BAC LD-EGFP). Successful integration of EGFP expression cassette into HSV-1 genome was confirmed by fluorescent microscopy and western blot. HSV-1 LD-EGFP infected cells even without promoter presence emit sufficient level of fluorescence, necessary for monitoring of viral replication in vitro. Moving away from the center of viral plaque where EGFP fluorescence of infected cells is expressed the most, fluorescence drops significantly. With this study we established a simple and direct system of continuous monitoring of HSV-1 infection in vitro, and opened the possibility of its application to other HSV-1 strains. Far efforts of our laboratory will be directed to adaptation of vector pInserter-MCS for the application of eg. miRNA sponge technology that would clarify the role of miRNA in virulence
Effects of tyrosol and quercetin on indicators of ageing in period circadian mutants of Drosophila
No full textCiklusi svjetla i mraka reguliraju cirkadijalne gene koji diktiraju ritmove metabolizma i antioksidativnih enzima koji su usko povezani sa stvaranjem slobodnih radikala (ROS) u organizmu. Prema jednoj od teorija starenja, nakupljanje slobodnih radikala uzrokuje smanjenje funkcionalnog kapaciteta organizma, što je vidljivo na bihevioralnoj (smanjenje lokomotorne aktivnosti, poremećeno spavanje) i biokemijskoj razini (oštećenja proteina, DNA i lipida). Poznato je da su mutacije u period (per) cirkadijalnom genu povezane s prijevremenim starenjem. Polifenoli su poznati po svojim antioksidativnim svojstvima, što znači da smanjuju i usporavaju oksidativna oštećenja stanica izazvana slobodnim radikalima. Istraţili smo potencijalan blagotvorni učinak polifenola kvercetina i tirosola na indikatore starenja kod period cirkadijalnih mutanata (per01) Drosophile melanogaster. Testovi su provedeni na per01 mutantima Drosophile oba spola. Mušice su od roĎenja hranjene hranom s dodatkom različitih koncentracija kvercetina ili tirosola. Testirali smo njihov bihevioralni i biokemijski fenotip nakon 2, 4 i 6 tjedana tretmana polifenolima te smo rezultate usporedili s mladim i starim netretiranim mušicama. Od bihevioralnih indikatora starenja mjerili smo negativnu geotaksiju (sposobnost vertikalnog penjanja), količinu lokomotorne aktivnosti i spavanja tijekom 24 sata, otpornost na stres izgladnjivanjem i isušivanjem, preţivljenje i teţinu. Mjerili smo i biokemijske indikatore u koje spadaju aktivnost antioksidativnih enzima katalaze (CAT) i superoksid dismutaze (SOD), nakupljanje AGE biomarkera starenja te količina mono-di-triglicerida i reduktivnih šećera. Rezultate testova na per01 mutantima usporedili smo s rezultatima mušica divljeg tipa. Potvrdili smo da postoje razlike u procesu starenja mušica divljeg tipa i period mutanata. Polifenoli kvercetin i tirosol pozitivno su djelovali na neke od bihevioralnih i biokemijskih indikatora starenja, a taj učinak ovisio je o spolu, genotipu i starosti mušica, te koncentraciji polifenola. Točan mehanizam djelovanja
polifenola nije još razjašnjen, a postoji mogućnost da na smanjenje oksidativnog stresa djeluje direktno (uklanjanjem ROS ili čak sprječavanjem njihova nastajanja) i indirektno (potičući djelovanje endogenih antioksidativnih enzima). Vaţno otkriće ovog istraţivanja je postojanje interakcije per gena s mehanizmom djelovanja polifenola.Circadian genes regulate metabolic changes closely connected with ageing. Ageing is caused by accumulation of Reactive Oxidative Species (ROS) which leads to changes in behaviour (decrease in locomotor activity, disrupted sleep) and physiology (damaged proteins, DNA and lipides). It was reported that mutation in period (per) circadian gene influences ageing by shortening lifespan. Polyphenols quercetin and tyrosol are known antioxidants, so we tested their beneficial effect on indicators of ageing and redox state in per01 circadian mutant. Tests were performed on flies of both sexes. They were fed on food containing different concentrations of polyphenols from eclosion and compared to flies fed on regular food. We tested their behavioral and biochemical phenotypes after 2, 4 and 6 weeks of treatment. We measured negative geotaxis (vertical climbing ability), amount of locomotor activity and sleep during 24 h, resistance to starvation and dehydration stress, longevity and weight. We also measured biochemical phenotypes such as CAT (catalase) and SOD (superoxide dismutase) activity, AGE biomarker, amount of reductive sugars and mono-di-tri-glycerides. We confirm difference in ageing process of wt and per01 flies. Polyphenols quercetin and tyrosol had positive effect on several behavioral and biochemical indicators of ageing. This effect was dependent on sex, genotype and age of flies and concentration of polyphenols. Exact mechanism of action of polyphenols is still not clear, and they could act directly (by removing ROS or preventing its generation) and indirectly (by stimulating the activity of the endogenous antioxidative enzymes). An important finding of this work is the interaction between per circadian gene and the mechanism of action of polyphenols
Uloga limfocitnih subpopulacija u pogoršanju diabetesa mellitusa tipa 2 uzrokovanog citomegalovirusnom infekcijom u debljini
No full textPretilost predstavlja veliki globalni problem do čijeg nastanka dolazi prekomjernim stvaranjem masnog tkiva kao posljedice povećanog unosa energije i smanjenja fizičke aktivnosti. Pretilost dovodi do brojnih komplikacija, a među najčešće spada metabolički sindrom koji obuhvaća i šećernu bolest tipa 2 (engl. Diabetes Mellitus Type 2, DM2). DM2 je kronični metabolički poremećaj karakteriziran hiperglikemijom te promjenama u metabolizmu proteina i masti. Nastaje kao posljedica razvoja inzulinske rezistencije (engl. Insulin Resistance, IR) čijim se glavnim uzrokom smatra upala visceralnog masnog tkiva (engl. Visceral Adipose Tissue, VAT) uzrokovana pretilošću. S razvojem pretilosti dolazi do stvaranja stanja stresa u VAT-u, aktivacije mnogih proupalnih stanica i lučenja proupalnih citokina što dovodi do upale VAT-a i IR-a. U brojnim istraživanjima uočena je povezanost između virusne infekcije i pojave DM2. Cilj ovog rada bio je ispitati utjecaj citomegalovirusne (engl. Cytomegalovirus, CMV) infekcije na razvoj DM2 u debljini. Također, željela sam ispitati utjecaj imunosnih stanica za koje je poznato da sudjeluju u razvoju upale VAT-a i IR kod pretilih pojedinaca, na ubrzan razvoj IR nakon infekcije mišjim citomegalovirusom (engl. Murine Cytomegalovirus, MCMV). Za potrebe pokusa koristila sam miševe na visokokalorijskoj masnoj dijeti (engl. High Fat Diet, HFD) inficirane MCMV-om. Provedenim istraživanjima dokazala sam kako MCMV infekcija dovodi do ranije pojave smanjene osjetljivosti na glukozu i razvoja IR-a kod miševa na HFD prehrani, no sama infekcija bez HFD prehrane nije imala nikakav utjecaj. Rezultati pokazuju da infekcija MCMV-om može utjecati i na raniji prijelaz iz predijabetesa u dijabetes. Također, uočeno je da MCMV infekcija miševa na HFD prehrani dovodi do povećanog stvaranja stanica NK, CD4+ limfocita T i CD8+ limfocita T za koje je poznato da sudjeluju u upali VAT-a. Deplecija stanica NK dovela je do značajnog poboljšanja osjetljivosti na glukozu i do smanjenog broja M1 makrofaga u VAT-u miševa na HFD prehrani iniciranih MCMV-om.
Ovi rezultati ukazuju da je infekcija MCMV-om jedan od rizičnih čimbenika za raniju pojavu DM2 u pretilosti. Također, može se zaključiti da je jedan od mehanizama kojim MCMV dovodi do ranije pojave IR uslijed pretilosti, povećanje
broja stanica NK koje imaju ključnu ulogu u razvoju upale VAT-a za koju je poznato da dovodi do razvoja IR-a
Razvoj dvostrukog luciferaznog reporter eseja za in vivo detekciju miRNA genskog utišavanja
No full textMost frequent global death causes are cardiovascular disorders such as cerebrovascular diseases, high blood pressure, congenital heart disease and coronary artery disease. Cardiovascular diseases often result in development of heart failure syndrome which in most cases leads to death within 5 years after diagnosis. Similar to heart failure, acute myocardial infarction is a silent murderer of today’s developed society due to sedentary life style and unhealthy habits such as smoking and unhealthy diet. Both disorders are characterized by heart cell remodeling and depletion in number of viable cardiomyocytes what is considered to be main obstacle in finding efficient therapy. Heart is an organ unable to respond to damage by self-renewal and therapy provided up to date is insufficient to increase number of viable CMs. Although many pharmaceuticals and surgical interventions are developed, all of them temporarily mend the heart. For this reason development of novel therapeutics is required among which miRNAs show to be very promising in boosting heart proliferation rate. MiRNA-199a-3p and 590-3p showed to significantly increase cardiomyocyte proliferation in vitro and in vivo and to preserve cardiac function after injury cause by mimicking myocardial infarction. Homer1 and CLIC5 genes are showed to be most down regulated by miRNA-199a-3p and 590-3p. To measure level of this downregulation more precisely and to show that this targeting is limited specifically to cardiomyocytes, not to other heart cells (cardiac fibroblasts, endothelial cells…) we decided to develop dual luciferase reporter model of monitoring miRNA targeting in vivo. System would take advantage of adeno-associated virus (AAV) vector tissue tropism, specifically transducing cardiomyocytes. Vector would carry transgene consisted of a 3’UTRs of Homer1 or CLIC5 gene together with luciferase (Renilla or firefly) sequence. Gene downregulation would be assesed by luciferase bioluminescence decrease after miRNA mimic intracardiac injection.Kardiovaskularne bolesti kao što su visoki krvni tlak, cerebrovaskularna te koronarna oboljenja predstavljaju jedan od najčešćih uzroka smrti na globalnoj razini. Takva oboljenja često rezultiraju sindromom zatajenja srca koji najčešće dovodi do smrti pet godina nakon uspostavljanja dijagnoze. Slično kao i zatajenje srca, infarkt mokarda je tihi ubojica današnjeg razvijenog društva te je posljedica sjedilačkog načina života i nezdravih navika. Oba poremećaja su karaterizirana remodeliranjem srčanih stanica te smanjenim brojem funkcionalnih kardiomiocita što se smatra glavnom preprekom u pronalasku učinkovite terapije. Srce je organ kojeg karakterizira nemogućnost samo-obnove uslijed ozljede te su terapije razvijene do danas neučinkovite u povećanju broja funkcionalnih kardiomiocita. Razvijeni su mnogi korisni lijekovi i kirurški zahvati, ali oni često samo privremeno zaliječe srce. Sukladno tomu, nužan je razvoj novih terapija u liječenju srčanih oboljenja među kojima su se mikro RNA molekule pokazale kao vrlo obećavajuće u poticanju proliferacije kardiomiocita. Jedan od primjera su miRNA-199a-3p i miRNA-590-3p koje su pokazale da značajno povisuju razinu proliferacije kardiomiocita kako in vitro tako i in vivo. Također, pokazale su bitnu ulogu u očuvanju srčane funkcije nakon oštećenja izazvanog srčanim udarom. Dva gena koji su bili utišani u najvećoj mjeri od strane miRNA-199a-3p i miRNA-590-3p su Homer1 i CLIC5. Da bi u buduće što preciznije mjerili to utišavanje te kako bi dokazali da je ono ograničeno samo na kardiomiocite, a ne ostale srčane stanice (fibroblaste i endotelne stanice), odlučili smo razviti dvostruki luciferazni esej za in vivo detekciju miRNA genskog utišavanja. Sistem bi koristio prednost tkivne specifičnosti adeno-združenog viralnog vektora transducirajući isključivo kardiomiocite u srčanom tkivu. Vektor bi nosio transgen koji se sastoji od 3'UTR regije Homer1 ili CLIC5 gena zajedno sa sekvencom gena za luciferazu (Renilla ili firefly). Utišavanje gena bi se mjerilo smanjenjem luciferazne bioluminiscencije nakon intrakardijalne injekcije miRNA-199a-3p i miRNA-590-3p
Screening of novel drugs for Alzheimer diseasein human neuroblastoma cells
No full textZNAČAJ: Alzheimerova bolest je jedna od najskupljih bolesti današnjice za sustav zdravstvene zaštite u razvijenim zemljama. Postojeći lijekovi samo ublažavaju simptome, a glavna meta tih lijekova je izuzetno složen enzim, intramembranska proteaza γ sekretaza.
REZULTATI: U ovom radu razvijen je ELISA protokol za mjerenje količine unutarstaničnog amiloid β peptida iz ljudskih stanica neuroblastoma SH-SY5Y APPwt A9 5x. Koristeći razvijeni protokol napravljen je probir između 5 potencijalnih lijekova za Alzheimerovu bolest. Najboljim inhibitorom γ sekretaze pokazao se JIVA 28, jer ne mijenja morfologiju stanica niti utječe na njihovu smrtnost, a dobro je topljiv u DMSO i ne mijenja svoje agregacijsko stanje. Potencijalni lijek JIVA 39 netopljiv u uvjetima u kojima rastu stanice, dok potencijalni lijekovi JIVA 4, JIVA 40 i JIVA 41 nisu pokazali inhibiciju γ sekretaze. Također, JIVA 40 je bio smrtonosan za stanice.
ZAKLJUČAK: Nakon inkubacije s potencijalnim lijekovima za Alzheimerovu bolest mjerena je količina unutarstaničnog Aβ iz ljudskih stanica neuroblastoma novim razvijenim ELISA protokolom. Rezultati ukazuju da je JIVA 28 jedini inhibitor γ sekretaze, jer istovremeno nije smrtonosan za stanice i ne mijenja njihovu morfologiju što ga čini jedinim potencijalnim lijekom za Alzheimerovu bolest.SIGNIFICANCE: Alzheimer’s disease is one of the most expensive diseases of today for health care system in developed countries. Present drugs only relief the symptoms and their main target is an extremely complex enzyme, intramembrane protease y secretase.
RESULTS: In our study a new ELISA protocol was developed for measuring the amount of intracellular amyloid β peptide from human neuroblastoma cells SH-SY5Y APPwt A9 5x. New developed protocol was used for screening of 5 potential drugs for Alzheimer’s disease. Best inhibitor of γ secretase is JIVA 28 because it doesn’t change the morphology of cells and isn’t lethal for cells while it is soluble in DMSO and doesn’t change its state of aggregation. Potential drug JIVA 39 isn’t soluble under conditions for cell growth and potential drugs JIVA 4, JIVA 40 and JIVA 41 didn’t show inhibition of γ secretase. Also, JIVA 40 was lethal for cells.
CONCLUSION: After incubation with potential drugs for Alzheimer’s disease the amount of intracellular Aβ from human neuroblastoma cells was measured with new developed ELISA protocol. Results indicate that only JIVA 28 inhibits y secretase and at the same time isn’t lethal or changes the morphology of the cells making it a potential drug for Alzheimer’s disease
A comparison of cyp 450 inhibition methods in human liver microsomes applied in early drug discovery
No full textJedan od važnih koraka u ranoj fazi istraživanja novih lijekova je procjena mogućnosti kemijskog spoja da izazove lijek-lijek interakciju (engl. drug-drug interaction, DDI). Enzimi citokromi P450 (CYP450) odgovorni su za oksidativni metabolizam velikog broja lijekova kao i metaboličku interakciju lijekova. Za najučestalije CYP450 izoforme (CYP1A2, CYP2C9, CYP2C19, CYP2D6 i CYP3A4) mogućnost inhibicije određuje se pojedinačno za svaku izoformu u in vitro sustavu ljudskih jetrenih mikrosoma korištenjem specifičnih supstrata. Sve veći broj sintetiziranih spojeva, često lipofilnih svojstava i ograničenih količina, zahtjeva otapanje u organskim otapalima koja sama mogu imati inhibitorne ili stimulatorne učinke na CYP450 enzime.
U ovom je radu razvijena metoda određivanja potencijala za inhibiciju CYP450 enzima pojedinačnim pristupom (engl. single approach) za ukupno 5 izoformi u ljudskim jetrenim mikrosomima, koristeći dimetilsulfoksid (DMSO) kao organsko otapalo u polaznoj matičnoj otopini. Dobiveni rezultati su uspoređeni s prethodno razvijenom i validiranom metodom u kojoj matičnu otopinu čini metanol. U tu je svrhu korišteno 7 komercijalnih inhibitora, prema preporuci regulatornih agencija, za pojedine izoforme CYP450. IC50 vrijednosti dobivene korištenjem DMSO kao otapala dobro koreliraju sa vrijednostima dobivenim s metanolom, te potvrđuju da se on može koristiti u ovoj metodi ukoliko je njegov udio u konačnoj inkubacijskoj smjesi <0.1%. Kako bi se povećala efikasnost, u određivanju potencijala za inhibiciju CYP450 za veći broj spojeva, razvijena je tzv. metoda koktel pristupa (engl. cocktail approach) koja omogućuje istovremeno profiliranje nekoliko izoformi unutar jedne inkubacijske smjese, te omogućava brže testiranje DDI potencijala. IC50 vrijednosti dobivene iz koktel pristupa dobro koreliraju s vrijednostima iz pojedinačnog pristupa, kao i s literaturnim vrijednostima, te upućuju na dobru optimizaciju ove metode. Nadalje, rezultati potvrđuju da se metoda koktel pristupa može koristiti kao visokoprotočna metoda za predviđanje mogućih lijek-lijek interakcija velikog broja novosintetiziranih spojeva, čime se povećava efikasnost tijekom rane faze istraživanja.One of the important steps in early drug discovery is the assessment of drug-drug interactions (DDI) potential for new chemical entities. Cytochrome P450 enzymes are responsible for the oxidative metabolism of numerous drugs, as well as their metabolic interaction. The inhibition potential for the most common CYP450 isoforms (CYP1A2, CYP2C9, CYP2C19, CYP2D6, and CYP3A4) is determined individually for each isoform in an in vitro system of human liver microsomes using specific substrates. An increasing number of new chemical entities, often lipophilic and of limited quantities, require organic solvents which can have either inhibitory or stimulatory effects on CYP450 on their own. In this work, a method was developed to assess the CYP450 inhibition potential for a total of 5 individual isoforms (single approach) in human liver microsomes, using dimetylsulfoxid (DMSO) as an organic solvent in the stock solution. Results were compared to a previously developed and validated method using a methanol stock solution. A total of seven commercially available and inhibitors, recommended by regulatory agencies, for the different CYP450 isoforms were used. IC50 values obtained using DMSO were in good agreement with those obtained using methanol, confirming that DMSO can be used in this assay providing the final concentration is <0.1%. In an effort to improve the screening efficiency for a larger number of compounds, the cocktail approach method was developed. This method enables simultaneous profiling of several isoforms within a one incubation mixture, allowing faster screening for DDI potential. IC50 values obtained in the cocktail approach correlate well with values obtained in the single approach, as well as the literature, suggesting the method was well optimized. Moreover, this confirms that the cocktail approach method can be used as a high-throughput screening tool to assess CYP450 inhibition potential for a larger number of compounds thereby increasing efficiency during the early discovery phase
Visoko-protočno pretraživanje za identifikaciju microRNA molekula u cilju poboljšanja CHO proizvodnje rekombinantnih proteina
No full textGlobal demand for biopharmaceuticals is increasing and requires constant improvement in manufacturing processes. Chinese hamster ovary (CHO) cells are dominant host for production of recombinant therapeutic proteins with human-like post-translational modifications. In the past, engineering of mammalian cell systems was focused on the manipulation of single target genes or proteins. Although cell performance is enhanced, numerous limitations and bottlenecks remain. Therefore, novel technologies and improvements in biopharmaceutical manufacturing processes are necessary to address this issue. Several unique characteristics make microRNAs (miRNAs) attractive alternative for CHO cell engineering. MicroRNAs are small non-coding RNAs that regulate gene expression at post-transcriptional level. Mature miRNA can simultaneously repress or degrade multiple target mRNAs involved in many cellular processes such as proliferation, apoptosis, cell cycle, metabolism, and protein synthesis. Importantly, mature miRNAs are highly conserved between species and due to low-target-specificity, they are capable of regulating hundreds of genes. Hence, several reports showed successful application of miRNA (engimiR) in CHO optimizations. However, due to insufficient improvement and cell line or recombinant protein dependency, none of them have made their way into industrial setting. The goal of this thesis was to explore phenotypic change after transient transfection with miRNA and identify engimiRs that improve CHO cell-specific productivity and viable cell concentration (VCC). Following protocol set-up, successful transfection of CHO cell line expressing recombinant erythropoietin (rEPO) with five pre-selected miRNAs confirmed proof-of-principle. Cell counting and ELISA assay provided insight into the effect of miRNA transfection on the VCC and rEPO concentration. In addition, functional high-throughput miRNA screening of non-viral delivery of human miRNA mimics library to CHO-rEPO was employed. Using this approach, 26 from 2042 miRNAs were identified to improve rEPO concentration at the cellular level by 3.5 to 6.0-fold without decreasing VCC. Highest effect, 6-fold increase in cell-specific productivity was detected after transient transfection with miR-3153. Finally, bioinformatics tools miRBase and miRWalk were utilized to predict conservation of human miRNA in CHO cells and to identify potential targets. Further studies are necessary in order to validate results and to select cell line and protein independent engimiRs in large-scale production.Globalna potražnja za biološkim lijekovima je u porastu i zahtjeva stalno unapređivanje proizvodnih procesa. Stanice ovarija kineskog hrčka (CHO) su najčešće korišteni domaćini u proizvodnji rekombinantnih proteina zbog post-translacijskih modifikacija sličnih ljudskima. U prošlosti, inženjerstvo staničnih sustava je bilo usmjereno prema manipulaciji pojedinačnih gena ili proteina. Iako je stanična učinkovitost time poboljšana, brojna ograničenja su preostala. Stoga, nužna je primjena novih tehnologija i unapređivanje proizvodne bioloških lijekova. Nekoliko jedinstvenih osobina čine mikro RNA (miRNA) primamljivom alternativom za inženjerstvo CHO stanica. Mikro RNA su male, nekodirajuće RNA molekule koje reguliraju gensku ekspresiju na post-transkripcijskoj razini. Zrela miRNA može istovremeno potisnuti ili razgraditi nekoliko mRNA meta uključenih u različite stanične procese, poput proliferacije, apoptoze, staničnog ciklusa, metabolizma i sinteze proteina. Nadalje, miRNA su visoko-konzervirane među vrstama i radi niske specifičnosti, sposobne su regulirati stotine gena. Nekoliko istraživačkih grupa je pokazalo uspješnu primjenu miRNA u optimizaciji CHO stanica. Međutim, nedovoljna efikasnost i ovisnost o korištenoj staničnoj liniji i rekombinantnom proteinu su razlog izostanka industrijske primjene. Cilj ovog rada je bio istražiti fenotipske promjene uslijed prolazne transfekcije s miRNA i identificirati one koje će poboljšati produktivnost i rast CHO stanica. Učinkovitost uspostavljenog protokola je pokazana uspješnom transfekcijom pet odabranih miRNA u CHO stanice koje izražavaju rekombinantni eritropoetin (rEPO). Brojanje stanica i ELISA esej su omogućili uvid u utjecaj miRNA transfekcije na koncentraciju živih stanica i eritropoetina. U nastavku, funkcionalni visoko-protočni skrining knjižnice ljudskih miRNA je primijenjen na CHO-rEPO stanicama. Takvim pristupom identificirano je 26 od 2042 miRNA koje su povećale razinu rEPO na staničnoj razini za 3.5 do 6 puta uz izostanak negativnog utjecaja na broj stanica. Najizraženiji utjecaj, povećanje za 6 puta je zabilježen nakon transfekcije s miR-3153. Konačno, bioinformatička analiza pomoću alata miRBase i miRWalk je korištena u svrhu predikcije konzerviranosti ljudskih miRNA u CHO stanicama te za identifikaciju potencijalnih meta. Dodatna ispitivanja su nužna kako bi se potvrdili dobiveni rezultati i kako bi se pronašla miRNA neovisna o staničnoj liniji i rekombinantnom proteinu te učinkovita u masovnoj proizvodnji
Determining the levels of mycotoxins in grains from conventional and organic farming systems
No full textKontaminacija hrane i hrane za životinje značajan je problem u svijetu. Mikotoksini su toksični sekundarni metaboliti gljivica i plijesni koji štetno utječu na zdravlje ljudi i životinja uzrokujući bolesti i značajne ekonomske gubitke u poljoprivredi i stočarstvu. Tijekom 2015. godine, prikupljen je 31 uzorak iz organskog uzgoja s područja Hrvatske i iz uvoza (Mađarska i Kina) te 33 uzorka iz konvencionalnog uzgoja s farmi na području Središnje Hrvatske. U ovom su radu analizirane koncentracije sljedećih mikotoksina: Aflatoksin B1, fumonizin B1, zearalenon, deoksinivalenol, T-2 toksin i okratoksin A. Aflatoksin B1 je spoj sa dokazanim jakim hepatotoksičnim učinkom. Fumonizin B1 ima jaki hepatotoksični i nefrotoksični učinak kod ljudi i ţivotinja. Zearalenon je estrogeni metabolit koji utječe na estrogene receptore. Deoksinivalenol utječe na središnji živčani sustav kod životinja i uzrokuje razna oboljenja. T-2 toksin uzrokuje oštećenje koštane srži te znatni pad broja leukocita kod ljudi, dok okratoksin A ima potencijalni kancerogeni učinak kod ljudi. Koncentracije navedenih mikotoksina su određivane primjenom validirane ELISA metode. Dobivene koncentracije mikotoksina u žitaricama iz organskog i konvencionalnog uzgoja uspoređivane su s najvećim dopuštenim razinama koncentracija mikotoksina propisane Uredbom Komisije (EZ) br. 1881/2006 o utvrđivanju najvećih dopuštenih količina određenih kontaminanata u hrani. Uspoređujući broj pozitivnih uzoraka, odnosno koncentracije analiziranih mikotoksina u žitaricama, žitarice iz organskog uzgoja su se pokazale značajno više kontaminiranim naspram žitarica iz konvencionalnog uzgoja. Visoke koncentracije mikotoksina u analiziranim žitaricama iz organskog uzgoja u poveznici su s nekorištenjem fungicida pri zaštiti usjeva od kontaminacije mikotoksinima.Contamination of food and feed is a significant problem in the world. Mycotoxins are secondary toxic metabolites syntetised by fungi and molds which affect the health of humans and animals, causing diseases and significant economic loss in agriculture and animal husbandry. During this study, 31 sample of organic farmed (Croatia, Hungary and China) and 33 samples of conventionally farmed (Central Croatia) various grains were collected. In this study, concentrations of mycotoxins: Aflatoxin B1, fumonisin B1, zearalenone, deoxynivalenol, T-2 toxin and ochratoxin A; were analysed. Aflatoxin B1 is a compound with proven strong hepatotoxic effects. Fumonisin B1 has a potent hepatotoxic and nephrotoxic effect on humans and animals. Zearalenone is a estrogenic metabolite that affects estrogen receptors. Deoxynivalenol affects the central nervous system in animals, and causes various diseases. T-2 toxin causes damage to bone marrow and a significant drop in the number of leukocytes in humans. Ochratoxin A has a potential carcinogenic effect in humans. The concentrations of different mycotoxins were determined by using a validated ELISA method. The resulting concentrations of mycotoxins in grains from organic and conventional farming were compared with the maximum concentration levels of mycotoxins prescribed by the European Commission Regulation (EC) No. 1881/2006 on establishing maximum levels for certain contaminants in foodstuff. Comparing the results of positive samples, the samples grown organically have proven to be significantly more contaminated with mycotoxins than samples from conventional farms. High concentrations of mycotoxins on the analyzed samples from organic farms may be associated with non-use of fungicides
Bv-2 cells as an alternative model for the study of cytomegalovirus infekction of microglia
No full textBV-2 stanice predstavljaju imortaliziranu mikroglijalnu staničnu liniju kao najčešće korištenu zamjenu za primarnu kulturu mikroglija stanica. Uobičajeno je da se uzgajaju u DMEM (engl. Dulbecco’s Modified Eagle Medium) mediju uz dodatak fetalnog goveĎeg seruma (FCS, engl. Fetal Calf Serum). In-vitro stanični mikrookoliš ne moţe dati točnu presliku onoga u središnjem ţivčanom sustavu, što naposljetku moţe dovesti do morfoloških i funkcionalnih promjena u mikroglija stanicama. Mikroglija stanice po prirodi su reaktivne i stoga su podloţne promjenama u svojoj okolini. Početni eksperimenti koje smo proveli u našem laboratoriju na spomenutoj liniji, u svrhu uspostavljanja in-vitro modela infekcije, pokazali su slabu permisivnost BV-2 mikroglija stanica za mišji citomegalovirus (MCMV). TakoĎer BV-2 mikroglija stanice pokazivale su obiljeţja stalne aktiviranosti i to u M1 aktivacijskome stanju. Kako bi utvrdili mogu li promjene u uvjetima kultivacije utjecati na permisivnost ovih stanica za MCMV, kao i na njihova fenotipska obiljeţja, stanice su uzgajane u različitim postocima FCS-a (0%, 2% i 5%) te su inficirane MCMV-om. Rezultati ovoga rada pokazuju da manipulacija uvjetima kultivacije, posebice oduzimanje FCS-a iz medija za uzgoj, dovodi do morfoloških promjena BV-2 mikroglija stanica. TakoĎer je povećana permisivnost bipolarnih BV-2 mikroglija stanica za MCMV infekciju. Različiti uvjeti uzgoja utjecali su i na razinu izraţaja proupalnih biljega iNOS, CD86 i CD16/32 te protuupalnog biljega CD206, ovisno o koncentraciji FCS-a. Zaključujemo da okolišne promjene koje mijenjaju metabolički i imunološki profil mogu dovesti do promijenjenog odgovora BV-2 mikroglija stanica na patogene.Murine microglial BV-2 cell line is commonly used as a substitute for primary microglia. They are usually cultivated in the Dulbecco’s modified eagle medium (DMEM) supplemented with fetal calf serum (FCS). This in vitro cellular environment is unable to imitate the one present in the central nervous system, thus causing morphological and functional changes to the microglial cells. Microglial cells are reactive by nature, and as such are affected by all changes in their environment. In the first experiments we performed with the goal of establishing an in-vitro infection model, BV-2 microglial cells exhibited low susceptibility to murine cytomegalovirus (MCMV). Also, they exhibited features of a permanent M1 activity. To determine whether the changes in the conditions of cultivation may affect the susceptibility of these cells to MCMV infection as well as their phenotypic characteristics, the cells were cultivated in varying FCS percentage (0%, 2% and 5%), while also being infected with MCMV. Results from our study show that manipulation of cultivation conditions, specifically FCS depletion, leads to morphological changes of BV-2 microglial cells. Also, results show increased susceptibility of rod-shaped BV-2 microglial cells for MCMV infection. Varying FCS depletion also affected the levels of pro-inflammatory markers iNOS, CD86 and CD16/32 and the antinflammatory marker CD206, depending of the concentration. This indicates that the environmental changes that modulate the metabolic and immunological profile can cause an altered response of microglial cells to pathogens