Repository of the University of Rijeka, Department of Biotechnology
Not a member yet
715 research outputs found
Sort by
ISRIB, PKR-mediated translational arrest inhibitor, enables efficient HSV-1 replication in ADAR1 deficient cells
No full textHerpes simpleks virus (HSV) je dvolančani DNA virus koji sudjeluje u razvoju različitih bolesti. Na razvoj HSV-1 infekcije utječu brojni faktori domaćina odnosno stanice (tzv. faktori virulencije) među kojima je ADAR1 protein. ADAR1 je jedan od glavnih enzima koji editira RNA te regulira brojne obrambene mehanizme stanice, uključujući modulaciju aktivacije protein kinaze R (PKR). Aktivacija PKR može dovesti do prekida sinteze proteina te time onemogućiti efikasnu replikaciju virusa. Osim proteina domaćina, brojni nestrukturni proteini virusa, poput ICP34.5, glavnog faktora neurovirulencije, inhibiraju signalne putove koji se preklapaju s ADAR1 regulacijom, uključujući PKR obranu domaćina. Koristeći se metodama transfekcije, Western Blot analize i titracije, naša istraživanja su pokazala da u stanicama s smanjenom ili dokinutom ekspresijom ADAR1 dolazi do aktivacije PKR nakon infekcije s HSV-1, neovisno o prisutnosti ICP34.5, virusnog inhibitora istih signalnih puteva. Ovi rezultati sugeriraju da je u nedostatku ADAR1 PKR aktivacijski signal presnažan i da ICP34.5 nema sposobnost inhibicije ili do aktivacije dolazi prije značajne ekspresije ICP34.5. Naša hipoteza je da će se inhibicijom aktiviranog PKR-posredovanog prekida sinteze proteina dovesti do poboljšane replikacije virusa u stanicama s nedostatkom ADAR1.
U idućem dijelu eksperimenta, uspješno smo potvrdili provirusnu ulogu ADAR1 enzima i naknadno dodane molekule ISRIB. ISRIB je farmakološki inhibitor koji se veže na eIF2β i time premošćuje aktivaciju eIF2α te omogućuje daljnju sintezu proteina. Naše istraživanje je potvrdilo našu hipotezu, odnosno tretiranje stanica s ISRIB dovelo je do pojačane replikacije virusa u ADAR1 KO stanicama. Međutim, na naše iznenađenje, otkrili smo da dodatak ISRIB-a kod HSV-1 infekcije rezultira i smanjenom aktivacijom kinaze PKR. Ovi rezultati ukazuju na potencijalni mehanizam regulatorne povratne sprege, međutim točan mehanizam tek treba biti potvrđen.Herpes simplex virus (HSV) is a double-stranded DNA virus that participates in the development of various diseases. The development of HSV-1 infection is influenced by numerous host or cell factors (so-called virulence factors), among which is the ADAR1 protein. ADAR1 is one of the main enzymes that edit RNA and regulate numerous defense mechanisms of the cell, including the modulation of protein kinase R (PKR) activation. Activation of PKR can lead to block of protein synthesis and thereby prevent efficient viral replication. In addition to host proteins, a number of viral nonstructural proteins, such as ICP34.5, a major neurovirulence factor, inhibit signaling pathways that overlap with ADAR1 regulation, including host defense PKR. Using the methods of transfection, Western Blot analysis and titration, our research showed that in cells with reduced or terminated expression of ADAR1, activation of PKR occurs after HSV-1 infection, regardless of the presence of ICP34.5, a viral inhibitor of the same signaling pathways. These results suggest that in the absence of ADAR1, the PKR activation signal is too strong and that ICP34.5 has no inhibitory capacity or activation occurs before significant ICP34.5 expression. Our hypothesis is that inhibition of activated PKR-mediated shutoff of protein synthesis will lead to enhanced viral replication in ADAR1-deficient cells.
In the next part of the experiment, we successfully confirmed the proviral role of the enzyme ADAR1 and the subsequently added molecule ISRIB. ISRIB is a pharmacological inhibitor that binds to eIF2β and thereby supresses the activation of eIF2α and enables further protein synthesis. Our research confirmed our hypothesis, i.e. treatment of cells with ISRIB led to enhanced virus replication in ADAR1 KO cells. However, to our surprise, we discovered that the addition of ISRIB in HSV-1 infection also results in reduced activation of the PKR kinase. These results suggest a potential regulatory feedback mechanism, however the exact mechanism remains to be confirmed
Genetička ablacija ADAR1, ADAR2 i ADAR3 koristeći CRISPR/Cas9 tehnologiju
No full textPosttranscriptional modifications are poorly understood cellular phenomenon. C6 deamination of adenosine to inosine is a common dsRNA modification carried out by ADAR family of enzymes. ADAR1, the chief editor, has two isoforms: interferon inducible p150 and constitutively expressed p110. ADAR2 is the other active cellular editor, while ADAR3 has no notable editing activity. Editing alters RNA structure leading to induction of various changes. Both RNA and DNA molecules are edited by ADAR. While cellular editing by ADARs plays a role in maintaining cellular homeostasis, the phenomenon has also been recorded during viral infection. Although they are well documented editors in infection with dsRNA viruses, role of ADARs during infection with dsDNA viruses remains unclear and seemingly varies. This project aimed to explore the role ADARs play during infection with dsDNA viruses using HSV-1 as a model. CRISPR/Cas9 method was used to try to generate ADAR KO cells lines. While ADAR2 KO failed, ADAR1 KO was partly successful. An improved CRISPR/Cas9 system that uses conditional expression might be used to successfully generate these cell lines. ADAR3 protein levels were undetectable by Western blot, so success of KO remains to be tested. Interferon inducible p150 isoform of ADAR1 was successfully ablated, while its p110 isoform remains functional. Such cell line opens the possibility of further exploring the role of p150 isoform during infection with HSV-1 and other dsDNA viruses.Posttranskripcijske modifikacije nedovoljno su shvaćeni stanični fenomen. C6 deaminacija adenozina u inozin je česta modifikacija dvolančane RNK koju provodi obitelj enzima ADAR. ADAR1, glavni editor, ima dvije izoforme: interferonom inducibilni p150 i konstitutivno eksprimirani p110. ADAR2 je drugi aktivni efektor, dok ADAR3 nema zapaženu aktivnost modificiranja. Modifikacijom se mijenja struktura RNK što dovodi do indukcije raznih promjena. ADAR-i modificiraju i RNK i DNK molekule. Dok stanično modificiranje pomoću ADAR-a igra ulogu u održavanju stanične homeostaze, fenomen je također zabilježen tijekom virusne infekcije. Iako su dobro dokumentirani editori u infekciji s dvolančanim RNK virusima, uloga ADAR-a tijekom infekcije s dvolančanim DNK virusima ostaje nejasna i naizgled varira. Ovaj projekt je imao za cilj istražiti ulogu ADAR-a tijekom infekcije dvolančanim DNK virusima koristeći HSV-1 kao model. Metoda CRISPR/Cas9 korištena je za pokušaj stvaranja ADAR KO staničnih linija. Dok ADAR2 KO nije uspio, ADAR1 KO bio je djelomično uspješan. Poboljšani CRISPR/Cas9 sustav koji koristi uvjetnu ekspresiju mogao bi se koristiti za uspješno generiranje ovih staničnih linija. Razine ADAR3 proteina nisu bile detektirane Western blotom, tako da uspješnost KO ostaje neodređena i treba se ispitati. Interferonom inducibilna izoforma ADAR1 p150 uspješno je ablirana, dok je njegova izoforma p110 ostala funkcionalna. Takva stanična linija otvara mogućnost daljnjeg istraživanja uloge izoforme p150 tijekom infekcije HSV-1 i drugim dvolančanim DNK virusima
Neutrophil gelatinase – associated lipocalin (NGAL) as a biological marker of kidney damage in patients with diabetes
No full textCilj istraživanja: Lipokalin povezan s neutrofilnom gelatinazom (NGAL) protein je od 25 kDa, dio je superporodice lipokalina i prvotno je pronađen u aktiviranim neutrofilima. Usporediti koncentracije markera NGAL-a kod bolesnika s teškom i bolesnika s umjerenom neproliferativnom dijabetičkom retinopatijom. Usporediti koncentracije vitamina D kod bolesnika s teškim i s umjerenim NPDR-om. Utvrditi korelaciju između koncentracija NGAL-a u urinu i omjera neutrofila i limfocita (NRL-a) kao i korelaciju između koncentracija NGAL-a u urinu i monocita i limfocita (MRL-a).
Ispitanici i metode: Ovo istraživanje uključilo je 40 ispitanika koji boluju od dijabetes melitus tipa 2, neproliferativne dijabetičke retinopatije (NPDR) i oticanja mrežnice (DME) koji su liječeni na Klinici za očne bolesti KBC-a Split u razdoblju od prosinca 2022. do ožujka 2023. godine. Uzorci su obrađeni i analizirani na Zavodu za medicinsko laboratorijsku dijagnostiku KBC Split. Prikupljeni su klinički podaci o dijagnozi ispitanika te su napravljena različita mjerenja i biokemijska ispitivanja.
Rezultati: Skupina bolesnika s teškim oblikom NPDR nije se razlikovala u temeljnim karakteristikama u odnosu na skupinu s umjerenim oblikom NPDR osim u vidnoj oštrini (0,46 (0,11-0,75) LogMAR vs. 0,65 (0,21-0,89) LogMAR, p = 0,032) i CST-u (354 (281-401) μm vs. 394 (324-470) μm, p = 0,003). Značajne razlike uočene su kod koncentracije NGAL-a u bolesnika s teškim oblik NPDR-a u odnosu na bolesnike s umjerenim oblikom NPDR-a (62,5 (10,0-841,0) ng/mL vs. 377,0 (180,8-1000,3) ng/mL, p = 0,020). Koncentracije vitamina D bile su značajno veće u bolesnika s umjerenim NPDR-om u odnosu na bolesnike s teškim oblikom NPDR-a (57,0 (39,8-71,3) nmol/L vs. 42,4 (25,4-69,9) nmol/L, p = 0,006). Nije utvrđena korelacija između koncentracija NGAL-a u urinu i NLR-a (r = -0,105, p = 0,588) kao ni korelacija između koncentracija NGAL-a u urinu i MLR-a (r = -0,135, p = 0,486).
Zaključak: Usprkos nedvojbenim rezultatima dosadašnjih istraživanja, potrebna su daljnja istraživanja kako bi se NGAL potvrdio kao pouzdan i relevantan biomarker za bubrežna oboljenja.Objectives: Neutrophil gelatinase-associated lipocalin (NGAL) is a 25-kDa protein, part of the lipocalin superfamily, and was originally found in activated neutrophils. To compare NGAL marker concentrations in patients with severe and patients with moderate non-proliferative diabetic retinopathy. To compare vitamin D concentrations in patients with severe and moderate NPDR. To determine the correlation between the concentration of NGAL in urine and the ratio of neutrophils and lymphocytes (NRL), as well as the correlation between the concentration of NGAL in urine and monocytes and lymphocytes (MRL).
Patients and methods: This study included 40 subjects suffering from type 2 diabetes mellitus, non-proliferative diabetic retinopathy (NPDR) and retinal edema (DME) who were treated at the KBC Split Eye Disease Clinic in the period from December 2022 to March 2023. The samples were processed and analyzed at the Department of Medical Laboratory Diagnostics, KBC Split. Clinical data on the subject's diagnosis were collected, and various measurements and biochemical tests were performed.
Results: The group of patients with a severe form of NPDR did not differ in basic characteristics compared to the group with a moderate form of NPDR except for visual acuity (0.46 (0.11-0.75) LogMAR vs. 0.65 (0.21-0, 89) LogMAR, p = 0.032) and CST (354 (281-401) μm vs. 394 (324-470) μm, p = 0.003). Significant differences were observed in the concentration of NGAL in patients with a severe form of NPDR compared to patients with a moderate form of NPDR (62.5 (10.0-841.0) ng/mL vs. 377.0 (180 .8-1000.3) ng/mL, p = 0.020). Vitamin D concentrations were significantly higher in patients with moderate NPDR compared to patients with severe NPDR (57.0 (39.8-71.3) nmol/L vs. 42.4 (25.4- 69.9) nmol/L, p = 0.006). No correlation was found between urinary NGAL concentrations and NLR (r = -0.105, p = 0.588) and no correlation between urinary NGAL concentrations and MLR (r = -0.135, p = 0.486).
Conclusion: Regardless of laboratory findings, further research is needed to confirm NGAL as a reliable and relevant biomarker for kidney disease
Communication between cells in the tumor microenvironment
No full textTumori su nakupina stanica koja posjeduje svojstvo nekontroliranog rasta. Na rast i napredovanje tumora utječu stanice koje se nalaze unutar tumorskog mikrookoliša (TME) kao što su; stanice imunosnog sustava, stromalne stanice, egzosomi. Egzosomi su izvanstanične vezikule koje nastaju unutar endosomalnog sustava formiranjem multivezikularnih tijela (MVB). Njihova važnost je porasla kada se uvidjelo kako oni nose odlike stanice ili tkiva iz kojega su potekli. Osnovne komponente egzosoma su proteini i nukleinske kiseline iz kojih se može iščitati informacija o izvornoj stanici. U tome glavnu ulogu ima miRNA koja sudjeluje u regulaciji i sintezi proteina. S obzirom na njenu ulogu u post-transkripcijskim modifikacijama, miRNA može potaknuti rast tumora djelovanjem na stanice imunosnog sustava i signalne puteve koji će uzrokovati metastaziranje i angiogenezu. Egzosomi su pogodni sustavi za dostavu lijekova do ciljanih organa, a modificiranje njihovih komponenti, kao što je miRNA, predstavlja značajan potencijal u budućem liječenju
Tannerella forsythia i njeni faktori virulencije
No full textTannerella forsythia is a gram negative bacteria inhabiting human gingival tissue. It is a member of a bacterial consortium known as the red complex. This consortium is connected to the development of periodontal disease and several other conditions. T. forsythia contributes to periodontal disease development by inducing dysbiosis in oral microbial community and suppressing the host immune response. It achieves this via a number of virulence factors. Major T. forsythia virulence factors can be divided into proteases, glycosidases and cell membrane and cell wall associated proteins. Most T. forsythia proteases partake in virulence via degradation of host tissue and suppression of immune signalling via interleukins. T. forsythia glycosidases are taught to degrade extracellular polysaccharides and proteoglycans, thereby reshaping the gingival environment and providing nutrients. The outer membrane protein BspA is likely involved in adhesion of bacterial cells to tissue surface and interactions with other periodontal bacteria. T. forsythia serpin, known as miropin, is taught to partake in inhibition of neutrophil serine proteases. The S-layer of T. forsithya, uniquely composed of two glycosylated components TfsA and TfsB, regulates biofilm formation, tissue invasion and immunosuppression. Outer membrane vesicles deliver these virulence factors to host cells. These virulence factors provide possible targets for future therapies of periodontal diseases.Tannerella forsythia je gram-negativna bakterija koja naseljava ljudsku gingivu te je pripadnica crvenog kompleksa, bakterijskog konzorcija povezanog s razvojem parodontalnih i drugih bolesti. T. forsythia doprinosi razvoju parodontalnih bolesti potičući disbiozu u oralnoj mikrobioti i suzbijanjem imunološkog odgovora domaćina, u čemu sudjeluje veliki broj faktora virulencije. Glavni faktori virulencije T. forsythia mogu se podijeliti na proteaze, glikozidaze te proteine povezane sa staničnom membranom i staničnom stjenkom. Većina proteaza T. forsythia razgrađuje tkivo domaćina i potiskuje imunološku signalizaciju interleukinima. Glikozidaze razgrađuju izvanstanične polisaharide i proteoglikane, čime izmjenjuju gingivalni okoliš i prikupljaju hranjive tvari. Protein vanjske membrane BspA sudjeluje u vezanju bakterijskih stanica za tkivo i interakcijama s drugim bakterijama zubnog plaka. Serpin T. forsythia, poznat i kao miropin, sudjeluje u inhibiciji serinskih proteaza neutrofila. S-sloj T. forsithya jedinstven je zato što je sastavljen od dvaju glikoziliranih komponenti TfsA i TfsB te sudjeluje u formiranju biofilma, invaziji tkiva i imunosupresiji. Mnogi od ovih faktora virulencije prenose se do stanica domaćina u vezikulama vanjske membrane. Ovi faktori virulencije pružaju moguće mete za buduće terapije parodontalnih bolesti
Mucoadhesion of pharmaceutical solutions containing sodium hyaluronate - influence of sodium hyaluronate concentration and molecular weight
No full textOtopine natrijeva hijaluronata koriste se kao umjetne suze koje vlaže i
regeneriraju oko. Natrijev hijaluronat kao polimer sastavljen od
ponavljajućih jedinica disaharida D-glukuronske kiseline i N-acetil-Dglukozamina pokazuje i mukoadhezivno svojstvo, što znači da stvara
interakciju s mucinom koji je sastavni dio sluznice na površini oka.
Stvarajući te interakcije produljuje se zadržavanje otopine na sluznici.
Svrha ovog rada je ispitati utjecaj faktora koji mogu povećati zadržavanje
otopine natrijeva hijaluronata na sluznici.
Ispitivalo se kako molekulska masa i koncentracija natrijeva hijaluronata u
otopini te osmolalnost otopine utječu na mukoadheziju otopina. Također,
ispitala su se reološka svojstva i osobine (viskoznost, pH, osmolalnost i
površinska napetost) otopina natrijeva hijaluronata različitih intrinzičnih
viskoznosti 0,6 m3/kg, 1,7 m3/kg i 2,3 m3/kg (odgovaraju redom
molekulskim masama 244 kDa, 980 kDa i 1420 kDa) triju masenih udjela:
0,21%; 0,4% i 0,6%, u hipotoničnim, izotoničnim i hipertoničnim uvjetima.
S povećanjem masenog udjela natrijeva hijaluronata, kao i s povećanjem
njegove molekulske mase viskoznosti otopina rastu, dok povećanje
osmolalnosti otopina smanjuje viskoznost neovisno o molekulskoj masi i
masenom udjelu natrijeva hijaluronata. Također ispitala se i stabilnost svih
otopina, nakon čuvanja na temperaturi od 50 °C tijekom tri mjeseca. U
svim slučajevima došlo je do pada viskoznosti otopina dok nije bilo
značajnih promjena drugih parametara.
Pomoću reoloških mjerenja na reometru, uz svinjski želučani mucin,
određen je relativni reološki sinergizam koji ukazuje postoji li interakcija
između otopine i mucina. Izotonične otopine intrinzičnih viskoznosti
natrijeva hijaluronata 1,7 m3/kg i 2,3 m3/kg s masenim udjelom od 0,4%
pokazale su interakciju s mucinom, dok otopina sa natrijevim hijaluronatom
najniže intrinzične viskoznosti 0,6 m3/kg nije pokazala interakciju. Bitno je
napomenuti da ta otopina je jedina pokazala Newtonovo reološko
ponašanje.
Porast osmolalnosti otopine pokazao je povećanje interakcije s mucinom
kao i povećanje masnog udjela natrijeva hijaluronata. Ovi su se utjecaji
ispitali na otopinama s natrijevim hijaluronatom intrinzične viskoznosti 1,7
m3/kg.
Interakciju s mucinom povećalo je veći maseni udio soli u otopini (veća
osmolalnost) i porast masenog udjela natrijeva hijaluronata, dok dobiveni
rezultati ne pokazuju proporcionalan odnos interakcije s mucinom i
molekulske mase natrijeva hijaluronata. Navedeno treba potvrditi
uključivanjem u ispitivanje više natrijevih hijaluronata u širem području
molekulskih masa (intrinzičnih viskoznost), te pomoću drugih metoda za
određivanje mukoadhezije.Sodium hyaluronate solutions are used as artificial tears that moisturize
and regenerate the eye. Sodium hyaluronate as a polymer composed of
repeating units of the disaccharide D-glucuronic acid and N-acetyl-Dglucosamine also exhibits mucoadhesive properties, which means that it
interacts with mucin, a part of the mucous membrane on the surface of the
eye. By creating these interactions, the retention of the solution on the
mucous membrane is prolonged. The purpose of this paper is to examine
the influence of factors that can increase retention on the mucous
membrane.
It was tested how the molecular weight and mass fraction of sodium
hyaluronate in the solution, and osmolality of the solution affect the
mucoadhesion of the solutions. Also, the rheological properties and
characteristics (viscosity, pH, osmolality and surface tension) of solutions
with different intrinsic viscosities of sodium hyaluronate 0.6 m3/kg, 1.7
m3/kg, and 2.3 m3/kg (respectively molecular weight ≈250 kDa, ≈980 kDa
and ≈1420 kDa) were tested in three mass fractions: 0.21%; 0.4% and
0.6%, in hypotonic, isotonic, and hypertonic conditions.
With an increase in the mass fraction of sodium hyaluronate, as well as
with an increase in its molecular weight, the viscosity of the solution
increases, while an increase in the osmolality of the solution decreases the
viscosity, regardless of the molecular weight and mass fraction of sodium
hyaluronate. The stability of all solutions was also tested after storage at
temperature 50 °C for three months. In all cases, there was a decrease in
the viscosity of the solutions, while there were no significant changes in
other parameters.
Using rheological measurements on a rheometer, relative rheological
synergism was determined with porcine gastric mucin, which indicates
whether there is an interaction between the solution and the mucin.
Isotonic solutions of sodium hyaluronate with intrinsic viscosities of 1.7
m3/kg and 2.3 m3/kg in a mass fraction of 0.4% showed interaction with
mucin, while the solution with sodium hyaluronate with the lowest intrinsic
viscosity of 0.6 m3/kg did not show interaction. It is important to note that
this solution was the only one that showed Newtonian rheological behavior.
The increase in the osmolality of the solution showed an increase in the
interaction with mucin as well as an increase in the mass fraction of sodium
hyaluronate. This influence was tested on solutions with sodium
hyaluronate with an intrinsic viscosity of 1.7 m3/kg.
The interaction with mucin increases with a higher mass fraction of salt in
the solution (higher osmolality) and an increase in the mass fraction of
sodium hyaluronate, while the obtained results do not show a proportional
relationship between the interaction with mucin and the molecular weight
of sodium hyaluronate. The above should be confirmed by including more
sodium hyaluronates in a wider range of molecular masses (intrinsic
viscosity) in the test, and by using other methods for determining
mucoadhesion
Neonatalna desenzibilizacija u istraživanju transplantacijske terapije za Parkinsonovu bolest bazirana na AAV vektorima
No full textWith over ten million diagnoses worldwide, Parkinson’s disease (PD) is the second most common neurodegenerative disease. The disease is characterized by progressive loss of dopaminergic neurons in substantia nigra pars compacta (SNpc), expressed through the various motor and non-motor symptoms. One of the most promising therapies for PD is cell – replacement therapy. The first clinical trials for cell-replacement therapy were in the 1980s and they involved the transplantation of foetal tissue rich in dopaminergic neurons to patients with an advanced type of the disease. Nowadays, Human Embryonic Stem Cells (hESCs) are used in transplantation therapy for PD and several other degenerative diseases. Nevertheless, this approach has a major drawback. The preclinical safety assessment of hESCs comprises of the in vivo experiments on animals, which includes transplantation of xenografts and strong activation of the host’s immune system. To surpass this problem immune-incompetent or immune-suppressed animals are used. Though the suppression of the host’s immune system is a viable approach, it is not sustainable for the long-term assessment of treatment with hESCs. Neonatal desensitization is the third method that can be used in the evaluation of hESC for cell-replacement therapy in PD. The principle of neonatal desensitization is based on the presentation of the human antigens (by injection of cell suspension) to the host´s immune system in the early stages of its development (e.g., up to 5 days after birth in rats). After the desensitization, the host’s immune system is ’’tricked’’ and the engrafting with the same cell type results in the integration and acceptation of the xenotransplant. However, the problem of this approach is that the differentiation of the cells used for desensitisation must be timely matched to the birth of the recipients. Therefore, we propose a new approach for desensitization based on the overexpression of surface antigens present on
the H9 hESC line via adeno-associated virus (AAV) vectors. We have successfully identified the surface antigens present on the H9 hESC line. Also, we have confirmed that by using cytomegalovirus (CMV) beta-actin (CBA) promoter we can accomplish viral expression in 5 days. Finally, we have successfully created a library of AAV vectors expressing HLA class I molecules found on the H9 hESC line.Parkinsonova bolest (PD) je druga najčešća neurodegenerativna bolest, koja zahvaća više od 10 miljuna pacijenata diljem svijeta. Glavna karakteristika bolesti je progresivan gubitak dopaminergičkih neurona u substantia nigra pars compacta (SNpc) regiji, koji se očituje kroz specifične motoričke i nemotoričke simptome. Jedna od terapija za PD je I transplatacijska terapija kojom se nadomješta gubitak dopaminergičkih neurona. Prva klinička ispitivanja za transplantacijsku terapiju uključivala su transplantaciju fetalnog tkiva, bogatog dopaminergičkim neuronima, kod pacijenta s uznapredovalim stadijom bolesti. Danas se u transplantacijskoj terapiji za PD koriste embrionalne matične stanice (eng. hESC). Ipak, korištenje matičnih stanica u transplantacijskoj terapiji ima i svoje nedostatke. Pretklinička istraživanja o sigurnosti transplantacijske terapije s matičnim stanicama sastoje se od in vivo pokusa na životinjama, što uključuje transplantaciju ksenografta i snažnu aktivaciju imunološkog sustava domaćina. Kao rješenje ovog problema, u trenutnim istraživanjima koriste se imunodifiencijentne ili framakološki imunološki potisnute životinje. Iako je supresija imunološkog sustava domaćina održiv pristup u kratkoročnom periodu, dugoročna analiza nije moguća. Kao treće rješenje predstavlja se desenzibilizacija mladunaca životinja, koja se pokazala kao valjana metoda dugoročne analize u transplantacijskoj terapiji. Načelo neonatalne desenzibilizacije temelji se na prezentaciji ljudskih antigena (injekcijom stanične suspenzije) imunološkom sustavu domaćina u ranim fazama njegova razvoja (npr. do 5 dana nakon rođenja kod štakora). Nakon desenzibilizacije imunološki sustav domaćina je prilagođen, te transplantacija istog tipa stanica rezultira integracijom i prihvaćanjem ksenotransplantata. Međutim, problem ovog pristupa je što se diferencijacija stanica korištenih za desenzibilizaciju, mora pravodobno uskladiti s rođenjem primatelja. Stoga predlažemo novi pristup
desenzibilizaciji, koji se temelji na prekomjernoj ekspresiji površinskih antigena prisutnih na liniji H9 embrijonalnoj matičnoj liniji koristeći adeno-povezane virusne (AAV) vektore. U našem istraživanju uspješno smo identificirali površinske antigene prisutne na H9 staničnoj liniji. Također smo potvrdili da upotrebom promotora citomegalovirusa (CMV) beta-aktina (CBA) možemo postići virusnu ekspresiju u 5 dana. Konačno, uspješno smo stvorili biblioteku AAV vektora koji izražavaju molekule HLA I razreda, pristutne na H9 staničnoj liniji
Characterization of global proteome profiles of human colon cancer cells depending on the status of the BRAF gene
No full textProtein BRAF je signalna serin/treonin protein kinaza uključena u
aktivaciju MAPK signalnog puta koji utječe na staničnu diobu, rast,
diferencijaciju i preživljenje. Mutacije BRAF, kao što je BRAF V600E,
dodatno aktiviraju MAPK signalni put što pojačava proliferaciju i preživljenje
tumora. BRAF V600E mutirani kolorektalni karcinom predstavlja podskup
kolorektalnog karcinoma karakteriziran lošim cjelokupnim preživljenjem i
ograničenim odgovorom na kemoterapiju i ciljanu terapiju. Unatoč brojnim
studijama koje ukazuju na pozitivan odgovor pacijenata oboljelih od
kolorektalnog karcinoma s BRAF mutacijom na kombiniranu inhibiciju
BRAF/EGFR, BRAF/MEK i BRAF/EGFR/MEK, ukupna stopa odgovora i
medijan preživljenja bez progresije nisu značajni, što dodatno naglašava
potrebu za učinkovitijim terapijama za ovu specifičnu populaciju pacijenata.
Stoga je svrha ovog diplomskog rada proširiti postojeće znanje o
signalnim putevima i staničnim procesima koje regulira BRAF V600E
mutacija u stanicama kolorektalnog karcinoma čovjeka. U tu svrhu,
provedeno je globalno proteomsko profiliranje u rasponima pH 3-10 NL i 4-
7 staničnih linija kolorektalnog karcinoma s divljim tipom BRAF (HTC116,
SW620) i BRAF V600E mutacijom (RKO, HT29) uporabom
dvodimenzionalne poliakrilamidne gel elektroforeze i MALDI-TOF/TOF
masene spektrometrije. Pri tome smo identificirali dvadeset proteina sa
statistički značajnom (p0.05) promjenom razine ekspresije u BRAF V600E
mutiranim u odnosu na divlji tip BRAF stanica kolorektalnog karcinoma.
Većina identificiranih proteina uključena je u stanične procese koji su važni
za progresiju tumora uključujući staničnu komunikaciju, stanični ciklus i
rast.
U ovom istraživanju otkriveno je nekoliko novih proteina biomarkera
potencijalno povezanih s agresivnim fenotipom BRAF-mutiranog
kolorektalnog karcinoma. Ti proteini uključuju proteine s potencijalnom
onkogenom ulogom, kao što je protein 5 koji sadrži MORN ponavljanje,
protein cinkovog prsta 230, eukariotski elongacijski faktor 2 kinaza i
serin/treonin protein kinaza 40, kao i one koje mogu djelovati kao tumorski
supresori, uključujući stanični receptor virusa hepatitisa A2 i Ras-povezan
protein Rab-40A. Potrebne su daljnje imunohistokemijske analize kako bi
se utvrdila uloga ovih proteina u patogenezi BRAF V600E-mutiranog
kolorektalnog karcinoma i procijenila njihova prognostička relevantnost.
Specifično ciljanje eukariotskog elongacijskog faktora 2 kinaze i
serin/treonin protein kinaze 40 se može razviti kao nova strategija za
kontrolu BRAF mutiranih kolorektalnih stanica i povećanje njihove
osjetljivosti na kemoterapijske lijekove.The BRAF protein is a signalling serine/threonine protein kinase involved
in the MAPK signalling pathway that regulates cell division, growth,
differentiation and survival. BRAF mutations, such as BRAF V600E, activate
the MAPK signalling pathway which enhances proliferation and cancer cell
survival. BRAF V600E mutated colorectal cancer represents a subset of
colorectal cancer characterized by poor overall survival and limited response
to chemotherapy. Despite multiple studies showing evidence of response to
combined BRAF/EGFR, BRAF/MEK and BRAF/EGFR/MEK inhibition, overall
response rates and median progression-free survival are modest, which
further underlines the necessity for more effective therapies for this specific
patient population.
The major goal of this graduate thesis was to extend the existing
knowledge of signalling pathways and cellular processes regulated by the
BRAF V600E mutation in colon cancer cells. For this purpose, global
proteomic profiling of BRAF V600E mutant (RKO, HT29) versus wild-type
BRAF (HTC116, SW620) colon cancer cells was carried out in the pH ranges
3-10 NL and 4-7 by means of two-dimensional gel electrophoresis followed
by MALDI-TOF/TOF mass spectrometric analysis. In this way, we were able
to identify twenty proteins with statistically significant (p <0.05) changes
in expression levels in BRAF V600E mutated in comparison to wild-type
BRAF colon cancer cells. The majority of identified proteins were involved
in cellular processes important for cancer progression including cellular
communication, cell cycle and growth.
Importantly, this study revealed several novel protein biomarkers
potentially associated with aggressive phenotype of BRAF mutated
colorectal cancer. These include proteins with potential oncogenic role such
as MORN repeat-containing protein 5, zinc finger protein 230, eukaryotic
elongation factor 2 kinase and serine/threonine-protein kinase 40, as well
as those that may act as tumour suppressors including Hepatitis A virus
cellular receptor 2 and Ras-related protein Rab-40A. Further
immunohistochemical analyses are required to ascertain the role of these
proteins in the pathogenesis of BRAF V600E mutated CRC and to assess
their prognostic relevance. In addition, targeting eukaryotic elongation
factor 2 kinase and serine/threonine-protein kinase 40 may prove as a novel
strategy to control behaviour of BRAF mutated CRC cells and to increase
their sensitivity to chemotherapy
Expression analysis of the circadian PERIOD genes in tissues of laryngeal squamous cell carcinoma
No full textGodišnje se dokumentira oko 100000 novo oboljelih osoba od karcinoma larinksa, od kojih su najčešći planocelulani karcinomi larinksa (engl. LSCC ili Larengial Squamous Cell Carcinoma). Procjenjuje se da je postotak petogodišnjeg preživljavanja pacijenata 60%, a podaci o smrtnosti o LSCC ostaju isti već godinama. Zadnjih godina raste interes za istraživanje veze cirkadijalnog ritma i razvojem raznih tumora poput leukemije, karcinoma dojke, pluća, endometrija, bubrega, kože, želuca, jetre te oralnih karcinoma i karcinoma glave i vrata, no u literaturi nisu objavljeni podaci o povezanosti LSCC i cirkadijalnog sustava. Cirkadijalni sustav regulira razne fiziološke i bihevioralne procese poput aktivnosti, apetita, metabolizma i ekspresije gena. Njegov molekularni mehanizam temelji se na kompleksnoj autoregulacijski transkripcijsko-translacijske povratnoj sprezi čiji su akteri mnogi geni, uključujući i negativno regulirajuće satne gene PERIOD (PER1, PER2 i PER3). Sa svrhom boljeg razumijevanja cirkadijalne ekspresiji u tumorima, analizirali smo ekspresijski profil cirkadijalnih satnih PER gena u tkivima pacijenta sa dijagnosticiranim planocelularnim karcinomom larinksa. Tkiva oboljelih pacijenata smo homogenizirali nakon čega smo izolirali RNA i proveli reverznu transkripciju, kako bi kvantificirali ekspresiju PER1, PER2 i PER3 gena pomoću metode lančane reakcije polimerazom u realnom vremenu. Usporedbom genske ekspresije PER gena u tumorskom i tumoru pridruženom tkivu, dobili smo rezultate koji pokazuju kako sva tri PER gena imaju smanjenu relativnu ekspresiju, gdje PER1 i PER3 imaju statistički značajno smanjenu ekspresiju (p<0,05), od čega PER3 ima najnižu ekspresiju. Navedeni rezultati impliciraju korelaciju smanjene ekspresije cirkadijalnih PER gena sa patogenezom LSCC i to posebice gena PER3.Every year there is about 100 000 new cases of laryngeal cancer and most of them belong to the laryngeal squamous cell carcinoma or LSCC subgroup. The 5-year survival rate is 60%, and the data about the lethality of LSCC stays the same for years. Many studies link the disruption of circadian rhythm with development and tumour progression of different types of cancers like leukaemia, endometrial cancer, breast, lung, kidney, skin, stomach, liver, oral and head and neck cancers. However, there is no literature that connects circadian rhythm and LSCC in particular. Circadian system regulates many physiological and behavioural processes like activity, appetite, metabolism and gene expression. Its molecular mechanism is based on complex autoregulatory transcriptional-translational feedback loops composed of different clock genes including negatively regulating PERIOD genes (PER1, PER2 and PER3). With the purpose of better understanding the circadian gene expression in cancer and adjacent non-cancer tissues, we analysed the gene expression profile of circadian clock PER genes in LSCC patients. After homogenization of patient's tissues, and the RNA isolation, the reverse transcription was performed. The Real Time PCR method was used to quantify and analyse the expression of PER1, PER2 and PER3 genes.Our results showed downregulation of all three PER genes. PER1 and PER3 have statistically significant downregulation (p<0,05), and PER3 has the strongest downregulation. These results indicate correlation of downregulation of circadian PERIOD genes, especially the PER3, with the LSCC pathogenesis