Repository of the University of Rijeka, Department of Biotechnology
Not a member yet
715 research outputs found
Sort by
Immunotherapy of tumors with T-cells carryng chimeric antigen receptors
No full textTerapija T-stanicama s kimeričnim antigenim receptorima (CAR, prema engl. chimeric antigen receptors) je novi pristup u liječenju tumora. Trenutno dostupne terapije Kymriah i Yescarta namijenjene su liječenju B-staničnih leukemija pozitivnih na CD19, površinski antigen izražen na velikoj većini B stanica. Ovaj rad sadrži prikaz glavnih karakteristika CAR T-stanične terapije, njene prednosti i nedostatke te buduće perspektive. CAR korišten u obje navedene terapije je visoko specifičan za CD19, a građen je od antigen-specifičnog dijela teškog i lakog imunoglobulinskog lanca te T staničnih signalnih motiva. CAR T-stanice dobivaju se transduciranjem autolognih T-stanica periferne krvi bolesnika s virusnim vektorom koji nosi CAR sekvencu. CAR T-stanice ubijanje tumorskih stanica provode ispuštanjem citotoksičnih granula te uz pomoć liganada smrti i citokina. CAR T-stanična terapija pokazuje visoku stopu uspješnosti u kliničkim istraživanjima. Unatoč visokoj uspješnosti, za sada postoje samo dvije, gore navedene, terapije koje ciljaju isti antigen. Nuspojave CAR T-stanične terapije uključuju citokinu oluju i B staničnu imunodeficijenciju. Citokina oluja može biti blaga do opasna po život te može oštetiti razne organe. Za njeno liječenje se koriste imunosupresivni lijekovi poput anti-IL-6 antitijela i kortikosteroida. Neki od pristupa poboljšanja učinkovitosti terapije su izrada CAR T-stanica korištenjem ne-virusnih vektora, CAR T-stanice s proupalnim citokinima i više-antigenskom specifičnošću. Korištenjem novih antigen-specifičnih molekula, čija se specifičnost modulira ovisno o ciljnom antigenu, otvara se mogućnost djelovanja na veći spektar antigena i/ili tumora. Stoga, u budućnosti CAR T-stanična terapija ima potencijal postati šire korištena terapija.Chimeric antigen receptor (CAR) T-cell therapy represents a new approach to tumor treatment. Currently available therapies of Kymriah and Yescarta are intended for the treatment of CD19-positive B-cell leukemias, a surface antigen expressed on the majority of B cells. This thesis discusses the main characteristics of CAR T-cell therapy, its advantages and disadvantages, and future perspectives. The CAR used in both therapies is highly specific for CD19 and is composed of an antigen-specific part of the heavy and light immunoglobulin chains and T cell signaling motifs. CAR T-cells are obtained by transducing autologous peripheral blood T-cells with a viral vector carrying the CAR sequence. CAR T cells kill tumor cells by releasing cytotoxic granules and using death ligands and cytokines. CAR T-cell therapy has had a high success rate in clinical trials. Despite the high success rate, there are currently only two therapies, mentioned above, that target the same antigen. Side effects of CAR T-cell therapy include cytokine storm and B cell immunodeficiency. Cytokine storm can be mild to life-threatening and can affect a variety of organs. Immunosuppressive drugs, such as anti-IL-6 antibodies and corticosteroids, are used to treat cytokine storm. Some of the approaches used to improve the therapeutic efficacy are CAR T cell production using non-viral vectors, CAR T cells with proinflammatory cytokines and multi-antigen specificity. The use of new antigen-specific molecules, whose specificity is modulated depending on the target antigen, opens the possibility of acting on a wider range of antigens and/or tumors. Therefore, in the future CAR T-cell therapy has the potential to become a more widespread therapy
Innovation management in pharmaceutical industry
No full textFarmaceutska industrija jedan je od najvažnijih globalnih proizvodnih sektora. Međutim, zadnjih nekoliko desetljeća sve brži razvoj novih proizvoda, gubitak prihoda zbog isteka patentnih zaštita te stroža zakonska regulativa predstavljaju prepreke razvoja farmaceutske industrije. Farmaceutska industrija ulaže velike količine resursa u istraživanje novih lijekova. Stoga visoki troškovi često ograničavaju znanstvenike u provedbi procesa istraživanja i razvoja s ciljem otkrivanja novih molekula od interesa.
Kako bi se ostvarili prihodi koji će financirati istraživanje i razvoj novih lijekova farmaceutski proizvodi trebaju učinkovitu zaštitu intelektualnog vlasništva. Za postizanje gospodarskog i društvenog napretka u današnjem globaliziranom poslovnom svijetu ključne su inovacije. Inovacija lijekova obuhvaća intenzivno istraživanje koje sadrži znanje o mehanizmima koji pokreću proces otkrivanja i razvoja lijekova. Temelj konkurentske prednosti u farmaceutskoj industriji ogleda se u uspješnoj inovaciji te se osnovni proizvod farmaceutske industrije koncentrira na novoj molekuli. Cilj ovog rada je definirati pojam inovacija i proces upravljanja inovacijama u farmaceutskoj industriji te objasniti temeljne čimbenike koji uvjetuju konačan uspjeh. Budući da ekskluzivnost u korištenju znanja potiče ulaganja u inovacije objašnjeni su oblici intelektualnog vlasništva s naglaskom na patent kao najučinkovitiji oblik intelektualnog vlasništva u farmaceutskoj industriji. Konačno, provedena je i analiza trenutnog stanja u svijetu s naglaskom na Europu kao potvrda teorijskom dijelu i postavljenim hipotezama.The pharmaceutical industry is one of the world's most important manufacturing sectors. However, in the last few decades, the ever-faster development of new products, the loss of revenue due to the expiration of patents and strict legal regulations have been obstacles to the development of the pharmaceutical industry. The pharmaceutical industry is investing
large resources in the development of new drugs. Therefore, high costs often limit scientists to enter the process of research and development in the research of new molecules of interest. In order to generate revenue that will fund research and development of new drugs, pharmaceutical products will enable the protection of industrial property. Innovation is the key to achieving economic and social success in today’s globalized business world. Drug innovation involves intensive research that encompasses knowledge of the mechanisms that drive the process of drug discovery and development. The foundation of competitive advantage in the pharmaceutical industry lies in successful innovation and the basic product
of the pharmaceutical industry is concentrated on a new molecule. Therefore, the aim of this paper is to explain the concept of innovation and the process of innovation management in the pharmaceutical industry and to explain the fundamental factors that determine the final success. Since exclusivity in the use of knowledge encourages investment in innovation, forms of intellectual property are explained, with the focus on patent as the most effective form of intellectual property in the pharmaceutical industry. An analysis of the current situation in the world with the focus on Europe
was conducted in order to confirm both theoretical and analytical part, and defined research hypotheses
The effects of irinotecan and Δ-9-tetrahydrocannabinol on biochemical, hematological and molecular biological markers in wistar rats
No full textIrinotekan je najvažniji citostatik za liječenje uznapredovalog karcinoma debelog crijeva. Njegove nuspojave, osobito akutni i odgođeni kolinergički sindrom, značajno remete kvalitetu života bolesnika. S ciljem umanjivanja nuspojava, bolesnici često uzimaju dodatke prehrani, uključujući i ilegalne pripravke s Δ-9-tetrahidrokanabinolom (THC), koji katkad sadrže >80% THC-a. U ovom radu istraženi su toksičnost i međudjelovanja irinotekana i THC-a na staničnoj razini, razini organa te njihovi učinci na organizam štakora soja Wistar, integriranjem biokemijskih, molekularno-bioloških i analitičkih metoda. Rezultati istraživanja pružaju dokaze o sinergijskom povećanju akutne toksičnosti irinotekana testiranog u jednokratnoj i.p. dozi od 100 mg/kg pod utjecajem THC-a uzimanog per os u dozi 7 mg/kg tijekom jedan, tri i sedam dana. Istovremena primjena irinotekana i THC-a pojačava stupanj oksidacijskog stresa i genotoksične učinke irinotekana u stanicama jetre. U štakora koji su tretirani irinotekanom i THC-om uočen je trend pada broja leukocita u usporedbi sa skupinom koja je tretirana samo irinotekanom. Istodobna primjena THC-a s irinotekanom ubrzala je izlučivanje THC-a u urinu u usporedbi sa skupinom štakora koji su tretirani samo THC-om, što također upućuje na moguću interakciju ispitivanih spojeva. Metoda plinske kromatografije-spektrometrije masa (GC/MS) koja je razvijena i validirana u sklopu ovog doktorskog rada prikladna je za određivanje koncentracije THC-a i njegovih metabolita u urinu štakora jer je precizna, točna i osjetljiva. Nadalje, u ovome su istraživanju po prvi puta izmjerene razine primarnih oštećenja DNA izazvanih THC-om u tri različite vrste stanica štakora upotrebom metode alkalnog komet-testa i dokazano je da je stupanj genotoksičnosti najviši u stanicama mozga. Iz dobivenih rezultata zaključuje se da istovremeno uzimanje irinotekana i visokih doza THC-a dovodi do štetnih farmakokinetičkih i farmakodinamičkih učinaka. Premda se dobiveni rezultati ne mogu izravno primijeniti na čovjeka, oni upućuju na niz neželjenih i potencijalno opasnih nuspojava te potrebu za krajnjim oprezom pri uzimanju THC-a u onkoloških bolesnika.Irinotecan (IRI) is a chief cytostatic used in the treatment of advanced colon cancer. Some of its side effects as acute and delayed cholinergic syndrome deteriorate quality of patients’ life. To improve their overall wellbeing, patients often use various supplements, including illegal Δ-9-tetrahydrocannabinol (THC) preparations, sometimes with >80% THC. This dissertation investigated the interactions of IRI and THC at the cellular level, organ level and their effects on the Wistar rat organism by integrating biochemical, molecular biology and analytical methods. The obtained results provide evidence of a synergistic increase in the acute toxicity of irinotecan tested at single i.p. dose of 100 mg/kg under the influence of THC taken per os at a daily dose of 7 mg/kg for one, three and seven days. Concomitant administration of irinotecan and THC enhances the degree of oxidative stress and genotoxic effects of irinotecan in liver cells. In rats given the combined treatment, a lowering of leukocyte counts was observed compared with the group treated with single irinotecan. Concomitant administration of THC with irinotecan enhanced the urinary excretion of THC compared with the group of rats treated with single THC, also suggesting a possible interaction of the tested compounds. The gas chromatography-mass spectrometry (GC-MS) method proposed within this study is precise, accurate, and sensitive and therefore acceptable for the quantification of THC and its metabolites in rat urine. Furthermore, in this study, the levels of primary DNA damage caused by THC in three different types of rat cells were measured for the first time using an alkaline comet assay, and genotoxicity was shown to be highest in brain cells. From the results obtained, it is concluded that concomitant administration of irinotecan with high doses of THC leads to adverse pharmacokinetic and pharmacodynamic effects. Although the results obtained cannot be directly extrapolated to humans, they indicate a number of undesirable and potentially dangerous side effects and the need for extreme caution in the administration of THC in oncology patients
BODIPY Compouds Fluorescent Markers for Biomacromolecules and Phototherapeutics
No full textJedna od metoda liječenja raka je fotodinamička terapija koja se temelji na korištenju molekula koje apsorbiraju zračenje te prijenosom energije generiraju citotoksični singletni kisik. Međutim, stanice raka često su hipoksične što predstavlja glavnu
prepreku u uspješnosti terapije. U sklopu ovog doktorskog rada istraživan je drugačiji pristup u liječenju raka u kojem učinkovitost terapije ne ovisi o prisutnosti kisika. U sklopu ove doktorske disertacije sintetizirane su četiri klase novih
fluorescentnih BODIPY boja koje kao supstituent sadrže fotoreaktivnu skupinu iz koje se fotokemijskom reakcijom generiraju kinon-metidi (QM). BODIPY spojevi izvrsni su fluorofori zbog termičke i fotokemijske stabilnosti, apsorpcije vidljivog svjetla, velikih molarnih apsorpcijskih koeficijenata i kvantnih prinosa fluorescencije. Nadalje, QM-i su reaktivni intermedijeri u kemiji fenola koji reagiraju s nukleofilima, uključujući DNA i proteine. Stoga, fotopobuđivanjem netoksičnih BODIPY spojeva nastaju toksični QM-i. Fotofizička svojstva BODIPY spojeva istraživana su korištenjem stacionarne i vremenski ovisne fluorescencijske spektroskopije, dok je fotokemijska reaktivnost ispitivana osvjetljavanjem otopina spojeva u metanolu. Nastajanje produkata metanolize upućuje na nastajanje QM-a koji su detektirani korištenjem laserske pulsne fotolize. Primijećeno je i da fotogenerirani QM reagiraju s goveđim serumskim albuminom pri čemu se spojevi kovalentno vežu na protein, što se može primijeniti za vizualizaciju proteina u gel elektroforezi ili fluorescencijskoj mikroskopiji. Jedno od naših glavnih otkrića je da se fotoreakcije triju klasa spojeva odvijaju samo pri pobuđivanju u viša singletna pobuđena stanja, dok se iz S1 stanja deaktiviraju fluorescencijom. Ova neuobičajena anti-Kasha fotokemijska reaktivnost u potpunosti je razjašnjena računskim studijima na TD-DFT razini teorije. Koncept korištenja jedne valne duljine svjetlosti za fotoaktivaciju boje i vezanje spoja na protein te druge valne duljine za očitavanje fluorescencije vrlo je primjenljiv u razvoju fluorescentnih markera. Antiproliferativno djelovanje BODIPY boja istraženo je korištenjem MTT testa na humanim stanicama raka. Nakon tretiranja stanica BODIPY spojevima i zračenjem, neke su klase spojeva pokazale pojačanu aktivnost što ih čini potencijalnim lead molekulama za razvitak novih fototerapeutika u terapiji karcinoma.One method to treat cancer is photodynamic therapy, which is based on the use of molecules that absorb light and transfer excitation energy, forming reactive oxygen species responsible for the cytotoxic effects. However, cancer cells are often hypoxic causing obstacles in the success of the therapy. This PhD thesis features a new approach of cancer phototreatment that does not rely on oxygen. Four classes of new fluorescent BODIPY dyes were synthesized that
were substituted by photochemically reactive substituents, which in the photodeamination reaction deliver quinone methides (QMs). BODIPY dyes are excellent fluorophores owing to their thermal and photochemical stability, absorption of visible light, high molar absorption coefficients and fluorescence quantum yields. Furthermore, QMs are ubiquitous reactive intermediates in the chemistry of phenols that react with nucleophiles including DNA or proteins. Thus, photoexcitation of the BODIPY dyes, which are not cytotoxic, transforms them to cytotoxic QMs. Photophysical properties of the BODIPY dyes were investigated by steady-state and time-resolved fluorescence, whereas photochemical reactivity was probed by irradiations in methanol. Methanolysis products indicated formation of QMs, which were detected by laser flash photolysis.
Furthermore, we have shown that photogenerated QMs react with bovine serum albumin and induce covalent attachment to the protein, which can be used for the visualization in gel electrophoresis or microscopy. One of our major discoveries is that the photoreaction of four classes of molecules takes place only upon excitation to higher singlet excited states, whereas S1 states deactivate by fluorescence. This unusual anti-Kasha photochemical reactivity was fully elucidated by computations at the TD-DFT level of theory. This concept to use one wavelength of light to photoactivate the dye and attach it to protein, and other wavelength to read the fluorescence is highly applicable in the development of fluorescent sensors. Antiproliferative activity of the dyes was investigated by MTT tests on human cancer cells. Upon treatment of cells with the dyes and irradiation, some classes of dyes showed enhanced activity, rendering potential leads in the development of cancer phototerapeutics
Ekspresija markera matičnih stanica u primarnim staničnim kulturama te tkivnim prerezima živčanog tkiva mladih oposuma
No full textUnlike the adult mammalian central nervous system (CNS) that has limited capacity for regeneration, the immature mammalian CNS shows a unique ability to successfully regenerate after injury. Although regeneration studies have provided significant insight into the basic molecular mechanisms underlying CNS regeneration, the key differences between the organisms that can and cannot regenerate are still unknown. Monodelphis domestica, commonly known as the gray short-tailed opossum, is a unique preparation that offers an exceptional opportunity to study mammalian CNS regeneration, without a need for intrauterine surgery. Opossums are marsupials born at highly immature developmental stage, with the possibility to regenerate spinal cord after injury in the first two weeks of their lives. The aim of this thesis was to prepare and characterize two different preparations: CNS primary cultures and fresh-fixed spinal cord tissue from the opossums of different age, which can and cannot regenerate after injury. Characterization was performed using immunofluorescence to reveal differences in the cellular content and expression of markers related to regeneration with a focus on stem cells. Also, we tested two different plating mediums to examine the impact of the medium composition on cell growth and differentiation. Firstly, we confirmed that the expression of TUJ1, a neuron-specific marker and the stem/glial progenitor SOX9 is mutually exclusive. Secondly, we confirmed that SOX2 is a powerful tool for characterizing stem/progenitor cells through the CNS. Thirdly, we showed that the medium composition indeed affects cell growth and differentiation. Finally, in spinal cord intact tissue, we confirmed the localization of cells that co-express SOX2 and SOX9. In younger tissue, these cells are present along the central canal, while in older animal cells are scattered. The results of this study will help to develop the tools to study and characterize CNS stem cells that could be used in novel strategies to cure spinal cord injury.Za razliku od središnjeg živčanog sustava (SŽS) odraslog sisavca koji ima ograničeni kapacitet regeneracije, embrionalni SŽS sisavaca iskazuje jedinstvenu sposobnost uspješne regeneracije nakon ozljede. Iako su brojna istraživanja pružila značajan uvid u osnovne molekularne mehanizme koji su temelj regeneracije SŽSa, ključne razlike između organizama koji imaju te onih koji nemaju sposobnost regeneracije, još uvijek su neodređene. Monodelphis domestica, poznatiji kao kratkorepi sivi oposum, jedinstveni je model koji pruža izuzetnu priliku za proučavanje regeneracije SŽS sisavaca, bez potrebe za invazivnim operacijama. Oposumi su tobolčari koji se rađaju vrlo nerazvijeni, s mogućnošću potpune regeneracije leđne moždine tijekom prva dva tjedna života. Cilj ovog rada je bio pripremiti i karakterizirati dva različita preparata: primarne stanične kulture SŽSa i tkivne prereze leđne moždine oposuma različite starosti te različite sposobnosti regeneracije. Karakterizacija je provedena uporabom imunofluorescencije s ciljem otkrivanja razlika u staničnom sadržaju te ekspresiji biljega koji su povezani s regeneracijom, posebice biljega matičnih stanica. Također, testirali smo dva različita medija za nasađivanje kako bi ispitali utjecaj sastava medija na rast i diferencijaciju stanica. Potvrdili smo da se ekspresija TUJ1, specifičnog biljega neurona, te biljega matičnih/glijalnih prekursora SOX9 međusobno isključuje. Biljeg SOX2 istaknuo se kao snažan alat za karakterizaciju potencijalnih matičnih stanica u SŽSu. Testiranjem različitih medija pokazali smo da sastav medija doista utječe na rast i diferencijaciju stanica. Konačno, u tkivu leđne moždine oposuma različite dobi posebno se istaknula različita lokalizacija stanica koje eksprimiraju i SOX2 i SOX9. U tkivima mlađih oposuma prisutne su duž središnjeg kanala, dok su u tkivu starijih razasute naokolo. Ovi rezultati doprinjeti će razvitku alata za proučavanje i karakterizaciju matičnih stanica SŽSa, koje se mogu koristiti u strategijama liječenja ozljeda leđne moždine
Utjecaj metamfetamina na redoks status kod Drosophila melanogaster
No full textMethamphetamine (METH) is a psychostimulant that affects central nervous system by increasing the concentration of the free dopamine, whose oxidation leads to the permanent damage in the structure and function of neurons, as the consequence of the increased production and accumulation of the radical oxygen species (ROS).
By using Drosophila melanogaster as a model organism we have tested impact of an acute dose of volatilized METH (vMETH) on the concentration of hydrogen peroxide (H2O2), in the brain, as one of the ROS and redox status representative. Individual flies of wild type strain CantonS (wt) used in the experiment were exposed to vMETH using the FlyBong method. The concentration of H2O2 was measured in the head tissue extracts, 10 hours after the administration, using dihydroetidium florescent dye. The results have shown that the acute exposure to vMETH does not lead to the change in the concentration of H2O2 in the wt flies compared to the control group.
Considering that research have shown connection between administration of the METH and increased expression of period (per) gene with enzyme activity of tyrosine hydroxylase, included in the synthesis of dopamine, I tested whether there is a difference in the concentration of H2O2 after the acute exposure to vMETH between different circadian mutants and wt flies. Circadian mutants of genes per, timeless (tim), Clock (Clk) and cycle (cyc) with alleles per01, tim01, ClkJrk and cyc01 were used in the experiment. per01 and tim01 flies showed the decreased concentration of H2O2 compared to the controls while ClkJrk and cyc01 flies had higher concentration of H2O2 after the acute exposure to vMETH. The concentration of H2O2 is significantly lower in tim01 flies compared to wt flies after the exposure to vMETH while cyc01 flies had a significantly higher concentration than wt flies.
Based on the results of this thesis, we suggest the influence of circadian genes on the endogenous concentration of H2O2, which is in the absence of per or tim increased, and in the absence of Clk or cyc decreased compared to wt. The administration of vMETH potentiates the production of H2O2 in the absence of cyc while the absence of tim gene attenuates that effect. The lack of difference in wt flies is surprising and possible mistakes in the method or its use should be considered. By establishing the molecular pathways involving H2O2 and circadian genes new methods for treatment of addiction could be developed.Metamfetamin (METH) je psihostimulans koji utječe na središnji živčani sustav povećavajući koncentraciju slobodnog dopamina, čija oksidacija uzrokuje trajna oštećenja strukture i funkcije neurona kao posljedicu povećane proizvodnje i akumulacije slobodnih kisikovih radikala (ROS-a).
Korištenjem Drosophile melanogaster kao modelnog organizma istražen je utjecaj akutne doze volatiliziranog METH-a (vMETH) na koncentraciju vodikovog peroksida (H2O2), u mozgu, kao jednog od predstavnika ROS-a i redoks statusa. U eksperimentu su korištene individualne mušice divljeg tipa CantonS (wt) izložene vMETH–u korištenjem FlyBong metode. Koncentracija H2O2 je mjerena u ekstraktima tkiva glava mušica 10 sati nakon administracije upotrebom dihidroetidij fluorescentne boje. Rezultati su pokazali da akutno izlaganje vMETH-u ne dovodi do promjene u koncentraciji H2O2 kod wt mušica u odnosu na kontrolu.
S obzirom na literaturno poznatu povezanost administracije METH-a s povećanom ekspresijom period (per) gena i aktivnosti enzima uključenog u sintezu dopamina, tirozin hidroksilaze, testirano je ima li razlike u koncentraciji H2O2 nakon akutne izloženosti vMETH-u između različitih cirkadialnih mutanata i wt mušica. Za eksperimente su korišteni cirkadialni mutanti u genima per , timeless (tim), Clock (Clk) i cycle (cyc) sa sljedećim alelima: per01, tim01, ClkJrk i cyc01. per01 i tim01 mušice su pokazale smanjenu koncentraciju H2O2 u odnosu na svoje kontrole, dok su ClkJrk i cyc01 mušice imale veću koncentraciju H2O2 nakon akutnog izlaganja vMETH-u. Koncentracija H2O2 je značajno niža kod tim01 mušica u usporedbi s wt mušicama nakon izlaganja vMETH-u, dok cyc01 mušice imaju značajno veću koncentraciju nego wt mušice.
S obzirom na rezultate ovoga rada predlažemo utjecaj cirkadialnih gena na endogenu koncentraciju H2O2 koja je u odsustvu per ili tim povećana, a u odsustvu Clk ili cyc smanjena u odnosu na wt. Administracija vMETH-a potiče proizvodnju H2O2 u odsustvu cyc dok odsustvo tim gena sprječava taj efekt. Nedostatak razlike kod wt mušica je iznenađujući te je potrebno razmotriti moguće pogreške u metodi ili njezinom provođenju. Utvrđivanjem molekularnih putova koji uključuju H2O2 i cirkadialne gene mogle bi se razviti nove metode liječenja ovisnosti o METH-u
Substrate Channeling via a Transient Protein-Protein Complex: The case of D-Glyceraldehyde-3-Phosphate Dehydrogenase and L-Lactate Dehydrogenase
No full textD-Gliceraldehid-3-fosfat dehidrogenaza (GAPDH) i laktat dehidrogenaza (LDH) tvore kompleks koji regulira metaboličke puteve. Međutim, mehanizam kojim se to odvija nije poznat. U ovom radu smo analizirali mogućnost prijenosa NADH sa GAPDH-NADH kompleksa na LDH izozime koristeći enzime iz raznih stanica. Proučavanje enzimske kinetike i vezanja NADH je pokazalo kako LDH može koristiti GAPDH-NADH kompleks kao supstrat. Aktivnost LDH sa GAPDHNADH kompleksom je provjerena sa LDH antitijelima kako bi pokazali da se reakcije međumolekularnog prijenosa i reakcije prijenosa zajedničkog liganda kroz otapalo odvijaju istodobno. Reakcija međumolekularnog prijenosa prevladava samo u slučajevima gdje su NADH koncentracije slične onima u citosolu. Metode molekularne dinamike su pokazale kako se prijelazne reakcije preko GAPDH-LDH kompleksa odvijaju isključivo pri nezasićenim NADH koncentracijama. Aktivna mjesta su očuvana između srčanih i mišićnih LDH izozima te između GAPDH molekula iz zeca I kvasca. Pozitivno električno polje između NADH vezajućih mjesta na LDH I GAPDH tetramerima je
pokazalo kako je prijenos NADH unutar GAPDH-LDH kompleksa, vjerojatno ekstenzija prijelaza NADH među podjediniciama unutar pojedinih tetramera. U slučaju kratkotrajnog (GAPDH-NADH)-LDH kompleksa zastupljenost reakcija međumolekularnog prijelaza NADH i prijenosa NADH kroz otapalo ovisi o poklapanju konstante odvajanja za (GAPDH-NADH)-LDH kompleks i
konstante odvajanja za GAPDH-NADH kompleks. Metabolički i molekularni inžinjering bi u budućnosti mogao koristiti međumolekularni prijenos supstrata za kontrolu metaboličkih puteva namiještajući afinitet vezanja supstrata za željene reakcijeske puteve.D-Glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase (GAPDH) and L-lactate dehydrogenase (LDH) can form a complex that can regulate the major metabolic pathways, however, the exact mechanism remains unknown. We analyzed a possibility of NADH-channeling from GAPDH-NADH complex to LDH isozymes using enzymes from different cells. Enzyme-kinetics and NADH-binding studies showed that LDH can use GAPDH-NADH complex as a substrate. LDH activity with GAPDH-NADH
complex was challenged with anti-LDH antibodies to show that the channeled and the diffusive reactions always take place in parallel. The channeling path is dominant only in assays with limiting free-NADH concertation that mimic cytosolic conditions. Analytical ultracentrifugation showed that the channeling does not require a high affinity complex. Molecular dynamics calculations and protein-protein interaction studies showed that LDH and GAPDH can form a leaky channeling complex only at subsaturating NADH concentrations. The interaction sites are conserved between LDH isozymes from heart and muscle, and between GAPDH molecules from rabbit and yeast cells. Positive electric fields between the NAD(H) binding sites on LDH and GAPDH tetramers, showed that NAD(H)-channeling within the LDH-GAPDH complex, can be an extension of NAD(H)-channeling between the adjacent subunits in each tetramer. In the case of a transient (GAPDH-NADH)-LDH complex, the relative contribution from the channeled and the diffusive paths depends on the overlap between off-rates for the transient (GAPDH-NADH)-LDH complex and off-rates for the GAPDH-NADH complex. Molecular evolution or metabolic engineering protocols can exploit substrate channeling for metabolic flux control by fine-tuning substrate-binding affinity for the key enzymes in the competing reaction paths
High Sensitivity DNA-Based Assays for the Detection of Seafood Species Substitution
No full textPorast potražnje za plodovima mora doveo je do čestih prijevara krivih navođenja podrijetla vrsta u ribolovnoj industriji što potencijalno financijski ili zdravstveno oštećuje potrošača. Uvođenje primjenjive metode za ispitivanje podrijetla vrste uvjetovalo bi smanjenje prijevara u ribolovnoj industriji. U ovom istraživanju ispitivali smo primjenu testova za određivanje vrsta na 15 uzoraka proizvoda plodova mora koji sadrže lignje (red: Chepalophoda) iz kojih je izdvojeno 82 primjerka korištenih u analizama. Potvrđena je mogućnost razlučivanja vrste Loligo vulgaris od ostalih vrsta komercijalno korištenih vrsta liganja računalnim analizama upotrebnom postojećih sljedova nukleotida regije COI iz javnodostupnih baza podataka te sljedova određenih iz referentnih uzoraka liganja vrsta Aloteuthis media i L. vulgaris korištenih u ovom radu. Djelatnici Nacionalnog instituta za biologiju (NIB) su proveli izotermalno umnažanje posredovano petljom (LAMP) specifično za vrstu L. vulgaris koji u trenutnoj fazi istraživanja nije pokazao primjenjivost. Proveli smo određivanje vrsta iz plodova mora upotrebom DNA barkodiranja sekvenciranih PCR produkata na temelju regija COI i 28S. DNA barkodiranja je provedeno formiranjem filogenetskog stabla Maximum likelihood metodom i Kimura 2-parametarskog modela u programu MEGA–X. Zaključujemo veću pouzdanost i primjenjivost regije COI u usporedbi s regijom 28S obzirom na veću uspješnost prilikom sekvenciranja, postojanja većeg broja referentnih sljedova u javnodostupnim bazama te jasnijeg razlučivanja vrsta statističkim analizama. Od 69 uspješno određenih vrsta plodova mora analiziranih u ovom istraživanju postoji 8,70% primjeraka kod kojih je prisutna prijevara zamjene vrsta. Neophodna je metaanaliza s velikim brojem primjeraka na razini cijelog slovenskog tržišta obzirom da su u ovom istraživanju analizirani relativno mali broj uzoraka na temelju kojih je teško procijeniti prisutnost prijevara na cijelom slovenskom tržištu.The increase in seafood demand resulted in frequent seafood frauds such as species mislabeling, which could lead to health risks or financial deprivation of consumers. Applicable assays for species identification would result in seafood fraud prevalence reduction in the fishing industry. In this study, we examined the application of high sensitivity DNA-based assays for the detection of species substitution for 82 specimens isolated from 15 seafood samples containing squid (order: Cephalopoda). Fragments of COI and 28S were used to assess whether commercially important species could be identified using DNA based approach. Pairwise intra- and inter-specific p-distances were assessed to determine the possibility of distinguishing L. Vulgaris from other commercially important squid species. We used COI sequences from publicly available databases and sequences determined from reference samples (A. media and L. Vulgaris species) in this study. Employees of the National Institute of Biology (NIB) performed loop-mediated isothermal amplification (LAMP) specific for L. Vulgaris, which showed no application at the current stage of the study. Phylogenetic analysis was performed as part of DNA barcoding by forming a maximum likelihood tree and a Kimura 2-parameter model in the MEGA–X program. We conclude greater reliability and applicability of the COI region compared to the 28S region, given the higher success in sequencing, the presence of a larger number of reference sequence data in publicly available databases, and a clearer distinction of species using the bootstrap method. Of the 69 successfully identified seafood species analyzed in this study, there are 8.70% of specimens in which species substitution fraud is present. A meta-analysis with a larger number of specimens from the entire Slovenian market is necessary, given that this research analyzed a relatively small number of samples based on which it is difficult to assess the presence of fraud in the entire Slovenian market
Optimisation of the method for measuring lipophilicity of tripyridylporphyrin
No full textOvaj rad daje pregled o metodama koje bi se mogle koristiti za mjerenje lipofilnosti tripiridilporfirina. Porfirini su potencijalno dobri fotosenzibilizatori koji se koriste u fotodinamičkoj terapiji jer imaju dobra fotofizička svojstva te im je sinteza jednostavna. Važnost ispitivanja lipofilnosti proizlazi iz toga što je odlika dobrog fotosenzibilizatora selektivnost na tumorske stanice, a na to utječe lipofilnost. Lipofilnost se mjeri kao distribucija molekule lijeka između organske faze (oktan-1-ol) i vodene faze izražena kao logP. Dakle, u radu se određivala vrijednost logP u različitim otapalima u usporedbi s referentnom vrijednošću oktan-1-ola i vode. Korištena su dva spoja: 5-(4-oktadekanamidofenil)-10,15,20-tris(1-oksido-3-piridil)porfirin i 5-(4-amidofenil)-10,15,20-tris(1-oksido-3-piridil)porfirin i šest različitih otapala koja su uključivala: metanol, butan-1-ol, oktan-1-ol, oktan-2-ol, PBS (engl.phpsphate buffer saline) i vodu. Eksperimentalni dio se sastoji od dva dijela. U prvom djelu je ispitivana topljivost ova dva navedena spoja u otapalima pomoću UV-Vis spektroskopije, dobiven je apsorpcijski spektar iz kojeg je onda izračunat molarni apsorpcijski koeficijent koji je u daljnjem postupku korišten za izračunavanje vrijednosti particijskog koeficijenta. Drugi dio eksperimenta uključivao je određivanje Rf vrijednosti pomoću tankoslojne kromatografije te upotrebu „shake-flask“ metode za konačno određivanje particijskog koeficijenta. Rezultati su pokazali da se ova dva spoja najbolje otapaju u butan-1-olu . i da je ovo otapalo, u kombinaciji s referentnim oktan-1-olom, optimalno za određivanje logP vrijednosti za tripiridilporfirine.This paper provides an overview of methods that could be used to measure the lipophilicity of tripyridylporphyrins. Porphyrins are potentially good photosensitizers used in photodynamic therapy because they have good photophysical properties and their synthesis is simple. The importance of lipophilicity testing stems from the fact that a good photosensitizer is characterized by selectivity for tumor cells, which is influenced by lipophilicity. Lipophilicity is measured as the distribution of a drug molecule between the organic phase (octan-1-ol) and the aqueous phase expressed as logP. Thus, the logP value in different solvents was determined in comparison with the reference value of octan-1-ol and water. Two compounds were used: 5- (4-octadecanamidophenyl) -10,15,20-tris (1-oxido-3-pyridyl) porphyrin and 5- (4-amidophenyl) -10,15,20-tris (1-oxido) -3-pyridyl) porphyrin and six different solvents which included: methanol, butan-1-ol, octan-1-ol, octan-2-ol, PBS (phpsphate buffer saline) and water. The experimental part consists of two parts. In the first part, the solubility of these two compounds in solvents was examined by UV-Vis spectroscopy, the absorption spectrum was obtained from which the molar absorption coefficient was then calculated, which was used in the further procedure to calculate the values of the partition coefficient. The second part of the experiment involved determining the Rf value by thin layer chromatography and using the shake-flask method to finally determine the partition coefficient. The results showed that these two compounds were best dissolved in butan-1-ol. and that this solvent, in combination with the reference octan-1-ol, is optimal for determining the logP value for tripyridylporphyrins
The importance of intellectual property in pharmaceutical industry
No full textSvjetsko stanovništvo i životni vijek u stalnom su porastu. Spas predstavlja razvoj novih lijekova i terapija. Razvoj novog lijeka i njegovo uspješno dovođenje na tržište rizičan je, dugotrajan i skup pothvat. Stoga, farmaceutske tvrtke snažno štite svoje patente širom svijeta dok im ne istekne zaštita. Ključna značajka farmaceutske proizvodnje je intelektualno vlasništvo. To se svodi na istraživačku farmaceutsku industriju jer se ona u velikoj mjeri oslanja na zaštitu intelektualnog vlasništva kako bi nadoknadila svoje ulaganje i obranila svoju tržišnu poziciju. Osim patentne zaštite, zaštitni su znakovi još jedan oblik prava intelektualnog vlasništva koji se koristi za identifikaciju i stavljanje na tržište farmaceutskih proizvoda. Drugi važan element farmaceutske industrije su poslovne tajne i zaštita podataka iz kliničkih ispitivanja. Slijedom toga, nacionalni sustavi intelektualnog vlasništva važni su pri razmatranju mogućnosti lokalne proizvodnje farmaceutskih proizvoda.
Cilj ovog rada je objasniti pojam i ulogu intelektualnog vlasništva u farmaceutskoj industriji i objasniti temeljne čimbenike koji uvjetuju konačan uspjeh. U svrhu jasnijeg tumačenja uloge intelektualnog vlasništva dani su primjeri uspješnih zaštita patenata u farmaceutskoj industriji. Zaključno, kao potvrda teorijskom dijelu i postavljenim hipotezama, provedena je i analiza trenutnog stanja u svijetu s fokusom na Europu