Repository of the University of Rijeka, Department of Biotechnology
Not a member yet
715 research outputs found
Sort by
The expression of nuclear receptor coactivator 2 in the murine uterus during early pregnancy
Get PDFCilj istraživanja: Uspostava i održavanje trudnoće su kompleksni procesi kontrolirani mnogim hormonima i transkripcijskim čimbenicima te bilo kakva nepravilnost molekula koje ju vode, može uzrokovati nemogućnost začeća ili spontani gubitak trudnoće. Prema literaturnim podatcima, 75 % neuspješnih trudnoća je pripisano izostanku ili nepravilnosti implantacije. Implantacija je kontrolirana progesteronom (P) i estrogenom (E) koji djeluju putem jezgrinih receptora. Aktivnost progesteronskog receptora (PR) je pod utjecajem NCOA-2, a utječe na aktivnost Hand2. Bjelančevine NCOA-2 i Hand2 su ključne u decidualizaciji. Cilj ovog rada je bio analizirati odnos između izražaja PR-a, NCOA-2 i Hand2 u ranoj trudnoći.
Materijali i metode: U istraživanju su korištene gravidne ženke miša divljeg tipa soja BALB/c. Mišice su žrtvovane na 2., 4., 6. i 7. dan nakon pojave vaginalnog čepa. Izražaj PR-a, NCOA-2 i Hand2 je određen metodom dvostruke imunofluorescencije na rezovima tkiva uterusa.
Rezultati: U razdoblju rane trudnoće, izražaj NCOA-2 i Hand2 se mijenja tijekom vremena. Prema provedenoj analizi, najveći izražaj navedenih molekula je na mjestu implantacije. Bjelančevine PR, NCOA-2 i Hand2 kolokaliziraju u stromalnim stanicama. Ko-regulator NCOA-2 je prisutan i u stanicama luminalnog (LE) i žljezdanog epitela. Molekule NCOA-2 i Hand2 su izražene u decidualnim stanicama.
Zaključak: Visoko regulirani mehanizmi u koje su uključeni PR, NCOA-2 i Hand2 su nužni za implantaciju embrija u miša. Navedene molekule su ključne i u procesu decidualizacije. Kolokalizacija PR-a, NCOA-2 i Hand2 u stromalnim stanicama upućuje na vjerojatnost da je NCOA-2 ko-regulator transkripcijske aktivnosti PR-a koji, u stromalnim stanicama, kontrolira izražaj Hand2.Aim of the study: Since the establishment and maintenance of pregnancy are complex processes run by many hormones and transcriptional factors, any irregularity between proteins included in pregnancy can lead to unsuccessful conception or spontaneous miscarriage. According to researches, 75 % of failed pregnancies are caused by improper implantation. Implantation is regulated by progesterone (P) and estrogen (E), which act through their nuclear receptors (NR). The activity of progesterone receptor (PR) is modulated with NCOA-2. Activation of PR leads to transcription of Hand2. Proteins NCOA-2 and Hand2 also play a critical role in decidualization. The aim of this research was to analyze relationship between PR, NCOA-2 and Hand2 during early pregnancy.
Material and methods: In this research, pregnant BALB/c mice were used. Mice were sacrificed 2, 4, 6 and 7 days after the apperance of vaginal plug. The expression of PR, NCOA-2 and Hand2 were determined by immunofluorescence of uterine tissues obtained from pregnant mice.
Results: During early pregnancy, the expression of NCOA-2 and Hand2 is changing in temporal manner. There is an indication that expression of these molecules is highest at the implantation site. Colocalization of PR, NCOA-2 and Hand2 was noticed in stromal cells. Coregulator NCOA-2 is located in luminal epithelial (LE) and glandular epithelial (GE) cells. Decidual cells are NCOA-2 and Hand2 positive.
Conclusion: Highly regulated mechanisms which include PR, NCOA-2 and Hand2 are essential in embryo implantation in mice. Mentioned molecules are also crucial in decidualization. Colocalization between PR, NCOA-2 and Hand2 suggests that NCOA-2 is coregulator of transcriptional activity of PR which controls the expression of Hand2 in stromal cells
Aegerolysin proteins in water extracts of selected basidiomycetes
No full textEgerolizini su obitelj visoko homolognih proteina koja obuhvaća proteine
molekulske mase 15 – 20 kDa. Prvi otkriveni egerolizin je Asp-hemolizin
izoliran iz plijesni Aspergillus fumigatus. Do sada su otkriveni u gljivama,
biljkama, praživotinjama i nekim patogenim bakterijama. Iako još njihova
glavna uloga nije u potpunosti razjašnjena, poznato je kako neki egerolizini
imaju anti-tumorska, antiproliferativna, antibakterijska i hemolitička
svojstva. Također, utvrđeno je da ovi proteini sami ili u djelovanju s drugim
proteinima stvaraju pore u prirodnim (stanice) i umjetnim membranama
(liposomi).
Cilj diplomskog rada je dokazati prisutnost egerolizinskih proteina u višim
gljivama (bazidiomicetama) koje u svojim genomima posjeduju gene za
proteine iz porodice egerolizina. Iskoristili smo sposobnost egerolizina da
se specifično vežu na liposome koji sadrže sfingolipide ceramid
fosfoetanolamin ili sfingomijelin u kombinaciji s kolesterolom.
Rezultati su pokazali prisutnost egerolizina u vrsti Hypholoma fasciculare,
za koju nije bilo poznato da sadrži egerolozine. Također, ta gljiva je
pokazala sposobnost permeabilizacije membrane bogate ceramid
fosfoetanolaminom i kolesterolom.
Prethodno navedeni rezultati potvrđuju do sad poznatu ulogu egerolizina te
bi mogli biti od potencijalnog značaja u otkrivanju njihove glavne uloge.Aegerolysins are a family of highly homologous proteins that encompass
proteins with molecule mass 15-20 kDa. First isolated aegerolysin is
Asp-hemolysin from the mould Aspergillus fumigatus. So far they have
beendiscovered in fungi, plants, protozoa and some pathogenic bacteria.
Although their main role is not fully clarified, it is known that some
aegerolysins have anti-tumor, antiproliferative, antibacterial and hemolytic
properties. It has also been found that these proteins, alone or in concert
with other proteins can make pores in natural (cells) and artificial
membranes (liposomes).
The main goal of this thesis was to prove the presence of aegerolysins in
Basidiomycota which possess genes coding for aegerolysin proteins.
We used the ability of aegerolysins to specifically bind to liposomes that
consist of ceramide phosphoethanolamine or sphingomyelin in combination
with cholesterol.
Results showed the presence of aegerolysin in the species Hypholoma
fasciculare, for wich it was unknown to contain aegerolysins. Also, this
fungus has showed the ability to induce pore forming in the membrane rich
with CPE and cholesterol.
The before mentioned results confirm the known role of aegerolysins and
also could help to uncover their main role
Izražaj čimbenika neovaskularizacije u uvjetima eksperimentalne hiperglikemije u CD26 deficijentim miševima
No full textUvod: Dipeptidil-peptidaza IV, odnosno molekula CD26 (DPP IV/CD26) ubikvitaran je transmembranski protein i serinska proteaza koja cijepa brojne biološki aktivne supstrate među kojima i one važne u regulaciji koncentracije glukoze u krvi. Prethodna istraživanja ukazala su na važnu ulogu DPP IV/CD26 u procesu angiogeneze, migracije stanica i apoptoze. Međutim, patofiziološki procesi cijeljenja rana u dijabetesu, koji predstavljaju značajan javnozdravstveni problem, nedovoljno su razjašnjeni. Pretpostavka ovog istraživanja je da DPP IV/CD26 ima važnu ulogu u procesu cijeljenja rana u uvjetima eksperimentalne hiperglikemije putem utjecaja na izražaj ključnih čimbenika neovaskularizacije.
Cilj istraživanja bio je uspostaviti pokusni model dijabetesa te model cijeljenja rana u CD26 deficijentnom (CD26-/-) i u divljem tipu miša (C57BL/6), te ispitati utječe li nedostatak DPP IV/CD26 na izražaj važnih čimbenika neovaskularizacije (VEGF i HIF-1α), praćenjem makroskopskih i mikroskopskih promjena tijekom procesa regeneracije i reparacije tkiva u uvjetima eksperimentalne hiperglikemije. Materijali i metode: Pokusnim životinjama CD26-/- i C57BL/6 soja induciran je eksperimentalni dijabetes intraperitonealnom aplikacijom otopine streptozotocina u citratnom puferu u dozi od 50 mg/kg tijekom 5 dana. Razvoj dijabetesa potvrđen je temeljem kliničkih, biokemijskih i histoloških parametara. Potom su pokusnim životinjama inducirane rane na dorzalnom dijelu tijela te su životinje žrtvovane drugog, četvrtog, sedmog, desetog i petnaestog dana cijeljenja rana. Provedena su histomorfometrijska, patohistološka i imunohistokemijska istraživanja na uzorcima tkiva rana, kontrolnih koža i gušterači. Određivan je izražaj čimbenika neovaskularizacije VEGF i HIF-1α, stupanj regeneracije koriuma te stupanj neovaskularizacije koriuma. Spektrofotometrijski je praćena enzimska aktivnost DPP IV/CD26 u tkivu kože rana divljeg tipa životinja tijekom procesa cijeljenja rana tkiva u uvjetima eksperimentalne hiperglikemije.
Rezultati: Analiza rezultata potvrdila je bolju toleranciju glukoze u CD26-/- soju miševa u odnosu na divlji tip. Histomorfometrijska analiza tkiva rana pokazuje veći stupanj regeneracije koriuma i smanjeno trajanje upalne faze u CD26-/- soju miševa dok C57BL/6 miševi pokazuju sporije stvaranje novog epidermisa i prekrivanje rane. Nadalje, nedostatak DPP IV/CD26 pozitivno utječe na bujanje veziva i retrakciju tkiva. Izražaj čimbenika neovaskularizacije HIF-1α i VEGF statistički je značajno viši (p<0,05) kod CD26-/- životinja u odnosu na C57BL/6 soj,
u svim ispitivanim danima cijeljenja tkiva. Broj novostvorenih kapilara u koriumu statistički je značajno viši (p<0,05) sedmog i desetog dana u CD26-/- soju u odnosu na C57BL/6 soj. Enzimska aktivnost DPP IV/CD26 statistički je značajno snižena (p<0,05) u tkivu rana u uvjetima eksperimentalne hiperglikemije kod C57BL/6 miševa drugog, četvrtog i sedmog dana cijeljenja u odnosu na odgovarajuću kontrolu.
Zaključak: Potvrđena je pretpostavka o značajnoj ulozi DPP IV/CD26 u homeostazi glukoze te u procesu regeneracije i reparacije tkiva u uvjetima eksperimentalne hiperglikemije. Nedostatak molekule CD26 povezan je s boljom tolerancijom glukoze, manje izraženim upalnim odgovorom, povećanjem izražaja čimbenika neovaskularizacije HIF-1α i VEGF te poboljšanom neovaskularizacijom koriuma u procesu cijeljenja rana kože. Dobiveni rezultati ukazuju na značajnost inhibicije DPP IV/CD26 kao moguće terapije u liječenju poremećaja cijeljenja rana u oboljelih od dijabetesa.Introduction: Dipeptidyl-peptidase IV or molecule CD26 (DPP IV/CD26) is a ubiquitous transmembrane protein and a serine protease that cleaves numerous biologically active substrates, including those with important role in regulating blood glucose concentrations. Previous studies have indicated the important role of DPP IV/CD26 in angiogenesis, cell migration and apoptosis. However, the pathophysiological processes of wound healing in diabetes, which represent a significant public health problem, are not sufficiently clarified. The hypothesis of this research is a significant role of DPP IV/CD26 in the process of wound healing under experimental hyperglycemia conditions.
The aim of this study was to establish an experimental model of diabetes and an experimental model of wound healing in CD26 deficient (CD26-/-) and wild type mice (C57BL/6), and to determine whether the DPP IV/CD26 deficiency influences on important neovascularization factors (VEGF and HIF-1α) by monitoring macroscopic and/or microscopic changes during the process of tissue regeneration and reparation under experimental hyperglycemia conditions.
Materials and methods: The experimental model of diabetes was induced in CD26-/- and C57BL/6 mice by intraperitoneal administration of a streptozotocine solution in a citrate buffer at a dose of 50 mg/kg for 5 days. The development of diabetes was confirmed on the basis of clinical, biochemical and histological parameters. Then, experimental wounds were induced on the dorsal part of experimental animals, and animals were sacrified on the second, fourth, seventh, tenth and fifteenth days of wound healing. Histomorphometric, histopathological and immunochemical analysis of wound, control skin tissue and pancreas were preformed. The expression of neovascularization factors of VEGF and HIF-1α, the degree of corium regeneration and the degree of neovascularization of the corium during cutaneous wound healing was determined. The enzymatic activity of tissue DPP IV/CD26 in wild type animals during the wound healing process in experimental conditions of hyperglycemia was measured using a spectrophotometric method.
Results: Obtained results confirmed a better tolerance of glucose in CD26-/- mice compared to the wild type. Histomorphometric analysis of wound tissue confirmed a higher degree of cortex regeneration and decreased duration of the inflammatory
phase in CD26-/- mice, while C57BL/6 mice show slower formation of new epidermis and wound coverage. Furthermore, DPP IV/CD26 deficiency positively affects the formation of connective tissue as well as tissue. Expression of neovascularization factors HIF-1α and VEGF were statistically significantly higher (p<0.05) in CD26-/- animals compared to C57BL/6 mice in all examined days of tissue healing. The number of new capillaries in the cortex was statistically significantly higher (p<0.05) on the seventh and tenth day in the CD26-/- mice compared to C57BL/6 animals. The enzymatic activity of DPP IV/CD26 in wound tissue in conditions of experimental hyperglycemia, was statistically significantly lower (p<0.05) in C57BL/6 mice on the second, fourth and seventh day of healing compared to physiological values.
Conclusion: The hypothesis of a significant role of DPP IV/CD26 in glucose homeostasis and in the process of tissue and reparation in conditions of experimental hyperglycemia has been confirmed. CD26 deficiency is associated with an improved glucose tolerance, a lower inflammatory response, increased expression of HIF-1α and VEGF neovascularization factors, and enhanced neovascularization of the cortex in healing wounds. Obtained results indicate the significance of DPP IV/CD26 inhibition as a possible therapy in the treatment of wound healing disorders in diabetic patients
Chromosomal Aberrations in Persons with Altered Fertility
Get PDFNeplodnost je u novije doba veliki zdravstveni problem koji pogaĎa 15%
populacije reproduktivne dobi. Definira se kao izostanak ţeljene trudnoće
uz redovite, nezaštićene spolne odnose tijekom razdoblja od najmanje
godinu dana. Neplodnost moţe biti uzrokovana ţenskim, muškim ili
zajedničkim faktorima, no u većini slučajeva dijagnoza ostaje nepoznata
odnosno definira se idiopatskom ili neobjašnjivom neplodnošću. Jedan od
čimbenika koji utječe na pojavu idiopatske neplodnosti je genetička
predispozicija, odnosno postojanje specifičnih genotipova i fenotipova
muškaraca i ţena povezanih s neplodnošću, a otkrivaju se kariotipizacijom
neplodnih parova. Poremećaji u graĎi i broju kromosoma uočeni
kariotipizacijom se jednim imenom nazivaju kromosomopatije te čine
gensku odrednicu neplodnosti. Uključuju kromosomske abnormalnosti
tjelesnih i spolnih kromosoma te utječu na muškarce i ţene. Svrha ovog
završnog rada je obraditi rezultate istraţivanja provedenih na neplodnim
parovima te utvrditi kromosomopatije koje mogu biti jedan od
potencijalnih uzroka nastanka neplodnosti ili neuspjeha terapijskog
pristupa metodama medicinski pomognute oplodnje (MPO). U literaturnim
pregledu rezultata najfrekventnije kromosomopatije u ţena su
gonosomalni mozaicizmi, a u muškaraca Klinefelterov sindrom.
UtvrĎivanje frekvencija pojavnosti odreĎenih kromosomopatija
omogućava odabir adekvatnog pristupa liječenju te usmjerenje ka
genetičkom savjetovanju parova u svrhu informiranja o posljedicama
liječenja metodama MPO koje uključuju prenošenje kromosomopatija na
potomke odnosno rizik od ponovljenih spontanih pobačaja te kongenitalnih
malformacija ploda.Infertility is becoming a public health issue which affects about 15% of the
population in reproductive age. Infertility is defined as inability to conceive
after one year of regular, unprotected intercourse. Although, both male,
female and mutual factor can contribute to infertility, in many cases
diagnosis are defined as unexplained. Unexplained infertility could be
caused by a variety of reasons, including most common one, a genetic
component which is related to specific genotypes and phenotypes
associated with infertility. Chromosome analysis also known as
karyotyping can reveal certain chromosomal abnormalities correlated to
genetic causes of infertility. Although chromosomal abnormalities involve
autosome and gonosome disorders they also affect both men and woman.
The purpose of this literature review is to process current research results
of karyotyped infertile couples and to determine which chromosome
abnormalities could potentially cause infertility or could be associated with
low-respond to couples undergoing assisted reproductive techniques
(ART). Nevertheless, by determining the type and prevalence of certain
chromosomal abnormality, the most frequent ones have proven to be
gonosomal mosaics for woman and Klinefelter syndrome in males. After
detecting certain chromosomal abnormality, couple should be lead to
comprehensive genetic counselling which includes information about
possible outcomes of ART as genetic risk of unbalanced offspring and high
rates of miscarriages and congenital malformation
BIOLOGIJA FIBROBLASTA U MIKROOKOLIŠU TUMORA
No full textTumorski mikrookoliš (TME) se sastoji od staničnih i nestaničnih komponenata te je važan za razvoj i metastaziranje karcinoma. Fibroblasti povezani s tumorom (CAF-ovi) su jedne od najvažnijih staničnih komponenata TME-a, koje imaju iznimnu važnost u nastanku, progresiji, invaziji i metastaziranju stanica karcinoma putem različitih mehanizama. CAF-ovi su heterogena populacija stanica, koje imaju različito podrijetlo te zbog toga i višestruke pozitivne markere. Također, imaju i širok spektar funkcija kojima promiču tumore, od parakrine signalizacije putem različitih faktora rasta, citokina i kemokina, remodeliranja i degradacije izvanstaničnog matriksa, do promicanja invazije, angiogeneze i metastaziranja. U ovom radu su sažeta saznanja iz pregleda literature koja su vezana za tumorski mikrookoliš i CAF-ove, njihovom podrijetlu i ulogama u tumorigenezi i metastaziranju.Tumor microenvironment (TME) consists of cellular and non-cellular components and as such is important for the development and invasion of cancer. Cancer-associated fibroblasts (CAFs) are one of the most important cellular components of TME, which have play extremely important role in the formation, progression, invasion and metastasis of carcinoma cells by various mechanisms. CAFs are heterogeneous cell population, which can originate from different sources and have multiple positive markers. Also, they have a wide range of functions to promote tumors, from paracrine signalling by different growth factors, cytokines and chemokines, remodelling and degradation of extracellular matrix, to the promotion of invasion, angiogenesis and metastasis. This paper summarizes findings from literature which are related to tumor microenvironment and CAFs, their origin and roles in tumorigenesis and metastasis
Rad ne sadrži naslov na drugom jeziku.
Get PDFAddiction is characterized by compulsive drug seeking and taking despite the negative consequences. In the laboratory, addiction is studied as set of simple forms of behaviors (endophenotypes), some of which are locomotor sensitization (LS), a phenotype of the motor-activating effects and preferential consumption, a phenotype of rewarding effects. The aim of the thesis is to develop tests for inducing and quantifying cocaine (COC) and methamphetamine (METH) motor-activating and rewarding effect, and investigate genetic mechanisms underlying such neural plasticity.
We developed and optimized two new methods, FlyBong for measuring motor-activating effects, and a self-administration method. We show that repeated exposures to volatilized COC and METH induce LS in flies, and that flies prefer COC and METH containing food to regular food. Pharmacodynamics of COC and METH LS and preferential consumption depends on the dopamine transporter. Reduction of dopamine, serotonin and octopamine, did not completely abolish the locomotor sensitization to COC and METH, suggesting the involvement of other monoamines in this processes. Manipulation of dopaminergic and serotoninergic vesicular monoamine transporters (VMAT) using RNA interference (RNAi), indicated that locomotor sensitization and preference to COC and METH depend on functional VMAT.
LS to COC depends on several circadian genes, period (per), cycle (cyc) and Clock (Clk), leads to high levels of reactive oxygen species (ROS) production and is susceptible to the exogenous redox perturbation. LS to METH depends only on one circadian gene, Clk, leads to lower levels of ROS and is less susceptible to exogenous redox perturbation. The motor-activation and rewarding effects of COC depend on the circadian gene per, while METH depends on Clk, indicating differential involvement of circadian genes in these two processes. Pre-treatment with H2O2 led to different effects on sensitivity and LS to COC and METH suggesting that H2O2 might function as a neuromodulator, and that its role is drug-specific.
Here we developed new behavioral tests and described the effects of COC and METH on two forms of neuronal plasticity. Our new high throughput test for measuring LS is ideally suited for unbiased genetic screen or selection. We described likely circadian and redox influence on behavior that correlates with monoaminergic
V
regulation. We hypothesize that circadian genes and redox regulation work together to change the brain functioning after consumption of addictive drugs.Jednostavna definicija ovisnosti podrazumijeva kompulzivno traženje i primjenu sredstva ovisnosti unatoč negativnim posljedicama koje ima za organizam. Ovisnost se kod laboratorijskih životinja proučava kao niz jednostavnih ponašanja (endofenotipova) upotrebom optimiziranih bihevioralnih testova koji moraju biti objektivni, reproducibilni i kvantitativni. Ovisnost o psihostimulansima (PS) kokainu (COC) i metamfetaminu (METH) se može razložiti na jednostavnija ponašanja povezana s motoričkim (senzitizacija) i nagrađujućim (preferencijalna konzumacija) učinkom. Cilj ovog doktorskog rada je ispitati utjecaj COC i METH na motorički i nagrađujući učinak povezan s genetskim promjenama koje dovode do neuralne plastičnosti primjenom novo razvijenih testova za induciranje i kvantifikaciju ponašanja.
Tijekom mog doktorskog studija razvila sam i optimizirala novu metodu za mjerenje motoričke aktivnosti potaknute primjenom PS koju smo nazvali FlyBong. Upotrebom novog optimiziranog protokola „FlyBong“, utvrđeno je da akutno i opetovano izlaganje Drosophile volatiliziranom COC i METH inducira povećanje motoričkog odgovora. Istražena je farmakodinamička sličnost između mehanizma djelovanja COC i METH te utjecaj monoamina dopamina, serotonina i oktopamina na bihevioralni odgovor kod akutne i opetovane primjene PS. Testirala sam hipotezu da su cirkadijalni geni period, timeless, clock, cycle i pigment-dispersing factor uključeni u endofenotip senzitizacije na COC i METH. Senzitizacija potaknuta s COC nije prisutna kod per01, cyc01 i ClkJrk mutanata, dok senzitizacija na METH nije prisutna kod ClkJrk mutanata. Izmjerila sam utjecaj COC i METH na sistemske biomarkere redoks statusa: katalazu, superoksid dismutazu, vodikov peroksid i reaktivne kisikove vrste čime sam pokazala da COC sistemski inducira veći, a METH manji pomak oksidativnog statusa Testirala sam utjecaj predtretmana s anti- i prooksidansima na motorički odgovor kod akutne i opetovane primjene COC i METH, čime sam pokazala da antioksidansi utišavaju senzitizaciju na METH, dok kod COC senzitizacija nije prisutna. Istražila sam potencijalnu neuromodulatornu i oksido-redukcijsku ulogu vodikovoga peroksida povezanu s predtretmanom koji nije uzrokovao sistemski pomak oksidativnog statusa, ali je utjecao na endofenotip senzitizacije. Testirana je hipoteza korelacije broja cirkadijanih gena i osjetljivosti na redoks status u ovisnosti o PS. Nađeno je da PS koji ovisi o više cirkadijalnih gena te uzrokuje veću sistemsku redoks preturbaciju pokazuje veću osjetljivost na promjenu redoks statusa u endofenotipu
VII
senzitizacije ako je pred tretman anti- ili prooksidativan, dok PS koji ovisi o manjem broju cirkadijalnih gena, uzrokuje manju sistemsku redoks preturbaciju te pokazuje manju osjetljivost na promjenu redoks statusa više orijentiranu na predtretman s molekulama manjeg antioksidativnog kapaciteta.
Kako bi ispitala da li PS utječu ma motivaciju za konzumacijom optimizirala sam test samo-administracije (Capillary Feeding, CAFE) gdje mušice biraju između otopine šećera i otopine šećera pomiješane s PS. Ovim istraživanjem je nađeno da mušice kojima je ponuđen izbor između otopine šećera i otopine šećera pomiješane s PS pokazuju preferenciju prema otopini s PS, koja je posljedica nagrađujućeg efekta PS. Nađeno je da su procesi učenja i pamćenja povezani s periferijalnom konzumacijom te da će mušice preferencijalno konzumirati otopinu s PS unatoč dodatku supstance gorkog okusa. Ukoliko se mušicama koje su izložene PS nekoliko dana za redom, jedan dan ne ponudi PS te ih se nakon toga ponovno izloži izboru između otopine šećera i otopine šećera i PS, mušice će pokazivati jednaku ili veću preferenciju za PS kao što je bila prije perioda apstinencije. Istražen je utjecaj cirkadijalnih gena te receptora i prijenosnika povezanih s farmakodinamičkim djelovanjem COC i METH na nagrađujući učinak. Pokazala sam da se preferencijalna konzumacija COC i METH razlikuje po tipu cirkadijalnih gena koji na nju utječu, a neki od njih kontroliraju motoričku senzitizaciju. Ovi rezultati upućuju na mogući zajednički genetski mehanizam koji je u podlozi preferencijalne konzumacije, kao oblika nagrađujućeg utjecaja PS i motoričke senzitizacije.
Ishodi mojeg doktorskog rada rezultirali su razvojem dvije nove objektivne i visokoprotočne metode za kvantifikaciju ponašanja Drosophile koja će omogućiti naredna istraživanja genetske osnove neuralne plastičnosti izazvane PS korištenjem metode genetskog probira ili genetske selekcije. Daljnja istraživanja cirkadijalnih/redoks povratnih spregi potaknutih primjenom COC i METH trebala bi pomoći u razumijevanju mehanizma kojima PS mijenjaju neuronske mreže, te usmjeravanju u nove potencijalne farmakološke smjerove razvoja lijekova za prevenciju i liječenje ovisnos
Effect of specific inhibitors on cholinesterase activity in water extracts of selected basidiomycetes
No full textEnzim kolinesteraza se nalazi u kolinergičnim sinapsama životinja i razgrađuje
neurotransmiter acetilkolin te tako zaustavlja prijenos živčanog signala među
stanicama. U zadnjem su desetljeću otkrivene i mnoge druge uloge tog enzima,
na primjer uloga u staničnoj diferencijaciji, u komunikaciji među stanicama te u
imunskom odgovoru. Enzim je bio nađen i u nekim gljivama kao npr. Aspegillus
niger i Physarum polycephalum, no objave s tog područja vrlo su rijetke i ne
postoje nikakva komparativna istraživanja o pojavnosti tih enzima u različitim
vrstama nižih (askomicete) i viših (bazidiomicete) gljiva. U okviru diplomskog
rada određivali smo aktivnost enzima kolinesteraza pomoću klasičnog
kolorimetrijskog testa (Ellmanova metoda). Pomoću prethodno odabranog
optimalnog supstrata napravili smo seriju mjerenja u ekstraktima bazidiomiceta
koji su prethodno pokazali kolinesteraznu aktivnost. Prisutnost kolinesteraza u
nekim ekstraktima potvrdili smo upotrebom specifičnih inhibitora. Nadalje smo
provjerili da li i sami ekstrakti gljiva sadrže inhibitore koji mogu inhibirati
životinjsku acetilkolinestarezu. Ekstrakte smo testirali i na prisutnost srodnih
hidrolitičkih enzima lipaza. Potvrdili smo kako se u našim aktivnim uzorcima
nalaze acetilkolinesteraze na koje djeluuju određeni inhibitori (diazinon,
malation, triklorfon, etopropazin hidroklorid, neostigmin bromid, edrofonijev
klorid, BW284C51), dok drugi inhibitori (Iso-OMPA, propidijev jodid) nisu imali
djelovanje na aktivnost ovog enzima. Pretpostavljamo da u nekim uzorcima ima
prisutnosti i butirilkolinesteraza, ili nekih drugačijih oblika acetilkolinesteraza.
Aktivnost koja se pokazala u ovim uzorcima govori o tome da acetilkolinesteraza
ima još funkcija osim one u živčanom prijenosu.The enzyme acetylcholinesterase is found in cholinergic synapses of animal
species where it breaks down the neurotransmiter acetylcholine. In this way, it
terminates the transmission of nerve signals. In the last decade some other roles
of this enzyme have been discovered, for instance a role in cell differentiation, in
communication between cells and in immune response. This enzyme has been
also found in some lower fungi such as Aspegillus niger and Physarum
polycephalum, but publications are rare in this field and there are no
comparative studies between other species of lover (ascomycetes) and higher
(basidiomycetes) fungi. In this master thesis, we determined the cholinesterase
activity using a classic colorimetric test (Ellman method). We made a series of
measurements in extracts of basidiomycetes which had shown cholinesterase
activity in previous tests. We confirmed the presence of cholinesterases in some
of these extracts using specific inhibitors. We also tested whether the extracts of
mushrooms themselves have inhibitors that would inhibit cholinesterases of
animal origin. We also tested the extracts for the presence of lipases. We
confirmed the presence of acetylcholinesterases in the selected samples. Some
inhibitors, such as (Diazinon, malathion, trichlorfon, neostigmine bromide,
edrophonium chloride, ethopropazine hydrochloride, BW284C51) inhibited the
extracts, while some (Iso-OMPA, propidium iodide) had no effect. We suggest
that in some extracts also cholinesterases with butyrylcholine binding activity are
present. The activity shown in the analysed samples suggests that there are
more functions to acetylcholinesterase except for the ones in transmission of
nerve signal
Cholinesterase activity in water extracts of selected basidiomycetes
No full text(Acetil)kolinesteraza je enzim kojeg prvenstveno povezujemo s njegovom funkcijom u prijenosu živčanih signala. Nalazi se u kolinergičnim sinapsama životinja i razgrađuje neurotransmiter acetilkolin te na taj način zaustavlja prijenos živčanog signala među stanicama. U zadnjem su desetljeću otkrivene i mnoge druge uloge tog enzima, na primjer uloga u staničnoj diferencijaciji, u komunikaciji među stanicama te imunosnom odgovoru. Obzirom na to da su kolinesteraze i/ ili acetilkolin nedavno bili otkriveni u biljkama, različitim vrstama mikroorganizama te u plijesnima Aspergillus niger i Physarum polycephalum logično je očekivati da ćemo ih pronaći također i u višim gljivama. Za sada još nije bilo istraživanja koja bi to pokazala. Određivala se aktivnost kolinesteraze u vodenim ekstraktima različitih bazidiomiceta pomoću klasičnog kolorimetrijskog testa (Ellmanova metoda) te denaturirajuće i nativne elektroforeze. Ellmanov test je pokazao najveću aktivnost enzima pri korištenju supstrata acetil-tiokolin klorida za razliku od butiril-tiokolin klorida i propionil-tiokolin klorida. Poliakrilamidna gelska elektroforeza u prisutnosti natrij-dodecil sulfata (SDS-PAGE) nije pokazala zadovoljavajuće rezultate, međutim nativnom elektroforezom su potvrđeni rezultati dobiveni Ellmanovim kolorimetrijskim testom gdje uzorci G18 (Cortinarius variicolor) i G32 (Echinoderma echinaceum) pokazuju najveću aktivnost. Ovakvi rezultati mogu otvoriti nove smjerove za otkrivanje novih vrsta i uloga kolinesteraza.(Acetyl)cholinesterase is an enzyme which is mostly regarded as important in the nervous system signaling. It is found in colinergic sinapses of the animals where it breaks down the neurotransmitter acetylcholine. Doing that, it terminates singaling transmission between neurons. In the last decade, many other acetylcholinesterase roles have been discovered; for example roles in cell differentiation and communication and immune response. Considering that cholinesterases and/or acetylcholine have recently been discovered in plants, different microorganisms and mold Aspergillus niger and Physarum polycephalum, it is only fair to expect finding them in higher fungi. At present, there hasn't been any research that tackled this kind of subject. Within this thesis, cholinesterase activity was determined in water extracts of various Basidiomycota using colorimetric test (Ellman's method), denaturating and native electrophoresis. Ellman's method showed the strongest enzyme activity when substrate acetylthiocholine chloride was used as opposed to butyrylthiocholine chloride and propionyltiocholine chloride. Polyacrylamide gel electrophoresis containing sodium dodecyl sulphate (SDS-PAGE) hasn't delivered wanted results, however native electrophoresis confirmed the results obtained using Ellman's method in which samples G18 (Cortinarius variicolor) and G32 (Echinoderma echinaceum) show the highest activity. These kind of results may give new directions in experimenting with new kinds and roles of cholinesterases
Herpes simplex virus 1 induced increased expression and mislocalization of FOXO proteins
No full textŽivotni ciklus herpes simpleks virusa 1 (HSV-1) sastoji se od dvije faze, produktivne i latentne. Tijekom produktivne faze virus uzrokuje brojne promjene u stanici, te podređuje staničnu mašineriju efikasnijoj replikaciji. HSV-1 se koristi različitim mehanizmima poput ICP0, koji usmjerava stanične proteine na degradaciju ili miRNA kojima regulira ekspresiju staničnih proteina, naročito onih uključenih u urođeni protuvirusni odgovor. Transkripcijski faktori FoxO važni su stanični proteini koji djeluju kao negativni regulatori protuvirusnog odgovora, što ih čini potencijalnom metom HSV-1. Istraživanje provedeno u Laboratoriju za molekularnu virologiju pokazalo je da tijekom HSV-1 produktivne infekcije dolazi do indukcije klastera staničnih miRNA molekula čije mete uključuju proteine iz podobitelji FoxO: FoxO1, FoxO3 i FoxO4, međutim utjecaj HSV-1 infekcije na ekspresiju proteina FoxO ostaje nedovoljno istražen. Naši preliminarni rezultati upućuju da u ranoj fazi produktivne HSV-1 infekcije dolazi do povećavanja razine proteina FoxO u stanicama HEK293. Kako bi istražili fenomen rane indukcije ekspresije, RPE1 i SH-SY5Y stanice inficirane su divljim tipom HSV-1, te je Western blot metodom određena razina proteina u različitim vremenskim točkama infekcije. Također, analizirali smo ekspresiju FoxO mRNA RT-qPCR metodom i unutarstaničnu lokalizaciju proteina FoxO vizualizacijom fluorescentnim mikroskopom u RPE1 stanicama. Naši rezultati pokazuju da HSV-1 produktivna infekcija dovodi do povećanja razine proteina FoxO1 i FoxO3, ali ne i mRNA, u ranoj fazi infekcije, te da rana indukcija ovisi o MOI. Također, tijekom kasnije faze HSV-1 infekcije FoxO1 translocira se iz jezgre inficiranih stanica u strukture cis Golgi mreže. Naši rezultati dokaz su da HSV-1 infekcija utječe na ekspresiju i lokalizaciju FoxO1 i FoxO3, te služe kao podloga za daljnje razjašnjavanje mehanizama regulacije, radi potencijalne uloge proteina FoxO u HSV-1 replikaciji.Herpes simplex virus 1 (HSV-1) replicates in two phases, productive and latent phase. The productive HSV-1 infection causes many changes in the cell and subordinates cellular metabolism to efficient replication. HSV-1 is using various mechanisms, such as virus protein ICP0, which directes cellualr proteins for degradation, and miRNAs, which regulate expression of cellular proteins, particularly those involved in the innate antiviral response. FoxO transcription factors are important cellular proteins that act as negative antiviral response regulators, making them the potential target of HSV-1. A study in the Laboratory for Molecular Virology showed that HSV-1 productive infection induced cluster of cellular miRNAs targeting host genes FoxO1, FoxO3 and FoxO4, but the effect of HSV-1 infection on FoxO protein expression remains unknown. Our preliminary results indicate that at an early stage of productive HSV-1 infection FoxO protein levels rise in HEK293 cells. In order to investigate this early induction phenomenon we infected RPE1 and SH-SY5Y with HSV-1 at different time points of infection and analyzed proteins by Western blot. In addition we analyzed the expression of FoxO mRNA using PCR and the subcellular localization of FoxO protein by fluorescencence microscopy. Our results show that HSV-1 productive infection leads to increased FoxO1 and FoxO3 protein levels, but not mRNA levels, at early stage of infection, and that this early induction strongly depends on MOI. Also, during the later phase of HSV-1 infection FoxO1 protein translocates from nucleus of infected cells to structures appearing as cis-Golgi network. Our results demonstrate that HSV-1 infection affects the expression and localization of FoxO1 and FoxO3 proteins, and serve as a basis for further clarification of regulatory mechanisms, in order to determine potential role of FoxO proteins in HSV-1 replication
Identification of malaria parasite virulence factors that counteract mosquito natural resistance
No full textMalaria is an infectious disease caused by Plasmodium parasites and transmitted by Anopheles mosquitoes. The ability of a given mosquito to transmit malaria parasites is determined by different factors: mosquito genetic factors (TEP1, responsible for mosquito resistance to malaria parasites), parasite genetic factors (Plasmodium falciparum Pfs47 surface protein, allows P. falciparum to by-pass the mosquito TEP1-dependent antiparasitic response) and diverse environmental factors. To identify novel parasite factors that contribute to Plasmodium infectivity in mosquitoes, the group of Stephanie Blandin has established a mutagenesis screen in the murine parasite Plasmodium berghei. They have recovered mutant parasites that are able to invade a normally fully resistant mosquito line. To identify the causative mutation(s), a virulent parasite VP1 was isolated, cloned and phenotyped (both the virulent parasite and the clones) in naturally resistant mosquitoes. During this project, we optimized the workflow for the phenotyping. We show that the optimal time for an infection that leads to high parasite loads is at 3 and 4 days post passage and that the optimal time for mosquito midgut dissections and microscopic analysis is at 10 to 12 days post infection. We also show that an antibiotic/antimycotic treatment of mosquitoes improves mosquito survival, but at the same time renders resistant mosquitoes more susceptible to infections (with both the wild type and the virulent parasites), indicating that the mosquito microbiota contributes in part to determine the resistance of resistant mosquitoes to parasites. With the intention of distinguishing virulent from avirulent virulent parasite clones, we phenotyped them in naturally resistant mosquitoes. We observed variable prevalences ranging from 2% to 38% for the different clones. Among the 12 clones, one stood out with the highest prevalence (38%) and parasite load (6), consequently being the best candidate for further exploration, despite its potentially partial phenotypic penetrance.Malarija je zarazna bolest uzrokovana Plasmodium parazitima, a prenose ju Anopheles komarci. Mogućnost prijenosa parazita malarije je određena različitim faktorima: genetičkim faktorima komarca (TEP1, odgovoran za rezistenciju komaraca protiv parazita malarije), genetičkim faktorima parazita (Plasmodium falciparum Pfs47 površinski protein, omogućuje P. falciparum da zaobiđe TEP1-ovisan antiparazitni odgovor) i različitim okolišnim čimbenicima. Za identifikaciju novih faktora parazita koji doprinose infektivnosti Plasmodium-a u komarcima, grupa vođena od strane Stephanie Blandin je uspostavila probir mutagenezom u murinskom parazitu Plasmodium berghei. Proizveli su mutirane parazite koji mogu napasti inače potpuno rezistentnu liniju komaraca. Kako bi identificirali ključne mutacije, virulentni parazit VP1 je izoliran, kloniran te zajedno s klonovima fenotipiziran u inače rezistentnim komarcima. Tokom ovog projekta, optimizirali smo proces fenotipiziranja. Pokazali smo da je optimalno vrijeme za infekciju koja vodi visokom broju parazita 3 i 4 dana poslije pasaža, a optimalno vrijeme za seciranje crijeva komaraca i mikroskopsku analizu istih 10 do 12 dana poslije infekcije. Isto tako, pokazali smo da antibiotski/antimikotski tretman komaraca poboljšava preživljavanje komaraca, ali u isto vrijeme čini prirodno rezistentne komarce podložnima infekciji (s parazitom divljeg tipa i virulentnim parazitom), što govori da mikrobiota u crijevima komaraca djelomično doprinosi u određivanju rezistencije rezistentnih komaraca na parazite. S namjerom razlikovanja avirulentnih i virulentnih klonova virulentnog parazita, fenotipizirali smo ih u rezistentnim komarcima. Zapazili smo varijabilne prevalencije od 2% do 38% za različite klonove. Između 12 klonova, jedan se istaknuo s najvišom prevalencijom (38%) i brojem parazita (aritmetička sredina 6) što bi indiciralo da je klon 8 najbolji kandidat za daljnje istraživanje, bez obzira na potencijalno parcijalnu penetraciju fenotipa