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The impact of microbiome in immunotherapy for breast cancer
No full textTrabalho Final de Mestrado Integrado, Ciências Farmacêuticas, 2024, Universidade de Lisboa, Faculdade de Farmácia.O cancro da mama é um dos cancros mais comuns em todo o mundo, sendo a principal causa de morte por cancro nas mulheres. Neste contexto, a imunoterapia baseada em inibidores dos checkpoints imunitários surgiu recentemente como um tratamento promissor, particularmente para o cancro da mama triplo-negativo. Contudo, a resposta a esta terapia varia significativamente entre doentes devido às diferenças entre os vários microambientes tumorais. Neste âmbito, o microbioma humano, nomeadamente as bactérias intestinais, parece desempenhar um papel fundamental nesta variabilidade. A microbiota intestinal, influenciada pela genética e pelo tipo de dieta, exerce um papel importante na saúde devido ao seu forte impacto no sistema imunitário, na inflamação e no metabolismo. No entanto, a disbiose intestinal, marcada pela perda de diversidade microbiana e de bactérias benéficas, desregula estes processos e está associada a várias doenças. Investigação recente tem realçado uma interação bidirecional entre a microbiota intestinal e o cancro da mama, bem como as suas terapias. A evidência indica que a microbiota intestinal pode ter tanto efeitos benéficos como prejudiciais no contexto desta doença. Certas espécies bacterianas podem desempenhar um papel positivo através da ativação da resposta imunitária antitumoral, por meio do recrutamento de linfócitos T citotóxicos para o microambiente tumoral, ou pela produção de metabolitos com propriedades protetoras que chegam ao tecido mamário. Em contrapartida, outras bactérias podem desempenhar um papel negativo, ao promover a imunossupressão, e a recaptação de estrogénios livres para a circulação. A própria microbiota da mama também parece estar associada ao cancro da mama por mecanismos semelhantes. A composição da microbiota intestinal e da mama difere nos doentes com cancro da mama em comparação com indivíduos saudáveis, o que reforça o papel potencial da disbiose na progressão desta doença. Além disto, a composição da microbiota influencia a eficácia e a toxicidade da imunoterapia, sendo que uma microbiota equilibrada e estirpes bacterianas específicas estão associadas a melhores resultados do tratamento. A análise da composição da microbiota pode ser útil para prever a resposta à imunoterapia. Intervenções baseadas no microbioma, incluindo o transplante de microbiota fecal, probióticos, intervenção dietética e prebióticos, representam uma abordagem promissora para otimizar as respostas à imunoterapia em doentes com cancro da mama. Contudo, é essencial mais investigação de modo a possibilitar futuras aplicações clínicas.Breast cancer is one of the most common cancers worldwide, being the leading cause of cancer-related death in women. In this context, immune checkpoint inhibitors-based immunotherapy has recently emerged as a promising treatment, particularly for triple-negative breast cancer. However, the response to this therapy varies significantly among patients due to differences in the various tumor microenvironments. Thus, the human microbiome, namely gut bacteria, appears to play a key role in this variability. The gut microbiota, influenced by genetics and type of diet, plays an important role in health due to its strong impact on the immune system, inflammation and metabolism. However, gut dysbiosis, marked by a loss of microbial diversity and beneficial bacteria, disrupts these processes and it is associated to various diseases. Recent research has highlighted a bidirectional interaction between gut microbiota and breast cancer, as well as its therapies.Evidence indicates that gut microbiota can have both beneficial and harmful effects in the context of this disease. Certain bacterial species can play a positive role by activating antitumor immune response, by recruiting cytotoxic T cells to the tumor microenvironment, or by producing metabolites with protective properties that reach the breast tissue. In contrast, other bacteria may play a negative role by promoting immunosuppression, and the reuptake of free estrogens to circulation. Breast microbiota itself also appears to be associated with breast cancer through similar mechanisms. The composition of both breast and gut microbiota differs in breast cancer patients compared to healthy individuals, which reinforces the potential role of dysbiosis in the progression of this disease. Moreover, microbiota composition influences the efficacy and toxicity of immunotherapy, with a balanced microbiota and specific bacterial strains being associated to improved treatment outcomes.
Microbiota composition analysis can be useful to predict the response to immunotherapy. Microbiome-based interventions, including fecal microbiota transplantation, probiotics, dietary intervention and prebiotics, represent a promising approach to optimize immunotherapy responses in breast cancer patients. Nevertheless, further research is essential to enable future clinical applications
Impacto da oxigenoterapia hiperbárica na função erétil
No full textTrabalho Final do Curso de Mestrado Integrado em Medicina, Faculdade de Medicina, Universidade de Lisboa, 2024A disfunção erétil (DE) define-se como a incapacidade de obter e/ou manter uma ereção suficiente para um desempenho sexual satisfatório. A saúde sexual e a satisfação com a vida sexual são fatores importantes na qualidade de vida, pelo que esta entidade tem um impacto considerável na diminuição da mesma. Está demonstrado que a DE pode representar uma primeira manifestação de doença cardiovascular. O oxigénio hiperbárico (OHB), ao promover a oxigenação de tecidos e a angiogénese, pode mostrar-se eficaz na melhoria da função erétil, nomeadamente quando a causa subjacente da disfunção é vascular.
O objetivo deste trabalho foi avaliar o efeito da oxigenoterapia hiperbárica na função erétil. Para verificá-lo, realizou-se um estudo prospetivo e não interventivo, com recurso ao preenchimento do questionário International Index of Erectile Function (IIEF-5) e de um outro sobre comorbilidades e fatores de risco na consulta inicial e no final do tratamento.
Foram incluídos dezassete doentes, com diferentes níveis de disfunção erétil e avaliados parâmetros como o motivo de tratamento, o número de sessões de OHB a que foram submetidos, a idade e fatores de risco para disfunção erétil. Mais de metade dos doentes submetidos a OHB verificaram uma melhoria na sua função erétil, no final dos seus tratamentos. Foram, ainda, encontradas relações relevantes entre doentes com uma DE ligeira e melhoria da função erétil, e doentes submetidos a um menor número de sessões e melhoria da função erétil.
Como limitações identificadas, o preenchimento dos questionários pelos próprios doentes pode não ter sido feito de forma correta; alguns doentes, por terem diminuição da acuidade auditiva, não puderam ser contactados.
No futuro, seria importante a condução de um estudo com uma amostra de maiores dimensões, com uma avaliação padronizada, com o intuito de perceber qual o esquema terapêutico a aplicar nos doentes com DE.Erectile dysfunction is defined as the inability to achieve and/or maintain an erection sufficient for satisfactory sexual performance. Sexual health and satisfaction with sexual life are important factors in quality of life, making this condition significantly impact its decrease. It has been shown that ED can be an initial manifestation of cardiovascular disease. Hyperbaric oxygen, by promoting tissue oxygenation and angiogenesis, can be effective in improving erectile function with, especially when the underlying cause of dysfunction is vascular.
The objective of this study was to evaluate the effect of hyperbaric oxygen therapy on erectile function. To verify this, a prospective and non-interventional study was conducted, using the International Index of Erectile Function (IIEF-5) questionnaire and a questionnaire on comorbidities and risk factors at the initial consultation and at the end of treatment.
Seventeen patients with varying levels of erectile dysfunction were included. Parameters evaluated included treatment rationale, number of hyperbaric oxygen therapy sessions undergone, age and risk factors for erectile dysfunction. More than half of the patients undergoing HBOT experienced improvement in their erectile function by the end of their treatments. Relevant outcomes were also found between patients with mild ED and improvement in erectile function, and patients who underwent a lower number of sessions and improvement in erectile function.
Some identified limitations were that self-completion of the questionnaires by patients may not have been done correctly; some patients could not be contacted due to decreased hearing acuity. In the future, it would be important to conduct a study with a larger sample size and a standardized evaluation, in order to determine the therapeutic regimen to be applied to patients with ED
Dysregulated autophagy in Alzheimer's disease using the aged SH-SY5Y APPswe cell model
No full textTese de mestrado, Ciências Biofarmacêuticas, 2024, Universidade de Lisboa, Faculdade de Farmácia.A doença de Alzheimer (DA) é uma patologia neurodegenerativa complexa e multifatorial, caracterizada pela formação de placas extracelulares de beta-amilóide (Aβ) e emaranhados neurofibrilares intracelulares compostos pela proteína tau hiperfosforilada. Estas anomalias levam à morte neuronal e à perda sináptica, que se manifestam clinicamente como declínio progressivo das funções cognitivas, alterações comportamentais, perda de memória, e, em fases avançadas, disfunção motora. Esta doença afeta cerca de 50 milhões de pessoas em todo o mundo, sendo particularmente prevalente na população acima dos 65 anos. Atualmente, não existe cura para a DA, e os tratamentos disponíveis são focados em aliviar os sintomas e retardar a progressão da doença. A investigação continua a procurar compreender melhor os mecanismos subjacentes à DA, com o objetivo de desenvolver terapias mais eficazes.
Um dos principais mecanismos implicados na progressão da DA é a disfunção da autofagia, um processo essencial para a manutenção da homeostasia celular através da degradação e reciclagem de componentes intracelulares danificados ou desnecessários, incluindo agregados de proteínas e organelos danificados. No contexto da DA, a autofagia encontra-se comprometida, o que contribui para a acumulação de placas de beta-amiloide (Aβ) e a formação de emaranhados neurofibrilares, marcadores patológicos clássicos da doença.
Recentemente, tem-se destacado o papel dos microRNAs (miRNAs) na regulação da autofagia e na inflamação associada a doenças neurodegenerativas. Em particular, o miR-142 tem emergido como um importante regulador nestes processos, sugerindo uma potencial correlação entre a sua expressão e a patologia da DA. Este estudo teve como objetivo explorar o papel da mitofagia e a expressão de genes relacionados à autofagia num modelo celular de DA, utilizando células SH-SY5Y (SH-WT) transfetadas com a mutação sueca do gene (SH-SWE), antes e após a indução de stresse oxidativo com peróxido de hidrogénio (H₂O₂). Este modelo permite a simulação de condições patológicas da DA associadas ao envelhecimento, proporcionando uma ferramenta relevante para estudar os mecanismos moleculares subjacentes à doença.
A fim de avaliar a autofagia, quantificámos a expressão dos genes Beclina-1, LAMP-1 e LAMP-2, utilizando RT-qPCR, e analisámos os níveis de proteína LC3 e LAMP-1 por imunocitoquímica (ICC) e Western blotting (WB). A coloração com LysoTracker foi efetuada com a finalidade de medir a atividade lisossomal nas células. Além disso, investigámos a expressão de marcadores sinápticos, como sinaptofisina e PSD-95, e marcadores inflamatórios, incluindo IL-1β, iNOS, TNF-α, S100B, TLR2 e TLR4, de modo a compreender a resposta inflamatória no modelo da DA. Avaliámos ainda a expressão de genes relacionados com a dinâmica mitocondrial, nomeadamente FIS1, DRP1 e MFN2, uma vez que a mitofagia — a degradação de mitocôndrias danificadas ou disfuncionais — é um componente crítico na DA. Finalmente, para analisar o efeito da mutação bem como do stress induzido pelo H2O2 no nosso modelo, avaliámos marcadores de diferenciação neuronal como SOX2, OCT4, MAP2, NeuN e BCL2 nas células SH-WT e SH-SWE diferenciadas.
Os nossos resultados demonstraram um aumento significativo da expressão de genes relacionados com a autofagia nas células SH-SWE, comparativamente às células SH-WT (controlo sem a mutação patológica). Em particular, LAMP-1 e LAMP-2 apresentaram níveis elevados nas células SH-SWE. LAMP-1, em especial, mostrou uma expressão significativamente maior nas células SH-SWE não tratadas com H₂O₂ (p < 0,01), e uma redução não significativa após a exposição ao stress oxidativo, sugerindo uma possível compensação da atividade lisossomal nestas células. Esta observação é corroborada pela coloração com LysoTracker, que indicou uma atividade lisossomal significativamente aumentada nas células SH-SWE em comparação com as células SH-WT (p < 0,001), com um efeito similarmente elevado, mas não significativo, após o tratamento com H₂O₂.
A expressão de Beclin-1, um marcador crucial na iniciação da autofagia, manteve-se inalterada nas células SH-SWE sob condições basais, mas foi significativamente elevada após o tratamento com H₂O₂ (p < 0,05), indicando que o stress oxidativo pode desencadear mecanismos compensatórios de autofagia. Em contrapartida, a expressão de LC3-II e, sobretudo a razão LC3-II/LC3-I, que são indicadores da formação de autofagossomas, estavam elevadas nas células SH-SWE em comparação com as células SH-WT (LC3-I/LC3II, p < 0,05). Este aumento não foi adicionalmente acentuado pelo tratamento com H₂O₂, sugerindo que a autofagia já se encontra ativada nas células SH-SWE, independentemente do stress oxidativo e que, a mutação APPSwe por si só representa o principal fator para esse aumento. A coloração para LC3 por ICC e os resultados de WB também confirmaram a elevação da expressão de LC3 nas células SH-SWE.
A função mitocondrial foi analisada através da coloração com MitoTracker, que revelou uma redução significativa da intensidade mitocondrial nas células SH-SWE (p < 0,0001), refletindo um possível aumento da mitofagia bem como uma disfunção mitocondrial associada à DA. Este efeito foi ainda mais exacerbado nas células SH-SWE tratadas com H₂O₂ (p < 0,0001), sugerindo que o stress oxidativo agrava a disfunção mitocondrial, potencialmente através da indução de mitofagia. Além disso, os marcadores de fissão mitocondrial, FIS1 e DRP1, estavam sobreexpressos nas células SH-SWE (p < 0,001 e p < 0,05, respetivamente), e o tratamento com H₂O₂ intensificou ainda mais essa expressão em FIS1, apontando para um aumento na fragmentação mitocondrial. A redução significativa da expressão de MFN-2, um marcador de fusão mitocondrial, nas células SH-SWE (p < 0,05), agravada pelo tratamento com H₂O₂, apoia a hipótese de um desequilíbrio entre os processos de fusão e fissão mitocondrial, que pode contribuir para a disfunção mitocondrial e neuronal observadas na DA.
Em termos de transmissão sináptica, verificámos especialmente uma redução significativa na expressão génica da proteína pré-sináptica sinaptofisina nas células SH-SWE em comparação com as células SH-WT (p < 0,001), havendo agravamento pela indução de stress oxidativo moderado (p < 0,05). Relativamente à expressão génica da proteína de densidade pós sináptica 95 (PSD-95), houve uma tendência de redução com o stress oxidativo, embora esta não tenha sido estatisticamente significativa.
A análise dos marcadores inflamatórios revelou um aumento acentuado na expressão de iNOS, TNF-α e S100B nas SH-SWE (p < 0,01, p < 0,001 e p < 0,05 vs. SH-WT, respetivamente). O tratamento com H₂O₂ também contribuiu para o aumento destes marcadores, tanto em células SH-WT quanto em SH-SWE. Estes resultados indicam que a mutação sueca do gene APP695 sensibiliza as células SH-SWE para respostas inflamatórias e que o stress oxidativo exacerba ainda mais estas respostas, possivelmente contribuindo para a neurodegeneração progressiva observada na DA. A expressão de IL-1β, embora aumentada após o tratamento com H₂O₂, não alcançou significância estatística, sugerindo que outros marcadores inflamatórios podem ter um papel mais central na resposta inflamatória neste modelo de DA.
Relativamente à diferenciação neuronal, verificámos que as células SH-SWE exibiram uma redução significativa na expressão de genes relacionados com a maturação neuronal, como MAP2 e NeuN, quando comparadas com as células SH-WT (p < 0,01 e p < 0,05, respetivamente). Esta diminuição foi ainda mais acentuada após o tratamento com H₂O₂, indicando que a mutação APPSwe, juntamente com o stress oxidativo, compromete a maturação e diferenciação neuronais e pode predispor as células à degeneração. Por outro lado, a expressão de genes associados à auto-renovação, como SOX2 e OCT4, aumentou ligeiramente nas células SH-SWE em comparação com as células SH-WT, com o H₂O₂ a induzir um aumento significativo na expressão de OCT4 (p < 0,01). Este aumento pode refletir uma tentativa de manter a capacidade de auto-renovação celular sob condições de stress, o que pode, paradoxalmente, comprometer a diferenciação neuronal adequada.
Finalmente, a análise dos miRNAs revelou padrões distintos de expressão para miR-142-3p e miR-142-5p. O miR-142-3p estava significativamente sobreexpresso nas células SH-SWE (p < 0,001), o que sugere o seu envolvimento na regulação de genes relacionados com a autofagia, como LC3 e LAMP-1, e na promoção da mitofagia nestas células. Em contraste, o miR-142-5p mostrou um aumento significativo apenas após a indução de stress oxidativo nas células SH-SWE (p < 0,05), sugerindo que esta isoforma do miR-142 pode estar mais diretamente envolvida na regulação de processos inflamatórios e apoptóticos. Estes resultados destacam o potencial destes miRNAs como alvos terapêuticos promissores na DA.Alzheimer's disease (AD) is a neurodegenerative disorder characterized by a progressive decline in cognitive functions, including memory, reasoning, and daily activities. Despite extensive research, effective treatments remain elusive. Autophagy, the cellular process responsible for degrading and recycling misfolded proteins, is significantly dysregulated in AD, particularly in the aging brain, leading to the accumulation of misfolded proteins and cellular debris. Recent studies highlight the role of miR-142, particularly miR-142-3p, in modulating autophagy and inflammation.
Here, we quantified gene expression levels of autophagy markers (Beclin-1, LAMP-1, LAMP-2) using RT-qPCR and measured protein levels of LC3 and LAMP-1 through immunocytochemistry and Western blotting. Additionally, we evaluated synaptic markers (synaptophysin, PSD-95), inflammatory markers (IL-1β, iNOS, TNF-α, S100B, TLR2 and TLR4), and mitochondrial dynamics markers (FIS1, DRP1, MFN2). We also assessed SOX2, OCT4, MAP2, NeuN, and BCL2 effect in differentiated SH-WT and SH-SWE cells. The expression levels of miR-142 isoforms (miR-142-3p and miR-142-5p) were also determined.
Results indicated heightened lysosomal activity in SH-SWE cells vs. SH-WT, evidenced by increased LysoTracker and elevated LAMP-1 and LAMP-2 expression, despite decreased LAMP-1 levels post-H₂O₂ treatment. Beclin-1 and LC3 were elevated, suggesting enhanced autophagy, though oxidative stress compromised autophagic flux. Mitochondrial dynamics were disrupted, with decreased MitoTracker levels and increased FIS1 and DRP1 levels alongside downregulated MFN2. Furthermore, SH-SWE showed increased pro-inflammatory responses, marked by elevated S100B, TNF-α, iNOS and TLR2 levels. OCT4 levels were decreased either in the absence or presence of H2O2 in SH-SWE cells, alongside decreased levels of MAP2 and NeuN. Differential expressions of miR-142 isoforms revealed that miR-142-3p was upregulated in SH-SWE cells VS. SH-WT, correlating with enhanced autophagy, while miR-142-5p increased in response to inflammation and apoptosis pathways.
Our findings highlight the complex interplay between autophagy, mitochondrial dysfunction, oxidative stress, and neuroinflammation in AD, suggesting miR-142 isoforms as potential therapeutic targets.CPM - iMed.ULisboa, Faculdade de Farmácia da Universidade de Lisboa
Copo menstrual : uma scoping review sobre as vantagens e desvantagens
No full textTrabalho Final do Curso de Mestrado Integrado em Medicina, Faculdade de Medicina, Universidade de Lisboa, 2024Os produtos de higiene menstrual são um pilar fundamental na gestão da menstruação, tendo sido desenvolvidas várias opções de modo a facilitar este processo natural e adaptar às necessidades e preferências individuais. A escolha do método de higiene menstrual, tal como todas as decisões envolvendo a saúde da mulher, deve ser informada e com base na melhor evidência disponível quanto a potenciais vantagens e desvantagens de cada método.
A utilização de copo menstrual é uma alternativa aos métodos de higiene menstrual tradicionais, como pensos higiénicos e tampões. Trata-se de um dispositivo reutilizável, projetado para ser inserido na vagina durante o período menstrual, sendo visto como uma opção mais sustentável a nível ambiental e económico, bem como potencialmente mais segura para a saúde feminina. Apesar de não ser o método preferencial, cerca de 1 em cada 5 mulheres usa o copo menstrual.
Objetivo: Analisar a evidência disponível sobre as vantagens e desvantagens associadas ao copo menstrual, explorando variações associadas a diferentes contextos, bem como usos alternativos deste dispositivo.
Metodologia: Para a revisão recorremos a plataformas de bases de dados, como PubMed, Cochrane, Trypdatabase, para a pesquisa de artigos publicados entre 2018 e 2023, em Português ou Inglês. Os artigos foram selecionados pela pertinência do título e do resumo para o objetivo da revisão.
Resultados e conclusões: O copo menstrual apresenta diversas vantagens e desvantagens, podendo diferir tendo em conta o contexto e circunstâncias em que é aplicado. O esclarecimento dos riscos e benefícios associados à sua utilização é fundamental para a decisão informada e literacia em saúde das mulheres.Menstrual hygiene products are a fundamental pillar in women's menstruation management, with various options developed to facilitate this natural process and adapt to individual needs and preferences. The choice of menstrual hygiene method, like all decisions involving women's health, should be informed and based on the best available evidence regarding the potential advantages and disadvantages of each method.
The use of a menstrual cup is an alternative to traditional menstrual hygiene methods, such as sanitary pads and tampons. It is a reusable device designed to be inserted into the vagina during menstruation, seen as a more environmentally and economically sustainable alternative, as well as potentially safer for women's health. Even though it is not the preferred method, about 1 in 5 women use a menstrual cup.
Objective: Analyze the available evidence on the advantages and disadvantages associated with the menstrual cup, exploring variations associated with different contexts, as well as alternative uses of this device.
Methodology: For the review we used database platforms such as PubMed, Cochrane, Trypdatabase, searching for articles published between 2018 and 2023, in Portuguese or English. Articles were selected based on the relevance of the title and the abstract to the review objective.
Results and conclusions: The menstrual cup has several advantages and disadvantages, which may differ depending on the context and circumstances in which it is applied. Clarifying the risks and benefits associated with the use of menstrual cups is essential for informed decision-making and women’s health literacy
Novel peptide cyclization systems: biomass-derived, bifunctional cyclopentenones as peptide cyclization linkers (ciclização de péptidos terapêuticos)
No full textTrabalho Final de Mestrado Integrado, Ciências Farmacêuticas, 2024, Universidade de Lisboa, Faculdade de Farmácia.inoácidos proteogénicos. Neste trabalho foram utilizadas ciclopentenonas derivadas de biomassa como agentes para a ciclização de péptidos, os aminoácidos reativos utilizados foram a cisteína e a lisina. Observou-se que a ciclopentenona funcionalizada com uma lactona era capaz de realizar a ciclização de péptidos de forma eficiente apenas quando ambos os aminoácidos reativos se encontravam diretamente adjacentes um ao outro. A bromo-diamino-ciclopentenona testada neste estudo não revelou a mesma seletividade, mas mostrou bastante versatilidade e foi capaz de induzir a ciclização de péptidos (com taxas de conversão superiores a 95%) independentemente da distância entre os dois aminoácidos reativos. Ciclopentenonas foram também usadas neste trabalho para a síntese de Aductos Doador-Aceitador de Stenhouse (DASA), a partir de 3-bromofurfural. Embora já se tenham efetuado várias modificações neste tipo de compostos, o trieno conjugado permanece pouco estudado. Ao sintetizar DASA a partir do 3-bromofurfural, o átomo de bromo poderia mais tarde ser explorado através de acoplamento de Suzuki, por exemplo, para formar novas ligações carbono-carbono na estrutura do DASA e explorar novas funcionalidades. Neste trabalho foram sintetizados DASA de primeira e segunda geração. Existe também uma enorme necessidade para o desenvolvimento da própria síntese de péptidos. Neste trabalho é apresentado um novo ciclo de síntese de péptidos em fase líquida. Foi concebido um novo grupo de proteção explorando as características de solubilidade dos compostos de amónio quaternário. Para sintetizar este composto, o sistema aromático do 9-fluerenemetanol (Fmoc-OH) é nitrado com um rendimento de 45%, depois é então reduzido ao grupo amino com um rendimento de 88% e por fim quaternizado com um rendimento de 51%. Embora as condições experimentais para as etapas seguintes ainda não tenham sido definidas é também proposta uma rota sintética para as mesmas.As peptide drugs are further explored for the development of novel drugs there is a constant demand for the development of novel peptide cyclization methods. The most used peptide cyclization methods generally require non-canonical amino acids which cannot be easily incorporated in biological peptide/protein synthesis and tend to be more expensive to produce than proteogenic amino acids. In this work, cyclopentenones derived from biomass residues were used as linkers for peptide cyclization, the reactive amino acids used were cysteine and lysine. Both cyclopentenones revealed remarkable results. It was observed that the cyclopentenone containing a fused lactone moiety would be efficient at peptide cyclization only when both reactive amino acids were directly adjacent to each other. The bromo-diamino-cyclopentenone tested in this study did not reveal the same selectivity, it proved to be, however, quite versatile and was able to induce peptide cyclization (with conversion rates over 95%) independently of the distance between both reactive amino acids tested. Cyclopentenones were also used in this work for the synthesis of Donnor-Acceptor Stenhouse Adducts (DASA) from 3-bromofurfural. Although several modifications have been performed on these photoswitching compounds the conjugated triene backbone remains unaltered. By synthesizing DASA from 3-bromofurfural the bromine atom could later be explored via Suzuki coupling to form novel carbon-carbon bonds on the triene backbone of the DASA and achieve novel functionalities. In this work DASA from the first and second generation were effectively synthesized. There has also been a growing demand for the development of peptide synthesis itself. In this work an innovative liquid-phase peptide synthesis cycle is presented. A novel protecting group for peptide synthesis is theorized where the characteristic solubility of quaternary ammonium compounds is explored. To produce this new protecting group the aromatic system in Fmoc-OH (9-fluerenemethanol) is first nitrated with a yield of 45%, the newly added nitro group is then reduced to the amino group with a yield of 88% and afterwards the amino group is successfully quaternized with a yield of 51%. Although the experimental conditions for the following steps were not yet determined, a synthetic strategy is also proposed
Designing novel CAR T cells to eliminate latently HIV-1- infected cells
No full textTese de mestrado, Ciências Biofarmacêuticas, 2024, Universidade de Lisboa, Faculdade de Farmácia.O Vírus da Imunodeficiência Humana (HIV) continua a ser um problema de saúde global, com um elevado número de indivíduos infectados e de mortes por ano em todo o mundo. A terapia antirretroviral (ART) controla a infeção pelo HIV mas não erradica as células infectadas latentemente pelo HIV, também chamadas de reservatórios virais. Os agentes de reversão da latência (LRA) têm sido utilizados para reativar os reservatórios virais e promover a sua eliminação. No entanto, a utilização isolada de LRAs como estratégia não é muito eficiente, uma vez que as células T CD8+ naturais não eliminam eficazmente as células infectadas reactivadas. A utilização da terapia com células T receptoras de antigénios quiméricos (CAR) tem sido vista como promissora no campo do VIH, dada a sua maior especificidade no reconhecimento de antigénios e a sua capacidade de ultrapassar a deficiência das células T CD8 citotóxicas naturais. Este projeto propõe uma combinação de um LRA, para reativar a expressão viral, e de uma terapia com células CAR T para atingir e matar as células infectadas pelo HIV em estado latente. A geração de células CAR T será composta por células que expressam um recetor Notch sintético (synNotch) à superfície para reconhecer a proteína CD4. Este reconhecimento desencadeará a expressão de um CARtoolbox, que inclui o CAR anti-HIV, e a flagelina, que funcionará como um LRA. Começámos por isolar as células mononucleares do sangue periférico (PBMCs) por gradiente de densidade Ficoll-Paque, a partir das quais as células T e as células T CD8+ foram isoladas por seleção negativa. Estas células foram activadas e transduzidas com partículas lentivirais que transportam o sistema synNotch ou um vetor de controlo para a CARtoolboox, o BFPmCherry. A expressão das construções foi verificada através de ensaios de citometria de fluxo. Conseguimos transduzir as diferentes construções em todas as subpopulações celulares, obtendo diferentes taxas de eficiência de transdução, dependendo da construção e da população celular utilizada. Além disso, conseguimos gerar células que expressam ambas as construções. Estes resultados representam os primeiros passos para a produção de células CAR T para eliminar os reservatórios latentes do HIV.Human Immunodeficiency Virus (HIV) is still a global health problem, with a high number of infected individuals and deaths worldwide per year. Antiretroviral therapy (ART) controls HIV infection but does not eradicate latently HIV-infected cells, also called viral reservoirs. Latent Reversal Agents (LRAs) have been used to reactivate viral reservoirs to promote their elimination. However, the singular use of LRAs as a strategy is not very efficient since natural CD8+ T cells do not efficiently eliminate the reactivated infected cells. The use of chimeric antigen receptor (CAR) T cell therapy has been seen as promising in the field of HIV given its higher antigen specificity recognition and its ability to overcome the impairment of natural cytotoxic CD8 T cells. This project proposes a combination of an LRA, to reactivate viral expression and CAR T cell therapy to target and kill latently HIV-infected cells. The generation of CAR T cells will comprise cells expressing a synthetic Notch (synNotch) receptor at the surface to recognize the CD4 protein. This recognition will trigger the expression of a CARtoolbox, comprising the anti-HIV CAR, and the flagellin, which will work as an LRA. We first isolated Peripheral Blood Mononuclear Cells (PBMCs) by Ficoll-Paque density gradient, from which T Cells and CD8+ T Cells were isolated by negative selection. These cells were activated and transduced with lentiviral particles carrying the synNotch system or a control vector for CARtoolbox, the BFPmCherry. The expression of the constructs was verified through flow cytometry assays. We could transduce the different constructs in all cell subpopulations, getting different transduction efficiency rates depending on the construct and cell population used. In addition, we successfully generated cells expressing both constructs. These results represent the first steps towards producing CAR T cells to eliminate HIV latent reservoirs.iMed ULisboa - Instituto de Investigação do Medicamento; João Gonçalves Laboratory
Suspending time in fashion : on grès, contemplating dress and glimpses of the sublime
No full textTese de doutoramento. Design. Universidade de Lisboa. Faculdade de Arquitetura. 2024Esta tese tem como objetivo apresentar um corpo de trabalho em torno da relação entre a moda e o conceito de tempo e, mais especificamente, a ideia de suspensão de tempo na moda. A investigação centrou-se no corpo de trabalho de Madame Grès que materializa a hipótese de um tempo suspenso. Madame Grès (1903-1993) trabalhou durante seis décadas no exclusivo mundo da alta costura Parisiense (inicialmente sob o nome de Alix), criando vestidos como se fossem esculturas vivas, sempre em busca do vestido ideal. Embora a sua obra seja muito mais vasta do que os ‘vestidos de deusa’ magistralmente drapeados, eles foram percepcionados como o seu arquétipo. O legado de Grès caracteriza-se pela busca incessante de uma estética absoluta, marcado pelo aperfeiçoamento do seu arquétipo ao invés de perseguir a novidade ou a mera repetição de modelos de sucesso em cada estação. A tese discute os longos vestidos drapeados realizados com um domínio técnico absoluto como uma profunda reflexão sobre a moda, o tempo e a memória, expressa no processo de fazer (o gesto infinito). No contexto do tempo, especificamente da duração, e através do arquétipo de Grès, a investigação reflecte sobre a presença da moda no museu. De que forma a exposição de artefactos de moda (o próprio objecto, a sua representação, a sua descrição ou a sua evocação) pode contribuir para representar materialmente a suspensão do tempo? Consequentemente, uma nova apreensão fenomenológica e estética do artefacto de moda emerge: afirmando-se como verdadeira corporização do efémero, a moda nega a sua transitoriedade inerente no momento da sua criação, memória ou de aparição enquanto objecto de contemplação. Numa brilhante ilusão, num momento fugaz, a moda parece suspender o tempo, oferecendo ao espectador uma sugestão de eternidade e do que a estética do Iluminismo definiu como sublime, termo designado para evocar sensações avassaladoras no contexto da arte. O momento de suspensão temporal – possível através da palavra escrita, de uma peça de vestuário, da fotografia ou de uma exposição – é o cerne do projecto aqui apresentado. Este foco permite articular o desenvolvimento teórico do projecto e a escrita da tese com a prática curatorial através da exposição Vivre sa Vie, Georges Dambier et la Mode / Viver a sua Vida, Georges Dambier e a Moda e da instalação sonora Robe-fantôme que oferecem uma realização espacial e material para os conceitos de moda, tempo, história e memória no contexto museológico.This thesis aims to deliver a body of work around the relationship between fashion and the notion of time, and more specifically the idea of suspending time in fashion. The investigation focused on Madame Grès’ body of work that materialized the hypothesis of temporal adjournment. Madame Grès (1903-1993) pursued a ceaseless quest for an absolute aesthetic in her designs, honing her archetypes rather than simply repeating successful designs for each season. The thesis discusses the long, draped dresses crafted with technical mastery as a profound reflection on fashion, time and memory within the process of making (the infinite gesture). In the context of time, specifically duration, and through Grès’ archetype, the investigation reflects on the presence of fashion in the museum. What can the public display of fashion artefacts (the object itself, its representation, its description or its evocation) contribute to materially representing the suspension of time? As a consequence, a new phenomenological and aesthetical apprehension of the fashion artefact emerges: ostensibly the cardinal embodiment of the ephemeral, fashion disavows its professed impermanence the moment it enters the museum as an object of contemplation. In a dazzling sleight of hand, within a fleeting moment, fashion seems to arrest time, offering the beholder a suggestion of eternity and what Enlightenment aesthetics termed the sublime, artfully designed to evoke strong sensations. The moment of temporal suspension—possible amidst words, in an item of clothing, in photography or in an exhibition – is the locus of the project here tendered. This focus connects the theoretical development of the project and the writing of the thesis with the curatorial practice through the exhibition Vivre sa Vie, Georges Dambier et la Mode / Viver a sua Vida, Georges Dambier e a Moda and the sound installation Robe fantôme that offers a spatial and material design for the concepts of fashion, time, history and memory in the museum space.N/
Ligandos à base de complexos multivalentes de boro para utilização em bioconjugados terapêuticos
No full textTrabalho Final de Mestrado Integrado, Ciências Farmacêuticas, 2024, Universidade de Lisboa, Faculdade de FarmáciaDesenvolvimentos recentes na área da biologia humana têm proporcionado uma compreensão mais clara dos mecanismos inerentes à patogénese de doenças como o cancro. A transição de células normais para um estado neoplásico envolve etapas complexas, incluindo a proliferação descontrolada, resistência à morte celular e a capacidade de promover a formação de novos vasos sanguíneos e metástases. De modo a combater estas particularidades do cancro, têm sido desenvolvidas várias estratégias que visam interromper esses processos.
Uma área promissora é o uso de complexos multifuncionais que combinam várias atividades biológicas numa única estrutura, mantendo a funcionalidade e letalidade dos componentes individuais adaptada à estrutura do complexo. Apesar da sua simplicidade conceitual, a síntese desses complexos é desafiadora devido à complexidade envolvida e às exigências específicas de cada aplicação biológica.
O boro surge como um elemento crucial nesses avanços, destacando-se pelas suas propriedades únicas que incluem a capacidade de formar ligações covalentes dinâmicas com alvos biológicos. Os ácidos borónicos, são ácidos de Lewis que podem ser modificados de modo a controlar a sua reatividade e estabilidade, sendo essenciais na construção de complexos terapêuticos.
Um tipo importante de complexos de boro são os iminoboronatos, que apresentam uma estrutura modular reversível, ideal para aplicações de bioconjugação. Os iminoboronatos mostram-se promissores na entrega de fármacos em células cancerígenas, pois são capazes de se ligar seletivamente a biomoléculas específicas, como anticorpos, e libertar o fármaco de maneira controlada no ambiente celular adequado. Além disso, os complexos, são projetados para responder a estímulos endógenos, como níveis elevados de glutationa e espécies reativas de oxigénio (ROS), que são características comuns em células cancerígenas. A clivagem controlada desses complexos em resposta a esses estímulos permite uma libertação eficiente e seletiva do fármaco no interior das células-alvo, minimizando efeitos colaterais indesejados.
Portanto, o desenvolvimento de iminoboronatos representa uma inovação significativa no campo da terapia do cancro, oferecendo novas oportunidades para o tratamento mais eficaz e direcionado dessa doença complexa e multifacetada. Neste trabalho são apresentadas abordagens sintéticas de formação de iminoboronatos, acoplados com um fármaco citotóxico (SN-38), visando o aumento das suas estabilidades e seletividade para o alvo, tendo como objetivo atingir os melhores resultados terapêuticos possíveis.Recent developments in the field of human biology have provided a clearer understanding of the mechanisms underlying the pathogenesis of diseases such as cancer. The transition of normal cells to a neoplastic state involves complex stages, including uncontrolled proliferation, resistance to cell death, and the ability to promote the formation of new blood vessels and metastases. To combat these characteristics of cancer, various strategies have been developed to interrupt these processes.
A promising area is the use of multifunctional complexes that combine multiple biological activities into a single structure, maintaining the functionality and lethality of the individual components adapted to the structure of the complex. Despite their conceptual simplicity, the synthesis of these complexes is challenging due to the complexity involved and the specific requirements of each biological application.
Boron emerges as a crucial element in these advances, standing out for its unique properties that include the ability to form dynamic covalent bonds with biological targets. Boronic acids, for example, are Lewis acids that can be modified to control their reactivity and stability, which is essential in the construction of therapeutic complexes.
An important type of boron complex is iminoboronates, which have a reversible modular structure ideal for bioconjugation applications. Iminoboronates show promise in drug delivery to cancer cells because they can selectively bind to specific biomolecules, such as antibodies, and release the drug in a controlled manner in the appropriate cellular environment. Additionally, these complexes are designed to respond to endogenous stimuli, such as elevated levels of glutathione and reactive oxygen species (ROS), which are common characteristics in cancer cells. The controlled cleavage of these complexes in response to these stimuli allows for efficient and selective drug release within the target cells, minimizing unwanted side effects.
Therefore, the development of iminoboronates represents a significant innovation in cancer therapy, offering new opportunities for more effective and targeted treatment of this complex and multifaceted disease. This work presents synthetic approaches for the formation of iminoboronates, coupled with a cytotoxic drug (SN-38), aiming to increase their stability and target selectivity to achieve the best possible therapeutic outcomes
Cis-platin derivatives and their PAMAM G2 complexes in the treatment of female cancers – in vitro studies
No full textTrabalho Final de Mestrado Integrado, Ciências Farmacêuticas, 2024, Universidade de Lisboa, Faculdade de Farmácia.Os cancros femininos, incluindo o cancro da mama, cérvix e ovário, constituem um
problema importante para a Saúde Pública (incidência crescente nas últimas décadas e
causa de mortalidade relevante). Apesar da utilidade da quimioterapia, esta está
associada a fortes efeitos secundários, limitando ou impedindo o tratamento. A cis
platina está aprovada contra o carcinoma do ovário, testículo e bexiga, mas também tem
sido utilizada “off-label” noutras neoplasias malignas. Este fármaco atua através da
citotoxicidade, ligando-se ao ácido desoxirribonucleico em formação, provocando
“crosslinks” que levam à morte celular. Alguns fatores limitam a utilização da cis
platina contra o cancro, tais como a baixa seletividade (levando a efeitos secundários
adversos), resistência, e consequentes recidivas. Assim, é necessário encontrar agentes
mais seletivos e eficazes que possam ser utilizados.
Esta dissertação propôs-se à preparação de derivados de cis-platina livres (M-cis
platina, D-cis-platina e Ac-cis-platina), seguida da complexação com dendrímeros de
poliamidoamina de geração 2. Foi utilizada uma razão molar fármaco:dendrímero de
10:1 para todos os derivados investigados. Os complexos foram caracterizados em
termos de tamanho, carga superficial e morfologia. A eficácia foi testada recorrendo a
duas linhas celulares cancerígenas (HeLa e MCF-7) e numa linha celular não
cancerígena (HMEC-1). Nestes ensaios foi medido o potencial de membrana
mitocondrial e os níveis de espécies reativas de oxigénio (ROS) para estudar o
mecanismo de ação dos derivados. Por fim, a citometria de fluxo analisou os principais
mecanismos de morte celular.
Os resultados mostraram que os complexos têm uma citotoxicidade comparável ou
superior à da cis-platina e maior seletividade em relação às células cancerígenas. A D
cis-platina complexada parece ser o complexo mais interessante, com maior
seletividade em células HeLa. A hiperpolarização da membrana mitocondrial ocorreu
para esta linha celular e na linha MCF-7. No que diz respeito ao ensaio das ROS, os
derivados livres foram responsáveis por um aumento sustentado e os derivados
complexados apresentaram um aumento gradual e controlado destas (em HeLa). Em
termos de mecanismo de morte celular, a apoptose foi o principal mecanismo de morte
celular, observado pela citometria de fluxo.
Este estudo concluiu que os derivados de cis-platina têm citotoxicidade comparável ou
superior ao fármaco comercial. A Ac-cis-platina foi particularmente citotóxica para as
células cancerígenas (embora pouco seletiva). A complexação dos derivados resultou
numa significativa maior toxicidade e seletividade contra as células cancerígenas. O
complexo D-cis-platina:PAMAM aparenta ser o mais interessante ao mostrar maior
seletividade contra células HeLa, um dos principais problemas da terapêutica
convencional com cis-platina.Female cancers, including breast, cervical and ovarian cancer, are a major Public Health
problem (increasing incidence in recent decades and a significant cause of mortality).
Despite the usefulness of chemotherapy, it is associated with strong side effects,
limiting or preventing treatment. Cis-platin is approved for ovarian, testicular and
bladder carcinoma, but has also been used off-label in other malignancies. This drug
acts through cytotoxicity, binding to forming deoxyribonucleic acid, causing crosslinks
that lead to cell death. Some factors limit the use of cis-platin against cancer, such as
low selectivity (leading to adverse side effects), resistance, and consequent relapses. It
is therefore necessary to find more selective and effective agents that can be used.
This dissertation set out to prepare free cis-platin derivatives (M-cis-platin, D-cis-platin
and Ac-cis-platin), followed by complexation with generation 2 polyamidoamine
dendrimers. A drug:dendrimer molar ratio of 10:1 was used for all the derivatives
investigated. The complexes were characterized in terms of size, surface charge and
morphology. Efficacy was tested using two cancer cell lines (HeLa and MCF-7) and a
non-cancer cell line (HMEC-1). In these tests, mitochondrial membrane potential and
levels of reactive oxygen species (ROS) were measured to study the mechanism of
action of the derivatives. Finally, flow cytometry analyzed the main mechanisms of cell
death.
The results showed that the complexes have comparable or greater cytotoxicity than
cis-platin and greater selectivity towards cancer cells. Complexed D-cis-platin seems
to be the most interesting complex, with greater selectivity in HeLa cells.
Hyperpolarization of the mitochondrial membrane occurred for this cell line and in the
MCF-7 line. Regarding the ROS assay, the free derivatives were responsible for a
sustained increase and the complexed derivatives showed a gradual and controlled
increase in ROS (in HeLa). In terms of cell death mechanism, apoptosis was the main
cell death mechanism observed by flow cytometry.
This study concluded that cis-platin derivatives have comparable or superior
cytotoxicity to the commercial drug. Ac-cis-platin was particularly cytotoxic to cancer
cells (although not very selective). Complexation of the derivatives resulted in
significantly greater toxicity and selectivity against cancer cells. The D-cis
platin:PAMAM complex appears to be the most interesting as it shows greater selectivity against HeLa cells, one of the main problems with conventional cis-platin
therapy