Repository of the University of Rijeka, Department of Biotechnology
Not a member yet
715 research outputs found
Sort by
The Role of VPS34 and Phosphatidylinositol 3-Monophosphate (PI3P) in Megakaryocyte Maturation and Platelet Production
No full textThe maturation of megakaryocytes (MKs) implies the polyploidization of the nucleus and the formation of a demarcation membrane system (DMS), an extensive internal membrane reservoir necessary for platelet production. While the initiation of the DMS starts with plasma membrane invagination and continues in the perinuclear region by the insertion of Golgiderived vesicles, the membrane source(s) and mechanism for further DMS expansion, cell growth and proplatelet formation remain elusive.
In the present study, we investigated the role of endolysosomal system during MKs maturation and platelet production. Vps34 kinase and its product lipid phosphatidylinositol 3-monophosphate (PI3P) are key components of early and late endosomes where they regulate vesicular trafficking. We demonstrate that, during maturation, Vps34-derived PI3P translocates
from the perinuclear early endosomes (EE) in immature, to peripheral late endosomes/lysosomes (LE/Lys) in mature MKs. Moreover, PI3P was found in close contact with PI(4,5)P2 (plasma membrane/DMS) and LE/Lys in mature MKs. Sequestration of PI3P by expression of 2xFYVE domain, specific pharmacological inhibition of Vps34-mediated PI3P production, or depletion of PI3P by expression of PI3P-phosphatase (MTM1) decreased proplatelet formation. At the same time, inhibition of PI3P production led to the intracellular accumulation of LE/Lys markers preventing their surface expression, suggesting an essential
role for PI3P in LE/Lys translocation toward the plasma membrane. Moreover, inhibition of Vps34 at earlier stages of MK maturation caused aberrant DMS development, decreased the size of MKs and the expression of GPIb, a DMS marker. In line with the above was targeting of downstream events in endosome maturation: overexpression of the dominant-negative late
endosomal GTPase Rab7 T22N or pharmacological inhibition of PI3P conversion to PI(3,5)P2 led to the enlarged LE/Lys, reduced surface levels of LE/Lys markers, and decreased proplatelet formation. In parallel, we investigated the role of early endosomal GTPase Rab5 which regulates endocytic uptake and represents the starting point for endosome maturation. In addition, Rab5 mediates the recruitment of Vps34 on the membrane of EEs, which is a key step during early-to-late endosome maturation. Rab5 mutants expressed from retroviruses showed the opposing effects on EE morphology and the amount of endocytosis in MKs. Active Rab5 Q79L induced the formation of large EEs that accumulated GPIb, increased transferrin internalization and at the same time increased proplatelet production. In contrast, inactive Rab5 N133L caused EE
fragmentation, GPIb retention at the plasma membrane, impaired transferrin endocytosis and strongly blocked proplatelet formation. Furthermore, active Rab5 Q79L increased membrane labeling by lipophilic dye PKH26 suggesting that the increased levels of the endocytosis might contribute to the internal membrane content in MKs. Together, these results suggest that PI3Ppositive LE/Lys contribute to the membrane growth and proplatelet formation by their translocation to the cell periphery and fusion with the plasma membrane, while early endosomal Rab5 regulates GPIb trafficking and represents the limiting step during endocytosis in MKs, the amount of which we believe is a major determinant of membrane growth and proplatelet
production. We also demonstrated for the first time that Vps34 localizes in the nucleus of primary MKs and other cells (BALB3T3, human mononuclear cells), as shown by immunofluorescence and cell fractionation experiments. Further analysis by confocal microscopy revealed that Vps34 is confined to the nucleolus, where it colocalizes with upstream binding factor (UBF), a
transcription factor required for rRNA expression. Inhibition of RNA polymerase I (Pol I) with actinomycin D, but not RNA Pol II with α-amanitin, abolished Vps34 nucleolar localization and Vps34 binding to UBF. In addition, pull-down of green fluorescent protein (GFP)-UBF coimmunoprecipitated Vps34 from BALB3T3 cells. Inhibition of Vps34 decreased mTORmediated S6K1 and S6 phosphorylation in MKs and blocked rRNA synthesis in BALB3T3, suggesting that it might play an important, still undescribed, role in the ribosome biogenesis and nucleolar organization and function. Our attempts to produce a stable cell line with Vps34
deletion by CRISPR/Cas9 gene-editing technology resulted in the successful generation of knockout (KO) cells for a single Vps34 isoform containing exon 2. Targeting other exons was unsuccessful, most likely because Vps34 is an essential gene and cells with complete Vps34 deletion do not survive. Taken together, the results of this thesis contribute to a better understanding of the involvement of the small lipid PI3P and related kinase Vps34 in the MK maturation and platelet production in addition to, until now, undescribed nucleolar localization and function of Vps34.Maturacija megakariocita (MK) uključuje poliploidizaciju jezgre te formiranje demarkacijskog sustava membrana (DMS), unutarstaničnog membranskog rezervoara neophodnog za stvaranje trombocita. Dok DMS započinje invaginacijom plazmatske membrane i dalje raste u perinuklearnoj regiji ugradnjom vezikula podrijetlom iz Golgijevog aparata, izvor(i) membrana potrebnih za daljnje širenje DMS-a i mehanizam nastajanja protrombocita još uvijek nisu dovoljno razjašnjeni.
U ovom radu istraživali smo ulogu endolizosomalnog sustava tijekom maturacije MK i stvaranja krvnih pločica. Vps34 kinaza i njen lipidni produkt fosfatidilinozitol 3-monofosfat (PI3P) su ključne komponente ranih i kasnih endosoma gdje reguliraju promet vezikula. Pokazali smo da se tijekom sazrijevanja, PI3P kojeg stvara Vps34, translocira s perinuklearnih
ranih endosoma u nezrelim, na kasne endosome i lizosome u zrelim MK. Također, PI3P kolokalizira s PI(4,5)P2 (marker plazmatske mebrane i DMS-a) i kasnim endosomima/lizosomima u zrelim MK. Sekvestracija PI3P zbog prekomjerne ekspresije 2xFYVE domene (veže PI3P), inhibicija proizvodnje PI3P putem farmakološke inhibicije Vps34 ili smanjenje PI3P zbog ekspresije PI3P-fosfataze (MTM1), značajno je smanjila produkciju protrombocita. U isto vrijeme, inhibicija stvaranja PI3P dovela je do unutarstaničnog nakupljanja markera kasnih endosoma/lizosoma sprječavajući njihovu
površinsku ekspresiju te sugerirajući esencijalnu ulogu PI3P tijekom translokacije kasnih endosoma/lizosoma prema plazmatskoj membrani. Nadalje, inhibicija Vps34 tijekom ranijih stadija sazrijevanja MK narušila je razvoj DMS-a, smanjila veličinu MK te razinu ekspresije GPIb, glavnog receptora MK i markera DMS-a. U skladu s prethodnim rezultatima bilo je i
ciljanje nizvodnih događaja u maturaciji endosoma: prekomjerna ekspresija dominantno negativne GTPaze Rab7 T22N na kasnim endosomima ili farmakološka inhibicija konverzije PI3P u PI(3,5)P2 uzrokovala je povećanje kasnih endosoma/lizosoma, smanjila površinsku ekspresiju markera kasnih endosoma/lizosoma te proizvodnju protrombocita.
Paralelno smo istraživali ulogu Rab5 GTPaze na ranim endosomima koja regulira endocitozu te predstavlja početnu točku za sazrijevanje endosoma. Također, Rab5 posreduje u vezanju Vps34 na membranu ranih endosoma što je ključni korak tijekom maturacije ranih endosoma u kasne. Ekspresija Rab5 mutanti sa retrovirusa pokazala je suprotne učinke na morfologiju ranih endosoma i endocitozu u MK. Aktivni Rab5 Q79L potaknuo je stvaranje velikih ranih endosoma koji su sadržavali GPIb, povisio je internalizaciju transferina te je u isto vrijeme povećao stvaranja protrombocita. Nasuprot tome, inaktivni Rab5 N133L prouzročio je fragmentaciju ranih endosoma, zadržavanje GPIb na plazmatskoj membrani, te je značajno snizio endocitozu transferina i produkciju protrombocita. Nadalje, aktivni Rab5 Q79L povećao je obilježavanje membrana sa lipofilnom bojom PKH26 sugerirajući kako bi povećana razina endocitoze mogla doprinijeti sadržaju unutrašnjih membrana u MK. Ovi rezultati sugeriraju da PI3P-pozitivni kasni endosomi/lizosomi doprinose rastu membrana i stvaranju protrombocita translokacijom na periferiju stanice i fuzijom s plazmatskom membranom, dok Rab5 regulira
unutarstanični promet GPIb te predstavlja ograničavajući korak tijekom endocitoze u MK, za koju vjerujemo da predstavlja glavnu odrednicu za rast membrana i stvaranje protrombocita. Također smo, pomoću imunofluorescencije i stanične frakcionacije, po prvi put pokazali lokalizaciju Vps34 u jezgri primarnih MK i ostalih stanica (BALB3T3, ljudski mononukleari). Daljnja analiza konfokalnom mikroskopijom otkrila je prisutnost Vps34 u jezgrici gdje kolokalizira s uzvodnim faktorom vezanja (engl. upstream binding factor, UBF), transkripcijskim faktorom potrebnim za ekspresiju rRNA. Inhibicija RNA polimeraze I (Pol I) s aktinomicinom D, ali ne i inhibicija Pol II s α-amanitinom, narušila je lokalizaciju Vps34 u
jezgrici te kontakt s UBF-om. Dodatno, imunoprecipitacija UBF-a obilježenog zelenim fluorescentnim proteinom (GFP) u BALB3T3 staničnoj liniji potvrdila je prisutnost Vps34 u istom kompleksu. Inhibicija Vps34 snizila je mTOR-posredovanu fosforilaciju S6K1 i S6 u MK te inhibirala sintezu rRNA u BALB3T3, sugerirajući kako bi Vps34 mogao imati važnu,
dosad neistraženu, ulogu u biogenezi ribosoma te organizaciji i funkciji jezgrice. Pokušaji da proizvedemo stabilnu staničnu liniju s deletiranim Vps34 pomoću CRISPR/Cas9 tehnologije za uređivanje gena bili su uspješni samo za jednu Vps34 izoformu koja sadrži egzon 2. Ciljanje drugih egzona nije bilo uspješno, vrlo vjerojatno zbog toga što je Vps34 esencijalan gen te stanice s potpunom delecijom Vps34 ne preživljavaju. Zajedno, rezultati ovog istraživanja doprinose boljem razumijevanju uloge male lipidne molekule PI3P i njene kinaze Vps34 u sazrijevanja MK i stvaranju krvnih pločica, uz do sada neopisanu lokalizaciju i funkciju Vps34 kinaze u jezgrici
Utjecaj cirkadijalnih gena i metamfetamina na oksidativni status Drosophile melanogaster
No full textMethamphetamine (METH) is a potent psychostimulant that causes relapsing substance addiction. Negative consequences of substance abuse are numerous and challenging to study in humans. Fortunately, effects of addictive drugs can be studied in model organisms, such as Drosophila melanogaster or fruit fly. Fruit flies are ideal for this research because their genome is sequenced and extensively studied. Methamphetamine causes elevated reactive oxygen species (ROS) production and disrupts their elimination, leading to oxidative stress. Circadian genes are partially responsible for ROS cycling and in Drosophila four core circadian genes are: period (per), timeless (tim), cycle (cyc) and clock (Clk). In this paper hydrogen peroxide (H2O2) concentration is followed after two exposures to volatilized METH in heads of five fly genotypes: wild type Canton S., per01, tim01, ClkJrk and cyc01. Hydrogen peroxide concentration was measured with dihydroethidium (DHE) stain. Concentration of H2O2 is expected to increase with higher METH exposure, and differences in H2O2 amount should also be noticed between the genotypes. Results show different H2O2 levels among genotypes and this provides insight into the role of circadian genes in the regulation of the oxidative status of Drosophila. The obtained data shows that wild type, per01 and tim01 flies show decrease with first vMETH dose, followed by increase in H2O2 concentration after the second dose. ClkJrk and cyc01 mutants show steady increase in H2O2 concentration with each dose. This shows that irrespective of the mutation METH leads to the increase in the oxidative species and poses questions about the molecular mechanism involved in the regulation of redox state after psychostimulant exposure.Metamfetamin (METH) je snažan psihostimulans koji uzrokuje relapsirajuću ovisnost. Negativne posljedice ovisnosti o drogama brojne su i izazovno ih je izučavati na ljudima. No, učinci droga mogu se vrlo jednostavno inducirati u modelnim organizmima kao što je Drosophila melanogaster ili vinska mušica. Vinske mušice pogodni su organizam za izučavanje u ovakvim istraživanjima jer su njihovi geni sekvencirani i dobro proučeni. Metamfetamin uzrokuje povišenu proizvodnju reaktivnih kisikovih vrsta (ROS) i remeti njihovo uklanjanje, što dovodi do oksidativnog stresa. Cirkadijalni geni su djelomično odgovorni za kruženje ROS-a, a četiri ključna cirkadijalna gena u Drosophile su: period (per), timeless (tim), cycle (cyc) i clock (Clk). Ovaj rad prati koncentraciju vodikovog peroksida (H2O2) u glavama mušica nakon drugog izlaganja volatiliziranom METH-u. Oscilaciju koncentracija pratilo se u pet genotipa mušica (wild type Canton S., per01, tim01, ClkJrk i cyc01) pomoću dihidroetidija (DHE). U rezultatima se očekuju razlike u koncentraciji među genotipovima i porast koncentracije vodikova peroksida sa porastom broja izlaganja METH-u. Rezultati ukazuju na različite razine vodikova peroksida u različitim genotipovima i to pruža uvid u ulogu cirkadijalnih gena u oksidativnom statusu Drosophile. Nadalje, rezultati prikazuju da u wild type, per01 i tim01 mušica, koncentracija H2O2 pada nakon prve, a raste nakon druge vMETH doze, dok u ClkJrk and cyc01 mutanata koncentracija H2O2 raste nakon svake doze vMETH-a. To ukazuje da bez obzira na mutaciju, METH uzrokuje porast oksidativnih vrsta i postavlja pitanja o molekularnim mehanizmima uključenim u regulaciju redoks stanja nakon izlaganja psihostimulansima
Fusobacterium nucleatum: universal colonizer
No full textFusobacterium nucleatum is a Gram-negative obligate anaerobic bacterium in the oral cavity. It plays a role in several oral diseases, including periodontitis and gingivitis but is also associated with a wide spectrum of human diseases throughout the body. The FadA adhesin conserved in F. nucleatum is a key virulence factor and a potential diagnostic marker for F. nucleatum-associated diseases. This thesis reviews F. nucleatum’s implication in periodontitis, colorectal cancer and adverse pregnancy outcomes. The pathogenic mechanisms involved in these diseases are discussed, with a particular emphasis on invasion, colonization, and induction of host inflammatory and tumorigenic responses. Biomarkers are also highlighted in order to improve diagnosis and subsequent treatment of these diseases.Fusobacterium nucleatum je gram-negativna obligatna anaerobna bakterija koja obitava u usnoj šupljini. Igra ulogu u nekoliko oralnih bolesti, uključujući parodontitis i gingivitis, ali je također povezana sa širokim spektrom ljudskih bolesti koje obuhvaćaju cijelo tijelo. Adhezin FadA konzerviran u F. nucleatum-u ključni je faktor virulencije i potencijalni dijagnostički marker za bolesti povezane s F. nucleatum-om. Ovaj rad razmatra implikacije F. nucleatum-a u parodontitisu, kolorektalnom karcinomu i nepovoljnim ishodima trudnoće. U radu se opisuju patogeni mehanizmi uključeni u ove bolesti, s posebnim naglaskom na invaziju, kolonizaciju i indukciju upalnih i tumorigenih odgovora domaćina. Biomarkeri su također istaknuti kako bi se poboljšala dijagnoza i liječenje navedenih bolesti
Dizajn peptidnih mimetika "Spike" proteina SARS-CoV-2 virusa na temelju sposobnosti samo-sastavljanja peptida
No full textSupramolecular chemistry is a discipline that studies the characteristics
of non-covalent bonds between molecules and / or ions. Advances in
supramolecular chemistry in the last two decades have enabled the fabrication
and design of peptide nanostructures. Peptides are biological molecules whose
sequences are naturally self-assembled in water and organized into
nanostructures. They are often investigated as carriers in targeted drug
delivery, and their purpose has been found in the fight against the pandemic
caused by the SARS-CoV-2 virus. This member of the beta-coronavirus group
infects cells and tissues by binding to ACE2 and NRP1 receptors with the S-
protein. The aim of this study was to design and prepare a minimalist peptide
version of the SARS-CoV-2 virus based on S-protein. Peptide mimetics
consisted of amino acids identified at the S-protein binding site (RBM) that
interact with the ACE2 and NRP1 receptors. After amino acid identification
using Pymol computer applications, three peptide sequences were designed:
FFLYY, FFLYYKK, and KYLFFQTY. Physiochemical characteristics of peptides
were determined by MALDI TOF / TOF MS and OD measurements. The
formation of spherical nanostructures was examined by determining the
critical concentration of micellization (CMC) using fluorescent
spectrophotometer and pyrene as a fluorescent probe. The peptides FFLYYKK
and KYLFFQTY form micelles at 0.65 mM and 2.15 mM, respectively. The
formation of micelles for the FFLYY peptide cannot be confirmed with certainty
as it failed to dissolve completely in the DMSO/water mixture. It also showed
the highest optical density, while the other peptides were well soluble in
aqueous solution. In future research, additional confirmation of the micelle
formation by ATF-FTIR spectroscopy and the atomic force microscope is
required. It is also necessary to examine their toxicity and the possibility of
binding and entering neurons and astrocytes whose morphological changes
would be monitored by fluorescence microscopy. Successful binding of peptide
mimetics to ACE2 and NRP1 may block virus entry and the influence on cells
would explain possible neurocognitive difficulties caused by infection.Supramolekularna kemija je disciplina koja proučava karakteristike
nekovalentnih veza između molekula i/ili iona. Napredak u području
supramolekularne kemije u posljednja dva desetljeća unaprijedio je dizajn i
primjenu peptidnih nanostruktura. Peptidi su biološke molekuke čije se
sekvence prirodnim procesom samo-sastavljanja u vodi organiziraju u
nanostrukture. Njihovom manipulacijom nastaju funkcionalni biokompatibilni
materijali. Često se istražuju kao nosači pri ciljanoj dostavi lijekova, a svoju
svrhu pronašli su i u borbi protiv pandemije uzrokovane SARS-CoV-2 virusom.
Ovaj pripadnik skupine betakoronavirusa inficira stanice i tkiva vežući se na
ACE2 i NRP1 receptore pomoću S-proteina. Cilj ovog istraživanja bio je
dizajnirati i pripremiti minimalističke peptidne verzije SARS-CoV-2 virusa.
Peptidni mimetici sastojali su se od aminokiselina identificiranih na veznom
mjestu S-proteina (RBM) kojim se veže na ACE2 i NRP1 receptore. Nakon
identifikacije aminokiselina pomoću računalne aplikacije Pymol, dizajnirane su
tri peptidne sekvence: FFLYY, FFLYYKK i KYLFFQTY. Fizio-kemijske
karakteristike peptida određene su metodama matricom potpomognute
laserske desorpcije/ionizacije (MALDI TOF/TOF MS) i mjerenjem optičke
gustoće (eng. optical density, OD). Formiranje sfernih nanostruktura
procesom samo-sastavljanja ispitivalo se određivanjem kritične koncentracije
micelizacije (eng. critical micelle concentration, CMC) metodom
spektrofotometrije i pirenom kao fluorescentnom probom. Peptidi FFLYYKK i
KYLFFQTY formiraju micele pri 0.65 mM i 2.15 mM. Formiranje micela za
peptid FFLYY ne može se sa sigurnošću potvrditi s obzirom da se nije uspio
potpuno otopiti u otopini DMSO-a i vode. On je pokazao i najveću optičku
gustoću, dok su ostali peptidi bili dobro topivi u vodenoj otopini. U budućim
istraživanjima potrebno je provesti dodatnu potvrdu agregacije peptida
pomoću infracrvene spektroskopije s Fourierovom transformacijom (ATFFTIR)
i mikroskopa atomskih sila (eng. atomic force microscope, AFM).Također je potrebno ispitati njihovu toksičnost te mogućnost vezanja na receptore i ulazak peptidnih nanostruktura u stanice neurona i astrocita čije
će se morfološke promjene pratiti fluorescentnim mikroskopom. Uspješno
vezanje peptidnih mimetika za ACE2 i NRP1 može blokirati ulazak virusa, a
djelovanje na moždane stanice objasnit će neurokognitivne poteškoće koje
nastaju kao posljedica infekcije
Antitumor Mechanisms of Biologically Compounds from Medicinal Mushrooms on the Colorectal Cancer Model
No full textKolorektalni karcinom (CRC) treća je najčešća vrsta karcinoma kod muškaraca i žena, s oko 35% pacijenata kojima je dijagnosticirana metastatska bolest u IV stadiju. Unatoč napretku u liječenju, očekivano trajanje života u bolesnika s etastatskom bolešću još uvijek nije zadovoljavajuće. Zbog česte rezistencije na lijekove tijekom konvencionalnih i ciljanih tretmana karcinoma, razvoj i ispitivanje terapija koje djeluju na više ciljeva važno je polje istraživanja. Izolirani spojevi specifični za ljekovite gljive, kao i složene smjese ekstrakata, detaljno su proučavani, a mnoge vrste gljiva dokazano su netoksični inhibitori raznih specifičnih onkogenih putova, kao i snažni imunomodulatori. Utvrdili smo značajan antiproliferativni i proapoptotički učinak ljekovitih gljiva pripravaka AGARIKON.1 i AGARIKON PLUS na ne-kolorektalne (A549, MCF-7, MIA PaCa2, HepG2) i kolorektalne (HCT-116, SW620) tumorske stanične linije, dok je učinak na staničnu liniju ljudskih fibroblasta (WI-38) bio proliferativan. Dalje smo istraživali učinak ljekovitih gljivičnih pripravaka AGARIKON.1 i AGARIKON PLUS u različitim kombinacijama s 5- fluorouracilom na modelu kolorektalnog karcinoma CT26.WT. Budući da je liječenje započelo tek nakon 14 dana nakon inokulacije tumora, ovo predstavlja vrlo kasni tumorski model uznapredovalog metastatskog karcinoma. Rezultati pokazuju da AGARIKON.1 i AGARIKON PLUS pokazuju imunostimulacijska i antiangiogena svojstva koja različito utječu na preživljenje: AGARIKON PLUS ima najslabiji učinak na povećanje ukupnog preživljenja (engl. overall survival) (OS = 22,2%), u kombinaciji sa 5-FU značajno ga produžuje u odnosu na negativnu kontrolu (OS = 87,5%), ali ne statistički značajno više u odnosu na 5-FU (OS = 77,7%) samostalno. Antitumorski učinci AGARIKON.1 i AGARIKON PLUS, sa ili bez 5-fluorouracila, temelje se na povećanju polarizacije M1 makrofaga, inhibiciji polarizacije M2 i TAM, učincima na profile citokina Th1/Th2/Th17, inhibiciji vaskularnih endotelnih čimbenika rasta (VEGF) i modulaciji metaloproteinaza 2 i 9 (MMP-2 i MMP-9). Neki od ovih učinaka mogu se pripisati antioksidativnoj sposobnosti fenolnih i drugih sastavnica prisutnih u ljekovitim gljivama. Primjena AGARIKON.1 i AGARIKON PLUS nije pokazala genotoksičnost niti bilo kakav štetan učinak na kliničke hematološke ili biokemijske parametre. Nadalje, proteomsko profiliranje tumorskih tkiva otkrilo je da AGARIKON.1 i AGARIKON PLUS sami ili u kombinaciji s 5-fluorouracilom ostvaruju antitumorske učinke utječući na temeljne procese u progresiji raka debelog crijeva (CRC), poput translacije, odgovor na stres nesmotanih proteina (UPR) kao i ciklus lipida i trikarboksilne kiseline (TCA). Ovi podaci pružaju dobru osnovu za proširenu translacijsku studiju.Colorectal cancer (CRC) is the third most frequent cancer type in both males and females, with about 35% of patients being diagnosed in stage IV metastatic disease. Despite advancements in treatment, life expectancy in patients with metastatic disease is still not satisfying. Due to frequent drug resistance during conventional and targeted cancer treatments, the development and testing of multi-target therapies is an important research field. Medicinal mushrooms specific isolated compounds as well as complex extract mixtures have been studied in depth, and many mushroom
species have been proven to be non-toxic multi-target inhibitors of specific oncogenic pathways, as well as potent immunomodulators. We established a significant antiproliferative and proapoptotic effect of medicinal mushroom preparations AGARIKON.1 and AGARIKON PLUS on non-colorectal (A549, MCF-7, MIA PaCa-2, HepG2) and colorectal (HCT-116, SW620) tumor cell lines, while the effect on human fibroblast cell line (WI-38) was proliferative. We further
investigated the effect of medicinal mushroom preparations AGARIKON.1 and AGARIKON PLUS in various combinations with 5-fluorouracil in CT26.WT mouse model. Since the treatment started only after 14 days after tumor inoculation, this represents a very late tumor model of advanced metastatic cancer. The results show that AGARIKON.1 and AGARIKON PLUS exhibit immunostimulatory, antiangiogenic properties which affect survival differently: AGARIKON PLUS has the weakest effect on increasing overall survival (OS = 22.2%), in combination with 5- FU significantly prolongs it in relation to the negative control (OS = 87.5%), but not statistically significantly more in relation to 5-FU (OS = 77.7%) alone. The antitumor effects of AGARIKON.1 and AGARIKON PLUS, with or without 5-fluorouracil, are based on enhancing M1 macrophage polarization, inhibition of M2 and TAM polarization, effects on Th1/Th2/Th17 citokine profiles, direct inhibition of CT26.WT tumor growth, inhibition of vascular endothelial growth factors (VEGF) and metalloproteinases 2 and 9 (MMP-2 and MMP-9) modulation. Some of these effects can be attributed to the antioxidant ability of phenolic and other components present in medicinal mushrooms. The administration of AGARIKON.1 and AGARIKON PLUS did not show
genotoxicity nor any adverse effect on clinical hematological or biochemical parameters. Furthermore, proteomic profiling of tumor tissues revealed that AGARIKON.1 and AGARIKON PLUS alone, or in combination with 5-fluorouracil, exert their antitumor effects by affecting fundamental processes in colorectal cancer (CRC) progression, such as translation, unfolded
protein response (UPR) as well as lipid and tricarboxylic acid cycle (TCA). This data provides good basis for an expanded translational study
Metabolomski pristup posttraumatskom stresnom poremećaju: neciljana i ciljana metabolomska analiza
No full textPosttraumatic stress disorder (PTSD) is a serious and complex neuropsychiatric disorder,
which can develop in a subset of individuals after traumatic event. Traumatic experience has
a major impact on cellular, biochemical and molecular systems, whose biological changes are
manifested through alterations in several organic systems, including variations in various
metabolites levels and different metabolic pathways. Metabolomics, as one of the “omics”
techniques, represent a useful tool for determining the changes in metabolites and
corresponding metabolic pathways in PTSD. The aim of this study was to identify and
(semi)quantitate altered metabolites in plasma of PTSD patients in comparison to healthy
control subjects in order to elucidate changes in metabolic pathways and select metabolites
that could represent new potential biomarkers of PTSD. The study included two research
approaches, untargeted and targeted metabolomic analysis. The untargeted analysis enrolled
two cohorts. Exploratory group included 50 PTSD patients and 50 healthy control subjects,
whereas a validation group enrolled 52 PTSD veterans and 52 control subjects. The cohort
enrolled in targeted metabolomic analysis has been comprised of 235 PTSD subjects and 241
healthy control individuals. The metabolomic analysis of plasma samples was conducted using
liquid chromatography coupled with mass spectrometry (LC-MS) and gas chromatography
coupled with mass spectrometry (GC-MS). After untargeted analysis, most of the compounds
altered in PTSD belonged to the group of glycerophospholipids, while levels of
lysophosphytydilethanolamine LPE(18:1) and lysophosphytydilcholine LPC(18:1) were
significantly different in control subjects and PTSD patients in both cohorts. After targeted
analysis, concentrations of 15 metabolites have been significantly changed in PTSD patients
in comparison to healthy individuals. The altered metabolites in plasma of PTSD subjects are
associated with several biological processes, including inflammation, mitochondrial function,
TCA cycle, HPA axis activity oxidative stress, neurotoxicity, membrane integrity and energy
production. The obtained results might contribute to the improvement or development of
novel therapeutic approaches for PTSD. Moreover, identified metabolites might represent
potential diagnostic, predictive and prognostic metabolomic biomarkers for PTSD.Posttraumatski stresni poremećaj (PTSP) je ozbiljan, stresom izazvani neuropsihijatrijski
poremećaj koji se može razviti u pojedinih osoba nakon izlaganja ili svjedočenja nekom
traumatskom događaju. PTSP je karakteriziran specifičnom grupom simptoma koji uključuju
ponovno proživljavanje traumatskog događaja, izbjegavanje i zatupljenost emocija, gubitak
interesa, negativne promjene razmišljanja i raspoloženja te brojne druge dodatne simptome.
Etiologija PTSP-a je kompleksna i još uvijek nejasna, međutim uključuje traumatski događaj te
biološku predispoziciju. Rezultira iz kompleksne interakcije gena i okoliša. Traumatsko
iskustvo utječe na brojne stanične, biokemijske i molekularne procese, što dovodi do pojave
različitih psiholoških i fizioloških promjena, uključujući promjene u razini metabolita i
odgovarajućih metaboličkih puteva. Metabolomika je grana znanosti, dio “omics” tehnologije
koja se bavi kemijskim procesima koji uključuju metabolite. Metaboliti su male molekule,
poput aminokiselina, nukleinskih kiselina, jednostavnih ugljikohidrata, masnih kiselina,
vitamina, organskih kiselina i ostalih skupina spojeva mase do 1.5 kDa. S obzirom na pristup,
metabolomika se može podijeliti na ciljanu i neciljanu metabolomsku analizu. Stoga,
metabolomika predstavlja odličan pristup za određivanje promijenjenih metabolita i
odgovarajućih metaboličkih puteva kod bolesnika s PTSP-om.
Cilj ovog istraživanja je bio identificirati i kvantificirati promijenjene metabolite u plazmi
bolesnika s PTSP-om i zdravih kontrolnih ispitanika kako bi se rasvijetlili promijenjeni
metabolomski putevi i utvrdili metaboliti koji bi mogli predstavljati nove potencijalne
biomarkere PTSP-a. Istraživanje je obuhvatilo oba metabolomska pristupa, neciljanu i ciljanu
metabolomsku analizu. Neciljana metabolomska analiza se najčešće koristi s ciljem otkrivanja
promijenjenih metabolita bez prethodno postavljene hipoteze, dok se u ciljanu analizu kreće
s unaprijed postavljenom hipotezom. Neciljana metabolomska analiza uključivala je dvije
kohorte ispitanika. Prva istraživačka skupina obuhvaćala je 50 bolesnika s PTSP-om i 50
zdravih kontrolnih ispitanika, dok je validacijska grupa uključivala 52 veterana s PTSP-om i 52
kontrolne zdrave osobe. S obzirom da je većina promijenjenih metabolita nakon neciljane
analize pripadala skupini lipida, ciljana metabolomska analiza uključila je različite lipidne
spojeve. Ciljana metabolomska analiza obuhvatila je 235 ispitanika s PTSP-om i 241 zdrave
kontrole. Metabolomska analiza uzoraka plazme provedena je primjenom tekućinske kromatografije združene s masenom spektrometrijom i plinske kromatografije združene s
masenom spektrometrijom.
Nakon neciljane metabolomske analize, većina promijenjenih spojeva pripadala je skupini
glicerofosfolipida, dok su lizofosfatidiletanolamin LPE(18:1) i lizofosfatidilkolin LPC(18:1) bili
jedini statistički značajno različiti metaboliti između kontrolnih ispitanika i pacijenata s PTSPom, identificirani u obje kohorte. Ostali značajno promijenjeni metaboliti u ispitanika s PTSPom pripadali su skupini aminokiselina, karnitina, jednostavnih šećera te organskih kiselina.
Najveći broj identificiranih značajno promijenjenih metabolita u PTSP-u nakon neciljane
metabolomske analize bili su lipidi ili njihovi derivati, stoga je ciljana metabolomska analiza
uključila različite skupine lipidnih spojeva. Nakon ciljane metabolomske analize, od 156
analiziranih lipidnih metabolita, 15 metabolita je bilo statistički značajno različito između
bolesnika s PTSP-om i kontrolnih zdravih ispitanika, uključujući 4 fosfatidilkolina, 2
fosfatidiletanolamina, 5 sfingomijelina, 2 kolesterol estera i 2 ceramida. Promijenjeni
metaboliti mogu predstavljati potencijalne dijagnostičke, prediktivne ili prognostičke
metabolomske biomarkere PTSP-a.
Metaboliti u plazmi koji se razlikuju između bolesnika s PTSP-om i kontrolnih zdravih
ispitanika, a koji su utvrđeni neciljanom i ciljanom metabolomskom analizom, povezani su s
različitim biološkim procesima, kao što su upalni procesi, mitohondrijska disfunkcija,
promjene u ciklusu limunske kiseline, oksidativni stres, neurotoksičnost, promjene na
staničnim membranama te poremećaji energetskog metabolizma. Dobiveni rezultati mogli bi
pridonijeti poboljšanju ili razvoju novih terapijskih pristupa za PTSP. Nadalje, identificirani
metaboliti mogu predstavljati potencijalne dijagnostičke, prediktivne ili prognostičke
metabolomske biomarkere PTSP-a
Lijekovima inducirani i genetički modeli miševa manične faze bipolarnog poremećaja
No full textBipolar disorder is a psychiatric disorder that greatly affects a patient’s day-to-day functioning and is characterised by recurrent manic and depressive episodes. Current mania treatments do not show efficacy for all patients, increasing the need for targeted therapeutic development. The drug development process includes its assessment using applicable animal models, which are sparse for mania in bipolar disorder. An ideal mouse model of mania should fulfil the three validity criteria, as well as display specific endophenotypes comparable to those in human patients. In the thesis, I reviewed some suggested mice models of mania in bipolar disorder, which are either a result of genetic manipulations or induced by drug administration. Single genetic manipulations focused on genes related to the circadian rhythm and dopaminergic, serotonergic, and glutamatergic systems resulted in mice models such as the Clock Δ19 and DAT knockdown mutant mice, which show a limited number of symptoms, predominantly locomotor hyperactivity. In comparison, an amphetamine-induced mouse model of mania showed limited results, suggesting that genetic models are more appropriate. The complex symptomatology of mania has yet to be fully reflected successfully in mouse models, which are mostly based on simple behavioural abnormalities. Regardless, the mutual comparison and assessment of known models allows the establishment of future directions in mouse model of mania development. Highlighting the use of multivariate approaches such as genetic information from human studies, extensive behavioural testing, and objective quantification of behaviours with cross-species paradigms will enable further advancement towards an ideal model of mania.Bipolarni poremećaj je psihijatrijski poremećaj koji uvelike utječe na svakodnevne funkcije pacijenta i karakteriziran je ponavljajućim epizodama manije i depresije. Trenutno dostupni tretmani manije nisu učinkoviti za sve pacijente, uvelike povećavajući potrebu za razvojem ciljanih terapija. Proces razvoja lijekova uključuje njegovo testiranje na odgovarajućim životinjskim modelima koji su rijetki za maniju u bipolarnom poremećaju. Idealni mišji model manije trebao bi zadovoljavati tri kriterija valjanosti, kao i prikazati specifične endofenotipove usporedive s onima zabilježenim kod ljudskih pacijenata. Ovaj rad uključuje pregled nekih od predloženih mišjih modela manije, koji su produkt genetskih manipulacija ili inducirani administracijom lijekova. Pojedinačne genetske manipulacije usredotočene na gene povezane s cirkadijalnim ritmom te dopaminergičkim, serotonergičkim i glutamatergičnim sustavima rezultirale su mišjim modelima kao što su Clock Δ19 i DAT knockdown mutantski miševi, koji pokazuju ograničen broj simptoma, pretežno lokomotornu hiperaktivnost. Za razliku od njih, amfetaminom induciran mišji model manije pokazao je ograničene rezultate, ukazujući na to da su genetski modeli prikladniji za primjenu. Složena simptomatologija manije još nije u potpunosti odražena u mišjim modelima, koji se uglavnom temelje na jednostavnim poremećajima u ponašanju. Bez obzira na to, međusobno uspoređivanje i procjena poznatih modela omogućuje uspostavljanje budućih pravaca u razvoju mišjeg modela manije. Uporaba multivarijantnih pristupa, kao što su korištenje genetskih informacija iz ljudskih istraživanja, razvoj opsežnih testova ponašanja te objektivna kvantifikacija ponašanja u kombinaciji sa razvojem međuvrsnih paradigmi omogućit će daljnji napredak u dizajnu idealnog modela manije
Dijagnostički, prognostički i terapijski značaj profiliranja N-glikoma kod kolorektalnog karcinoma
No full textKolorektalni karcinom (CRC, engl. colorectal cancer) nastaje kada stanice u debelom crijevu ili rektumu izgube svoju sposobnost kontrole diobe i preživljavanja nakon čega dolazi do njihovog abnormalnog rasta. S otprilike 1,8 milijuna novih slučajeva u 2018., CRC je treći najčešći karcinom u muškaraca i drugi u žena te drugi najsmrtonosniji karcinom u svijetu. Povećana razina CEA ili CA19-9 u serumu ukazuje na prisutnost CRC-a. Međutim, mjerenje njihovih razina kao test za CRC pokazuje smanjenu osjetljivost i specifičnost, što isključuje njihovu uporabu za ranu dijagnozu, ali pomaže u procjeni i praćenju bolesti tijekom liječenja. S obzirom na nemogućnost korištenja CEA i CA 19-9 za detekciju CRC-a, velika je potreba za novim biomarkerima. Rana dijagnoza bolesti pomoću novih biomarkera bila bi značajna zbog činjenice da je petogodišnja stopa preživljavanja veća od 95% ukoliko je tumor još uvijek lokaliziran. Promijenjena glikozilacija proteina na površini stanice ili u sekretomu prepoznata je kao čimbenik koji može uzrokovati, pridonijeti ili rezultirati razvojem raznih bolesti uključujući CRC. Kod karcinoma, promijenjena glikozilacija čini bitnu stavku jer glikoproteini specifični za tumor igraju ključnu ulogu u rastu, diferencijaciji, transformaciji, adheziji, migraciji i invaziji stanica te metastazama karcinoma. Stoga se profiliranjem N-glikoma pokušavaju pronaći novi biomarkeri korisni za dijagnozu, prognozu i terapiju CRC-a. Jedan od predloženih biomarkera za dijagnozu je omjer glikana H5N4S2/H5N4S1 analiziran u serumu oboljelih od CRC. Smanjena galaktozilacija i sijalinizacija fukoliziranog IgG-a te povećana razina razgranatog (engl. bisecting) GlcNAc u strukturi imunoglobulina G (IgG) čvrsto su povezani s nastankom CRC-a i smrtnim ishodom ove bolesti. Smanjena sijalinizacija IgG-a rezultira proupalnom aktivnošću povezanom s lošijom prognozom. Profiliranje N-glikoma ima značaj i u terapiji, gdje se uvidjelo da terapija zračenjem povećava ekspresiju ST6GAL1 enzima rezultirajući porastom sijalinizacije nekoliko membranskih glikoproteina, što potiče stvaranje metastaza. Potrebna su daljnja istraživanja kako bi se utvrdila točna uloga ovih promjena N-glikoma u progresiji CRC-a. Boljim uvidom u utjecaj
različitih razina glikanskih struktura u CRC-u na mehanizme održavanja homeostaze i razvoja tumora, profiliranje N-glikoma može dobiti na iznimnoj važnosti u svakodnevnim kliničkim testiranjima te razvoju novih terapija
Kortikalna plastičnost u višejezičnim osobama
No full textNeurološka osnova jezika, od učenja do njegovih funkcija kao što su gramatika i govor do njegovih patoloških problema, tema je znanstvenog istraživanja više od stoljeća. Dosadašnja otkrića uglavnom su povezivala jezik s frontalnim i temporalnim režnjevima korteksa, polazeći od izvorne veze iz 19. stoljeća s Brocinim i Wernickeovim područjem. Višejezičnost, nekoć kritizirana kao "zbunjujući utjecaj na djecu", polako je opisana kao značajni pokretač neuroplastičnih promjena u mozgu. Od pojave funkcionalne magnetske rezonancije (fMRI), sve veći broj studija povezuje višejezičnost sa strukturnim i funkcionalnim promjenama, i to ne samo u primarnoj frontotemporalnoj regiji. Budući da jezik koristi iznimno širok raspon kognitivnih funkcija (od sluha preko obrade do govora), tijekom učenja i korištenja stranog jezika stimulira se široka kortikalna mreža. Zanimljivo je da neuroplastičnost koju izaziva višejezičnost ovisi o nekoliko čimbenika: dobi učenja, kombinaciji jezika, razini tečnosti itd., koji sve vode do značajno različitih prilagodbi u mozgu. Od posebnog medicinskog interesa je veza između višejezičnosti i demencije, jer mnoge studije ukazuju na neuroprotektivni učinak usvajanja jezika i upotrebe drugog jezika. Ovaj pregled sažima neke od najrelevantnijih nalaza na tom području u posljednja dva desetljeća, kao i odabir mišljenja istaknutih stručnjaka na području dvojezičnosti i neurolingvistike.The neural basis of language, from acquisition to its functions such as grammar and speech to its pathological issues, has been under scientific exploration for well over a century. Findings so far have mainly linked language to the frontal and temporal lobes of the cortex, extending from the original 19th century association with Broca and Wernicke’s areas. Multilingualism, once discouraged as a “distracting influence on children” has slowly been described as a major driver of neuroplastic change in the brain. Since the advent of functional magnetic resonance imaging (fMRI), an increasing number of studies have linked multilingualism to both structural and functional changes, not only in the primary frontotemporal region. Since language employs an extremely wide variety of cognitive functions (from hearing to processing to speech), a wide cortical network is stimulated when learning and using non-native language. The neuroplasticity induced by multilingualism, interestingly, seems to be dependent on several factors: age of acquisition, combination of languages, level of fluency etc., all leading to significantly different adaptations in the brain. Of particular medical interest is the link between multilingualism and dementia, as many studies suggest a neuroprotective effect of language acquisition and second language use. This review summarises some of the most relevant findings in the field over the past two decades, as well as a selection of opinions by the prominent experts in bilingualism and neurolinguistics
Dipeptidyl Peptidase IV (DPP IV/CD26) Inhibitors in the Treatment of Type 2 Diabetes
No full textŠećerna bolest ili dijabetes (lat. diabetes mellitus) kronična je metabolička bolest čije su glavne karakteristike perzistentna hiperglikemija te poremećaji u metabolizmu ugljikohidrata, proteina i masti. Razlikujemo šećernu bolest tipa 1, šećernu bolest tipa 2, gestacijski dijabetes te ostale manje zastupljene oblike. Šećerna bolest, zbog svoje brzorastuće prevalencije i incidencije te visoke stope smrtnosti predstavlja veliki javnozdravstveni problem. Dipeptidil-peptidaza IV ili molekula CD26 (DPP IV/CD26) serinska je proteaza i ubikvitinirani multifunkcionalni glikoprotein uključen u brojne fiziološke i patološke procese. Važan je čimbenik u održavanju homeostaze glukoze, prvenstveno jer razgrađuje inkretine. Inhibicija enzimske aktivnosti DPP IV/CD26 pokazala se kao terapija visokog potencijala. Cilj ovog završnog rada je iznijeti pregled različitih aspekata šećerne bolesti, osobito modernijih mogućnosti terapije, s naglaskom na inhibitore DPP IV/CD26 kao učinkovite terapijske opcije.Diabetes (lat. Diabetes mellitus) is a chronic metabolic disease whose main characteristics are persistent hyperglycemia and disturbances in the metabolism of carbohydrates, proteins and fats. Known subtypes are type 1 diabetes, type 2 diabetes, gestational diabetes and other less common forms. Diabetes is a major public health problem due to its rapidly increasing prevalence and incidence and a high mortality rate. Dipeptidyl peptidase IV or CD26 molecule (DPP IV/CD26) is a serine protease and a ubiquitinated multifunctional glycoprotein involved in a number of physiological and pathological processes. It is an important factor in the maintenance of glucose homeostasis, mainly due to its ability to degrade incretins. Inhibition of DPP IV/CD26 enzyme activity has been shown as a high-potential therapy. The aim of this thesis was to provide an overview of various aspects of diabetes, particularly more modern treatment options, with a focus on DPP IV/CD26 inhibitors as effective therapeutic options