Repository of the University of Rijeka, Department of Biotechnology
Not a member yet
715 research outputs found
Sort by
Characterization and cloning of SNX9 fused with green fluorescent protein in DAMI and HEK293 cell line
No full textTrombociti, najmanje krvne stanice koje imaju važnu ulogu u hemostazi, nastaju u koštanoj srži iz prekursora, megakarocita. U procesu nastanka trombocita reorganizacija aktinskog citoskeleta je esencijalna. Sortirajući neksin 9 (engl. Sorting nexin 9, SNX9) je višefunkcijski protein koji koordinira promet na membrani i dinamiku aktina unutar stanica. SNX9 aktivira proteine Wiskott-Aldrich sindroma (engl. Wiskott–Aldrich Syndrome protein, WASP) koji zauzvrat iniciraju polimerizaciju aktina putem Arp2/3 kompleksa. Arp2/3 kompleks se veže za aktinske filamente kako bi se započelo grananje F-aktinskih niti. Kako bi polimerizacija aktina bila potpuno uspješna potrebne su male Rho GTPaze te PI(3)P i PI(4,5)P2, važni signalni lipidi.
Ovim radom ispitana je ekspresija i unutarstanična lokalizacija SNX9 u ljudskoj megakarioblastičnoj staničnoj liniji (DAMI). Naši glavni rezultati pokazali su kako je ekspresija SNX9 povećana u diferenciranim DAMI stanicama te kako SNX9 lokalizira ili perinuklearno ili je jednoliko raspršen po citoplazmi stanice. U diferenciranim DAMI stanicama SNX9 je često bio prisutan u obliku diskretnih vezikula koje su dijelom kolokalizirale s F-aktinom. Nadalje, kako bi dodatno ispitali lokalizaciju i učinak egzogene ekspresije SNX9, subklonirali smo SNX9 fuzioniran sa zelenim fluorescentnim proteinom (engl. green fluorescent protein, GFP) u retroviralni vektor (engl. Murine stem cell virus vector, MSCV). Točna veličina GFP-SNX9 i njegova lokalizacija je potvrđena u HEK293T staničnoj liniji. Ekspresija GFP-SNX9 u DAMI stanicama je pokazala podjednaku lokalizaciju kao endogeni SNX9. GFP-SNX9 je povećao polimerizaciju aktina (F-aktin) u nestimuliranim DAMI i HEK293T, ali ne i u diferenciranim DAMI stanicama. Dodatno, ekspresija GFP-SNX9 povisila je razinu PI(4,5)P2 u DAMI stanicama. Ovi rezultati ukazuju na to da bi SNX9 mogao biti uključen u proces polimerizacije aktina u DAMI stanicama te bi daljnja istraživanja mogla pomoći u definiranju uloge SNX9 u formiranju trombocita.Platelets, the smallest blood cells that play a major role in hemostasis, develop within the bone marrow from precursor cells, megakaryocytes. In this process, extensive rearrangement of actin cytoskeleton is crucial for bending and branching of proplatelet extensions. Sorting nexin 9 (SNX9) is a multifunctional scaffold protein involved with coordination of membrane trafficking and actin dynamics. More specifically, SNX9 activates Wiskott-Aldrich Syndrome protein (WASP) which in return initiates actin polymerization via activation of the Arp2/3 complex. The Arp2/3 complex binds to actin filaments and starts the formation of branched F-actin fibers. In order for actin polymerization to be successful, small Rho GTPases and PI(3)P and PI(4,5)P2, important signaling lipids, must be involved.
In this thesis, we investigated the expression and intracellular localization of SNX9 in human megakaryoblast cell line (DAMI). Our main results showed that expression of SNX9 increased with differentiation of DAMI cells and that SNX9 localized either perinuclearly or was dispersed throughout the cell cytoplasm. In differentiated DAMI cells SNX9 was often present in discrete vesicles that partially colocalized with F-actin. Moreover, in order to investigate localization and effect of exogenous SNX9, we subcloned SNX9 fused with green fluorescent protein (GFP) into retroviral murine stem cell virus vector (MSCV). Correct size of GFP-SNX9 and its localization were confirmed in HEK293T cell line. Expression of GFP-SNX9 showed same localization to endogenous protein in DAMI cells. Expression of GFP-SNX9 increased actin polymerization in HEK293T and undifferentiated DAMI, but not in differentiated DAMI cells. Furthermore, GFP-SNX9 increased PI(4,5)P2 levels in DAMI cells. These results suggest that SNX9 could be involved in the process of actin polymerization in DAMI cells. Therefore, a further study might help in better understanding of SNX9 role in platelet formation
EFFECTS AND SIDE EFFECTS OF CORTICOSTEROIDS IN ARTHRITIS TREATMENT
Get PDFArtritis je kronična bolest koja uzrokuje oštećenje zglobova i gubitak njihove funkcije čime se narušava kvaliteta života. Postoji nekoliko različitih tipova artritisa. Najčešći su: reumatoidni artritis (RA), juvenilni idiopatski artritis (JIA), giht, osteoartritis te psorijatični artritis. Artritis je bolest koja nije izlječiva. Koriste se različiti imunosupresivni lijekovi kojima se ublažavaju simptomi bolesti čime se pacijentu omogućava normalan život. Glukokortikoidi, skupina su lijekova, koji se koriste za liječenje artritisa. Njihova je uloga djelovanje na različite vrste stanica koje su uključene u upalu, čime se smanjuje upalni proces u organizmu. Glukokortikoidi djeluju zahvaljujući aktivaciji glukokortikoidnih receptora. Oni imaju mogućnost da nakon aktivacije reguliraju različite stanične mehanizme kao što su transrepresija i transaktivacija. Kortikosteroidi, osim što suzbijaju upalu, imaju i mnogobrojne štetne posljedice. Dugotrajna primjena kortikosteroida povezana je s neželjenim učincima kao što su povećanje tjelesne težine, osteoporoza, psihički poremećaji, mrena. Također, nuspojave variraju ovisno o dozi te duljini trajanja terapije. Međutim, unatoč ozbiljnim nuspojavama, kortikostreoidi se i dalje koriste kao prva mjera za sprječavanje upala, ali se, s obzirom da još uvijek nema adekvatnih lijekova, koriste i za dugotrajno liječenje reumatskih bolesti
Multivariate regression methods for chemometric analysis of the near-infrared spectra
Get PDFMultivarijatna analiza i regresija predstavljaju jedan od glavnih alata u analizi mjernih podataka s primjenom u kontroli kvalitete, kompresiji podataka, predviđanju varijabli u sustavima visoke kompleksnosti, a od nedavno i optimizaciji modela pomoću kojih je moguće opisati i predvidjeti ponašanje takvih sustava. Iako je matematički aparat za multivarijatnu analizu bio razvijen već početkom 20. st., puni procvat ovih metoda bilježi se tek razvojem i dostupnošću računala najnovije generacije.
Cilj diplomskog rada je istražiti primjenjivost i učinkovitost različitih metoda multivarijatne analize za dekonvoluciju spektara u bliskom infracrvenom podučju elektromagnetskog zračenja (NIR), izmjerenih za trokomponentnu smjesu spojeva glukoza, fruktoza i saharoza. Naglasak je na regresijskim tehnikama koje omogućuju, provjeru točnosti te pouzdanosti, kako za prilagodbu razvijenih modela, tako i za predikciju varijable odgovora. Najvažnije svojstvo tih tehnika je da primjena regresije pruža mogućnost samokonzistentne kalibracije, tj. određivanje kalibracijskih parametara optimizacijom kalibracijskog modela. Pritom, zbog podatkovne kompleksnosti NIR spektara, za primjenu svih istraženih metoda nužno je provesti i njihovu predobradu. Većina primijenjenih metoda, tj. analiza glavnih komponenti (PCA), multivarijatna linearna regresija (MLR), ridge regresija, regresija glavnih komponenti (PCR), regresija parcijalnih najmanjih kvadrata (PLS) te umjetne neuronske mreže, u prilagodbi modela sadrži korak selekcije ili redukcije podataka sadržanih u ulaznoj matrici spektara.
Istražene su i uspoređene značajke različitih metoda predobrade i prilagodbe modela te njihova učinkovitost za kvantitativnu analizu NIR spektara smjese navedenih spojeva. Kao najučinkovitija pokazala se ridge regresija, za koju ponovljena unakrsna validacija modela pokazuje out-of-sample pogrešku koja iznosi tek 0.63±0.08%. Rezultati i zaključci o istraženim metodama obrade NIR spektara primijenjivi su u praksi za brzu i efikasnu analizu smjesa kemijski sličnih spojeva u industrijskom i znanstveno-istraživačkom okružju.Multivariate analysis and regression present one of the main tools in the analysis of measured data, with applications in quality control, data compression, forecasting of variables in highly complex systems, and more recently, model optimization which enable description and behavior prediction of such systems. Although the mathematical apparatus for multivariate analysis was developed in the early 20th century, full flourishing of these methods is recorded in parallel with the development and availability of the latest generation computers.
The aim of the present thesis is to investigate the applicability and effectiveness of different multivariate analysis methods for deconvolution of spectra in the near-infrared region of electromagnetic radiation (NIR), measured for a three-component mixture of glucose, fructose and sucrose. The emphasis is on regression techniques that allow the precision and accuracy validation both for the fitted model as well as the prediction of the response variable. The most important feature of these techniques is that regression provides the possibility of self consistent calibration, that is, determination of the calibration parameters through calibration model optimization. Due to the complexity of NIR spectra, for the application of all investigated methods, it is necessary to carry out the pre-processing of the measured data. Most of the applied regression methods, thus principal component analysis (PCA), ridge regression, principal component regression (PCR), partial least squares regression (PLS), and artificial neural networks, include variable selection or data reduction step in model fitting.
The characteristics of different methods for NIR spectra pre-processing and model fitting, and their efficiency for the quantitative analysis of the aforementioned compounds in their mixture, were investigated and compared. Ridge regression was shown to be the most effective, for which repeated cross validation showed out-of-sample error of only 0.63±0.08%. The results and conclusions of the investigated NIR spectra analysis methods are applicable in practice for a rapid and efficient determination of chemically similar compounds in their mixtures, both in industrial and scientific research environments
Molekularni procesi u patogenezi Alzheimerove bolesti: strukturalne analize membranske proteaze gama-sekretaze metodama molekularne dinamike
No full textAlzheimer`s disease is the most expensive condition for
health care providers in the industrialized nations. The pathogenic
processes are most often associated with changes in metabolism of
amyloid precursor protein, most notably to the function of the membrane
embedded protease gamma-secretase. In the last twenty years more than
a hundred different therapeutic approaches that target amyloid
metabolism and gamma-secretase have failed. Some therapies have even
enhanced the cognitive decline characteristic associated with the disease.
Future drug-development efforts depend on insights into gamma-
secretase structure and function.
Experimental: Gamma-secretase structures at 3.4 Å resolution were
analyzed using multiscale molecular dynamic approaches and electrostatic
calculations.
Results: Gamma-secretase can guide its long amyloid peptides into its
active site by its nicastrin domain. The substrate is then processively
cleaved by penetration of its negatively charged C-terminal through the
enzyme active site, which is dominated by the negatively charged Asp257
and Asp385. The high density of negative charges in the hydrophobic
protein interior leads to highly dynamic structural changes in the residues
250-280 and residues 375-390. These highly flexible regions can stabilize
different electrostatic interactions, by forcing Asp257 or Asp385 to interact
with Lys380 and the N-terminus of the cleavage residue peptide. These
highly flexible motions are also affected by disease-causing mutations.
Similar to the disease-causing mutations classic aspartic protease
inhibitors could block dynamic structural changes in the active site and
lead to interruption of the processive cleavages. All cases of interrupted
cleavages result in potentially toxic accumulation of hydrophobic amyloid
proteins in the cell membrane.
Conclusion: Molecular dynamics studies have revealed unique functional
changes in gamma-secretase structure that cannot be visualized in static
measurements of protein structure. Some of the conformational changes
presented in the enzyme substrate complex could be targeted in the
future as novel drug design strategies.Alzheimerova bolest je najskuplja bolest za zdravstveni sektor
u industrijaliziranim zemljama. Patogeni procesi najčešće su povezani s
promjenama u metabolizmu prekursora proteina amiloida, te ponajviše s
funkcijom membranske proteaze, gama-sekretaze. U posljednjih dvadeset
godina više od stotinu različitih terapijskih pristupa koji ciljaju
metabolizam amiloida i gama-sekretazu nisu uspjeli. Neke su terapije čak
olakšale i ubrzale kognitivni pad karakterističan za bolest. Budući pokušaji
za razvoj lijekova ovise o uvidu o funkciji i strukturi gama-sekretaze.
Eksperimentalno: Strukture gama-sekretaze, s razlučivošću od 3,4 Å,
analizirane su korištenjem različitih molekularno-dinamičkih pristupa i
elektrostatskih proračuna.
Rezultati: Gama-sekretaza može voditi duge amiloidne peptide prema
svom aktivnom mjestu, pomoću svoje nikastrinske domene. Supstrat se
zatim postepeno cijepa sa prodiranjem svojeg negativno nabijenog C-
terminala kroz aktivno enzimsko mjesto, u kojemu dominira negativan
naboj sa strane Asp257 i Asp385. Visoka gustoća negativnih naboja u
unutrašnjosti hidrofobnog proteina dovodi do izrazito dinamičnih
strukturnih promjena u aminokiselinskim ostacima 250-280 i 375-390.
Ova visoko fleksibilna regija može stabilizirati različite elektrostatičke
interakcije, prisiljavajući Asp257 ili Asp385 na interakciju s Lys380 i N-
terminalnim krajem peptida nastalog cijepanjem. Na ove vrlo fleksibilne
pokrete utječu i mutacije koje uzrokuju bolest. Slično mutacijama koje
izazivaju bolest, klasični inhibitori aspartatne proteaze mogu blokirati
dinamičke strukturne promjene na aktivnom mjestu i dovesti do prekida
procesivnog cijepanja. Svi slučajevi prekida cijepanja dovode do
potencijalno toksičnog nakupljanja hidrofobnih amiloidnih proteina u
staničnoj membrani.
Zaključak: Studije molekularne dinamike otkrile su jedinstvene
funkcionalne promjene u strukturi gama-sekretaze koje se ne mogu
vizualizirati pri statičkim mjerenjima strukture proteina. Neke od
predstavljenih konformacijskih promjena u kompleksu enzim-supstrat
mogu se ubuduće ciljati kao nove mete za dizajn lijekova
Razvoj i optimiranje protokola za pripremu uzoraka te metoda za instrumentalnu analizu pršuta i bijelih vina u svrhu kontrole kvalitete i karakterizacije
No full textThis doctoral thesis gives a detailed and critical overview of registration and compliance control processes for products registered under the EU quality schemes. Especially, currently used analytical methods and contemporary mass spectrometry (MS)-based molecular approaches, with the high potential of implementation in the food authenticity assessment, are presented along with their strengths and weaknesses. The lack of standardized guidelines and robust analytical methods has been noticed. Therefore, in this thesis, as part of the original experimental research, robust MS-based analytical methods and corresponding sample preparation workflows have been optimized, namely (i) absolute label-free quantification (LFQ) of proteins by high definition mass spectrometry (HDMSE) method, (ii) matrix-assisted laser desorption/ionization (MALDI) mass spectrometry imaging (MSI) for detection of peptide profiles, (iii) gas chromatography mass spectrometry (GC-MS) for quantitative assessment of amino acids and (iv) MALDI time of flight (TOF) MS fingerprinting method for detection of wine fingerprints. In the analysis of analytical data, the chemometric methods, such as the principal component analysis (PCA), were applied. Optimized experimental and data processing settings were, for the first time, successfully implemented for: (a) the comprehensive characterization and the assessment of variability in quality traits for Protected Designation of Origin (PDO) “Istarski pršut/Istrski pršut”, authentic Croatian ham, (b) the differentiation of dry- and smoke-cured hams with different production technologies and (c) the classification of Croatian white wines. The herein optimized MS-based methods and protocols could potentially be implemented in the food authentication, the comprehensive characterization of dry-cured hams and the classification of white wines, which are already present on the market. The variability in quality traits for PDO “Istarski pršut/Istrski pršut” has been confirmed, therefore, further standardization of production is needed. Increased concentrations for lipophilic amino acids are the specificity of dry-cured hams produced without skin or with prolonged processing time, while the increased concentration of alanine could be a potential marker for the unique production of PDO “Istarski pršut/Istrski pršut”.Prošireni sažetak:
Doktorski rad daje detaljan i kritički pregled procesa registracije i kontrole usklađenosti za proizvode registrirane u okviru shema kvalitete Europske Unije. Prikazane su trenutno korištene metode analize, zajedno s njihovim snagama i slabostima, kao i suvremeni molekularni pristupi utemeljeni na spektrometriji masa (MS) s visokim potencijalom provedbe u procjeni autentičnosti hrane. Uočen je nedostatak standardiziranih smjernica i robustnih metoda analize za kontrolu kvalitete autentičnih prehrambenih i poljoprivredno-prehrambenih proizvoda.
Osnovna hipoteza istraživanja je da se osjetljivi i visoko propusni analitički pristupi i metode mogu koristiti u provjeri autentičnosti prehrambenih i poljoprivredno-prehrambenih proizvoda. Specifično:
1. Varijabilnost u svojstvima kvalitete, za pršute proizvedene prema zaštićenoj recepturi, može se karakterizirati analizom kemijskog sastava, teksturalnih svojstava i jedinstvenih molekularnih profila bjelančevina, peptida i aminokiselina prisutnih u pršutima. Instrumentalne metode analize temeljene na MS optimalne su za procjenu molekularnih profila.
2. Svako bijelo vino ima reprezentativni molekularni otisak koji se može detektirati pomoću instrumentalnih metoda analize temeljenih na MS. Potonji doprinosi klasifikaciji bijelih vina.
Opći cilj (svrha) doktorske disertacije jest poboljšanje mehanizama i alata za provjeru autentičnosti prehrambenih i poljoprivredno-prehrambenih proizvoda.
Specifični ciljevi istraživanja ove doktorske disertacije bili su sljedeći:
1. Unapređenje postojećih protokola za procjenu teksturalnih svojstava pršuta uz pomoć instrumentalnih metoda analize;
2. Razvoj robusnih metoda analize i pristupa, temeljenih na MS, za ciljanu kvalitativnu i kvantitativnu analizu bjelančevina i aminokiselina pršuta;
3. Razvoj robusnih metoda analize i pristupa, temeljenih na MS, za ciljanu kvalitativnu analizu peptida pršuta;
4. Razvoj brzih metoda analize, temeljenih na MS, za neselektivne analize molekularnih profila vina;
5. Sveobuhvatna karakterizacija ZOI „Istarski pršut/Istrski pršut“ kako bi se naknadno procijenila varijabilnost u kvaliteti;
6. Određivanje profila (slobodnih) aminokiselina pomoću GC-MS metode za nekoliko nedimljenih i dimljenih pršuta s različitim i zaštićenim tehnologijama proizvodnje u svrhu klasifikacije;
7. Određivanje neselektivnog molekularnog profila nekoliko hrvatskih bijelih vina pomoću MALDI MS metode za potrebe klasifikacije bijelih vina.
Postupci:
Kao dio originalnog eksperimentalnog istraživanja u ovom doktorskom radu, optimirana je instrumentalna metoda za određivanje teksturalnog profila pršuta te odgovarajući postupci pripreme uzoraka i metode analize temeljene na MS: apsolutna kvantifikacija proteina bez označavanja (LFQ) metodom visoke razlučivosti (HDMSE), metoda matricom potpomognuta ionizacija laserskom desorpcijom (MALDI) za molekularno oslikavanje (MSI) peptidnih profila, plinska kromatografija s detektorom masa (GC-MS) za kvantitativnu analizu aminokiselina i neselektivna MALDI MS metoda za detekciju ukupnog molekularnog profila bijelih vina. U analizi prikupljenih analitičkih podataka primijenjeni su kemometrijski postupci, poput metode analize glavnih komponenata (PCA).
Rezultati:
U ovom doktorskom radu optimirani eksperimentalni postupci i metode u sinergiji sa kemometrijskim metodama po prvi puta su uspješno primijenjeni za sveobuhvatnu karakterizaciju i procjenu varijabilnosti u svojstvima kvalitete za ZOI „Istarski pršut/Istrski pršut“, autentični hrvatski pršut koji se proizvodi prema zaštićenoj recepturi. Nadalje, provedena je klasifikacija: 1. nedimljenih i dimljenih pršuta s različitim, zaštićenim proizvodnim tehnologijama i 2. nekoliko hrvatskih bijelih vina.
Zaključci:
Potvrđena je varijabilnost u kvaliteti za ZOI „Istarski pršut/Istrski pršut“, stoga je potrebna daljnja standardizacija proizvodnje. Povećane koncentracije lipofilnih aminokiselina specifičnost su pršuta proizvedenih bez kože ili s produženim vremenom obrade, dok bi povišene koncentracije alanina mogle biti potencijalni marker za jedinstvenu zaštićenu proizvodnju ZOI “Istarski pršut/Istrski pršut”. Primijenjene brze i precizne metode bazirane na MS u sinergiji s kemometrijskim postupcima imaju visok potencijal primjene u rutinskoj kontroli autentičnosti prehrambenih i poljoprivredno-prehrambenih proizvoda
Izolacija i karakterizacija probiotičkih bakterija iz sive medonosne pčele (Apis mellifera carnica)
No full textMedonosne pčele, u svojem probavnom traktu skrivaju bogatu mikrobnu zajednicu koja se nizom adaptacija prilagodila tom okolišu. Mikrobiota pčele živi u mutualističkoj vezi sa svojim domaćinom. Pomaže domaćinu da razgradi šećere iz nektara, stimulira imunosni sustav domaćina, izlučuje antimikrobne spojeve i potiče rast u razvoj domaćina iz rane faze. Postoji sve više dokaza koji ukazuju da je uloga mikrobiote kritična za zdravlje pčele i produktivnost cijele košnice. Metagenomsko sekvenciranje potvrdilo je da su bakterije mliječnog vrenja koje pripadaju rodu Lactobacillus najbrojniji pripadnici mikrobiote pčele. Te bakterije imaju visok stupanj adaptacije na okoliš u kojem žive te se po nekoliko karakteristika ističu od ostalih pripadnika roda Lactobacillus. Neke od glavnih karakteristika su: tolerancija na visok osmotski tlak i preferencija za fruktozu kao glavni izvor energije. U ovom radu napravljena je izolacija, pomoću MRS medija selektivnog za Laktobacile, bakterija mliječnog vrenja koje pripadaju rodu Lactobacillus iz probavnog trakta iz Kranjske pčele (Apis mellifera carnica) lociranih na autohtonom staništu na području zapadne Hrvatske (Gorski Kotar). Ukupno je izolirano 16 sojeva mikroba, 6 od kojih je bilo katalaza-negativno. 3 katalaza-negativna soja su uspješno identificirana na razini roda kao Lactobacillus pomoću metode MALDI-TOF MS. Sojevi A6, A10 i A15 pokazali su visok stupanj tolerancije na visoki osmotski tlak, i utvrđen je rast u broju vijabilnih stanica bakterija unutar 72 sata. Ova 3 izolata po karakteristikama odgovaraju nativnoj mikrobioti probavnog trakta pčele, no potrebno je provesti detaljnije analize poput sekvenciranja genoma ovih izolata kako bi se utvrdile bakterijske vrste i genetska srodnost s drugim sojevima.Honeybees harbor a specialized, host-adapted microbial community in their digestive system. This honeybee microbiota lives in a mutualistic relationship with its host and helps the host digest trace sugars found in nectar, degrades polysaccharides found in pollen, stimulates the host’s immune system, excretes antimicrobial compounds which ward off pathogens and promotes host growth and development. There is growing evidence that this microbiota plays an indispensable role in maintaining individual honeybee health and consequently the health as well as productivity of the entire beehive. Metagenomic sequencing has confirmed that Lactic acid bacteria of the genus Lactobacillus are the most abundant members of the native honeybee microbial community and that they have a high degree adaptation to the niche environment of the honeybee gut that distinguishes them from other Lactobacillus species in the same genus. The most prominent adaptations are good tolerance to high osmotic pressure and fructose, as opposed to glucose, as the preferred energy source. The present study attempted to isolate, using MRS medium selective for Lactobacilli, lactic acid bacteria belonging to the genus Lactobacillus from the digestive tract of Carniolan honeybees (Apis mellifera carnica) in their native habitat of western Croatia. In total, 16 microbial isolates were obtained, 6 of which were catalase negative. 3 of these were successfully identified on the genus level as Lactobacilli using MALDI-TOF MS. These 3 bacterial isolates (A6, A10, A15) also showed a good degree of osmotic tolerance with growth observed in sugar syrup solution during 72 hours. The observed characteristics of these 3 isolates correspond to the expected adaptations to honeybee gut environment and the likelihood is high that they are indeed members of honeybee native microbiota
Provođenje supstrata preko prijelaznog protein-protein kompleksa: : Slučaj D-gliceraldehid-3-fosfat dehidrogenaze i L-laktat dehidrogenaze
No full textNADH channeling from D-Glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase (GAPDH) to L-Lactate dehydrogenase (LDH) can regulate the major metabolic pathways. We have investigated possible NADH channeling from GAPDH to LDH isozymes using enzymes from different cells
Numerous non-computational experimental data has shown that NADH is channeled through GAPDH to LDH through a transient protein complex: analytical ultracentrifugation and enzyme-kinetics studies showed that GAPDH molecules can channel their NADH substrate to LDH molecules via a transient LDH-GAPDH complex. Michaelis–Menten constants for LDH activity in channeling and diffusive reactions depend on the extent of GAPDH saturation with NADH substrate. Different molecular dynamics approaches (all-atom and coarse-grained models) showed that LDH and GAPDH tetramers can form a complex that breaks down when the enzymes are saturated with NADH molecules. LDH and GAPDH tetramers form a complex that can simultaneously support channeled and diffusive reactions as a part of a large supramolecular complex. The interaction sites are conserved between LDH isozymes from heart and muscle, and between GAPDH molecules from rabbit and yeast cells. Positive electric fields between the NAD(H) binding sites in LDH and GAPDH tetramers showed that NAD(H)-channeling within the LDH-GAPDH complex can be an extension of NAD(H)-channeling between the adjacent subunits in each tetramer.Provođenje NADH substrata od D-gliceraldehid-3-fosfat dehidrogenaze (GAPDH) do L-laktat-dehidrogenaze (LDH) može regulirati glavne metaboličke puteve. Istražili smo mogući naćin prosljiđivanja NADH kroz ova dva enzima, koristeći I enzime iz raznih organizama.
Brojni ne-računalni podaci upućuju na prosljeđivanje NADH kroz tranzicijski protein kompleks LDH i GAPDH. Studije analitičke ultracentrifugacije i enzimske kinetike upućuju na mogucnost proslijediivanja NADH od GAPDH do LDH preko takvog kompleksa, a Michaelis-Menten konsante za aktivnost LDH u reakcijama vodjenim difucijom I reakcijama vodjenim proslijedjivanjem substrata, pokazuju ovisnost o zasicenosti GAPDH sa NADH substratom. Različite tehnike računalne molekularne dinamike (all-atom i coarse-grained modeli molekularne dinamike) prikazuju kompleks ova dva enzima koji se raspada zasićenjem sa NADH. LDH i GAPDH mogu provoditi reakcije vođene difuzijom i vođene proslijeđivanjem substrata kao dio višemolekulskog kompleksa. Interaktivna mjesta su očuvana izmedju izoenzima LDH iz srca i mišića sisavaca, te GAPDH iz sisavca (zec) i pekarskog kvasca. Pozitivni električni naboj izmedju NADH vezujućih mjesta ova tetramera LDH i GAPDH pokazuju kako proslijeđivanje NADH moze biti proširenje modela koji govori o proslijeđivanju istog substarta medju susjednim podjedinicama svakog tetramera
Construction of plasmid pINFUSE-m04
No full textHumani citomegalovirus (HCMV) je široko rasprostranjeni virus koji, nakon primarne infekcije, uspostavlja latentnu infekciju i doživotno se zadržava u organizmu domaćina. Razlog zbog kojeg organizam domaćina nije u mogućnosti u potpunosti eliminirati virus i na taj način razriješiti infekciju leži u činjenici da genom HCMV-a, kao i drugih citomegalovirusa (CMV-a), kodira za brojne proteine koji suprimiraju imunološki odgovor. Budući da je HCMV visoko specifičan za vrstu i ne može inficirati životinjske stanice, za istraživanje CMV infekcije i imunološkog odgovora na istu se kao model najčešće koristi infekcija miševa mišjim citomegalovirusom (MCMV), čiji genom također kodira za brojne imunoevazine homologne onima za koje kodira genom HCMV-a. Jedan od imunoevazina MCMV-a, protein m04, tijekom infekcije odvodi dio molekula MHC I na površinu inficirane stanice, čime se stanicama NK otežava detekcija i uklanjanje inficiranih stanica. Budući da molekularni mehanizmi kojima protein m04 djeluje na molekule MHC I još uvijek nisu dovoljno razjašnjeni, u ovom je radu konstruiran ekspresijski vektor za ekspresiju proteina m04 u stanicama sisavaca, čime će se omogućiti istraživanje proteina m04 u nativnom obliku izvan konteksta virusne infekcije.Human Cytomegalovirus (HCMV) is a widespread virus that establishes a latent infection after a primary one and is permanently retained in the host organism. The reason the host organism is not able to obliterate the virus and resolve the infection lies in the fact that the HCMV genome and other cytomegaloviruses (CMVs) encode for numerous proteins that suppress the immune response. Considering HCMV is highly species-specific and cannot infect animal cells, the most commonly used model for the CMV infection and immune response research is the murine infection by the murine cytomegalovirus (MCMV) virus, whose genome also encodes for the immunoevasins homologous to those encoded by HCMV genome. One of the MCMV immunoevasins, m04 protein, draws part of the MHC I molecules on the surface of the infected cell during the infection, hence the NK cells are unable to detect and remove the infected cells. An expression vector for expressing m04 proteins in mammalian cells has been constructed in this paper, which will enable the study of protein m04 in native form outside the context of viral infection, since the molecular mechanisms, which the MHC I molecules are affected by m04 protein, have not yet been sufficiently clarified
Effect of dopaminergic system on psychostimulant – induced neural plasticity
No full textDopaminski nagrađujući put je evolucijski očuvana struktura mozga čija je uloga procesuiranje primarnih bioloških nagrada kao što su hrana, reprodukcija, socijalne interakcije te stvaranje percepcije zadovoljstva. Kratkoročna stimulacija psihostimulansima zadržava dopamin u sinaptičkoj pukotini i remeti homeostatske mehanizme što onemogućuje normalnu funkciju dopaminskog sustava. Dugoročna stimulacija potiče dugotrajne promjene na molekularnoj razini uključujući promjene u ekspresiji gena te u funkciji i morfologiji neurona.
Neuralna plastičnost je proces reorganizacije neurona koji se javlja kao posljedica dugoročne stimulacije dopaminskih receptora. Promjene koje se odvijaju prilikom kronične izloženosti psihostimulansima su smanjena ekspresija D2 dopaminskih receptora i transportera te promjene u biokemijskom sastavu neurona. Takve promjene mogu se pratiti i mjeriti eksperimentalnim metodama poput uvjetovane preferencije mjesta, samoadministracije i bihevioralne senzitizacije.
Ulogu u funkcionalnoj plastičnosti imaju transkripcijski faktori CREB (engl. cAMP response element binding protein) i ΔFosB (engl. DeltaFosB) koji posreduju stvaranju tolerancije i senzitizacije vezanih uz povećanu samoadministraciju droge. Smanjenjem transmisije dopamina u NAc (engl. nucleus accumbens) CREB smanjuje senzitizaciju i potiče samoadministraciju droge negativnim potkrepljenjem. Aktivacija ΔFosB povećava senzitizaciju i potiče samoadministraciju droge i primarnih nagrada pozitivnim potkrjepljenjem. Ulogu u morfološkoj plastičnosti imaju neurotrofični faktori kao što je BDNF (engl. brain derived neurotrophic factor), ali i mala nekodirajuća miRNA (engl. micro ribonucleic acid) gdje miRNA-212 utječe na proizvodnju neurotrofičnih faktora i signalizaciju cAMP-a čime indirektno regulira administraciju kokaina.The dopamine reward pathway is an evolutionarily conserved brain structure that has a role in processing primary biological rewards such as food, reproduction, social interactions and creating perception of pleasure. Short-term stimulation with psychostimulants retains dopamine in the synaptic cleft and disrupts homeostatic mechanisms, which impairs normal function of the dopamine system. Long-term stimulation promotes longlasting changes at the molecular level, including changes in gene expression and neuronal function and morphology.
Neural plasticity is a process of neuronal reorganization that occurs as a consequence of a long-term stimulation of dopamine receptors. Changes that occur during chronic exposure to psychostimulants are decreased expression of D2 dopamine receptors and transporters as well as changes in the biochemical composition of neurons. Those changes can be monitored and measured by experimental methods such as conditioned place preference, self-administration and behavioral senzitization.
Transcriptional factors CREB (cAMP response element binding protein) and ΔFosB (DeltaFosB) play a role in functional plasticity and mediate tolerance and senzitization related to increased drug self-administration. By reducing dopamine transmission to the NAc (nucleus accumbens), CREB reduces senzitization and promotes drug self-administration by negative reinforcement. Activation of ΔFosB enhances senzitization and promotes self-administration of drugs and primary rewards by postitive reinforcement. Neurotrophic factors, such as BDNF (brain-derived neurotrophic factor), but also small non-coding miRNA (micro ribonucleic acid) play a role in morphological plasticity. miRNA-212 has also been shown to influence the production of neurotrophic factors and signalization of cAMP, that indirectly regulates cocaine administration
Investigation of atmospheric deposition impacts on the sea surface biochemistry
No full textCilj ovoga rada je ispitati utjecaj simulacije atmosferskog taloženja na biodostupnost atmosferskih hranjivih tvari te svojstava izlučenog otopljenog organskog materijala s naglaskom na lipidnom materijalu tijekom rasta morske dijatomeje Chaetoceros pseudocurvisetus na 20 °C. Eksperiment je proveden kroz tri serije uzgoja u triplikatu: I) kontrolna skupina (K) koja je simulirala stanje oligotrofnog mora prosječnih godišnjih koncentracije nitrata na području srednjeg Jadrana (koncentracija nitrata 18 mM); II) kontrolna skupina inkubirana dodatkom nitrata do 42.2 mM (KN); i III) kontrolna skupina inkubirana dodatkom vodene otopine atmosferskih aerosola urbanog područja do koncentracije nitrata 42.2 mM (KA). Srednji specifični prirast stanica iznosio je 2.4 d-1 (dan) za K, 2.8 d-1 za KN te 2.7 d-1 za KA uzgoj. Istovremeno s porastom abundancije stanica zamijećeno je i smanjenje koncentracija hranjivih soli (nitrata, amonijevih soli i fosfata) kod svih skupina. Dobra korelacija zamijećena je između srednje vrijednosti abundancije i koncentracija partikularnog organskog ugljika (POC) (K r=0.976; KN r=0.909; KA r=0.980). Značajni porast koncentracija otopljenog organskog ugljika (DOC) zamijećen je tijekom eksponencijalne faze rasta u KA (13.1%) naspram K (5.9%) i KN (8.6%). Od četvrtog dana, kod K i KA zamijećene su značajno više vrijednosti DOC/stanica u odnosu na KN. U isto vrijeme je došlo i do značajnog porasta koncentracije otopljenih lipida (DLip) te DLip/stanica za K i KA u odnosu na KN. Lipidne klase kao biomarkeri stresa stanica značajno su bile više u K, povišene u KA, dok su najniže bile u KN uzgoju. Ovim radom je pokazano da: I) dušikove soli atmosferskog porijekla su biodostupne i primarno utječu na porast abudancije stanica C. pseudocurvisetus u N-limitirajućim uvjetima; II) sastavnice atmosferskog aerosola utječu na kvantitetu i kvalitetu izlučene otopljene organske tvari tijekom rasta C. pseudocurvisetus ; i III) promjena kvalitete otopljenog lipidnog materijala tijekom uzgoja ukazuje da sastavnice atmosferskih aerosola uzrokuju stanje okolišnog stresa za stanice dijatomeje C. pseudocurvisetus