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Transannular Acylation Facilitates C5-C9 Bond Formation in Hyperforin Total Synthesis
Get PDFHyperforin is considered the flagship congener
among polycyclic polyprenylated acylphloroglucinols due to its
compelling and complex molecular architecture, coupled with
remarkable biological activity, thus rendering it an appealing
synthetic target for chemists over the past two decades. Herein, an
innovative linear total synthesis of hyperforin is reported. Our
synthesis relies on the formation of the bicyclo[3.3.1]nonane-2,4,9-trione framework via transannular acylation of a decorated eightmembered ring, followed by late stage bridgehead substitution
miRNA Expression Profile in Primary Limbal Epithelial Cells of Aniridia Patients
Get PDFPURPOSE. This study evaluates the microRNA (miRNA) expression profile in primary limbal
epithelial cells (pLECs) of patients with aniridia.
METHODS. Primary human LECs were sampled and isolated from 10 patients with aniridia
and 10 healthy donors. The miRNA profile was analyzed using miRNA microarrays. The
biological roles of miRNA-validated target genes were delineated in silico by the enrichment analyses of the gene ontology (GO) and Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes
(KEGG) pathway. The expression of the most deregulated miRNAs was analyzed using
quantitative real-time PCR (qRT-PCR).
RESULTS. Microarray analysis revealed 10 differentially expressed miRNAs in pLECs of
patients with aniridia relative to healthy controls (fold change = ≤ –2 or ≥ +2), nevertheless these were only differentially expressed using an unadjusted P value < 0.05.
The qRT-PCR validation confirmed the significantly altered expression of miR-138-5p in
pLECs of patients with aniridia (P = 0.005). In silico GO analysis of miR-138-5p target
genes revealed the potential biological functions of miR-138-5p in regulating various
cellular and molecular processes, including the positive regulation of cell motility, G1/S
phase cell cycle transition, and cell migration, as well as the negative role in regulating
epithelial cell differentiation. Pathway analysis highlighted the main involvement of the
PI3K-Akt, Hippo, Wnt, Focal adhesion, cAMP, p53, IL-17, Jak-STAT, and MAPK-signaling
pathways.
CONCLUSIONS. This study revealed miRNA expression profile in pLECs of patients with
aniridia using miRNA microarray and identified miRNAs that had not been previously
reported for aniridia LECs. Our study also provides functional and pathway information
that can be used to predict possible mechanism of miRNA function in LECs, thereby
bridging the gap in the pathogenesis of AAK studies
Bacterial Adhesion: Mechanisms and Variability in Single-Cell Adhesion
No full textDie bakterielle Adhäsion und Biofilmbildung auf Implantatoberflächen stellt die moder- ne Medizin vor Herausforderungen wie Komplikationen durch Implantatversagen und Biofilm-assoziierte Infektionen. Die Biofilmbildung beginnt mit der Adhäsion von ersten Bakterienzellen auf einer Oberfläche. Diese Arbeit befasst sich mit Strategien zur Re- duzierung der Adhäsion von Staphylococcus aureus. Hierzu werden Einflussfaktoren wie Oberflächenrauheit auf der Nanometerskala, Oberflächenchemie und hydrophobe Eigen- schaften sowie die Funktionalisierung mit biologischen Flüssigkeiten wie Blutplasma und Speichel untersucht. Als Test-Oberflächen wurden Silizium, Hydroxylapatit, Zahnschmelz und Titan verwendet. Neben diesen Modifikationen wurde untersucht, wie sich Merkmale einzelner Bakterienzelle auf die Adhäsionskraft auswirken, wobei der Schwerpunkt auf dem Alter der Zellwand und Bereichen mit unterschiedlicher Adhäsionsfähigkeit auf der Zellwand liegt. Zur Quantifizierung der Adhäsionskräfte wurde die auf Rasterkraftmi- kroskopie (AFM) basierende Einzelzell-Kraftspektroskopie (SCFS) eingesetzt, während für die Zellcharakterisierung konfokale Fluoreszenzmikroskopie und AFM-Bildgebung verwendet wurden.Bacterial adhesion and biofilm formation on implant surfaces is a major challenge in modern medicine, often leading to severe complications like implant failures and biofilm- associated infections. Biofilm formation begins with the initial adhesion of bacterial cells. This thesis explores strategies to reduce adhesion of Staphylococcus aureus by modifying surface features such as nanoscale roughness, chemistry, and hydrophobicity, alongside functionalisation with biological fluids like blood plasma and saliva. Surfaces of interest include silicon, hydroxyapatite, enamel, and titanium. Additionally, the thesis investigates how features of the bacterial cell impact adhesion strength, focussing on cell wall age and regions of different adhesion capability on the cell wall. Atomic force microscopy based single-cell force spectroscopy (SCFS) was employed to quantify adhesion forces, while confocal fluorescence microscopy and atomic force microscopy imaging were used for cell characterisation
Effect of MiRNA 204-5P Mimics and Lipopolysaccharide-Induced Inflammation on Transcription Factor Levels, Cell Maintenance, and Retinoic Acid Signaling in Primary Limbal Epithelial Cells
Get PDFMicroRNA-204-5p (miR-204-5p) is a critical regulator of differentiation, structural
maintenance, and inflammation in limbal epithelial cells (LECs). This study examined the
role of miR-204-5p in modulating the gene expression related to transcription factors, cell
structure, extracellular matrix remodeling, and retinoic acid signaling under normal and
lipopolysaccharide (LPS)-induced inflammatory conditions. Using qPCR, we analyzed the
mRNA levels of FOSL2, FOXC1, Meis2, PPARγ, ABCG2, PTGES2, IL-1β, IL-6, KRT3, KRT12,
MMP2, MMP9, RARA, RARB, RXRA, RXRB, CRABP2, RBP1, RDH10, ADH7, ADH1A1,
FABP5, CYP1B1, and CYP26A1, while changes in protein levels were assessed via Western
blot or ELISA. Our data revealed that the overexpression of miR-204-5p reduced the mRNA
levels of FOXC1, KRT12, and RDH10 under normal and inflammatory conditions (p ≤ 0.039).
Additionally, it decreased FOSL2 and RXRA mRNA under normal conditions (p = 0.006,
p = 0.011) and KRT3 and FABP5 mRNA under inflammatory conditions (p = 0.010, p = 0.001).
The IL-6 mRNA expression was significantly increased following the LPS treatment in cells
overexpressing miR-204-5p (p = 0.029). A protein analysis revealed significant reductions
in FOXC1 and KRT3 in the miR-204-5p-transfected cells during LPS-induced inflammation
(p = 0.020, p = 0.030). These findings suggest that miR-204-5p modulates genes critical to the
differentiation, migration, and inflammatory response of LECs. The modulation of FOXC1
and KRT3 by miR-204-5p highlights these proteins as novel targets under inflammatory
conditions
Langzeit-Follow-up bei Kindern und Erwachsenen mit angeborenem Herzfehler nach kardialer Resynchronisationstherapie
Get PDFHintergrund: Die kardiale Resynchronisationstherapie (CRT) ist eine bewährte Methode zur Behandlung von Herzinsuffizienz bei Erwachsenen. Bei Kindern und Erwachsenen mit angeborenem Herzfehler hat sich die CRT in den letzten Jahren ebenfalls als wichtiges Mittel zur Behandlung von Herzinsuffizienz etabliert. Die Indikationsstellung unterscheidet sich aufgrund der Heterogenität der angeborenen Herzfehler jedoch stark von der erwachsenen Patientenpopulation. Zu dieser Patientenkohorte liegen nur wenige Daten vor und es gibt kaum Langzeitergebnisse.
Methodik: Diese retrospektive multizentrische Studie untersucht das Outcome von 105 Kindern und Erwachsenen mit angeborenem Herzfehler nach kardialer Resynchronisationstherapie. Die mediane Follow-up-Zeit betrug 64 Monate (5,3 Jahre).
Ergebnisse: Das mediane Alter bei Implantation betrug 19,5 Jahre und reichte von wenigen Monaten bis 69 Jahre. Einen morphologisch linken Systemventrikel wiesen 71,4% (n=75), einen morphologisch rechten Systemventrikel 27,6% (n=29). Zwei Patienten wiesen ein univentrikuläres Herz auf (1,9%). Vor Implantation bestand bei 72,4% (n=76) der Patienten eine vorherige Schrittmachertherapie. Den primären Endpunkt bestehend aus Tod oder Herztransplantation haben 26,7% der Patienten (n=28) erreicht. Davon sind 17,1% Patienten (n=18) gestorben und 9,5% (n=10) wurden herztransplantiert. Es zählten 80 Patienten (76,2%) zu den Respondern, welche als Erhöhung der systemisch ventrikulären Ejektionsfraktion und/oder Verringerung der QRS-Zeit vor und 6 bis 12 Monate nach CRT-Implantation definiert wurde. Die QRS-Zeit verringerte sich von 169,46 ± 31,05ms vor Implantation auf 166,30 ± 34,18ms (p=0,279) zum aktuellen Follow-up. Die Ejektionsfraktion stieg von 32,11 ± 10,01% auf 42,22 ± 14,58% (p=0,003) an. Das NYHA-Stadium verbesserte sich mit einem Median von III (I: 0%; II: 48,5%; III: 43,6%; IV: 7,9%) auf II (I: 27,9%; II: 38,2%; III: 22,1%; IV: 11,8%; p=0,003). Das NT-proBNP sank von 3283,49 ± 5073,14pg/ml auf 3040,97 ± 4637,18pg/ml (p=0,078). Als prädiktiver Parameter für Response konnte in dieser Studie eine QRS-Zeit über 140ms vor CRT-Implantation identifiziert werden (p=0,020). Patienten im Alter von 0 bis 17 Jahren (p=0,010) mit morphologisch linkem Systemventrikel (p=0,039), AV-Block 3. Grades (p=0,011) und einer vorherigen Schrittmachertherapie (p=0,009) erreichten weniger häufig den gemeinsamen Endpunkt bestehend aus Tod oder Herztransplantation. Prädiktive Parameter für das Erreichen des primären Endpunktes galten zum einen ein hohes Alter (p=0,004) und zum anderen keine vorherige Schrittmachertherapie (p=0,007).
Schlussfolgerung: In dieser Studie konnte verdeutlicht werden, dass die CRT zu einer Verbesserung der QRS-Zeit, Ejektionsfraktion, NYHA-Stadium und des NT-proBNP-Wertes führt. Insbesondere jüngere Patienten mit einem morphologisch linken Systemventrikel, vorheriger Schrittmachertherapie und langer QRS-Dauer profitierten von einer CRT.Background: Cardiac resynchronization therapy (CRT) is a highly effective treatment of congestive heart failure in adults. In children and adults with congenital heart disease CRT is also an important tool to treat congestive heart failure. However indications differ widely from those of the adult population because of the heterogeneity of the congenital heart diseases. Data in this patient population is rare and especially long-term follow-up is scarce.
Methods: This retrospective study examines the outcome of 105 children and adults with congenital heart defects after cardiac resynchronization therapy. The median follow-up time consisted of 64 months (5.3 years).
Results: The median age at implantation was 19.5 years and ranged from a few months to 69 years. A systemic left ventricle was present in 71.4% (n=75), a systemic right ventricle in 27.6% (n=29). Two patients had a univentricular heart (1.9%). Before implantation 72.4% (n=76) of the patients had a pacemaker therapy.
The primary endpoint consisting of death or heart transplantation was reached by 26.7% (n=28). Of these, 17.1% (n=18) died and 9.5% (n=10) underwent heart transplantation. The QRS duration decreased slightly from 169.46 ± 31.05ms before implantation to 166.30 ± 34.18ms (p=0.279) at the latest follow-up. The ejection fraction increased from 32.11 ± 10.01% to 42.22 ± 14.58% (p=0.003). NYHA stage improved with a median of III (I: 0%; II: 48.5%; III: 43.6%; IV: 7.9%) to II (I: 27.9%; II: 38.2%; III: 22.1%; IV: 11.8%) at the current follow up (p=0.003). NT-proBNP also fell slightly from 3283.49 ± 5073.14pg/ml to 3040.97 ± 4637.18pg/ml (p=0.078).
A QRS duration above 140ms before CRT implantation was found to be a predictive parameter for response in this study (p=0,020). Patients aged 0 to 17 years (p=0,010) with a systemic left ventricle (p=0,039), 3rd degree AV block (p=0,011) and previous pacemaker therapy (p=0,009) were less likely to reach the common endpoint. Predictive parameters for reaching the primary endpoint were older age (p=0,004) and no previous pacemaker therapy (p=0,007).
Conclusion: This study showed that CRT is a proven method of treating heart failure in children and adults with congenital heart disease and leads to an improvement in QRS duration, NYHA stage, ejection fraction and NT-proBNP value. Younger patients with a systemic left ventricle, previous pacemaker therapy and high QRS duration benefited in particular from CRT
HER2-low status as a distinct breast cancer subtype: myth or truth? Analysis of the WSG trials WSG-ADAPT-HR+/HER2-, WSG-PlanB, and WSG-ADAPT-TN
Get PDFBackground New data show that not only HER2-overexpressing breast cancer (BC) tumors but also HER2-low
tumors, classically considered as HER2-negative, respond to HER2-targeting antibody–drug-conjugates. Our objective
was to analyze the prevalence of HER2-low BC in a pooled analysis of contemporary early BC trials and to evaluate its
role as a prognostic factor in terms of survival in comparison to HER2-zero BC.
Methods We evaluated 5598 patients with locally HR+/HER2- BC from the screening cohort of WSG-ADAPTHR+/HER2-, 2592 patients with HR+/HER2- or HR-/HER2- from the adjuvant WSG-PlanB trial, and 336 patients
from the WSG-ADAPT-TN trial. Central HER2 testing was performed prospectively in WSG-ADAPT and retrospectively
in WSG-PlanB. Following ASCO/CAP guidelines, HER2-low status was defned as immunohistochemistry (IHC) 1+or
2+and in situ hybridization (ISH)-negative, and HER2-zero was defned as IHC 0. Agreement between HER2 assess‑
ments was evaluated with Cohen’s kappa coefcient, and efects of HER2 status on pathological complete response
(pCR) and on survival were analyzed with logistic regression and Cox proportional hazards models, respectively.
Findings In WSG-ADAPT-HR+/HER2-, 3198 (64.6%) tumors were HER2-low by the central and 3096 (55.6%)
by the local histology (agreement for HER2-low status was 61.0%). In HR+/HER2- cases from WSG-PlanB, 601 tumors
(28.7%) were HER2-low. In both cohorts, HER2-low status was signifcantly associated with higher ERBB2 mRNA expres‑
sion by Oncotype DX test in comparison to HER2-zero: mean 9.3 vs. 9.1 (p<.001) by local HER2 assessment in WSGADAPT and mean 9.2 vs. 8.8 (p<.001) in WSG-PlanB. Furthermore, patients with HER2-low tumors in WSG-ADAPTHR+/HER2- signifcantly less often had a pCR compared to the HER2-zero tumors (p=.015). No signifcant diference was observed in (invasive and/or distant) disease-free survival (DFS) between centrally HER2-low and HER2-zero
tumors in both HR+/HER2- cohorts (WSG-ADAPT-HR+/HER2- distant DFS: unadjusted HR=1.06, 95%CI 0.83–1.36,
similar results for local assessment; WSG-PlanB DFS: unadjusted HR=1.28, 95%CI 0.91–1.82). In the HR-/HER2- WSGPlanB cohort, centrally HER2-low tumors (10.5%) were associated with better DFS (unadjusted HR=0.21, 95%CI
0.05–0.83), this association was not observed in the WSG-ADAPT-TN.
Conclusion The prevalence of HER2-low status varied between the analyzed trials. Our results show that survival
does not difer between HER2-low and HER2-zero tumors in HR+/HER2- cohorts; however, HER2-low status appears
to have an inconsistent impact on survival in TNBC. Therefore, our fndings do not support the characterization
of HER2-low status as a distinct BC subtype
Der Einfluss der Membranproteine GPR107 und GPR108 auf die Calciumhomöostase
Get PDF1.1 Der Einfluss der Membranproteine GPR107 und GPR108 auf die Calciumhomöostase
Die Gruppe der G-Protein gekoppelten Rezeptoren stellt mit über 800 bekannten Re-zeptoren die größte Familie unter den humanen Membranproteinen dar und bildet dar-über hinaus eine der wichtigsten Zielstrukturen verschiedener medikamentöser Therapien. Dementsprechend stellt ein möglichst genaues Verständnis des Aufbaus sowie der Funktion der einzelnen G-Protein gekoppelten Rezeptoren eine wichtige Grundlage, unter anderem für die Entwicklung neuer therapeutischer Ansätze, dar.
Bei den beiden G-Protein gekoppelten Rezeptoren 107 und 108 handelt es sich um zwei bisher nur wenig erforschte Mitglieder dieser Proteinfamilie. Dabei konnte für beide Proteine bisher weder die exakte Struktur noch ein jeweiliger Ligand oder die exakte intrazelluläre Signalkaskade, über welche die beiden Rezeptoren agieren, identifiziert werden. Entsprechend werden sowohl das GPR107- als auch das GPR108-Protein lediglich aufgrund ihrer prognostizierten Struktur mit sieben potentiellen Transmembrandomänen der Superfamilie der G-Protein gekoppelten Rezeptoren zugeordnet. Für ein genaueres Verständnis dieser Rezeptoren wurden im Rahmen dieser Arbeit einerseits die intrazelluläre Lokalisation und eine mögliche Spaltung des GPR107- und des GPR108-Proteins sowie andererseits funktionelle Aspekte, insbesondere der Einfluss der beiden Proteine auf die intrazelluläre Calciumhomöostase, näher betrachtet.
Während für das GPR107-Protein bereits eine Protease-Schnittstelle sowie eine zumindest partielle Lokalisation des Proteins im Golgi-Apparat beschrieben ist, zeigt sich dies für das GPR108-Protein noch weitgehend unklar. Aus diesem Grund erfolgte im Rahmen dieser Arbeit zunächst die Untersuchung der intrazellulären Lokalisation des GPR108-Proteins sowie die Betrachtung potentieller Schnittstellen innerhalb des Proteins. Für die intrazelluläre Lokalisation des GPR108-Proteins stellte sich hierbei fluoreszenzmikroskopisch eine deutliche Abhängigkeit der Lokalisation des N-terminalen GPR108-Proteins von der gleichzeitigen Expression des C-terminalen Proteinabschnitts dar. Während das N-terminale GPR108-Protein ohne den C-Terminus überwiegend im endoplasmatischen Retikulum detektiert werden kann, zeigt sich bei Expression der gesamten GPR108-Proteinsequenz eine deutliche Anreicherung des N-terminalen Proteinabschnitts im Golgi-Apparat sowie in kleinen Vesikeln, welche insbesondere in den Zellausläufern lokalisiert sind. Dementsprechend scheint der C-Terminus hier eine
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wichtige Voraussetzung für den Austritt des N-terminalen GPR108-Proteins aus dem endoplasmatischen Retikulum dazustellen. Für den C-terminalen Abschnitt des GPR108-Proteins, welcher die Transmembrandomänen enthält, zeigt sich hingegen unabhängig von der zeitgleichen Expression des N-terminalen Proteinabschnitts eine Lokalisation in kleinen Vesikeln, welche über große Teile der Zelle verteilt vorliegen. Lediglich in sehr stark exprimierenden Zellen lässt sich die für die Transmembrandomänen zu erwartende Lokalisation in der Zellmembran detektieren.
Hinsichtlich einer potentiellen Spaltung des GPR108-Proteins ergaben sich in der mikroskopischen Betrachtung zwar deutliche Hinweise auf eine Spaltung des GPR108-Proteins innerhalb der Zelle, jedoch konnte weder durch Fluoreszenzmikroskopie noch durch Untersuchungen mittels Western Blot ein Motiv innerhalb des Proteins als Schnittstellensequenz identifiziert werden.
Im Gegensatz hierzu scheint sich die Lokalisation der Protease-Schnittstelle innerhalb des strukturverwandten GPR107-Proteins deutlich klarer darzustellen. Vorige Arbeiten identifizierten dabei insbesondere mittels molekularbiologischer Untersuchungen im Western Blot eine KSKR-Sequenz vor den Transmembrandomänen als Schnittstelle für die Protease Furin. Ergänzend erfolgte im Rahmen dieser Arbeit die mikroskopische Untersuchung dieser Schnittstelle. Unter Mutation dieser KSKR-Sequenz sowie durch Markierung beider Proteintermini mittels verschiedener Fluoreszenzproteine ließ sich diese Sequenz auch mikroskopisch als Schnittstellenmotiv des Proteins bestätigen.
Neben den Betrachtungen der beiden Rezeptoren GPR107 und GPR108 hinsichtlich einer potentiellen Spaltung sowie ihrer intrazellulären Lokalisation erfolgte im Rahmen dieser Arbeit vorrangig die Untersuchung funktioneller Aspekte der beiden Proteine, insbesondere deren Einfluss auf die intrazelluläre Calciumhomöostase mittels Calcium Imaging. Hierbei zeigte sich zunächst ein gegenüber den Kontrollzellen signifikant erhöhter Calciumeinstrom in GPR107 exprimierende Zellen infolge einer Erhöhung der extrazellulären Calciumkonzentration. Weiterhin ließ sich dieser Effekt des GPR107-Proteins nach separater Expression des N- sowie C-terminalen Proteinabschnitts klar dem C-terminalen Abschnitt des GPR107-Proteins zuordnen. Der N-Terminus hingegen zeigte keinen wesentlichen Einfluss auf diesen Effekt.
Im Gegensatz zu diesen Beobachtungen bei Expression des GPR107-Proteins resultiert die Expression des GPR108-Proteins lediglich in einem geringgradigen Anstieg der intrazellulären Calciumkonzentration infolge einer Erhöhung der extrazellulären Calciumkonzentration. Dementsprechend scheint das GPR108-Protein keinen wesentlichen Einfluss auf den Calciumeinstrom in Zellen aufzuweisen.
Weiterführend zeigte sich für die beiden G-Protein gekoppelten Rezeptoren 107 und 108 eine ausgeprägte Auswirkung auf intrazelluläre Calciumspeicher. Sowohl bei Expression
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des GPR107- als auch bei Expression des GPR108-Proteins stellte sich die, durch Applikation von Carbachol oder Thapsigargin induzierte, Freisetzung von Calcium aus intrazellulären Speichern signifikant verringert gegenüber Kontrollzellen dar. Somit scheint hier ein ursächlicher, mit der Expression der beiden Rezeptoren GPR107 beziehungsweise GPR108 einhergehender, verringerter Füllungszustand dieser Speicher wahrscheinlich. Bei näherer Betrachtung dieser Auswirkungen der beiden Proteine gelang auch hier nach separater Expression der jeweilgen N- und C-Termini der Rezeptoren eine klare Zurodnung dieses Effektes zu den C-terminalen Proteinabschnitten. Während unter alleiniger Expression der C-Termini eine gleichartige, beziehungsweise im Falle des GPR108-Proteins eine nochmals signifikant stärkere Verringerung der intrazellulären Calciumfreisetzung beobachtet werden kann, zeigte sich unter alleiniger Expression der jeweiligen N-Termini diesbezüglich keine wesentliche Auswirkung.
Als dritten zu beobachtenden Effekt hinsichtlich der zellulären Calciumhomöostase ließ sich bei Expression des GPR107-Proteins eine signifikante Erhöhung der basalen intrazellulären Calciumkonzentration verzeichnen.
Aufgrund der deutlichen Strukturverwandtschaft der beiden Proteine GPR107 und GPR108 zueinander sowie lediglich sehr geringer struktureller Ähnlichkeit mit anderen G-Protein gekoppelten Rezeptoren wurde in dieser Arbeit des Weiteren eine mögliche Interaktion dieser beiden Proteine untersucht. Hierbei ergaben sich sowohl in Bezug auf den Calciumeinstrom in die Zellen als auch hinsichtlich der Carbachol-induzierten Calci-umfreisetzung aus intrazellulären Speichern keine Hinweise auf eine diesbezügliche In-teraktion der beiden Rezeptoren.
Neben den funktionellen Auswirkungen auf die intrazelluläre Calciumhomöostase erfolgte im Rahmen dieser Arbeit zudem die Betrachtung verschiedener, den beobachteten Effekten potentiell zugrundeliegenden, G-Protein gekoppelter Signalkaskaden. In erster Linie wurde hierfür das GPR107-Protein näher untersucht. Eine erste allgemeine Untersuchung eines G-Protein gekoppelten Signalwegs des GPR107-Proteins erfolgte dabei mit Suramin, unter dessen Einfluss eine Inhibierung der Aktivierung aller G-Proteine resultiert. Da sich die Effekte des GPR107-Proteins unter diesem Einfluss jedoch nicht wesentlich veränderten, bleibt hierbei eine Bestätigung des Agierens des GPR107-Proteins über ein G-Protein aus.
Aufgrund bereits vorliegender Untersuchungen, welche keine Hinweise auf einen cAMP-vermittelten Signalweg des GPR107-Proteins erkennen ließen, erfolgte im weiteren Ver-lauf dieser Arbeit insbesondere die Betrachtung einer konstitutiven Gi-Aktivierung durch das GPR107- beziehungsweise das GPR108-Protein sowie eines Agierens des GPR107-Proteins über die Phospholipase C. Hierbei ergaben sich jedoch keine
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Anhaltspunkte für das Wirken der beiden G-Protein gekoppelten Rezeptoren 107 und 108 über eine dieser Signalkaskaden.
Für eine weiterführende Untersuchung des GPR107-Proteins hinsichtlich der Charakte-ristik eines G-Protein gekoppelten Rezeptors erfolgte darum die Betrachtung der poten-tiellen G-Protein-Bindungsstelle des Proteins. Entgegen der Vermutungen resultierte hierbei nach Modifikation der wahrscheinlichen G-Protein-Bindungsposition innerhalb des dritten intrazellulären Loops der Transmembrandomänen keine Verringerung der Effekte des GPR107-Proteins, sondern im Gegensatz sogar eine signifikante Verstär-kung. Dies ließ sich dabei sowohl für den Calciumeinstrom in GPR107 exprimierende Zellen als auch für die Carbachol-induzierte intrazelluläre Calciumfreisetzung verzeich-nen. Eine klare Identifikation dieser Sequenz als G-Protein-Bindungsstelle des GPR107-Proteins blieb hiermit zwar aus, jedoch scheint diese Aminosäuresequenz innerhalb des dritten intrazellulären Loops den Einfluss des GPR107-Proteins auf die Calciumhomöo-stase wesentlich zu beeinflussen.
Da die exakte Anzahl an Transmembrandomänen bisher nicht bekannt ist, wurde neben der Untersuchung der einzelnen G-Protein gekoppelten intrazellulären Signalkaskaden auch die Möglichkeit in Betracht gezogen, dass das GPR107-Protein potentiell einen Ionenkanal mit sechs putativen Transmembrandomänen darstellen könnte. Für eine diesbezügliche Untersuchung wurden innerhalb einer putativen Poren-ähnlichen Region negativ geladene Aminosäuren durch neutrale ersetzt. Diese Modifikation zeigte jedoch keinen Einfluss auf den mit der Expression des GPR107-Proteins einhergehenden er-höhten Calciumeinstrom in Zellen. Somit scheint es eher unwahrscheinlich, dass das GPR107-Protein einen Calcium-permeablen Ionenkanal bildet.
Da sowohl für das GPR107- als auch für das GPR108-Protein bisher keine Liganden bekannt sind und diese somit der Gruppe der orphan G-Protein Rezeptoren zugeordnet werden, erfolgte im Rahmen dieser Arbeit auch die Untersuchung einiger potentieller Liganden für das GPR107-Protein. Hierbei wurden aufgrund der erheblichen Einflüsse des GPR107-Proteins in Bezug auf den Calciumeinstrom sowie die intrazelluläre Calci-umfreisetzung insbesondere Liganden untersucht, welche ebenfalls die Calciumhomöo-stase beeinflussen. Zunächst erfolgte die Betrachtung einer potentiellen Interaktion des GPR107-Proteins mit verschiedenen Glucocorticoiden. Die untersuchten Glucocorti-coide Beclomethason, Corticosteron, Dexamethason, Hydrocortison und Prednisolon21-Acetat beeinflussten hierbei die Auswirkungen des GPR107-Proteins auf den intrazellu-lären Calciumhaushalt in keinem wesentlichen Ausmaß, sodass sich hierdurch kein Hin-weis auf eine Interaktion beziehungsweise ein Fungieren dieser Glucocorticoide als Lig-anden des GPR107-Proteins ergibt.
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Auch das polyvalente Kation Neomycin wurde in dieser Arbeit als potentieller Ligand des GPR107-Proteins untersucht. Neomycin aktiviert den Calcium-sensing receptor (CaSR), welcher durch seine Funktion als Calciumsensor an der zellulären Reaktion auf eine veränderte extrazelluläre Calciumkonzentration beteiligt ist. Untersucht wurde, inwieweit Neomycin auch das GPR107-Protein aktiviert. Hierbei ergaben sich keine Anhaltspunkte für eine Interaktion des GPR107-Proteins mit dem Neomycin beziehungsweise auf eine hiermit potentiell einhergehende Charakteristik des GPR107-Proteins als Calci-umsensor.
Da mehrere Arbeiten darauf hindeuten, dass das GPR107-Protein mit dem Peptidhor-mon Neuronostatin interagiert, wurde abschließend auch Neuronostatin als möglicher Ligand des GPR107-Proteins untersucht. Interessanterweise scheint auch Neuronosta-tin die intrazelluläre Calciumhomöostase zu beeinflussen, wobei die hier zugrundliegen-den intrazellulären Signalwege sowie beteiligte Rezeptoren bisher weitgehend unbe-kannt sind. Für den erhöhten Calciumeinstrom in die Zelle, welche unter Expression des GPR107-Proteins zu beobachten ist, zeigte sich keine wesentliche Auswirkung bei Be-trachtung dieses Effektes unter dem Einfluss von Neuronostatin. Im Gegensatz hierzu stellte sich die mit der Expression des GPR107-Proteins einhergehende Verringerung der Calciumfreisetzung aus intrazellulären Speichern unter dem Einfluss von Neurono-statin zwar lediglich gering, jedoch signifikant stärker verringert dar. Inwieweit diese Aus-wirkung auf eine tatsächliche Interaktion des Neuronostatins mit dem G-Protein gekop-pelten Rezeptor 107 und eine hierdurch bedingte Neuronostatin-induzierte Verstärkung des GPR107-Effekts zurückzuführen ist, ist unklar. Ein genaues Verständnis der hier zugrundeliegenden Mechanismen obliegt somit künftigen Untersuchungen.1.2 The influence of the membrane proteins GPR107 and GPR108 on calcium homeostasis
With more than 800 known receptors, the group of G protein-coupled receptors re-presents the largest family of human membrane proteins and forms one of the most important target structures of various drug therapies. Therefore, a precise understanding of the structure and function of these G protein-coupled receptors is an important basis for, among others the development of new therapeutic approaches.
The two G protein-coupled receptors 107 and 108 are two members of this protein family that have been little explored so far. For both proteins neither the exact structure nor a respective ligand or the exact intracellular signaling pathway through which the two re-ceptors act could be identified. Accordingly, the GPR107 and GPR108 protein are both assigned to the superfamily of G protein-coupled receptors solely because of their pre-dicted structure with seven potential transmembrane domains. For a more detailed un-derstanding of these receptors, the intracellular localization and a possible cleavage site of the GPR107 and GPR108 protein were examined in more detail in this thesis. Further-more, functional aspects, in particular the influence of the two proteins on intracellular calcium homeostasis were explored as well.
While for the GPR107 protein a protease cleavage site and a partial localization in the Golgi apparatus have already been described, these aspects largely have yet to be de-termined for the GPR108 protein. For this reason, the intracellular localization of the GPR108 protein and the consideration of potential cleavage sites within the protein were investigated in this thesis. In case of the intracellular localization of the GPR108 protein, fluorescence microscopy showed a clear dependence regarding the localization of the N-terminal GPR108 protein on the simultaneous expression of the C-terminal protein segment. Without the C-terminal GPR108 protein the N-terminus can be detected pre-dominantly in the endoplasmic reticulum. In contrast, when the entire protein sequence of the GPR108 protein is expressed, there is a clear enrichment of the N-terminal protein section in the Golgi apparatus and in small vesicles, which are localized in particular in the cell extensions. Therefore, the C-terminus seems to be an important prerequisite regarding the exit of the N-terminal GPR108 protein from the endoplasmic reticulum. The C-terminal section of the GPR108 protein, which contains the transmembrane domains, localizes in small vesicles, which are distributed over large parts of the cell whereas the localization in the cell membrane, expected for the transmembrane domains can only be seen in very strongly expressing cells. This can be found independently from the simul-taneous expression of the N-terminal protein section.
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With regard to a potential cleavage site of the GPR108 protein, microscopic observation revealed clear indications of a cleavage within the cell, but neither fluorescence microscopy nor Western blot investigations could identify an unambiguously cleavage sequence.
In contrast, the localization of the protease cleavage site within the structurally related GPR107 protein appears to be much clearer. Previous studies, in particular molecular-biological investigations by means of Western blots identified a KSKR sequence prece-ding the transmembrane domains as a cleavage site for the protease furin. As part of this thesis the cleavage site was supplementary carried out by microscopic examination. By mutating the KSKR sequence and by marking both protein termini with different flu-orescent proteins, this sequence could also be confirmed microscopically as the cleavage site of the protein.
In addition to the examinations of the two receptors GPR107 and GPR108 with regard to a potential cleavage site and their intracellular localization, the functional aspects of the two proteins have been investigated. Therefor particularly their influence on the in-tracellular calcium homeostasis was explored by calcium imaging in this study. In com-parison to the control cells, cells expressing the GPR107 protein showed a significantly strengthened calcium influx as a result of an increase in the extracellular calcium con-centration. Furthermore, after separate expression of the N- and C-terminal protein sec-tion, this effect could be clearly assigned to the C-terminal section of the GPR107 protein. The N-terminus showed no significant influence on this effect.
In contrast to these observations in case of expression of the GPR107 protein, expres-sion of the GPR108 protein results in only a slight rising of intracellular calcium concent-ration as a consequence of an increase in extracellular calcium concentration. Accordin-gly, the GPR108 protein does not appear to have any significant impact on calcium influx into cells.
Further, the two G protein-coupled receptors 107 and 108 showed a considerable effect on intracellular calcium stores. After expression of the GPR107 protein as well as after expression of the GPR108 protein, the release of calcium from intracellular stores in-duced by application of carbachol or thapsigargin was significantly reduced compared to control cells. This indicates a probable underlying reduced filling state of intracellular calcium stores, caused by expression of the GPR107 and GPR108 protein. On closer examination of these results, when the respective N- and C-termini of the receptors were expressed separately, it was also possible to clearly assign this effect to the C-terminal protein sections. While there can be observed a similar reduction in intracellular calcium release, or in case of the GPR108 protein a significantly stronger reduction, when the C-
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termini are expressed solely, there was no significant effect when the respective N-ter-mini were expressed alone.
The third effect to be determined with regard to cellular calcium homeostasis was a sig-nificant increase in the basal intracellular calcium concentration when the GPR107 pro-tein was expressed.
Due to the clear structural relationship between the two proteins GPR107 and GPR108 and only very low structural similarity to other G protein-coupled receptors, a possible interaction of these two proteins was also investigated in this thesis. In this context, neit-her in regard to the influx of calcium into the cells nor to the release of calcium from its intracellular stores, induced by carbachol, there were any indications of an interaction between these two receptors.
In addition to the functional effects on the intracellular calcium homeostasis, this study also considered various G protein-coupled signaling pathways that potentially underlie the observed effects. First and foremost, the GPR107 protein was examined more closely for this purpose. A first general investigation of a G protein-coupled signaling pathway of the GPR107 protein was performed with suramin, under which influence an inhibition of the activation of all G proteins results. Since the effects of the GPR107 pro-tein were not significantly different under this influence, there is no confirmation of the GPR107 protein acting via a G protein.
Based on existing studies, which did not reveal any evidence of a cAMP-mediated sig-naling pathway of the GPR107 protein, this thesis further focused in particular on a con-stitutive Gi activation by the GPR107 or GPR108 protein as well as a mechanism of the GPR107 protein via phospholipase C. As a result, no evidence for an operation of the two G protein-coupled receptors 107 and 108 via one of these signaling pathways could have been observed.
For a further investigation with regard to the characteristics of a G protein-coupled re-ceptor, the potential G protein binding site of the GPR107 protein was explored. Contrary to assumptions, the modification of the probable G protein binding site within the third intracellular loop of the transmembrane domains did not result in a reduction in the effects of the GPR107 protein, but even in a significant increase. This was recorded both for the calcium influx into GPR107 expressing cells and for the intracellular calcium re-lease, induced by carbachol. Although consequently, this sequence was not clearly iden-tified as the G protein binding site of the GPR107 protein, this amino acid sequence within the third intracellular loop appears to have a significant influence on the effects of the GPR107 protein on calcium homeostasis.
Since the exact number of transmembrane domains is not yet known, the possibility that the GPR107 protein could potentially represent an ion channel with six putative
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transmembrane domains was taken into consideration in addition t
MALDI-TOF mass spectrometry combined with machine learning algorithms to identify protein profiles related to malaria infection in human sera from Côte d’Ivoire
Get PDFBackground In sub-Saharan Africa, Plasmodium falciparum is the most prevalent species of malaria parasites. In
endemic areas, malaria is mainly diagnosed using microscopy or rapid diagnostic tests (RDTs), which have limited sensitivity, and microscopic expertise is waning in non-endemic regions. Matrix-assisted laser desorption/ionization timeof-fight (MALDI-TOF) mass spectrometry (MS) is nowadays the standard method in routine microbiology laboratories
for bacteria and fungi identifcation in high-income countries, but is rarely used for parasite detection. This study aims
to employ MALDI-TOF MS for identifying malaria by distinguishing P. falciparum-positive from P. falciparum-negative sera.
Methods Sera were obtained from 282 blood samples collected from non-febrile, asymptomatic people aged 5
to 58 years in southern Côte d’Ivoire. Infectious status and parasitaemia were determined by both RDTs and microscopy, followed by a categorization into two groups (P. falciparum-positive and P. falciparum-negative samples).
MALDI-TOF MS analysis was carried out by generating protein spectra profles from 131 Plasmodium-positive and 94
Plasmodium-negative sera as the training set. Machine learning (ML) algorithms were employed for distinguishing P.
falciparum-positive from P. falciparum-negative samples. Subsequently, a subset of 57 sera (42 P. falciparum-positive
and 15 P. falciparum-negative) was used as the validation set to evaluate the best two of the four models trained.
Results MALDI-TOF MS was able to generate good-quality spectra from both P. falciparum-positive and P. falciparumnegative serum samples. High similarities between the protein spectra profles did not allow for distinguishing
the two groups using principal component analysis (PCA). When four supervised ML algorithms were tested by tenfold cross-validation, P. falciparum-positive sera were discriminated against P. falciparum-negative sera with a global
accuracy ranging from 73.28% to 81.30%, while sensitivity ranged from 70.23% to 83.97%. The independent test
performed with a subset of 57 serum samples showed accuracies of 85.96% and 89.47%, and sensitivities of 90.48%
and 92.86%, respectively, for LightGBM and RF.
Conclusion MALDI-TOF MS combined with ML might be applied for detection of protein profles related to P.
falciparum malaria infection in human serum samples. Additional research is warranted for further optimization such
as specifc biomarkers detection or using other ML models
Immune Response after COVID-19 Vaccination in Elite Athletes
Get PDFThe COVID-19 pandemic led to the development of new and different types of vaccines. These vaccines differ in mechanism, immunogenicity and reactogenicity and have been widely used in the adult population. However, there were concerns about their efficacy and the acceptability of their side effects in athletes. Therefore, this study investigates the immunogenicity and reactogenicity in elite athletes after COVID-19 vaccination and compares the responses between a double-dosed mRNA and a single-dosed vector vaccine.
The immune response was analysed in 72 athletes (56 mRNA (BNT162b2/mRNA-1273), 16 vector (Ad26.COV2.S) vaccinations). Blood samples were taken before the first vaccination, 14 days after the second mRNA vaccination and 21 days after the single Ad26.COV2.S vaccination. The long-term immune response was analysed 6 months after the last vaccination. The vaccine-induced immunoglobulin G antibody response, its neutralizing activity, CD 4 T-cells and CD 8 T-cells were assessed. Side effects, including time loss in training, were self-reported by the athletes.
Overall, the induction of immunoglobulin G antibodies was significantly greater with the double-dosed mRNA vaccines (5702 BAU/ml, p<0.001) compared to a single dose of Ad26.COV2.S (61 BAU/ml). In addition, the median neutralizing activity after mRNA vaccination was significantly greater (99.7%, p<0.001) than after the single-dosed Ad26.COV2.S vaccination (11%). This was also observed for CD 4 T-cells, which were induced significantly stronger by the mRNA vaccines (0.13%, p<0.001) than by the Ad26.COV2.S vaccine (0.05%), while the opposite was true for CD 8 T-cells (mRNA: 0.02%, Ad26.COV2.S (0.15%, p<0.001).
After reviewing the initial results, a booster immunisation was indicated for the Ad26.COV2.S sample. This was done with the BNT162b2 vaccine in 11 athletes. Two weeks after this booster immunisation IgG antibodies increased significantly to 3456 BAU/ml (p<0.001), as did the neutralizing activity of the antibodies (100%, p<0.001), CD 4 T-cells (0.13%, p<0.001) and CD 8 T-cells (0.43%, p<0.001).
The cumulative median time loss in training after the double-dosed mRNA vaccines was 2 days. Initially, the single-dosed Ad26.COV2.S vaccine also resulted in a median time loss of 2 days. The cumulative median time loss after Ad26.COV2.S and mRNA boost vaccination was 3 days.
Our results indicate that the immune response in competitive athletes after vaccination with Ad26.COV2.S results in a poorer immune response than after vaccination with mRNA vaccines. A booster vaccination after Ad26.COV2.S vaccination leads to a significant increase in immune parameters comparable to the initial immune response after mRNA vaccination. The effects of vaccination on training, as measured by the duration of training restrictions and the incidence of side effects, were comparable.Die COVID-19 Pandemie hat zu einer schnellen Entwicklung von neuen Impfstoffen geführt, die sich in Bezug auf ihren Mechanismus, ihre Immunogenität und die Reaktogenität unterscheiden. Die verschiedenen Impfstoffe wurden in der Erwachsenenbevölkerung in großem Umfang eingesetzt. Dennoch gab es Bedenken hinsichtlich ihrer Wirksamkeit und der Akzeptanz ihrer Nebenwirkungen bei Sportlern. In der vorliegenden Studie werden daher die Immunogenität und die Reaktogenität bei Leistungssportlern nach einer COVID-19-Impfung untersucht und die Reaktionen zwischen einer doppeldosierten mRNA-Impfung und einer einfachdosierten Vektor-Impfung (Ad26.COV2.S -Impfung) verglichen.
Die Immunreaktion wurde bei 72 Sportlern (56 mRNA- (BNT162b2/ mRNA-1273), 16 Vektor- (Ad26.COV2.S) Impfungen) analysiert. Die Blutproben wurden vor der Impfung, 14 Tage nach der zweiten mRNA- und 21 Tage nach der einmaligen Ad26.COV2.S-Impfung genommen. Zur Beobachtung der Langzeitimmunität wurde 6 Monate nach der letzten Impfung erneut Blut abgenommen. Anhand der entnommenen Blutproben wurden die Immunglobulin G (IgG) Antikörperreaktion, die neutralisierende Aktivität der Antikörper, CD 4 T-Zellen und CD 8 T-Zellen analysiert. Die Nebenwirkungen, einschließlich des Zeitverlusts beim Training, wurden von den Sportlern in einem Tagebuch dokumentiert. Insgesamt war die Induktion von IgG-Antikörpern bei einer doppelten Dosis mRNA-Impfstoff signifikant größer (5702 BAU/ml, p<0.001) als bei einer einzelnen Dosis Ad26.COV2.S (61 BAU/ml). Darüber hinaus war die mediane neutralisierende Aktivität nach mRNA-Impfstoffen signifikant höher (99,7 %, p<0.001) als nach der Ad26.COV2.S-Einzelimpfung (11 %). Dies wurde auch für die CD 4 T-Zellen beobachtet, die durch die mRNA-Impfstoffe signifikant stärker induziert wurden (0.13%, p<0.001) als durch den Ad26.COV2.S-Impfstoff (0.05%). Die CD 8 T-Zellen wurden durch die Ad26.COV2.S Impfung signifikant mehr induziert (0.15%) als durch die mRNA-Impfung (0.02%, p<0.001).
Nach einer vorläufigen Analyse wurde eine Auffrischungsimpfung für die Ad26.COV2.S-Stichprobe empfohlen. Diese wurde mit dem BNT162b2-Impfstoff bei 11 Sportlern durchgeführt. 2 Wochen nach der Auffrischungsimpfung stiegen die IgG-Antikörper signifikant auf 3456 BAU/ml an (p<0.001), ebenso die neutralisierende Aktivität der Antikörper (100%, p<0.001), die CD 4 T-Zellen (0,13%, p<0.001) und die CD 8 T-Zellen (0.43%, p<0.001).
Der kumulative mediane Zeitverlust beim Training nach den mRNA-Impfungen betrug 2 Tage. Auch die Einzeldosis des Ad26.COV2.S -Impfstoffs führte zunächst zu einem medianen Zeitverlust von 2 Tagen. Der kumulierte mediane Zeitverlust durch die Nebenwirkungen der Impfung betrug nach der heterologen Ad26.COV2.S und mRNA-Impfung 3 Tage.
Unsere Ergebnisse deuten darauf hin, dass die Immunantwort bei Leistungssportlern nach der Impfung mit Ad26.COV2.S schlechter ausfällt als nach der Impfung mit mRNA-Impfstoffen. Eine Auffrischungsimpfung nach der Ad26.COV2.S-Impfung führt zu einem signifikanten Anstieg der Immunparameter, der mit der anfänglichen Immunantwort nach der mRNA-Impfung vergleichbar ist. Die Auswirkungen der Impfung auf das Training, gemessen an der Dauer der Trainingseinschränkungen und dem Auftreten von Nebenwirkungen, waren vergleichbar.Bundesinstitut für Sportwissenschafte