Repository of the University of Rijeka, Department of Biotechnology
Not a member yet
715 research outputs found
Sort by
Size-exclusion chromatography-based isolation of extracellular vesicles from cerebrospinal fluid of patients with severe traumatic brain injury
No full textSevere traumatic brain injury (TBI) is intracranial damage caused by external force and is the leading cause of death and disability among young people. The damage to brain tissue involves a complex and mostly long-lasting cascade of pathological processes such as inflammation, excitotoxicity and apoptosis, which are targeted for management during the critical care. Although a full recovery after severe TBI is possible, the mechanisms of neuroregeneration and thus targeted measures to support neuro-recovery are unknown. However, intercellular communication between neurons and glia cells is cellular activity vital for the renewal of old synapses and establishment of new ones.
Newly described potential mediators of intercellular communication in the brain are extracellular vesicles (EVs). EVs are nanosized particles enveloped with phospholipid bilayer and capable of transporting proteins, lipids and nucleic acids between cells. The previous study discovered that cerebrospinal fluid (CSF) of patients with severe TBI shows dynamic changes in both physical properties of EVs and levels of neuroregeneration-associated proteins. This EV dynamics indicates possible neuro-recovery response of the brain. The goal of this research was to enable analysis of EV-proteome by isolating total EVs from clinical CSFs after severe TBI.
An in-house size-exclusion chromatography (SEC) based on sepharose CL-6B was developed in this work and used it to separate total EVs from CSF pools of 6 control patients and 6 severe TBI patients. After collection, SEC fractions were characterised by 3 independent methods: immunoblot analysis for CD9 protein (i) and acetylcholinesterase (AChE) assay (ii) as well-established EV protein markers and Bradford assay (iii) to determine the total protein concentration. These quantifications of SEC fractions resulted in partially overlapping curves with AChE and CD9 peaks detected in earlier fractions than
III
total protein peak. The results indicate a successful separation of EVs from soluble proteins enabling the proteome analysis by mass spectrometry.Teška traumatska ozljeda mozga je intrakranijalno oštećenje uzrokovano vanjskom silom te je vodeći uzrok smrtnosti i invaliditeta u mladih ljudi. Ozljeda moždanog tkiva uključuje složenu i dugotrajnu kaskadu patoloških procesa poput upale, ekscitotoksičnosti i apoptoze, a liječenje bolesnika u kritičnom stanju je usmjereno na ublažavanje tih negativnih procesa. Iako je potpuni oporavak nakon ozljede moguć, mehanizmi neuroregeneracije kao i potencijalne mjere koje bi je poticale još uvijek nisu otkrivene. Međutim, oporavak starih sinapsi i stvaranje novih ovisi o međustaničnoj komunikaciji između neurona i glija stanica.
Novi potencijalni posrednici međustanične komunikacije u mozgu su izvanstanične vezikule (IV). IV su nanočestice obavijene fosfolipidnom membranom i mogu prenositi lipide, proteine i nukleinske kiseline između stanica. U prethodnom istraživanju pokazalo se da u cerebrospinalnoj tekućini pacijenata s teškom traumatskom ozljedom mozga dolazi do dinamičnih promjena fizikalnih svojstava IV-a i razina proteina uključenih u neuroregeneraciju. Te promjene ukazuju na moguće procese neuroregeneracije. Cilj ovog istraživanja bio je izolirati ukupne IV iz kliničkih uzoraka cerebrospinalne tekućine nakon teške traumatske ozljede mozga i time omogućiti analizu njihova proteoma.
Kromatografska metoda na bazi sefaroze CL-6B razvijena je tijekom ovog rada i primijenjena za razdvajanje ukupnih IV-a iz cerebrospinalne tekućine 6 kontrolnih i 6 bolesnika s teškom traumatskom ozljedom mozga. Sakupljene kromatografske frakcije karakterizirane su pomoću 3 metode: imunoblot analizom za CD9 protein (i), esejem za acetilkolinesteraznu aktivnost (AChE) (ii), koji su poznati proteinski markeri IV-a te Bradford esejem (iii) kojim se odredila koncentracija ukupnih proteina. Kvantifikacija frakcija rezultirala je krivuljama koje su se djelomično preklapale. Vrhovi krivulja AChE i CD9
V
detektirani su u ranijim frakcijama u odnosu na ukupne proteine. Rezultati ukazuju na uspješno razdvajanje IV-a od solubilnih proteina čime je omogućena njihova daljnja proteomska analiza masenom spektrometrijom
Determination of imidacloprid and its metabolites in urine by solid phase extraction and high performance liquid chromatography
No full textPesticidi se koriste kao sredstva za zaštitu bilja i očuvanje zdravlja ljudi. Njihova nekontrolirana primjena uzrokovala je nakupljanje ostataka i razgradnih produkata u okolišu što negativno utječe na cijeli ekosustav i predstavlja zdravstveni rizik za ljude. Izloženost ljudi takvim tvarima prati se biološkim monitoringom. Biokemijski pokazatelji izloženosti pružaju informacije o vanjskoj / apsorbiranoj dozi, toksičnim učincima spoja te služe za procjenu rizika. Bitan preduvjet za to su pouzdani analitički postupci. Cilj rada bio je predložiti metodu za praćenje razina pesticida imidakloprida i njegovih metabolita, 6 – klornikotinske kiseline i imidakloprid ureje, u biološkom materijalu, urinu, tijekom dugotrajne izloženosti niskim dozama.
Ispitani su postupci akumuliranja tih spojeva iz uzoraka urina ekstrakcijom na čvrstoj fazi na sorbensima: poli(divinilbenzenu-co-N-vinilpirolidin) (Oasis HLB), stiren-divinilbenzenu (SDB-1) i stiren-divinilbenzenu u kombinaciji s oktadecilsilicijevim dioksidom (SDB/C18). Priprava uzoraka optimirana je za konačnu analizu tekućinskom kromatografijom visoke djelotvornosti uz UV detektor s nizom dioda.
Djelotvornosti akumuliranja imidakloprida i njegovih metabolita iz vode sa sorbensa Oasis HLB bile su u rasponu (98 – 104) %, na sorbensu SDB-1 (68 – 102) %, a na SDB/C18 (77 – 100) %. Akumuliranja spojeva iz urina na sorbensu Oasis HLB nije bilo moguće radi nemogućnosti uklanjanja interferirajućih sastojka iz matrice urina. Rezultati akumuliranja na SDB sorbensu ukazuju na njegovu nedovoljnu selektivnost.
Akumuliranje spojeva iz urina na stupcu (SDB/C18), uz ispiranje sa 1 %-tnom smjesom metanola u deioniziranoj vodi i eluiranje 20 %-tnom smjesom diklormetana u acetonitrilu, pokazalo se kao najprikladniji postupak priprave uzorka za konačnu analizu tekućinskom kromatografijom. Djelotvornost ekstrakcije za imidakloprid i imidakloprid ureju je 95 % i 91 %, (R.S.D. 7 – 12 %). 6 – klornikotinsku kiselinu nije
moguće odrediti ekstrakcijom na SDB/C18 stupcu uz HPLC analizu. Osjetljivost određivanja za oba spoja bila je 20 ng/ml. Ekstrakcija imidakloprida i njegovog metabolita imidakloprid ureje iz urina na sorbensu SDB/C18 uz završnu HPLC – UV DAD analizu predložena je za primjenu pri procjeni izloženosti ljudi.Pesticides are used as a means to protect plants and preserve human health. Their uncontrolled use has caused the accumulation of residues and degradation products in the environment, which negatively affects the entire ecosystem and poses a health risk to humans. Human exposure to such substances is tracked by biological monitoring. Indicators of biochemical exposure provide information on the external/absorbed dose and the toxic effects of the compound and are used for risk assessments. The essential precondition for this are reliable analytical procedures. The aim of this thesis was to propose a method for monitoring pesticide levels of imidacloprid and its metabolites, 6-chloronicotinic acid and imidacloprid urea, in biological material, i.e. urine, during long-term exposure to low doses.
Procedures for accumulating these compounds from urine samples were studied using solid phase extraction on: poly(divinylbenzene-co-N-vinylpyrrolidone) (Oasis HLB), styrene-divinylbenzene (SDB-1) and octadecylsilic dioxide in combination with styrene-divinylbenzene (SDB/C18). Sample preparation was optimized for final high-performance liquid chromatography with UV diode array detector analysis.
Extraction recoveries of imidacloprid and its metabolites from the Oasis HLB sorbent were within the range of (98 – 104) %, on SDB-1 (68 – 102) % and on SDB/C18 (77 – 100) %. Extraction of compounds from urine on Oasis HLB was not possible due to the inability to remove interfering polar matrices of urine. The results of extraction on SDB sorbent indicate its lack of selectivity.
The extraction of compounds from urine on column SDB/C18, rinsing with a 1 % methanol in deionized water and eluting with a 20 % dichloromethane in acetonitrile, was shown to be the most suitable sample preparation procedure for final analysis using liquid chromatography. The
extraction efficiency for imidacloprid and imidacloprid urea was 95 % and 91 %, (R.S.D., 7 – 12 %). 6 – chloronicotinic acid cannot be determined by extraction on the SDB/C18 column coupled with HPLC analysis. The limit of detection for both compounds was 20 ng/ml. Extraction of imidacloprid and its metabolite imidacloprid urea from urine on SDB/C18 sorbent with final HPLC – UV DAD analysis is suggested for use in assessing human exposure to imidacloprid
Regulatory principles of drug nomenclature
No full textNacionalnim pravilnicima i smjernicama za nazivanje lijekova regulirani su kriteriji koje podnositelji zahtjeva za stavljanje lijeka u promet moraju zadovoljiti prilikom tvorbe naziva lijekova. Samim time oni predstavljaju vodič podnositeljima zahtjeva kako bi ispravno tvorili naziv lijeka za državu članicu u kojoj žele staviti lijek u promet. Cilj ovog istraživanja je bio putem strukturiranog pregleda svih dostupnih pravilnika ili smjernica država članica Europskog gospodarskog prostora odrediti međusobne razlike, odnosno odrediti kriterije koje bi svi pravilnici/smjernice trebali sadržavati kao dobri vodiči podnositeljima zahtjeva. Osim toga, cilj je bio provesti anketu o razumijevanju značenja kvalifikatora u nazivima lijekova na općoj populaciji i zdravstvenim djelatnicima Republike Hrvatske. Ovo se istraživanje provodilo u svrhu procjene razumijevanja ispitanika o značenjima određenih kvalifikatora te se na taj način zaključilo jesu li kvalifikatori predviđeni hrvatskom nacionalnom smjernicom odgovarajući za upotrebu pri nazivanju lijekova u Republici Hrvatskoj. Istraživanje je pokazalo kako brojni važni kriteriji nisu zastupljeni u većini pravilnika i da se oni načelno značajno razlikuju. Mnogi pravilnici/smjernice su vrlo kratki, s malim brojem propisanih kriterija kao zahtjeva koje trebaju zadovoljavati prilikom tvorbe naziva lijekova. Također se analizom ankete uvidjelo kako ispitanici obje skupine dosta dobro razumiju značenje svih kvalifikatora te da su ih, nakon danog objašnjenja i primjera lijeka u čijem se nazivu određeni kvalifikator nalazi, procijenili odlično razumljivima. Jedino je kvalifikator MITE bio onaj kojeg niti jedna skupina nije dovoljno točno i precizno opisala te bi se njegova primjena i propisivanje pravilnikom u nazivima lijekova u Republici Hrvatskoj trebala ponovno preispitati i raspraviti.National regulations and guidelines on naming of medicinal products regulate the criteria that applicants or marketing authorization holders must fulfill when forming the name of a medicinal product. They are therefore a guide for applicants and marketing authorization holders to correctly form the name of the medicinal product for the Member State in which they wish to place the medicinal product on the market. This research is aimed at identifying differences between regulations/guidelines, ie at determining the criteria that all regulations/guidelines should contain in order to constitute good guides for applicants and marketing authorization holders, through a structured review of all available regulations or guidelines of the Member States of the European Economic Area. The aim was also to survey the understanding of the meaning of qualifiers in the names of medicinal products in the general population and amongst the health professionals in the Republic of Croatia. This research was conducted to assess the respondents' understanding of the meanings of certain qualifiers and thus to conclude whether the qualifiers provided by the Croatian national guideline are appropriate for the use in naming of medicines in the Republic of Croatia. The research showed that numerous important criteria are not represented in most guidelines and that they mostly differ significantly. Many guidelines are very short, with a small number of prescribed requirements to be fulfilled when creating drug names. Also, the analysis of the survey showed that the respondents of both groups understand the meaning of all qualifiers quite well and that, after the given explanation and example of the name of the medicinal product where a certain qualifier is found, they assessed them as perfectly understandable. Only the "MITE" qualifier was not described accurately and precisely enough by either of the groups, so its application and regulation by the guideline on naming of medicinal products in the Republic of Croatia should be re-examined and discussed
Interchangeability of biosimilar drugs
No full textBiološki lijekovi proizvedeni postupcima rekombinantne tehnologije (biotehnološki lijekovi) predstavljaju veliki medicinski napredak u liječenju mnogih autoimunih bolesti i karcinoma. Istekom patentne zaštite biotehnoloških lijekova, počeo je razvoj biosličnih lijekova koji su svojevrsne kopije bioloških lijekova, što se u posljednjem desetljeću intenziviralo i rezultiralo znatnim brojem odobrenih biosličnih lijekova. Iako je u postupku davanja odobrenja za biosličan lijek potvrđena visoka razina sličnosti sa izvornim biološkim lijekom u kakvoći, sigurnosti primjene i djelotvornosti, bioslični lijekovi zbog svoje prirode ne mogu biti identične kopije izvornih bioloških lijekova. Zbog toga se provode dodatno brojna klinička ispitivanja u kojima su pacijenti podvrgnuti zamjeni izvornog biološkog lijeka biosličnim lijekom. Promatrani parametri u ispitivanjima zamjenjivosti su djelotvornost, sigurnost i imunogeničnost lijekova. Cilj ovog rada je analizirati ispitivanja zamjenjivosti i pokazati kako zamjenom biosličnim lijekom ne dolazi do smanjenja djelotvornosti i sigurnosti, odnosno povećanog rizika u odnosu na korist u usporedbi s primjenom izvornog biološkog lijeka. Odabrana su cjelovita klinička ispitivanja objavljena u razdoblju od 1. siječnja 2016. godine do 1. svibnja 2020. godine na PubMed-u. Neki od kriterija za odabir ispitivanja bili su: cjelovitost podataka, dizajn ispitivanja, populacija te trajanje terapije prije i nakon zamjene. Izdvojena su ukupno 22 rada, od kojih su 19 randomizirana klinička ispitivanja, a 3 promatračka prospektivna klinička ispitivanja. U randomiziranim kliničkim ispitivanjima zabilježeno je kako su djelotvornost i sigurnost ostale slične između skupina koje jesu i skupina koje nisu podvrgnute zamjeni. U promatračkim prosprektivnim ispitivanjima nije uočena razlika u djelotvornosti i sigurnosti lijekova prije i nakon zamjene. Dvanaest randomiziranih kliničkih ispitivanja sadržavalo je i podatke o broju pacijenata koji su prestali primati terapiju tijekom ispitivanja. Uočeno je kako je veći broj pacijenata prestao primati terapiju u ispitivanjima koja su sadržavala proširenje u kojem su pacijenti bili obaviješteni o vrsti terapije što se djelomično može pripisati utjecaju nocebo efekta. Unatoč ovim obećavajućim rezultatima, uvođenje biosličnih lijekova u kliničku praksu još uvijek je veliki izazov.Biological drugs produced by recombinant technology (biotechnological drug) represent a major medical progress in the treatment of many autoimmune diseases and cancers. Development of the biosimilar drugs, which are copies of biological drugs, began with the expiration of the patent protection of the biotechnological drugs. Research of biosimilar drugs was intensified in the last decade and resulted in a significant number of approved biosimilars. Although biosimilars show a high level of similarity with referent biological drugs in terms of quality, safety and efficacy, biosimilars cannot be identical to reference biological drug due to their nature. Therefore, a number of additional clinical trials are conducted in which patients have undergone the switch from reference to biosimilar drug. Observed parameters in switch studies are efficacy, safety and immunogenicity of the drug. The aim of this thesis is to analyze switch studies and show that the switch doesn't have influence on decrease in efficacy and safety. Complete clinical studies published in the period from January 2016 to May 2020 were selected. Some study selection criteria were: data integrity, study design, study population and duration of the treatment before and after the switch. A total of 22 papers were selected of which 19 were randomised clinical trials and 3 were observational prospective clinical trials. Efficacy and safety have been reported to remain similar between switched and unswitched patients in randomised clinical trials. Also, no difference in efficacy and safety was observed before and after the switch in observational prospective studies. Higher rates of discontinuation were observed in nine open-label extensions which can be attributed to the influence of the nocebo effect. Despite these promising results, the introduction of biosimilar drugs into clinical practice is still a major challenge
Mjerenje redoks statusa u cirkadijalnim mutantima Drosophile melanogaster
No full textCircadian rhythms are oscillations that occur in a 24 hour period as a result of an endogenous biochemical oscillator known as the circadian clock. It regulates physiological and behavioral processes in all mammals. Hydrogen peroxide (H2O2) is a reactive oxygen species (ROS) molecule that also acts as a signaling molecule. We wanted to look at the connection between oxidative stress and the involvement of circadian genes to then be able to further investigate the effects of methamphetamine (METH) on the redox states in Drosophila. Disruptions in circadian rhythms are often seen in substance abuse disorders. In order to measure oxidative stress we used fluorescent dihydroethidium (DHE) staining and studied the variations in the levels of H2O2 in the wild type (wt) and circadian mutants ClkJrk, per01, tim01 and cyc01 of Drosophila melanogaster. Furthermore, we wanted to know if there was a difference in levels of H2O2 circulating in the head and body of the fly and whether it was under the influence of the time of day. Our data suggests that H2O2 levels vary between wt and circadian mutants and that in the circadian mutants the concentration of H2O2 varies depending on the time of day, while in wt it does not. More H2O2 is found in the head.Cirkadijalni ritmovi su oscilacije koje se zbivaju u periodu od 24 sata kao rezultat endogenog biokemijskog oscilatora poznatog kao cirkadijalni sat. On regulira fiziološke i bihevioralne procese u svim sisavcima. Vodikov peroksid (H2O2) je jedna od molekula reaktivnih kisikovih vrsta koja ujedno djeluje i kao signalna molekula u mnogim procesima. Htjeli smo vidjeti poveznicu između oksidativnog stresa i cirkadijalnih gena kako bi mogli dalje istražiti utjecaj metamfetamina (METH) na redoks status kod Drosophile. Poremećaji u cirkadijalnim ritmovima se često viđaju kod zloupotrebe substanci. Kako bismo izmjerili oksidativni stres koristili smo se metodom bojanja fluorescentnom dihidroetidij (DHE) bojom te smo mjerili koncentraciju H2O2 koji se nalazi u wild type (wt) mušicama i cirkadijalnim mutantima ClkJrk, per01, tim01 and cyc01 Drosophile melanogaster. Nadalje, htjeli smo vidjeti postoji li razlika u količini H2O2 koji se nalazi u glavi i u tijelu mušica i je li pod utjecajem doba dana. Naši podatci ukazuju na to da količine H2O2 variraju između wt i cirkadijalnih mutanata i da kod cirkadijalnih mutanata koncentracija H2O2 varira ovisno o dobu dana, dok kod wt ne. Veća je koncentracija H2O2 u glavi
Primjena strojnog učenja u dizajnu peptida
No full textThe main purpose of this thesis is to explore the use of computational techniques such as machine learning and genetic algorithms in peptide design. Peptides, short amino acid chains, have a wide variety of biomedical applications. They are used in drug design and as drug delivery systems. Peptide design is an expensive and time-consuming process because it requires high-throughput screenings together with experimental validation, which require a lot of time and resources. Machine learning and genetic algorithms, which will be reviewed in this thesis, can be used to design peptides faster and cheaper by programming the computer to do the work of designing for us. In addition, peptide properties that are important for their function will be reviewed. Basic physico-chemical properties are being used by computer algorithms to predict and/or optimise a peptide with a wanted trait. Some of these traits are antimicrobial or antiviral activity and can be used in applications such as the design of a new type drug based on peptides. Peptide design with computational techniques is a newly emerging field of study and most of the examples considered are of newer date. For this reason, this thesis aims to spread the knowledge about peptides and peptide design.Glavna svrha ovog završnog rada je istražiti uporabu računalnih tehnika poput strojnog učenja i genetskog algoritma u dizajnu peptida. Peptidi, kratki lanci aminokiselina, imaju raznolike primjene u polju biomedicine. Koriste se u dizajnu lijekova i kao nosači lijekova. Dizajn peptida je skup i dugotrajan proces jer istraživači provode visoko-protočni probir zajedno sa eksperimentalnom validacijom koji zahtijevaju puno vremena i sredstava. Strojno učenje i genetski algoritmi mogu biti korišteni da dizajniramo peptide brže i jeftinije programiranjem računala da radi proces dizajniranja za nas. Svojstva peptida koja su važna za njihove funkcije će biti objašnjena. Ta fizikalno-kemijska svojstva koriste računalni algoritmi da predviđaju i/ili optimiziraju peptid sa željenom funkcijom. Funkcije, poput antimikrobnog i antiviralnog djelovanja, se mogu primijeniti u dizajnu novih vrsta lijekova baziranih na peptidima. Dizajn peptida uz pomoć računalnih tehnika je novo područje i većina razmotrenih studija su novijeg datuma. Zbog toga, ovaj rad ima za namjeru širenje znanja o peptidima i dizajnu peptida
Photodynamic effect of porphyrin under hypoxic conditions on melanoma cells
No full textNovi i neinvazivan pristup u liječenju tumora, gdje nakon unosa fotosenzibilizatora (PS) u stanice slijedi ozračivanje područja vidljivom svjetlošću, zove se fotodinamička terapija (PDT). Porfirin, kao PS, može apsorbirati vidljivu svjetlost i potaknuti stvaranje reaktivnih kisikovih vrsta (ROS-ovi) koji će in situ inducirati apoptozu stanica. PDT uključuje netoksične komponente PS-a, svjetlost odgovarajuće valne duljine (600-800 nm) te kisik koji je potreban za uspješan ishod terapije.
Svrha je ovog istraživačkog rada ispitati djelotvornost fotodinamičkog učinka N-oksidiranih piridilporfirina konjugiranih lipofilnim lancima različitih duljina na stanice melanoma u hipoksičnim uvjetima. Prvo su određeni citotoksični učinci testiranih spojeva na stanice fibroblasta (HFF) i melanoma (MEWO) u normalnim i uvjetima smanjene koncentracije kisika (hipoksični uvjeti). Također, odredili smo ulaze li porfirini u stanice melanoma te utvrdili dio stanice gdje se najviše nakupljaju.
Na temelju rezultata tretmana stanica ljudskih stanica HFF i MEWO spojevima 10C-O, 14C-O, 18C-O i AMIDO-O, dokazali smo kako navedeni spojevi nisu citotoksični u mraku. Spojevi 10C-O i AMIDO-O ni u manjim, ni u većim koncentracijama ne djeluju citotoksično. Lipofilnost spojeva utjecala je na ulazak u stanice i na razinu citotoksičnosti. Spojevi s duljim alkilnim lancem (14C-O, 18C-O) su se pokazali više lipofilnima i jačeg intenziteta crvene boje pod fluorescentnim mikroskopom jer lakše ulaze u stanice i uzrokuju staničnu smrt. Navedeni spojevi inhibiraju rast stanica MEWO i HFF te su u uvjetima hipoksije, postignute tretmanom sa CoCl2 pokazali više selektivnima za stanice melanoma, nego za normalne fibroblaste.
Ovi rezultati idu u prilog tome da su potrebna daljnja istraživanja koja bi otkrila točne mehanizme djelovanja spojeva u cilju što učinkovitijeg tretmana koji će iskoristiti hipoksiju tumora kao prednost u liječenju, što pruža potencijalno i obećavajuće djelovanje u tretmanu rezistentnih hipoksičnih tumora.A modern and non-invasive approach in the treatment of tumors, where the proper introduction of photosensitizers (PS) into cells is followed by irradiation of the local area with visible light, is called photodynamic therapy (PDT). Porphyrin, as PS, can efficiently absorb visible light and stimulate the formation of reactive oxygen species (ROS) that will induce cell apoptosis in situ. PDT includes non-toxic components of PS, light of an appropriate wavelength (600-800 nm) and oxygen required for a successful treatment outcome.
The specific purpose of this study was to examine the efficacy of the photodynamic effect of N-oxidized pyridylporphyrins conjugated to lipophilic chains of varied lengths on melanoma cells under hypoxic conditions. The cytotoxic effects of the compounds on fibroblast (HFF) and melanoma (MEWO) cells under normal and reduced oxygen concentration conditions (hypoxic conditions) were first determined. We equally determined whether porphyrins enter melanoma cells and determined the key part of the cell where they accumulate the most.
Based on the results of treatment of human cells HFF and MEWO with compounds 10C-O, 14C-O, 18C-O and AMIDO-O, we proved that these compounds are not cytotoxic in the dark. Compounds 10C-O and AMIDO-O do not cause cytotoxic effects in either lower or higher concentrations.
The lipophilicity of the compounds affected cell entry and cytotoxicity levels. Compounds with a longer alkyl chain (14C-O and 18C-O) have been shown to be more lipophilic and of stronger red color under a fluorescent microscope because they enter cells more easily and typically cause cell death.
These compounds inhibit the growth of MEWO and HFF cells and under conditions of hypoxia, achieved by treatment with CoCl2, showed to be more selective for melanoma cells than for normal fibroblasts.
These results support the need for further research to reveal the exact mechanisms of action of the compounds for the most effective treatment that will utilize tumor hypoxia as a treatment advantage, providing a potential and promising effect in the treatment of resistant hypoxic tumors
In vitro evaluation of new fenantren derivatives on tumor cell lines
No full textDanas se maligna oboljenja liječe različitim pristupima koji uključuju kirurške postupke, zračenje i terapiju lijekovima. Terapija antitumorskim lijekovima je pristup koji se temelji na induciranju citotoksičnosti za tumorske stanice. Prirodni spojevi su tijekom povijesti bili važan izvor u razvoju lijekova. Ti su spojevi važne početne strukture za razvoj lijekova specifičnog djelovanja odnosno važne strukture za dobivanje sintetičkih aktivnih tvari. Iz kolekcije novosintetiziranih spojeva provode se ispitivanja, kao primjerice testiranja na staničnim linijama zloćudnih tumora u čovjeka u uvjetima in vitro ili visokoprotočna istraživanja. Fenantreni su klasa aromatskih metabolita, od kojih neki, posjeduju prilično jaku citotoksičnu aktivnost protiv staničnih linija raka, kao što su A549 (adenokarcinom bazalnog epitela alveola), SK-OV-3 (humani adenokarcinom jajnika), HL-60 (humana promijelocitična leukemija), HeLa (karcinom grlića maternice), MCF-7 (karcinom dojke). Temeljem prethodnih istraživanja različitih struktura fenantrena koje su pokazale biološku aktivnost, uključujući i onu protutumorsku, ovim radom se željela utvrditi citotoksičnost i antiproliferativna djelotvornost nove serije derivata fenantrena na tumorskim staničnim linijama pomoću metode MTT testa koja je služila za analizu proliferacije stanica in vitro, te uz pomoć metode Western blot za analizu ekspresije potencijalnih meta u tretiranim stanicama. Pokusi su rađeni na tumorskim staničnim linijama: A549 (adenokarcinom pluća), CFPAC-1 (stanice duktalnog adenokarcinoma gušterače), HeLa (karcinom grlića maternice), HepG2 (stanice hepatocelularnog karcinoma jetra), SW620 (stanice adenokarcinoma debelog crijeva, metastaze) te na jednoj staničnoj liniji netransformiranih stanica fibroblasta HFF-1. Dicijano supstituirani akrilonitrili 8 i 11 i njihovi ciklički analozi 15 i 17 su pokazali najjaču antiproliferativnu aktivnost, dok su derivati 8 i 11 također pokazali i selektivnost prema HeLa i HepG2 staničnim linijama. Razina ubikvitinirane forme HIF-1α statistički se povećala u stanicama Hela i HepG2 nakon tretmana derivatima 8 i 11. Protein MEK 1/2 imao je smanjenu ekspresiju u stanicama HeLa i HepG2 nakon tretmana derivatima 8 i 11. Zaključno, ovaj diplomski rad pokazuje potencijal testiranih derivata fenantrena 8 i 11 kao potencijalnih kandidata za daljnju optimizaciju u procesu razvoja lijekova.Today, malignancies are treated with a variety of approaches that include surgical procedures, radiation, and drug therapy. Antitumor drug therapy is the approach based on cytotoxicity induction in tumor cells. Natural compounds have been an important source in drug development throughout history. These compounds are important starting structures for development of specific drugs or important structures for production of synthetic active substances. From a collection of newly synthesized compounds, tests are carried out, such as testing for human malignant tumor cell lines in vitro or in high-throughput studies. Phenanthrenes are a class of aromatic metabolites, some of them bearing fairly strong cytotoxic activity against cancer cell lines, such as A549 (adenocarcinoma of the basal epithelium of the alveoli), SK-OV-3 (human ovarian adenocarcinoma), HL-60 (human promyelocytic leukemia), HeLa (cervical cancer), MCF-7 (breast cancer). Guided by previous studies of various phenanthrene structures that have shown biological activity, including antitumor ones, this work was aimed to study cytotoxicity and antiproliferative efficacy of a new series of phenanthrene derivatives on tumor cell lines using the MTT assay method used for cell proliferation assessment in vitro and Western blot for analysis of expression of potential targets in treated cells. The experiments were performed on tumor cell lines: A549 (lung adenocarcinoma), CFPAC-1 (pancreatic ductal adenocarcinoma cells), HeLa (cervical carcinoma), HepG2 (hepatocellular carcinoma cells), SW620 (colon adenocarcinoma cells), and on one cell line of untransformed fibroblast cells HFF-1. Dicyano substituted acrylonitriles 8 and 11 and their cyclic analogs 15 and 17 showed the strongest antiproliferative activity, while derivatives 8 and 11 also showed selectivity for HeLa and HepG2 cell lines. The level of ubiquitinated form HIF-1α was statistically increased in Hela and HepG2 cells after treatment with derivatives 8 and 11. MEK 1/2 protein had reduced expression in HeLa and HepG2 cells after treatment with derivatives 8 and 11. In conclusion, this thesis demonstrates the potential of tested phenanthrene derivatives 8 and 11 as potential candidates for further optimization in the drug development process
Dizajn katalitički aktivnih peptida i peptidnih nanostruktura : Završni rad
No full textAmino acids are the building blocks used to construct peptides. Peptides can form different secondary structures such as alpha helices and beta sheets. Through evolution, these structures became more complex and formed proteins. Enzymes are proteins that attract interest in terms of scientific research. They are widely explored for their catalytic properties. They facilitate biological reactions and accelerate the reaction rate. While much is known about mechanisms of catalysis, replicating these enzymatic systems remains a challenge. One approach to address this issue is the use of short peptide sequences instead of enzymes. The advantage is possibility of manipulating their physio-chemical properties to suit specific design requirements in reactions. Self-assembly of short peptides presents a simplified method of producing successful catalysts like enzymes. Supramolecular self-assembly approach offers opportunities to manipulate such structures. However, these “de novo designed catalysts” still lack functionality compared to bigger proteins. Many scientific reports are being made about emerging strategies and possible peptide sequences that could catalyse different reactions such as ester hydrolysis, aldol reactions, deacetalization etc. Moreover, nanotechnology has evolved immensely in the past decade. Knowledge about constructing nanomaterials allowed for creating peptide nanostructures such as micelles, amyloid-like fibres and others. Catalytic ability of these formations is being tested to facilitate reactions such as ester hydrolysis. In this work, we will focus on explaining the importance of using short peptides in catalysis instead of proteins.Aminokiseline su gradivni elementi za peptide. Peptidi formiraju različite sekundarne strukture poput alfa-heliksa i beta-ploča. Tijekom evolucije ove su strukture postale složenije i formirale proteine. Enzimi su proteini koji privlače interes u znanstvenim istraživanjima. Široko se istražuju zbog svojih katalitičkih svojstava. Oni olakšavaju i ubrzavaju biološke reakcije. Iako se mnogo zna o mehanizmu katalize, oponašanje ovih enzimskih sustava je prilično izazovno. Zbog toga se dizajniraju kratke peptidne sekvence koje se koriste za katalizu reakcija poput hidrolize estera. Njihova prednost leži u mogućnosti manipulacije njihovih fizikalno-kemijskih svojstava kako bi odgovarali specifičnim uvjetima dizajna za reakcije. Samostalno sklapanje (eng. self-assembly) kratkih peptida predstavlja jednostavnu metodu za pripremu uspješnih katalizatora kao što su enzimi. Supramolekularni pristup samostalnom sklapanju nudi mogućnosti manipulacije takvim strukturama u velikoj mjeri. Ti takozvani „novo dizajnirani katalizatori“ još uvijek nemaju funkcionalnost kakvu imaju veći proteini. Mnogo je objavljenih znanstvenih radova o novim strategijama i mogućim peptidnim sekvencama koje djeluju kao katalizatori u reakcijama poput hidrolize estera, aldolnih reakcija, deacetilacije itd. Nadalje, nanotehnologija se izrazito razvila u posljednjem desetljeću. Znanje o konstruiranju nanomaterijala omogućilo je stvaranje peptidnih struktura poput micela, vlakana sličnim amiloidima i dr. Katalitička sposobnost ovih formulacija ispituje se kako bi se olakšale reakcije poput hidrolize estera. U ovom ćemo se radu usredotočiti na važnost korištenja kratkih peptida u katalizi umjesto proteina
Modeliranje agregacije proteina NPAS3 i CRMP1 povezanih sa šizofrenijom u stanicama neuroblastoma
No full textChronic mental illness affects millions of people every year, while its origins and mechanisms remain unclear. Since symptoms of neurodegenerative and mental disorders are similar, our research focuses on protein aggregation. Protein aggregation changes the structure of protein and can cause loss of function or gain of a novel toxic function. There are several proteins characterized as aggregating in mental illnesses, of which we focused on Collapsin Response Mediator Protein 1 (CRMP1) and Neuronal PAS Domain Protein 3 (NPAS3). We expressed variants of mentioned proteins in neuroblastoma cell line and assessed them by immunofluorescence.
CRMP1 has been detected as insoluble in brains of mental disorder patients and seen to aggregate in cell culture. In our research we wanted to confirm aggregation of the long and short CRMP1 variants. The long variant is seen to aggregate alone, while short variant is only known to co-aggregate with other proteins. Since the long variant od CRMP1 has a longer N-terminal section unlike the short variant, we investigated its truncation too. However, we did not see aggregation of long and short CRMP1 variants when expressed alone, nor the effect of N-terminal truncations. Thus, we believe CRMP1 has greater tendency to co-aggregate with other proteins and the following research should explore it in more detail.
Meanwhile, genetic studies have implicated a mutated version of NPAS3 in mental disorders. Also, mutant NPAS3 has been seen as insoluble in cell culture. We examined aggregation of full-length wild type and mutated NPAS3 variants, along with the major NPAS3 structural regions. We observed that mutated NPAS3 does not enter the nucleus and therefore cannot perform its normal function as transcription factor. Interestingly, we have seen that the bHLH1 region of NPAS3 can aggregate by itself and is stabilised by presence of the PAS region. Our results confirmed that NPAS3 aggregation is a consequence of mutation, but there could be other mechanisms which include disruption of bHLH1 region.
Next steps should include further investigation of bHLH1 and PAS regions of NPAS3, with regards to mutation and translocation. Finally, this and similar research could result in model of aggregation for both proteins, which could be translated to other proteins implicated in mental illness.Milijuni ljudi obolijevaju od kronične mentalne bolesti godišnje, dok su uzorci i mehanizmi još uvijek nepoznati. Simptomi neurodegenerativnih i mentalnih poremećaja su slični, zbog čega se naše istraživanje temelji na agregaciji proteina. Agregacija proteina mjenja strukturu proteina te može dovesti do gubitka funkcije ili stjecanja nove toksične funkcije proteina. Postoji nekoliko proteina čija je agregacija opisana u mentalnim poremećajima, a u ovom radu istražili smo protein posrednik odgovora kolapsina 1 (eng. Collapsin Response Mediator Protein 1 ili CRMP1) i neuronski protein s PAS domenom 3 (eng. Neuronal PAS Domain Protein 3 ili NPAS3). Eksprimirali smo verzije spomenutih proteina u staničnoj liniji neuroblastoma i analizirali ih putem immunofluorescencije.
U mozgovima pacijenata s mentalnim poremećajima, CRMP1 je detektiran u netopljivoj frakciji te je utvrđeno da agregira u staničnoj kulturi. U našem istraživanju željeli smo potvrditi agregaciju duge i kratke verzije CRMP1. Do sada je viđeno kako duga verzija može sama agregirati, dok kratka verzija agregira u prisutnosti drugih proteina. Duga verzija se razlikuje od kratke verzije po svom N-terminalnom dijelu, zbog čega smo dodatno istražili i skraćene verzije. Međutim, nismo vidjeli agregaciju duge ni kratke verzije kao ni utjecaj N-terminalog dijela. Shodno tome, vjerujemo kako CRMP1 ima veću sklonost prema ko-agregaciji s drugim proteinima, što je potrebno detaljnije istražiti u budućnosti.
Međutim, genetska istraživanja su potvrdila prisutnost mutirane verzije proteina NPAS3 u mentalnim poremećajima te je dokazana njegova netopljivost u staničnoj kulturi. Istražili smo agregaciju divlje i mutirane verzije NPAS3 te agregaciju glavnih regija proteina NPAS3. Primijetili smo kako mutirana verzija proteina NPAS3 ne ulazi u jezgru, zbog čega ne može djelovati kao transkripcijski faktor. Zanimljivo je kako smo vidjeli da bHLH1 regija može samostalno agregirati te je stabilizirana prisustvom PAS regije. Naši rezultati su potvrdili kako je agregacija NPAS3 posljedica mutacije, no moguće je da postoje i drugi mehanizmi agregacije koji uključuju ometanje bHLH1 regije. Slijedeći koraci bi trebali uključivati daljnje istraživanje bHLH1 i PAS regija, uzimajući u obzir mutaciju i translokaciju povezanu s proteinom NPAS3. U konačnici, slična istraživanja mogu dovesti do modela agregacije, koji bi se mogao primijeniti i na druge proteine implicirane u mentalnim poremećajima