Repository of the University of Rijeka, Department of Biotechnology
Not a member yet
715 research outputs found
Sort by
In silico aided design of CO2 trapping substrates for catalyzed formation of carbonates and carbamates (IP-2019-04)
No full textPrikupljaju se podaci vezani uz projekt i to:
1) in silico studije: računaju se mogući supstrati za Pd-katalizirane intra- i inermolekulske karbamacije i
karbonacije uz upotrebu CO2; provode se kemijski računi o stabilnosti i geometriji reaktanata,
međuprodukata i produkata u navedenim reakcijama. Računati će se i PES plohe kao i mogući mehanistički
putevi. Računi će se provoditi u računalnim programima Gaussian i ORCA
2) eksperimentalni kemijski podaci:
a) sinteza supstrata na temelju in silico podataka
b) podaci o uvjetima reakcije (soli metala, ligandi, otapala, temperatura reakcija, CO2 pritisak,itd)
c) podaci o opsegu reakcija i iskorištenja (ispitivanje reakcija s različitim supstratima te reakcijska
iskorištenja)
d) karakterizacija spojeva (Rf vrijednosti, boja spoja te kristalinična svojstva, NMR podaci, maseni spektri
(HRMS i fragmentacija), IR, UV/VIS, elementarna analiza, temperature tališta i vrelišta)
e) kemijske kinetike (NMR podaci)
3) eksperimetalni biološki in vitro podaci:
a) određivati će se biološka aktivnost sintetiziranih spojeva
Svaka osoba koja radi na projektu voditi će dnevnik rada u kojima će prema datumu i prema eksperimentalnom broju
biti navedeni svi prikupljeni podaci za određeni eksperiment. Kompjuterski podaci čuvati će se na vanjskom HD disku
pod identifikacijskom broju eksperimenta. Ovi sirovi podaci će se obrađivati pri pisanju izvješća, publikacija te
prezentacija. Poštovati će se svi FAIR principi. Pronalažljivost, dostupnost, interoperabilnost te ponovna upotreba će
biti osigurana kroz uvođenje članaka i popratnih informacija (Supporting information) u hrvatske (CROSBI, DABAR,
HRČAK) i međunarodne baze podataka (Researchgate, PubMed, Google scolar, ORCID, Scopus, Scifinder, Reaxis, Web
of Science, itd) koje će se mjesečno ažurirati
Utjecaj temperaturnog disbalansa na biologiju CD8+ limfocita T
No full textIn normal conditions, body temperature is tightly maintained at approximately 37 oC. However, in case of infection, body temperature can change by increasing or decreasing its value, resulting in fever or regulated hypothermia, respectively. This change in body temperature has a role in the anti-pathogenic response, as well as in the modulation of the immune system. Little is known about how temperature affects immune cells. To investigate how temperature affects CD8+ T cells, we used CD8+ T cells isolated from OT-1 mice. CD8+ T cells were separated by MACS and stimulated with SIINFEKL peptide at concentrations of 0, 0.1, 1, and 10 ng/ml and costimulated with 0.5 μL/ml of αCD28. Cells were incubated at 34.5 oC and 37 oC for 3 days, after which proliferation, expression of activation markers and production of cytotoxic cytokines were analyzed using flow cytometry. Results showed decreased proliferation and cytokine production, as well as diminished differentiation into effector type in cells cultured at a lower temperature of 34 oC compared to cells at the physiologically optimal temperature of 37 oC. Moreover, cells incubated at 37 oC showed increased chances of forming MPECs. In this study, we show that temperature affects CD8+ T cell differentiation into effector phenotype and their cytotoxicity. Further research can provide insight into advanced therapies in cancer treatment and better vaccine efficacy.U normalnim uvjetima, tjelesna temperatura je strogo održana na približno 37 oC. Međutim, u slučaju infekcije, tjelesna temperatura se može promijeniti povišenjem ili sniženjem, rezultirajući vrućicom ili reguliranom hipotermijom. Ove promjene tjelesne temperature imaju ulogu u protu-patogenskom odgovoru, a također utječu i na imunosni sustav. Da bi istražili kako temperatura utječe na CD8+ T limfocite, koristili smo stanice koje smo izolirali iz OT-1 miševa. CD8+ T limfociti su izdvojeni koristeći MACS i stimulirani SIINFEKL peptidom u koncentracijama od 0, 0.1, 1, 10 ng/ml te kostimulirane s 0.5 μL/ml αCD28. Stanice su bile smještene u inkubator na 34.5 oC i 37 oC kroz 3 dana, nakon čega su analizirani proliferacija, ekspresija aktivacijskih markera i proizvodnja citotoksičnih citokina, koristeći se protočnom citometrijom. Rezultati su pokazali da stanice kultivirane na nižoj temperaturi imaju smanjenu proliferaciju i proizvodnju citokina, te umanjenu diferencijaciju u efektore, u usporedbi sa stanicama uzgojenim na fiziološki optimalnoj temperature od 37 oC. Stanice inkubirane na 37 oC su pokazale veći potencijal pretvorbe u memorijski tip efektorskih stanica. U ovom istraživanju, pokazali smo da temperatura utječe na diferencijaciju CD8+ limfocita T te njihovu citotoksičnost. Daljnja istraživanja mogu dati uvid u napredne terapije u liječenju karcinoma i bolju djelotvornost cjepiva
Pathophysiology and Treatment of Spinal Muscular Atrophy
No full textSpinalna mišićna atrofija (SMA) nasljedna je neurodegenerativna bolest koja uzrokuje progresivnu slabost i gubitak mišića. Nastaje uslijed mutacija u SMN1 genu koji je ključan za preživljavanje motoričkih neurona. Najčešće se javljaju delecije egzona 7 na oba kromosoma, dok se točkaste mutacije rjeđe pojavljuju. Degeneracija motoričkih neurona dovodi do pojave simptoma bolesti uključujući slabost, atrofiju i paralizu skeletnih mišića, koja se širi na respiratorne mišiće te dolazi do problema s disanjem i smrti. SMN1 gen kodira za SMN (prema eng. survival motor neuron) protein koji ima različite uloge u procesima unutar neurona, od kojih su najvažnije one u metabolizmu RNA. Njegov nedostatak dovodi do nepravilne funkcije, a kasnije i smrti neurona, što dovodi do nastanka SMA. Postoji i SMN2 gen, koji je pseudogen i rijetko daje funkcionalan protein, iako se razlikuje od SMN1 gena u samo nekoliko nukleotida. Budući da SMN2 eksprimira SMN protein u malim količinama, povećan broj kopija SMN2 gena povezuje se s boljim kliničkim ishodom. Nove dijagnostičke metode poput testiranja delecija i točkastih mutacija te rani probir novorođenčadi pomogle su u tretiranju oboljelih jer pacijenti tretirani presimptomatski te u ranoj fazi bolesti imaju veću šansu za preživljavanje i razvitak pravilnih motoričkih funckija.Razvoj različitih terapija za SMA predstavlja velik iskorak u liječenju ove bolesti, ali i neurodegenerativnih bolesti općenito. Najnovija dostignuća u liječenju SMA uključuju razvoj ciljanih terapija kao što su nusinersen, onasemnogene abeparvovec (genska terapija) i risdiplam. Nusinersen, prvi odobreni lijek za SMA, djeluje tako da sprječava izrezivanje egzona 7 u SMN2 genu, omogućujući stvaranje funkcionalnog SMN proteina. Genska terapija, posebice onasemnogene abeparvovec, omogućava dostavu funkcionalnog SMN1 gena u stanice koristeći adeno-združeni virusni vektor, dok risdiplam djeluje kao modifikator prekrajanja SMN2 gena. Napredak u razumijevanju molekularnih mehanizama, dijagnostičkih metoda i terapijskih opcija za SMA značajno doprinosi poboljšanju kvalitete života oboljelih. Iako je postignut značajan napredak, daljnja istraživanja ostaju ključna za razvoj još učinkovitijih terapija i poboljšanje kvalitete života pacijenata širom svijeta
NECTIN-2 EXPRESSION IN BREAST CANCER TISSUES
No full textCilj istraživanja: Nektin-2 (Nec2) je adhezijska molekula sa značajnom ulogom u imunosnom odgovoru. Pretpostavlja se da povišen izražaj Nec2 na brojnim solidnim tumorima ima ulogu u razvoju karcinoma tako što omogućuje izbjegavanje imunološkog nadzora. Stoga interakcije Nec2 s imunološkim sustavom čine ovu molekulu obećavajućom metom za ciljanu imunoterapiju usmjerenu na poticanje imunološkog odgovora protiv stanica tumora. Istraživanja na ograničenoj skupini pacijentica utvrdila su da stanice karcinoma dojke imaju povišenu razinu izražaja Nec2. Ovo istraživanje nastoji nadopuniti dosadašnja saznanja, te na većoj skupini pacijentica kvantificirati izražaj membranskog Nec2 i utvrditi povezanost izražaja Nec2 i kliničko-patoloških podataka pacijentica.
Materijali i metode: Uzorci biopsija dojke pacijentica zajedno s odgovarajućim kliničko-patološkim podacima prikupljeni su iz arhiva Zavoda za patologiju i citologiju, Kliničkog bolničkog centra Rijeka. Od ukupno 131 uzoraka izrađeni su tkivni mikroareji (eng. tissue microarrey, TMA) te se provelo imunohistokemijsko bojanje membranskog Nec2. Kako bi kvantificirali razinu Nec2 izraženog na membranama stanica korišten je parametar H-ocjena za procjenu imunoreaktivnosti.
Rezultati: Uočena je visoka incidencija Nec2 pozitivnih uzoraka karcino-ma dojke. Iako je uočen izražaj Nec2 i na netumorskim uzorcima razina izraženog Nec2 značajno je viša u tumorskim uzorcima. Nije uočena statistički značajna ovisnost izražaja Nec2 u stanicama sa sljedećim kliničko-patološkim podacima pacijentica: tip karcinoma, stadij proširenosti karcinoma, dob te hormonski HER2 status.
Zaključak: Rezultati ovog istraživanja pokazuju da je razina izražaja Nec2 povećana u tkivima karcinoma dojke u odnosu na zdravo tkivo, međutim, nije uočena veza izražaja Nec2 s analiziranim kliničko-patološkim parametrima pacijentica.Research goal: Nectin-2 (Nec2) is an adhesion molecule with a significant role in the immune response. Elevated expression of Nec2 in many solid tumors is pressumed to play a role in cancer development through evasion of immune surveillance. Interactions of Nec2 with the immune system make this molecule a promising target for targeted immunotherapy aimed at regulating the immune response against tumor cells. Research on breast cancer cells determined an increased level of genetic and protein expression of Nec2, but in a limited group of patients. The current study aims to complete the previous findings by quantifying the expression of membrane Nec2 in a larger group of patients and to establish the connec-tion between the expression of Nec2 and the clinical and pathological data of the patients.
Materials and methods: Samples of breast biopsies of female patients along with corresponding clinical and pathological data were collected from the archives of the Department of Pathology and Cytology, Rijeka Clinical Hospital Center. From a total of 131 samples, tissue microarrays (TMA) were made and immunohistochemical staining of membrane Nec2 was performed. In order to quantify the level of Nec2 expressed on cell membranes, the H-score parameter was used to assess immunoreactivity.
Results: A high incidence of Nec2 positive breast cancer samples was ob-served. Although Nec2 expression was also observed in non-tumor samples, the level of expressed Nec2 was significantly higher in tumor samples. No statistically significant dependence of Nec2 expression and following clinical and pathological data was observed: type of cancer, size of cancer tissue, age and hormonal/HER2 status.
Conclusion: The results show an increased level of expressed Nec2 in breast cancer tissues compared to healthy tissue, however, no link between Nec2 expression and any clinical-pathological parameters of the patients was observed
Opioid Receptors and Developtment of Addiction
No full textOvisnost o opioidima problem je koji postoji dugi niz godina širom svijeta, a nastaje zlouporabom opioidnih analgetika koji se koriste za liječenje boli. Bol smatramo jednim od važnijih osjeta koji tijelu omogućuju brzu reakciju na bolne podražaje i zaštitu od opasnosti. Osjet boli prenosi se pomoću Aδ i C vlakana od izvora boli koje registriraju nociceptori na slobodnim aksonima neurona te kroz leđnu moždinu prenose signale do područja mozga bogatih opioidnih receptorima. Najefektivniji lijekovi za liječenje boli su opioidni analgetici poput morfina, kodeina i fentanila. U tijelu djeluju kao ligandi za opioidne receptore. To su vrsta G proteinom spregnutih receptora, široko rasprostranjenih po tijelu, građenih od 7 transmembranskih uzvojnica koji prilikom vezanja endogenih liganda ili opioidnih lijekova potiču nastajanje analgezije i ugode u organizmu. Za razvoj ovisnosti najznačajnije su tri skupine opioidnih receptora: μ-receptori, ĸ-receptori i δ-receptori koji se razlikuju po endogenim ligandima koji na njih djeluju te po ulogama koje imaju prilikom razvoja ovisnosti ili otežavanja liječenja iste. Pa se tako μ-receptori povezuju sa sustavom nagrađivanja, ĸ-receptori s motivacijom i δ-receptori s promjenama raspoloženja. Aktivacijom opioidnih receptora pokreću se signalne kaskade preko podjedinica G proteina, ali i signalni put povezan s β-arestinom, te se putevi razlikuju u posljedicama koje uzrokuju. Dugotrajna izloženost opioidnih lijekovima ima negativan utjecaj na sustav nagrađivanja te puteve neurotransmitera dopamina, što posljedično dovodi do razvoja ovisnosti, tolerancije te sindroma ustezanja prilikom naglog prestanka uzimanja opioidnih lijekova.Opioid addiction has been a problem for many years worldwide, arising from the misuse of opioid analgesics used for pain treatment. Pain is considered one of the essential sensations that allow the body to quickly react to painful stimuli and protect itself from danger. The sensation of pain is transmitted through Aδ and C fibers from the pain source registered by nociceptors on the free axons of neurons and transmitted through the spinal cord to areas of the brain rich in opioid receptors. The most effective drugs for pain treatment are opioid analgesics such as morphine, codeine, and fentanyl. In the body, they act as ligands for opioid receptors. These receptors are a type of G-protein-coupled receptor, widely distributed throughout the body, composed of 7 transmembrane helices, which, upon binding with endogenous ligands or opioid drugs, facilitate developtment of analgesia and the sensation of pleasure in the body. The most significant receptors for addiction development are three groups of opioid receptors: μ-receptors, ĸ-receptors, and δ-receptors, which differ in the endogenous ligands that act on them and their roles in addiction development or complicating its treatment. For example, μ-receptors are associated with the reward system, ĸ-receptors with motivation, and δ-receptors with mood changes. Activation of opioid receptors triggers signaling cascades through G-protein subunits and a signaling pathway associated with β-arrestin, with pathways differing in their consequences. Prolonged exposure to opioid drugs negatively impacts the reward system and dopamine neurotransmitter pathways, which subsequently leads to the development of addiction, tolerance, and withdrawal syndrome upon sudden cessation in usage of opioid drugs
Rizični čimbenici depresije kod studenata : Završni rad
No full textDepression is a mental health condition which Journal of Affective Disorders
confirmed that 24.4% university students experience. This thesis is focused
on the main factors contributing to depression among university students,
such as sleep deprivation, poor eating habits and social interactions.
Through research of existing literature, the study is focused on the high
prevalence of depression in this population, often driven by unique
challenges faced during the academic year and by the academic stressors.
Sleep deprivation is shown to disrupt cognitive and emotional functioning,
leading to lowered academic performance and increased depressive
symptoms. Poor dietary habits, characterized by emotional eating and the
consumption of low-nutrient, high-caloric foods, are linked to heightened
psychological distress, creating a cycle of depression and unhealthy
behaviour. In addition, social interactions as one of the risk factors
underscores the significance, where strong social networks act as a
protective factor against depression, while social isolation and breakups of
romantic relationships contribute to the development of depressive
symptoms. Identifying these factors, this thesis offers valuable insights that
can guide the development of targeted prevention and intervention
strategies to the specific needs of university students. The thesis attempts
to improve the mental health and general well-being of college students by
focusing on both lifestyle and social interactions.Depresija je mentalno zdravstveno stanje koje je Journal of Affective
Disorders potvrdio da ga doživljava 24,4% studenata. Ovaj rad je fokusiran
na glavne čimbenike koji uzrokuju depresiju među studentima, kao što su
nedostatak sna, loše prehrambene navike i društvene interakcije. Kroz
istraživanje dostupne literature, studija je usmjerena na visoku
rasprostranjenost depresije u populaciji studenata, često potaknuta
izazovima s kojima se suočavaju tijekom akademske godine i stresorima
povezanim s učenjem. Dokazano je da nedostatak sna utječe na kognitivno
i emocionalno funkcioniranje, što rezultira slabijim akademskim uspjehom i
izraženim simptomima depresije. Loše prehrambene navike, koje
karakterizira emocionalno prejedanje i konzumacija hrane s niskim
nutrijentima, a visokokalorične, povezane su s pojačanim psihološkim
stresom, stvarajući ciklus depresije i nezdravog ponašanja. Uz sve
navedeno, socijalne interakcije kao jedan od rizičnih čimbenika naglašavaju
važnost kako jake društvene mreže djeluju kao zaštitni čimbenik protiv
depresije, dok socijalna izolacija i prekidi ljubavnih veza doprinose razvoju
simptoma depresije. Identificirajući te čimbenike, ova teza nudi vrijedne
uvide koji mogu voditi razvoj ciljane strategije prevencije i intervencije
prema specifičnim potrebama studenata. Ovaj rad pokušava poboljšati
mentalno zdravlje i opću dobrobit studenata fokusirajući se na način života
i društvene interakcije
The role of m6A modification in biological processes, diseases and infections
No full textN6-metiladenozin (m6A) najčešća je modifikacija eukariotskih RNA. Metilacija adenozina odvija se kotranskripcijski u staničnoj jezgri. Regulirana je proteinima koji metiliraju RNA poput METTL3, METTL14 i WTAP zvanih pisači, proteinima koji demetiliraju RNA poput FTO i ALKHB5 zvanih brisači te proteinima koji uočavaju ovu modifikaciju poput YTHDC1-2, YTHDF1-3 i HNRNPC zvanih čitači. M6A regulira ekspresiju gena tako što utječe na stabilnost, prekrajanje i prijenos mRNA iz jezgre te na njenu razgradnju. Koregulacjia translacije i raspadanja koju provode proteini regulatori m6A modifikacije dovodi do ubrzanog metabolizma mRNA i može dovesti do pojačanja proizvodnje proteina. Regulacija ekspresije gena presudna je pri diferencijaciji stanica pa ne čudi da m6A i tamo igra ključnu ulogu. Međutim, regulatori m6A nisu u svim tkivima podjednako aktivni pa
se funkcija m6A najbolje očituje u organima reproduktivnog, živčanog i imunosnog sustava. Upravo zbog tog značajnog utjecaja na imunosni sustav, tumori i patogeni iskorištavaju m6A modifikaciju kako bi smanjili imunosni odgovor te kako bi bolest koju uzrokuju mogla bolje napredovati. Štoviše, neki virusi mogu iskoristiti i regulatore m6A kako bi pojačali ekspresiju svojih gena, a smanjili ekspresiju gena domaćina. Herpes simpleks virus tipa 1 poseban je po tome što uzrokuje premještanje proteina regulatora m6A tijekom infekcije. Virusni protein ICP27 koji regulira preradu RNA uzrokuje premještanje METTL3 i METTL14 iz jezgre u citoplazmu domaćina. Daljnja su istraživanja potrebna kako bi se pojasnili svi mehanizmi djelovanja regulatora m6A modifikacije i njihovog međudjelovanja s virusnim proteinima tijekom infekcije.N6-methyladenosine (m6A) is the most common modification of the eukaryotic RNA. Methylation of adenosine occurs cotranscriptionally in the cell's nucleus. It is regulated by proteins that methylate RNA such as METTL3, METTL14 and WTAP called writers, proteins that demethylate RNA such as FTO and ALKBH5 called erasers and proteins that recognize this modification such as YTHDC1-2, YTHDF1-3 and HNRNPC called readers. M6A regulates gene expression by influencing the stability, splicing and transport of mRNA from the nucleus as well as its decay. The coregulation of translation and decay which is done by YTHDF1 and YTHDF2 causes acceleration of mRNA metabolism and can lead to an increase in protein production. Regulation of gene expression is vital during cell differentiation so it is not surprising that m6A is crucial in that process. However, the activity of m6A regulators differs between tissues and the function of m6A is most easily seen in the reproductive, nervous and immune systems. Because of that significant influence over the immune system, tumors and pathogens use m6A modification to suppress immune response and allow the progression of disease. Herpes simplex virus type 1 causes redistribution of m6A regulators. Viral protein ICP27 which regulates RNA processing causes METTL3 and METTL14 to transfer from the nucleus to the cytoplasm of the host. Further research is needed to clarify the mechanisms of action of m6A regulators and their interaction with viral proteins during infection
Cellular mechanisms involved in turnover of pathogenic ahcy transcripts and protein identified in ahcy deficiency patients
No full textNedostatna aktivnost S-adenozilhomocistein hidrolaze (SAHH) je rijetka nasljedna
bolest ciklusa metionina uzrokovana točkastim mutacijama u genu SAHH. SAHH služi za
uklanjanje S-adenozilhomocisteina (SAH), nusprodukta i snažnog inhibitora brojnih staničnih
metiltransferaza, čime SAHH igra ključnu ulogu u održavanju staničnog metilacijskog
potencijala. Smanjena aktivnost ovog esencijalnog enzima rezultira značajnim biokemijskim
poremećajima kod ljudi, uzrokujući multisistemsku bolest karakteriziranu neurorazvojnim
zastojem, miopatijom i disfunkcijom jetre. Do danas je opisano svega 16 pacijenata s različitim
težinama bolesti, od kasne kliničke manifestacije do smrtnih ishoda tijekom dojenačke dobi.
Trenutni terapijski pristup uključuje dijetalnu restrikciju unosa metionina koja pokazuje
kliničku korist kod nekih bolesnika, iako varirajuće učinkovitosti. Prethodne studije pokazale
su da je razina inaktivacije enzima povezana s težinom bolesti i potencijalno, s ishodom
terapije. Cilj ovog doktorskog rada je istražiti funkcionalne posljedice tri varijante gena SAHH
(p.W112*, p.Y143C, p.Y328D) koje su otkrivene kod dva pacijenta s izrazito teškom
biokemijskom i kliničkom prezentacijom nedostatne aktivnosti SAHH-a do danas opisane u
literaturi. Naglasak ove studije je na učincima mutacija na gensku ekspresiju i staničnim
mehanizmima u pozadini značajnog nedostatka proteina SAHH, pružajući molekularne uvide
koji mogu pomoći u razvoju i promjeni novih terapijskih strategija u budućnosti.
Materijali i metode
U sklopu ove studije proveli smo sveobuhvatne analize razina mutiranih transkripata i
proteina SAHH u fibroblastima pacijenata i ekspresijskim sustavima in vitro. Rekombinantni
plazmidi koji sadrže mutirane cDNA pripremljeni su u svrhu izvanstanične ekspresije proteina
i pripreme ljudskih staničnih modela (Hek293, HepG2, SW480) putem lentivirusne
transdukcije. Biblioteke cDNA konstruirane su iz ukupne RNA izolirane iz stanica pacijenata
i staničnih modela HepG2 za interno sekvenciranje transkriptoma (mRNAseq).
Bioinformatička analiza korištena je za kvantificiranju ekspresije pojedinih alela SAHH u
fibroblastima pacijenata. Diferencijalna analiza ekspresije, funkcionalna anotacija i analiza
genske ontologije (GO) provedene su kako bi se identificirali geni s promijenjenom
ekspresijom u modelima HepG2. Razine mutiranih proteina analizirane su nakon tretmana
ljudskih staničnih modela inhibitorom proteasoma MG-132. Na kraju, provedena je računalna
analiza in silico kako bi se predvidjeli učinci pogrešnih mutacija na stabilnost proteina.
Rezultati
Analiza ekspresije proteina kombiniranih heterozigotnih fibroblasta (W112*/Y143C i
Y328D/Y143C) otkrila je smanjene razine SAHH-a kod oba pacijenta. Uz to, stanice koje
sadrže preuranjeni stop-kodon (PTC) pokazale su i smanjene razine transkripata.
Rekombinantni mutanti SAHH uspješno su sintetizirani korištenjem izvanstaničnog
ekspresijskog sustava in vitro, bez razlika u prinosu između varijanti. Analiza staničnih modela
sa stabilnom ekspresijom proteina pokazala je izrazito nisku ekspresiju SAHH-a s mutacijama
W112* i Y328D, za razliku od normalnih razina varijante SAHH-Y143C. Sekvenciranje
transkriptoma otkrilo je neuravnoteženu ekspresiju alela kod jednog pacijenta zbog potpunog
nedostatka transkripata koji sadrže PTC. U staničnim modelima HepG2, identificirano je 58
diferencijalno eksprimiranih gena koji su prvenstveno povezani s regulacijom ekspresije gena
i biosintezom staničnih makromolekula. Detaljna analiza istaknula je E3-ubikvitinsku ligazu
TRIM33 kao potencijalnog regulatornog faktora uključenog u nedostatak proteina SAHHY328D.
Inhibicija proteasoma povećala je ekspresiju varijante SAHH-Y328D u svim
pripremljenim staničnim modelima. Dodatno, konfokalna mikroskopija otkrila je izraženu
tendenciju ovog mutanta za nakupljanje unutar stanice. Konačno, analiza in silico potvrdila je
da aminokiselinska supstitucija Y328D značajno remeti stabilnost SAHH-a zbog značajnih
strukturnih promjena u hidrofobnoj jezgri proteina.
Zaključci
Značajno smanjene razina mRNA i proteina SAHH primijećene u stanicama pacijenata
mogu pridonositi težini fenotipa nedostatne aktivnosti SAHH-a. Prema dobivenim rezultatima,
mutacije Y328D i W112* primarni su čimbenici koji pridonose nedostatku ekspresije proteina
uočene kod pacijenata. Značajni nedostatak SAHH-a rezultat je stanične regulacije genske
ekspresije mehanizmima NMD i UPS. TRIM33 je predložen kao potencijalni regulator
pojačane proteasomske degradacije mutanta SAHH-Y328D.Introduction and aims
S-adenosylhomocysteine hydrolase (AHCY) deficiency is a rare hereditary disease of
methionine cycle caused by point mutations in the AHCY gene. AHCY functions as a disposal
route for S-adenosylhomocysteine (SAH), a byproduct and strong inhibitor of numerous
cellular methyltransferases, thus AHCY plays a pivotal role in maintaining cellular methylation
potential. Reduced activity of this essential enzyme results in significant biochemical
aberrations in humans, leading to a multisystemic disorder characterized by
neurodevelopmental delay, myopathy and liver dysfunction. To date, only 16 patients have
been reported with diverse disease severity, ranging from late clinical onset to fatal outcomes
during infancy. Current therapeutic approach involves dietary methionine restriction which
demonstrates clinical benefits in some patients, albeit with varying efficacy. Previous studies
have shown that the magnitude of mutational impact is associated with clinical presentation of
the disease and possibly therapy outcome. The aim of this doctoral thesis is to investigate
functional consequences of three AHCY variants (p.W112*, p.Y143C, p.Y328D) discovered in
two patients with extremely severe biochemical and clinical manifestations of AHCY
deficiency reported so far. This study focuses on differential expression effects of these
mutations and their underlying mechanisms involved in aberrant AHCY turnover, providing
molecular insights that can help guide the development and application of novel therapeutic
strategies in the future.
Materials and methods
In this study, we performed comprehensive analyses of mutant AHCY transcript and
protein levels in patient fibroblasts and in vitro expression systems. Recombinant plasmids
harboring mutant cDNAs were prepared for cell-free protein expression and the preparation of
human cell models (Hek293T, HepG2, SW480) via lentiviral transduction. cDNA libraries
were constructed from total RNA isolated from patient-derived cells and HepG2 models for inhouse
transcriptome sequencing (mRNAseq). Bioinformatic analysis was employed to quantify
the expression of individual AHCY alleles in patient fibroblasts. Differential expression
analysis, functional annotation and gene ontology (GO) analysis were performed to identify
genes with altered expression in HepG2 models. Mutant protein levels were analyzed following
treatment of human cell models with proteasome inhibitor MG-132. Lastly, in silico
computational analysis was performed to predict the effects of missense mutations on protein
stability.
Results
Protein expression analysis of compound heterozygote fibroblasts (W112*/Y143C and
Y328D/Y143C) revealed reduced AHCY levels in both patients. Additionally, cells harboring
premature termination codon (PTC) also displayed reduced transcript levels. Recombinant
AHCY mutants were successfully synthesized using in vitro cell free expression system,
without any discrepancies in yield across all variants. Analysis of stably expressing human cell
models showed markedly lower expression of AHCY harboring W112* and Y328D mutation,
contrasting normal levels of Y143C variant. Transcriptome sequencing revealed an allelic
imbalance in one patient due to complete absence of transcripts containing PTC. In HepG2 cell
models, 58 differentially expressed genes were identified that are primarily associated with
gene expression regulation and biosynthesis of cellular macromolecules. Detailed analysis
highlighted ubiquitin ligase TRIM33 as a potential regulator involved in aberrant turnover of
AHCY-Y328D mutant. Proteasome inhibition increased expression of Y328D variant across
all prepared human cell models. Moreover, microscopy reveled pronounced tendency of this
mutant protein to aggregate within the cell. Finally, in silico analysis confirmed that Y328D
substitution significantly disrupts AHCY stability due to structural changes in protein’s
hydrophobic core.
Conclusion
Considerable decrease of mRNA and protein levels observed in patient-derived cells
may contribute to the severity of AHCY deficiency phenotype. According to the results
obtained, Y328D and W112* mutations are primary factors contributing to the loss of protein
expression observed in the respective patients. Aberrant AHCY turnover is the result of cellular
regulation of gene expression through NMD and UPS mechanisms. TRIM33 is suggested to
have a regulatory role in proteasomal degradation of AHCY-Y328D mutant
The effects of moderate white wine consumption on vascular reactivity of the isolated rat thoracic aorta
No full textRezultati epidemioloških studija jasno ukazuju na povoljne učinke umjerene
konzumacije vina na ljudsko zdravlje, posebice na kardiovaskularni sustav.
Vino usporava razvoj ateroskleroze i arterioskleroze ostvarujući
protuupalne, antitrombocitne i antioksidacijske učinke. Osim alkohola,
vinski polifenoli smatraju se posrednicima ovih učinaka. Tradicionalna
macerirana bijela vina s bogatim fenolnim sadržajem privlače pozornost
proizvođača i znanstvenika, a njihovi biološki učinci slabije su istraženi. Cilj
provedenog istraživanja bio je ispitati i usporediti utjecaj umjerene
konzumacije standardnog i maceriranog bijelog vina na vazodilatacijski i
vazokonstrikcijski odgovor aorte štakora.
Sprague Dawley štakori, mužjaci (N = 45) randomizirani su u 3 skupine i
podvrgnuti 4-tjednom konzumacijskom protokolu: kontrolna (K) skupina
konzumira isključivo vodu, skupina SV standardno, a skupina MV
macerirano bijelo vino. Nakon konzumacije slijedi izolacija torakalne aorte
štakora i preparacija vaskularnih prstenova. Prstenovi svih skupina (N =
107) dodatno se randomiziraju i izlažu jednom od dva doza – učinak
protokola u in vitro uvijetima: vazodilatacijski gdje su prekontrahirani
prstenovi tretiraju kumulativnim koncentracijama acetilkolina; i
vazkonstrikcijski, bez prekontrakcije, s kumulativnim koncentracijama
noradrenalina. Raspon je primijenjenih koncentracija acetilkolina i
noradrenalina jednak s konačnim koncentracijama u organskom bazenčiću
od 1nM do 10 µM). Glavne mjere ishoda su maksimalni vazodilatacijski i
vazokonstrikcijski učinak (Emax) te koncentracija potrebna za postizanje 50
% maksimalnog učinka (EC50).
Vazokonstrikcijski učinak nije se razlikovao među skupinama. Međutim,
konzumacija maceriranog bijelog vina promijenila je vazodiatacijsku
učinkovitost acetilkolina koji je u koncentracijskom rasponu od 0,1 do 1 µM
ostvario značajno veći učinak na vaskularnim prstenovima aorta MV
štakora. Sukladno, potentnost je acetilkolina bila najveća u MV, nešto
manja u SV, a najmanja u K skupini s pripadajućim EC50 vrijednostima od
43 nM, 57 nM i 70 nM za MV, SV i K.The results of epidemiological studies clearly indicate the beneficial effects
of moderate wine consumption on human health, especially on the
cardiovascular system. Wine slows the development of atherosclerosis and
arteriosclerosis by achieving anti-inflammatory, antiplatelet and antioxidant
effects. Except alcohol, wine polyphenols are thought to mediate these
effects. Traditional macerated white wines with rich phenolic content attract
the attention of producers and scientists, and their biological effects are less
well examined. The aim of the study was to examine and compare the
impact of moderate consumption of standard and macerated white wine on
the vasodilation and vasoconstriction response of the rat aorta.
Male Sprague Dawley rats (N = 45) were randomized into 3 groups and
subjected to a 4-week consumption protocol: the control (K) group
consumed only water, the SV group standard, and the MV macerated white
wine. Following consumption trial, the rat thoracic aortas were isolated and
the vascular rings prepared. The rings of all groups (N = 107) were
additionally randomized and exposed to one of two in vitro dose - response
protocols: vasodilatory protocol where the precontracted rings were treated
with acetylcholine and vasoconstriction protocol, without precontraction
with noradrenaline. Acetylcholine and noradrenaline were applied
cumulatively to acomplish final concentrations from 1nM to 10 µM in the
organ baths. The main outcome measures were the maximal vasodilation
and vasoconstriction effect (Emax) and the concentration of noradrenaline
and acetylcholine that produce 50% of maximal effect (EC50).
Noradrenaline-induced vasoconstriction effect was similar for all groups.
However, the consumption of macerated white wine changed the
vasodilation efficacy of acetylcholine, which induced a significantly greater
vasodilatory effect of MV rat aorta in the concentration range from 0.1 to 1
µM. Accordingly, the potency of acetylcholine was the highest in MV, slightly
lower in SV, and the lowest in the K group with corresponding EC50 values
of 43 nM, 57 nM and 70 nM for MV, SV and K, respectively.
The obtained results indicate a vasoprotective effect of moderate
consumption of macerated white wine in rats. The effect of standard white
wine consumption needs to be further clarified
Agregacija EHD3 ovisi o više kritičnih regija
No full textSchizophrenia is a debilitating chronic mental illness that affects people’s
ability to perform daily activities. Schizophrenia is treated with antipsychotics
and psychotherapy which only target the symptoms, however there is little
known about its molecular background. There are several biological theories
of schizophrenia, but the most influential is the dopamine hypothesis, which
states that there is an imbalance in dopamine transmission. Other theories
suggest neurodevelopmental changes, such as brain maturation and altered
neurotransmission, as key factors in development of schizophrenia. Along with
genetic and environmental factors, which contribute to development of
schizophrenia, protein aggregation was introduced as a possible non-genetic
cause. Protein aggregation occurs when proteins misfold due to errors in
folding or trafficking machinery. One newly discovered protein to aggregate in
brains of schizophrenia patients is EH-domain containing 3 (EHD3). EHD3 is
believed to be one of the main regulators of endocytic recycling involved,
among other functions, in endosome trafficking and promotion of
dopaminergic transmission. Previous research showed that full length EHD3
consistently aggregates in SH-SY5Y cells, while a truncated form EHD3 1-399,
with its linker region deleted, does not. In contrast, EHD3 1-434, which
contains both the linker region and an EH domain, aggregates. Linker region
was therefore suspected to be a critical region for EHD3 aggregation. In this
thesis, we aimed to determine whether the aggregation occurs within 400-
434 amino acids of EHD3 by fluorescent microscopy and ultracentrifugation
assay. Ultracentrifugation data surprisingly revealed that EHD3 1-434 does
not appear in the aggregome of HEK293 cells, as hypothesized, but it still
formed aggregate-like structures in both SH-SY5Y and HEK293 cells. Since
EHD3 1-434 probably does not aggregate, we suspected involvement of the
EH domain in EHD3 aggregation. Novel fragments EHD3 1-404 and EHD3 400-
535 were therefore cloned and expressed in both cell lines. However, they did
not show any signs of aggregation. Co-aggregation of full length EHD3 with
non-aggregating EHD3 1-399 was also investigated. Fluorescent microscopy
results showed that full length EHD3 induces EHD3 1-399 to aggregation in
neuroblastoma cells. Future research is needed to determine the critical region
of EHD3 aggregation by generating novel constructs that include small parts
of linker region or the EH domain.Shizofrenija je kronična mentalna bolest koja utječe na sposobnost
izvršavanja redovnih dnevnih aktivnosti. Tipične linije liječenja shizofrenije su
antipsihotici i psihoterapija koji ciljaju samo simptome, no malo se zna o
njenim molekularnim uzrocima. Između nekoliko razrađenih bioloških teorija
shizofrenije, najviše se ističe dopaminska hipoteza koja počiva na nedostatku
ravnoteže u prijenosu dopamina. Druge teorije predlažu neurorazvojne
promjene, poput maturacije mozga i promijenjene neurotransmisije, kao
glavne čimbenike u razvoju shizofrenije. Uz genetske i okolišne čimbenike koji
doprinose razvoju shizofrenije, agregacija proteina predložena je kao moguć
ne-genetski uzrok. Agregacija proteina proizlazi iz nepravilnog smatanja
proteina uzrokovanog greškama u mehanizmima za smatanje i prijenos. Jedan
od novootkrivenih proteina koji agregira u mozgu pacijenata sa shizofrenijom
je EH-domain containing 3 (EHD3). Kao jedan od glavnih regulatora
endocitoznog recikliranja, smatra se da je uključen i u endosomalni prijenos i
pospješivanje dopaminske transmisije. Prethodna istraživanja pokazuju da
EHD3 konzistentno agregira u stanicama neuroblastoma, osim u obliku EHD3
1-399, kada mu je linker regija izbrisana. Nasuprot tome, EHD3 1-434, koji
sadrži i linker regiju i EH domenu, agregira. Posljedično, linker regija je
pretpostavljena kao moguća kritična regija za EHD3 agregaciju. U ovom radu,
težili smo odrediti događa li se agregacija unutar 400-434 aminokiselina
EHD3, koristeći se fluorescentnom mikroskopijom i ultracentrifugiranjem.
Iznenađujuće, rezultati ultracentrifugiranja pokazuju da se EHD3 1-434 ne
nalazi u agregomu HEK293 stanica kao što se pretpostavljalo, ali formira
strukture slične agregatima u SH-SY5Y i HEK293 stanicama. Kako EHD3 1-
434 ne agregira, sumnjali smo na ulogu EH domene u agregaciji EHD3. Novi
fragmenti EHD3 1-404 i EHD3 400-535 stoga su klonirani i eksprimirani u obje
stanične linije, no nisu pokazali nikakve znakove agregacije. Također, ispitala
se i ko-agregacija „full length“ EHD3 s EHD3 1-399 koji obično ne agregira.
Rezultati fluorescentne mikroskopije pokazali su da „full length“ EHD3 inducira
EHD3 1-399 na agregaciju u stanicama neuroblastoma. Potrebna su daljnja
istraživanja kako bi se odredila kritična regija EHD3 agregacije putem
kloniranja novih fragmenata koji uključuju male dijelove linker regije ili EH
domene