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Augmented reality in breast cancer surgical planning
No full textTrabalho Final do Curso de Mestrado Integrado em Medicina, Faculdade de Medicina, Universidade de Lisboa, 2024O cancro da mama é a forma de cancro mais prevalente e com a maior taxa de mortalidade entre as mulheres. standard. Esta cirurgia, envolve a excisão do tumor com margens livres, tentando preservar a forma natural da mama. Por isso, antes da cirurgia, é essencial compreender e visualizar a localização do tumor, o seu tamanho e a relação entre o volume da mama e o volume do tumor, de modo a permitir a remoção total do cancro sem compromisso estético. O principal objetivo deste estudo foi determinar se a visualização imersiva de modelos mamários em 3D poderia melhorar o planeamento cirúrgico do cancro da mama quando comparada com a interpretação de apenas a RM mamária. Foram recrutadas 30 doentes e as RM mamárias foram registadas nas posições prona e supina. As referências anatómicas e o tumor foram anotados utilizando um software de computação de imagem, de modo a gerar modelos 3D do cancro da mama, prontos para serem visualizados com óculos de realidade aumentada. Foi realizado um estudo de utilizadores com 5 cirurgiões, para avaliar a usabilidade da ferramenta imersiva com os HoloLens 2®, comparando-a com a interpretação de apenas a RM mamária. Os questionários Raw NASA-TLX e SUS, juntamente com uma entrevista semiestruturada, foram aplicados a todos os utilizadores, para avaliar a qualidade e a utilidade da visualização do tumor. Este estudo ilustrou os vários benefícios da computação espacial da próxima geração no planeamento da cirurgia do cancro da mama em comparação com os métodos tradicionais, especificamente por oferecer uma representação mais precisa da vista intraoperatória, o que, em última análise, pode levar à redução das taxas de mastectomia.Breast cancer is the most prevalent form of cancer and has the highest mortality rate among women. Breast cancer conservative surgery plus adjuvant radiotherapy is considered as a gold standard. It involves tumor excision with clear margins, while trying to preserve the natural shape of the breast. Therefore, prior to surgery, it is essential to comprehend and visualize tumor's location, size and the relationship between breast volume and tumor volume in order to allow total cancer removal without aesthetic compromise. The main goal of this research was to determine whether immersive visualization of 3D breast models could improve breast cancer surgical planning when compared to breast MRI interpretation alone. Thirty patients were recruited, and breast MRI were registered in the prone and supine position. Both the anatomical references and tumor were annotated using an image computing software to generate breast cancer 3D models, ready to be visualized with an optical see-through augmented reality headset. A user study was performed with 5 surgeons, to evaluate an immersive tool usability with the HoloLens 2® and compare it to breast MRI interpretation alone. The Raw NASA-TLX and the SUS questionnaires along with a semi-structured interview were given to all users, to assess the quality and usefulness of tumor visualization. This study illustrated several benefits of next generation spatial computing in breast cancer surgery planning compared to the standard methods, specifically by offering a more accurate representation of the intraoperative view, that ultimately could lead to reduce mastectomy rates
The role of Rab6A-mediated protein trafficking in vascular development
No full textTese de mestrado, Investigação Biomédica, Universidade de Lisboa, Faculdade de Medicina, 2024A rede vascular sanguínea é um sistema ramificado que irriga todos os órgãos em vertebrados, o que é fundamental para a embriogénese, a fisiologia e a regeneração. A disfunção desta rede está associada a múltiplas doenças, incluindo cancro, retinopatia diabética ou malformações arteriovenosas. A maioria dos vasos sanguíneos forma-se através da angiogénese, um processo realizado pelas células endoteliais (CEs), células que revestem o interior dos vasos sanguíneos. Durante este processo, as CEs estão constantemente expostas a estímulos, que ativam múltiplas vias de sinalização e regulam as suas várias funções, tais como a migração, a proliferação, e a especialização. Para tal, as CEs necessitam de um controlo rigoroso dos processos de tráfego intracelular, integrando desta forma os estímulos, através da endocitose/internalização e a secreção polarizada de proteínas sinalizadoras e recetores de membrana. A família de proteínas Rab GTPases é crucial para o tráfego intracelular pois regula a secreção, a endocitose e o tráfego de vesículas. Embora as Rab GTPases tenham sido recentemente reconhecidas como importantes reguladoras do tráfego das CEs, pouco se sabe sobre a forma como estes mecanismos regulam as funções das CEs e qual a sua relevância para o desenvolvimento dos vasos sanguíneos. A Rab6A é um dos principais membros das Rab GTPases, amplamente expressa na maioria das células de mamíferos e é conhecida por desempenhar um papel importante no transporte retrógrado e anterógrado de e para o complexo de Golgi. Para além de estar envolvida em vários passos do transporte vesicular, estudos realizados em células não endoteliais indicaram que a Rab6A participa em vários processos celulares, incluindo a adesão celular, a migração, e a regulação do ciclo celular, que são funções cruciais das CEs durante a angiogénese. Deste modo, a Rab6A parece ser uma forte candidata a mediar o tráfego intracelular das CEs. Por conseguinte, colocámos a hipótese de que a Rab6A é crucial para o desenvolvimento dos vasos sanguíneos, regulando várias funções. Para compreender o papel da Rab6A no desenvolvimento dos vasos sanguíneos, começámos por examinar a sua expressão nas CEs, utilizando dados de sequenciação de ácido rinonucleico (RNA) de CEs isoladas da retina de ratinho em diferentes fases do desenvolvimento pós-natal (sexto dia após o nascimento (P6), P10, P15, P21 e P50). Esta análise revelou que a Rab6A é expressa nas CEs da retina ao longo do desenvolvimento pós-natal. Assim, neste estudo, recorreu-se a uma abordagem in vivo usando ratinhos mutantes para a Rab6A em CEs, após a injeção de tamoxifeno. Para estudar o envolvimento da Rab6A durante a angiogénese, usámos a retina de ratinhos como modelo em diferentes etapas do desenvolvimento (P6, P12 e P30), uma vez que é um modelo bem estabelecido para o estudo do desenvolvimento vascular. A deleção da Rab6A em CEs de ratinhos neonatais afetou significativamente a vasculatura das retinas. De forma geral, observou-se que as retinas mutantes exibiram vasos com morfologia aberrante: dilatados (aumento do diâmetro dos vasos), com tortuosidade e imaturos (perda de quiescência). Estas alterações foram acompanhadas por extravasamento de glóbulos vermelhos dos vasos sanguíneos, levando a hemorragias. Adicionalmente, embora se tenha observado que o número de células “tip” e de filopodia estava aumentado nos mutantes, a migração das CEs estava alterada, o que levou a um atraso da expansão radial da vascularização da retina. Observou-se ainda que a formação das camadas intermédia e profunda das retinas mutantes estava comprometida. Verificou-se também que a Rab6A não é importante para manter a integridade dos vasos durante a idade adulta, uma vez que a sua deleção em ratinhos adultos não causou nenhum defeito na rede vascular. Deste modo, estes resultados sugerem que a Rab6A é maioritariamente importante durante o desenvolvimento dos vasos. Paralelamente, investigou-se se mais algum órgão estaria afetado pela deleção da Rab6A em CEs. Curiosamente, apenas foram observados defeitos na vasculatura dos cérebros de ratinhos mutantes. Estes apresentaram uma rede vascular desorganizada caracterizada por vasos com tortuosidade, algumas áreas avasculares e hemorragias. Observou-se, ainda, que nos cérebros mutantes o número das células “tip” estava aumentado, em comparação com o controlo. No entanto, algumas destas células “tip” exibiram uma morfologia aberrante, com estruturas semelhantes a microaneurismas. Além disso, muitas destas células apresentavam ausência quase completa de filopodia. Apesar destas diferenças morfológicas, não foram observadas alterações significativas tanto na densidade de vasos como na sua cobertura por pericitos. Com o objetivo de encontrar pistas para entender o mecanismo molecular que conduz às alterações observadas na vasculatura da retina e do cérebro de ratinhos mutantes para a Rab6A, recorremos à tecnologia de sequenciação de RNA de célula única (scRNA-seq), uma técnica que permite caracterizar os transcriptomas de células a nível individual. Embora o nosso objetivo inicial fosse o de realizar esta técnica em CEs de retinas mutantes para Rab6A, devido ao baixo número de CEs na retina, não o conseguimos fazer. Por isso, decidimos então realizar scRNA-seq em CEs dos cérebros mutantes e controlo em diferentes etapas do desenvolvimento vascular (P6, P12 e P30) e comparar os perfis transcriptómicos. Esta análise, revelou que, à semelhança do fenótipo observado nas retinas de mutantes, a etapa mais afetada pela deleção da Rab6A foi a P12, que apresentou um elevado número de genes diferencialmente expressos em comparação com o controlo. Nestes genes, observou-se que genes relacionados com o processo da angiogénese estavam sobre-expressos na ausência do Rab6A nas CEs do cérebro. Contudo, os genes que se encontraram mais sobre-expressos foram dois genes que foram identificados como estando envolvidos na proliferação celular, o Ccnb1ip1 (ou Hei10) e o Rpph1. Contrariamente, no P6 foi identificado um cluster de CEs maioritariamente composto por células mutantes para Rab6A que expressam genes que são regulados pelo fator de transcrição p53. Este fator é conhecido por ativar vários genes em resposta a vários tipos de stresses, tais como a ativação de oncogenes, hipoxia, danos no ácido desoxirribonucleico (DNA) e stress ribossómico. Embora esta análise nos tenha proporcionado informações sobre as alterações a nível transcriptómico após a deleção da Rab6A nas CEs do cérebro de ratinhos, não foi suficiente para entender o mecanismo na sua totalidade. É importante referir que a análise dos dados de scRNA-seq efetuada neste trabalho foi sumária, isto é não realizámos análises dos genes diferencialmente expressos nos diferentes clusters de CEs, mas apenas nas CEs mutantes para Rab6A versus CEs controlo. Assim, para obter uma análise mais precisa, estamos atualmente a analisar os genes diferencialmente expressos entre as CEs mutantes para Rab6A versus CEs controlo em cada cluster de CEs. Para complementar esta análise, seria de grande interesse realizar proteómica para identificar alterações a nível proteico após a deleção da Rab6A em CEs, uma vez que a Rab6A regula vários passos do tráfego de proteínas. O nosso estudo revela pela primeira vez o papel da proteína Rab GTPase Rab6A na angiogénese e na morfogénese vascular durante o desenvolvimento pós-natal. Os nossos resultados revelaram que a deleção pós-natal da Rab6A em CEs dá origem a defeitos vasculares significativos na retina e no cérebro, acompanhados por alterações na integridade da barreira entre o sangue e os tecidos. Para além disso, os nossos resultados sugerem que a Rab6A é essencial para o processo de angiogénese, regulando o brotamento de CEs (seleção de células “tip” e formação de filopodia), a migração, a proliferação, a formação e a maturação das barreiras hematoencefálica edos resultados e entender os mecanismos moleculares subjacentes às funções da Rab6A nas CEs. A compreensão destes mecanismos é crucial para o avanço do nosso conhecimento e pode oferecer informações sobre os processos angiogénicos e potenciais intervenções terapêuticas. hematorretiniana. No entanto, é ainda necessária mais investigação para confirmar alguns dos resultados e entender os mecanismos moleculares subjacentes às funções da Rab6A nas CEs. A compreensão destes mecanismos é crucial para o avanço do nosso conhecimento e pode oferecer informações sobre os processos angiogénicos e potenciais intervenções terapêuticas.Angiogenesis is a complex biological process crucial for tissue growth, repair, and regeneration. Endothelial cells (ECs) orchestrate this process through coordinated migration, proliferation, polarization, and differentiation to form new blood vessels in response to microenvironmental cues. Intracellular trafficking plays a crucial role in regulating these processes. Despite considerable progress in understanding angiogenesis, key regulators mediating these trafficking events and controlling EC behaviors remain underexplored. Rab GTPases have recently emerged as crucial regulators of EC trafficking. Among them, Rab6A/A’ (referred to as Rab6A hereafter), the most abundant Golgi-associated Rab GTPase, is a major regulator of vesicular trafficking and is known to play several roles in cellular functions. This makes Rab6A a strong candidate for the regulation of EC trafficking, however, it has never been characterized in ECs. Thus, we hypothesize that Rab6A regulates several EC functions crucial for blood vessel development. The main objective of this thesis is to study the role of Rab6A in blood vessel development by characterizing the functional impact of postnatal Rab6A deletion in ECs in vivo. For that, we generated an inducible endothelial-specific knockout mouse model of Rab6A. Here, we show that Rab6A is required for angiogenesis and vascular barrier formation and maturation. Rab6A loss leads to aberrant vascular morphology with disrupted barrier integrity in the growing retina, characterized by hyper sprouting, with an increased number of tip ECs and filopodia at the vascular front, a hyper dense vascular network, with dilated and tortuous vessels, impaired vertical sprouting, and subsequent defective formation of the intermediate and deep vascular plexus. In the brain, Rab6A loss resulted in a disorganized vascular network with tortuous vessels, an increased number of tip cells, some exhibiting microaneurysm-like structures, and compromised barrier integrity leading to hemorrhages. These findings, for the first time, reveal that Rab6A, through its role in intracellular trafficking, influences various EC functions including migration, proliferation, angiogenic sprouting, and barrier formation and maturation. Understanding the mechanisms by which Rab6A regulates these EC behaviors could provide new therapeutic targets for treating aberrant angiogenesis in various diseases such as cancer and diabetic retinopathy
Triclustering-based patient stratification : a case study in Multiple and Amyotrophic Lateral Sclerosis
No full textTese de Mestrado, Ciência de Dados, 2025, Universidade de Lisboa, Faculdade de CiênciasA Esclerose Múltipla é uma doença inflamatória autoimune que afeta o Sistema Nervoso Central, levando
à perda de mielina por parte dos neurónios, que, por sua vez, resulta em neurodegeneração. Esta doença
pode ser dividida em vários tipos, sendo o mais comum denominado de Recidivante Remitente. Este tende
a manifestar-se de duas maneiras distintas: ataques agudos, denominados de recaídas, onde nova atividade
da doença é detetada, e dos quais o paciente pode recuperar totalmente ou parcialmente, e progressão
silenciosa, caracterizada pela ausência dos ataques previamente mencionados, mas onde deterioração
irreversível dos sintomas ocorre.
A Esclerose Amiotrófica Lateral é uma condição que também leva a neurodegeneração, resultando em
perda progressiva das capacidades motoras. Apesar disto, esta é mais agressiva no seu ataque, tendo uma
progressão mais rápida que culmina na morte do paciente entre três a cinco anos depois do diagnóstico.
Atualmente, o diagnóstico de ambas é limitado pela ausência de um teste definitivo. Para Esclerose
Múltipla, a combinação de Ressonância Magnética de Imagem com outros exames e a ocorrência de
ataques agudos com danos cerebrais são necessários para confirmar a presença da doença. Para Esclerose Amiotrófica Lateral, vários testes têm de ser feitos, de modo a confirmar que os sintomas sentidos
não podem ser atribuídos a outras doenças. Adicionalmente, para haver confirmação da mesma, a sua
progressão tem de ser confirmada através do agravamento dos sintomas ou disseminação dos mesmos
para zonas previamente não afetadas.
Dependendo do tipo de Esclerose Múltipla e da gravidade do diagnóstico, a doença pode culminar na
morte do paciente, mas os sintomas mais comuns prendem-se na perda de mobilidade e funções cognitivas. Apesar de perda de mobilidade também ser um dos sintomas de Esclerose Amiotrófica Lateral, um
dos sintomas mais graves que acaba por ocorrer e levar à morte do paciente é insuficiência respiratória.
Em relação ao tratamento de qualquer uma das doenças, devido à inexistência de uma cura definitiva,
estes estão limitados à diminuição da taxa de progressão da doença e dos sintomas das mesmas, de forma
a melhorar a qualidade de vida dos doentes.
Para avaliar a progressão das mesmas, várias métricas de progressão são recolhidas ao longo de exames que o paciente vai fazendo com frequência. Uma das escalas mais usadas para a Esclerose Múltipla
é a Escala Expandida do Estado de Incapacidade e os seus derivados intitulados de Sistemas Funcionais.
No caso da Esclerose Lateral Amiotrófica, análogos destas escalas, intitulados de Escala Funcional de
Avaliação de Esclerose Lateral Múltipla e os seus derivados são usados. Estas escalas providenciam
informação relativa à gravidade dos sintomas ao longo do tempo e permitem avaliar o seu estado de
progressão. Dado que estas doenças possuem uma progressão heterogénea que varia de paciente para paciente, a
sua compreensão é difícil e a administração de cuidados adequados e avaliação do seu impacto demonstram ser tarefas árduas.
A estratificação de pacientes pode ser vantajosa neste problema, visto que pode inserir um paciente
num grupo com progressão já mapeada, providenciando uma ideia de como a doença vai evoluir ao longo
do tempo. Adicionalmente, através da descoberta de grupos de progressão da doença, ensaios clínicos
podem ser melhorados e as características mais importantes destas doenças identificadas. Ainda assim,
a natureza sensível ao tempo dos dados aumenta a complexidade desta tarefa, sendo que a maioria dos
métodos de estratificação comumente aplicados são incapazes de capturar padrões temporais.
Com isto em mente, e com o objetivo de identificar grupos de progressão das doenças mencionadas,
dois métodos descritos na literatura foram aplicados a um conjunto de dados de cada doença: ClusTric e
agrupamento baseado em Dynamic Time Warping. O primeiro é uma técnica de Triclustering que permite
descobrir padrões de pacientes que ocorrem apenas em algumas variáveis e instantes temporais, denominados triclusters. O segundo é um método que compara séries temporais que descrevem as variáveis
de cada paciente, estando limitado à utilização de todas as variáveis para obter uma solução. Adicionalmente, um novo método, denominado Metatriclustering, foi desenvolvido durante esta tese e aplicado
ao mesmo conjunto de dados, de modo a tentar melhorar a explicabilidade e a atribuição de grupos aos
pacientes. Este último é também uma técnica de Triclustering que visa agrupar os padrões mais semelhantes, de modo a reduzir a quantidade de grupos de pacientes.
Para aplicar estes métodos, um conjunto de dados para cada doença foi utilizado. Para Esclerose
Múltipla, o conjunto de dados foi cedido pela Fondazione Istituto Neurologico Nazionale Casimiro
Mondino, sob o projeto Europeu BRAINTEASER. Por outro lado, o conjunto de Dados Clínicos de Esclerose Lateral Amiotrófica de Lisboa, obtido no âmbito do projeto AIpALS, foi utilizado para a outra
doença. Ambos estes conjuntos de dados necessitaram de metodologias de pré processamento antes de
serem utilizados nos métodos de agrupamento previamente mencionados. A partir destes foi possível
criar snapshots de pacientes (instância temporal onde vários exames, realizados ao longo de uma curta
janela temporal, foram agrupados), lidar com valores em falta, etc. Durante este processo, as variáveis
temporais que viriam a ser utilizadas foram escolhidas.
Para avaliar os agrupamentos obtidos, uma estrutura de validação foi utilizada, que visava a obtenção
de métricas internas, externas e de classificação. Adicionalmente, dendrogramas, boxplots, gráficos de
evolução e de pertença (membership) foram utilizados para comparar resultados. Dada a forma com que o
método de Metatriclustering foi implementado, a validação dos seus resultados foi mais limitada, ausente
de métricas de avaliação.
Para o método ClusTric e Metatriclustering, vários parâmetros foram testados, enquanto que para o
agrupamento baseado em Dynamic Time Warping, apenas os parâmetros padrão foram avaliados. A utilização de diferentes números de snapshots foi analizado para cada um destes métodos. Adicionalmente,
para cada conjunto de parâmetros e número de snapshots, os resultados obtidos quando dois a seis grupos de pacientes eram selecionados foram investigados. Para o primeiro e último método, a remoção de
determinadas variáveis dos conjuntos de dados foi testada, assim como o impacto que o escalonamento
dos dados tem nos seus resultados. Para Esclerose Múltipla, todos os métodos produziram grupos de pacientes com boa separabilidade,
sendo que ClusTric obteve melhores resultados quando cinco grupos de pacientes foram descobertos, enquanto que Metatriclustering sugeriu a existência de quatro e o agrupamento baseado em Dynamic Time
Warping três. Devido à ausência de métricas de avaliação para o método Metatriclustering, não foi possível fazer uma comparação mais profunda com os outros métodos. Relativamente aos outros dois métodos, os grupos com melhores métricas foram os obtidos através do método ClusTric. Adicionalmente,
através deste foi possível identificar que apenas quatro das nove variáveis inicialmente consideradas eram
relevantes. Por último, o efeito de escalonamento dos dados foi mínimo para este método, enquanto que
o seu impacto foi mais significativo para o agrupamento baseado em Dynamic Time Warping.
Para Esclerose Amiotrófica Lateral, a separabilidade dos grupos foi aceitável para ClusTric, que identificou a existência de quatro grupos, e Metatriclustering, que sugeriu a existência de três, mas melhor
para o agrupamento baseado em Dynamic Time Warping, que detetou três grupos. Este último método
foi também o que produziu as melhores métricas de avaliação. Através dos resultados de ClusTric, uma
das variáveis foi identificada como não importante no agrupamento dos pacientes. Adicionalmente, a remoção de uma outra variável levou a um melhoramento dos resultados obtidos tanto para ClusTric como
para agrupamento baseado em Dynamic Time Warping. Semelhantemente ao que havia sido verificado
para Esclerose Múltipla, foi possível concluir que o escalonamento dos dados teve um impacto mais significativo para agrupamento baseado em Dynamic Time Warping. Com escalonamento, este método passou
a sugerir a existência de quatro grupos de pacientes e os seus resultados eram comparáveis aos obtidos
por ClusTric. Dado que escalonamento das variáveis é um passo que deve ser efetuado na aplicação deste
método (uma vez que Dynamic Time Warping é baseado em distância euclidiana), estes resultados foram
considerados os mais relevantes.
Através destes resultados, foi possível identificar várias vantagens de cada um dos métodos em estudo: (ClusTric) – pouco afetado pelo escalonamento dos dados e capaz de identificar variáveis mais
importantes; agrupamento baseado em Dynamic Time Warping – método mais simples, com menos
parâmetros para otimizar e capaz de produzir bons resultados quando todas as variáveis são significativas; Metatriclustering – explicabilidade melhorada dos grupos e facilidade de atribuir um grupo a um
novo paciente.
Uma vez que Metatriclustering foi capaz de produzir bons agrupamentos, mais investigação do
mesmo é justificado, de modo a obter métricas de avaliação e comparar os seus resultados com os dos
outros métodos de forma mais aprofundada.Multiple and Amyotrophic Lateral Sclerosis are neurodegenerative diseases that affect millions of people
in the world. The first is characterized by acute outbursts that typically leave the patient with decreased
mobility and lessened cognitive function, while the latter is more severe in the attack of motor neurons
resulting in patient death by respiratory failure after a few years. Currently, there is no available cure
for either condition and the few available treatments focus on slowing disease progression and improving patient quality of life. Despite this, a highly heterogenous progression characterizes these illnesses,
making it harder to understand them and provide adequate care.
Patient stratification could be advantageous in this problem as it may help improve clinical trials
and identify relevant traits of these diseases. However, the time-sensitive nature of the data makes it a
complex task, as most of the currently used stratification methods are incapable of capturing temporal
patterns.
In this work, two state-of-the art temporal approaches were evaluated: ClusTric and Dynamic Time
Warping based clustering. Additionally, a new method entitled Metatriclustering is proposed with the
intent of improving cluster explainability and patient cluster attribution.
The results obtained showed that all methods could remain competitive in cluster separability but, due
to the absence of a robust validation framework for Metatriclustering, an in depth comparison between the
latter and the other methods was not possible. Among the remaining approaches, ClusTric produced the
best results for Multiple Sclerosis, identifying the existence of five disease progression groups, while both
ClusTric and Dynamic Time Warping based clustering produced good results for Amyotrophic Lateral
Sclerosis, identifying the existence of four disease progression groups.
Overall, the findings in this thesis showcase the advantages of Triclustering based approaches for
problems with a temporal nature and justify the ongoing development of Metatriclustering
Estudo da interação do HPV e microbioma na orofaringe
No full textTrabalho Final do Curso de Mestrado Integrado em Medicina, Faculdade de Medicina, Universidade de Lisboa, 2024Introdução: Nas últimas décadas tem-se verificado um aumento da incidência do carcinoma da orofaringe associado ao vírus do papiloma humano (HPV), com características distintas do carcinoma da orofaringe HPV-negativo, associado ao tabaco e álcool. Medidas preventivas como a vacinação contra o HPV parecem prevenir a infeção por este vírus na orofaringe, impedindo a carcinogénese mediada pelo HPV. Dados mais recentes apontam para o papel da disrupção do microbioma na promoção de inflamação e indução tumoral, modulando a resposta à infeção por HPV e à terapêutica do carcinoma da orofaringe. Métodos: Foi elaborado um estudo exploratório que selecionou mulheres que recorreram à consulta de Ginecologia entre 2022 e 2024. Estas mulheres foram contactadas por via telefónica para responder a um questionário sociodemográfico. Posteriormente, foram convocadas a comparecer com os parceiros para a colheita de uma amostra da orofaringe para determinação do HPV e microbioma. Resultados: Das 51 mulheres selecionadas, 30 mulheres consentiram em responder ao questionário. Foi determinado o HPV da orofaringe de 21 mulheres e o microbioma de 18 mulheres, tendo sido testados 4 parceiros do sexo masculino. Das mulheres avaliadas, 46.7% eram vacinadas contra o HPV, 16.7% eram fumadoras e 86.7% praticavam sexo oral. Foi identificado o genótipo HPV42 na orofaringe de 1 dos doentes. A composição do microbioma desta população consistia maioritariamente em espécies de Streptococcus (100%), Moraxella (40.9%) e Staphylococcus (36.4%). Conclusão: Este estudo permitiu concluir que mulheres a quem é feita uma abordagem holística do ecossistema genital baseada na prevenção, com recurso a probióticos e vacinação contra o HPV, têm uma menor prevalência de HPV na orofaringe. É necessário aumentar a literacia da população para o impacto da infeção por HPV e do microbioma na orofaringe, sendo necessários mais estudos nesta área.Introduction: In the last few decades there has been an increase in the incidence of oropharyngeal cancer associated with human papillomavirus (HPV), with distinct features from HPV-negative oropharyngeal cancer, associated with smoking and alcohol. Preventive care such as the HPV vaccine seems to halt oropharyngeal infection, preventing HPV mediated carcinogenesis. Recent data points to the role of microbiome disruption in inflammation and tumor induction, modulating the response to HPV infection and oropharyngeal cancer treatment. Methods: An exploratory study was designed to select women that attended Gynecology appointments from 2022 to 2024. These women were contacted by cellphone to answer a sociodemographic questionnaire. They were then called, along with their partners, for an oropharyngeal swab to evaluate HPV and microbiome. Results: From the 51 selected women, 30 of them consented to answer the questionnaire. HPV was test in 21 women and microbiome evaluation was conducted in 18 women. 4 male partners were also tested. Of the women test, 46.7% were vaccinated against HPV, 16.7% were smokers and 86.7% practiced oral sex. HPV42 was isolated in one of the patients. The microbiome of this population consisted mostly of species of Streptococcus (100%), Moraxella (40.9%) and Staphylococcus (36.4%). Conclusion: This study suggests that women who are given a holistic approach to their genital ecosystem based on preventive care with probiotics and HPV vaccination have less HPV in the oropharynx. It is mandatory to increase population literacy on the impact of HPV and the microbiome in the oropharynx. Further research is needed
Identification of Corrector Combinations to Increase the Rescue of F508del-CFTR Traffic and Function
No full textTese de mestrado, Bioquímica e Biomedicina, 2023, Universidade de Lisboa, Faculdade de CiênciasMutations in the CFTR gene cause Cystic Fibrosis (CF) – the most common life-threatening recessive
inherited disease in Caucasians. The deletion of a phenylalanine at position 508 (p.Phe508del or F508del)
is the most prevalent CF-causing mutation, affecting 80-85% of CF population worldwide. This mutation
leads to CFTR protein misfolding (i.e., class II CFTR mutation) that is retained by the endoplasmic
reticulum quality control (ERQC), thereby precluding its processing and trafficking to the apical plasma
membrane (PM), being instead targeted for proteasomal degradation.
To date, there are three CFTR corrector drugs (rescuing the mutant protein to the PM) approved
for individuals who are F508del-homozygous (all combined with the potentiator VX-770/ivacaftor
that stimulates the channel activity): VX-809/lumacaftor, VX-661/tezacaftor and VX-445/elexacaftor.
Despite such progress, individuals taking these CFTR modulators still face several disease-related
symptoms and complications, including progressive decline in lung function, which suggests that there
is still scope for additional or better correctors to further increase the rescue of F508del-CFTR.
A recent drug repurposing approach developed by the CF Research Lab (BioISI) was used to screen
the FDA-approved drug library, i.e., drugs already approved for the treatment of other (unrelated)
diseases, and thus identified 40 drugs which partially rescue F508del-CFTR PM traffic.
The main goal of this work was to investigate the effects of these FDA-approved drugs in combination
with the approved CFTR correctors VX-661 and/or VX-445 in order to identify combinations that further
increase the rescue of F508del-CFTR PM traffic and function. To this end, the effects of FDA-approved
drugs in rescuing F508del-CFTR traffic and function were assessed and validated by functional and
biochemical assays. Furthermore, the mechanism of action (MoA) of these drugs was also investigated.
In conclusion, the work presented here constitutes an important step forward in the process of
developing new CF therapies based on a drug repurposing approach
Tumor immune evasion in brain metastases of melanoma
No full textTrabalho Final de Mestrado Integrado, Ciências Farmacêuticas, 2024, Universidade de Lisboa, Faculdade de Farmácia.O Melanoma é um tipo de cancro de pele agressivo, que apresenta altas taxas de morbilidade e mortalidade. Segundo as estatísticas cerca de 50% dos casos, as células de melanoma migram pela corrente sanguínea, atravessando a barreira hematoencefálica e, por conseguinte, instalam-se no parênquima cerebral, provocando assim as conhecidas metástases cerebrais. Estas metástases têm sido alvo de grande preocupação no mundo clínico e científico, por haver ainda pouco conhecimento sobre a forma como conseguem influenciar os vários mecanismos de defesa do organismo a seu favor como também por apresentar dificuldades na resposta à terapêutica.
De facto, o sistema imunitário desempenha um papel crucial na prevenção e bloqueio da progressão de doenças, no entanto, as células de melanoma conseguem alterar a função do sistema imunitário explorando pontos de controlo, como as vias PD-1/PD-L1 e CTLA-4, que reduzem a atividade das células T e que promovem o crescimento tumoral. Adicionalmente, estudos mais recentes têm vindo a reportar que o microambiente onde se inserem estas metástases cerebrais também influencia o seu crescimento. Assim sendo, esta monografia tem o intuito também de abordar estas interações entre o tumor e as células do parênquima cerebral, para que se consiga redirecionar para possíveis alvos terapêuticos.
Efetivamente, durante muitos anos o tratamento para as metástases cerebrais do melanoma era limitado a terapias locais como resseção cirúrgica, radioterapia e radiocirurgia estereotáxica. Contudo estes métodos apresentam uma eficácia limitada e estão associados a uma sobrevivência média de apenas alguns meses.
Efetivamente, a introdução de terapias direcionadas e imunoterapias melhorou significativamente os resultados. Em 2011, a FDA aprovou inibidores de BRAF e MEK para melanoma com mutação BRAF. Além disso, inibidores imunológicos mostraram eficácia em prolongar a sobrevivência e agora são tratamentos padrão para metástases cerebrais de melanoma. De facto, a gestão do melanoma e das metástases cerebrais avançou significativamente com a introdução destas novas terapêuticas. Contudo, acredita-se que com um melhor entendimento do meio onde se insere o tumor, poderá levar a novos rumos terapêuticos.Melanoma is an aggressive type of skin cancer with high morbidity and mortality rates. According to statistics, in around 50% of cases, melanoma cells migrate through the bloodstream, crossing the blood-brain barrier and consequently settling in the brain parenchyma, thus causing what are known as brain metastases.
These metastases have been the subject of great concern in the clinical and scientific world, as there is still little knowledge about how they can influence the body's various defense mechanisms in their favor, and because they present difficulties in responding to therapy.
In fact, the immune system plays a crucial role in preventing and blocking the progression of diseases. However, melanoma cells manage to alter the function of the immune system by exploiting checkpoints, such as the PD-1/PD-L1 and CTLA-4 pathways, which reduce T-cell activity and promote tumor growth.
In addition, more recent studies have reported that the microenvironment in which these brain metastases are located also influences their growth. Therefore, this monograph also aims to address these interactions between the tumor and the cells of the brain parenchyma, to redirect them towards possible therapeutic targets.
Indeed, for many years, treatment for melanoma brain metastases was limited to local therapies such as surgical resection, radiotherapy, and stereotactic radiosurgery. These methods have limited efficacy and are associated with an average survival of just a few months.
However, the introduction of targeted therapies and immunotherapies has significantly improved results. In 2011, the FDA approved BRAF and MEK inhibitors for BRAF-mutated melanoma. In addition, immune inhibitors have shown efficacy in prolonging survival and are now standard treatments for melanoma brain metastases.
Indeed, the management of melanoma and brain metastases has advanced significantly with the introduction of these new therapies. However, it is believed that a better understanding of the tumor's environment could lead to new therapeutic directions
Development of decorated liposomes for ocular delivery of triamcinolone acetonide
No full textTrabalho Final de Mestrado Integrado, Ciências Farmacêuticas, 2024, Universidade de Lisboa, Faculdade de Farmácia.Os corticosteroides têm sido utilizados por muitos anos para tratar inúmeras condições oftálmicas. O acetonido de triamcinolona é um corticosteroide usado para minimizar muitas condições inflamatórias que afetam os olhos e a pele. Os lipossomas são sistemas avançados de veiculação de fármacos que geralmente transportam fármacos hidrofóbicos a um alvo específico, melhorando a sua farmacodinâmica.
O objetivo deste trabalho foi produzir e caracterizar lipossomas de acetonido de triamcinolona contendo Soluplus e vitamina E-TPGS, para aplicação oftálmica. Esta estratégia foi adotada para melhorar a solubilidade do fármaco e, por outro lado, para estabilizar a bicamada fosfolipídica. O método escolhido para produzir lipossomas foi a hidratação do filme lipídico e posteriormente foi efetuado um planeamento experimental de forma a rastrear as condições de otimização das formulações. As amostras foram submetidas a métodos de caracterização físico-química como a eficiência de encapsulação, tamanho de partícula e índice de polidispersão, análise calorimétrica e finalmente o teste de libertação de fármaco in vitro. Os resultados revelaram que a adição do tensioativo Soluplus e vitamina E-TPGS aumentou a solubilização do fármaco e a estabilidade do sistema lipossomal. Também foi possível verificar que os lipossomas conferiram uma taxa de libertação superior do que o fármaco na sua forma livre, atingindo percentagens próximas de 80%. A eficiência de encapsulação, por outro lado, não foi a esperada, já que não atingiu sequer 50% e possivelmente não obtivemos uma população homogénea de SUVs, mas uma mistura de MLVs e LUVs, já que os valores de índice de polidispersão estiveram abaixo de 0.50 ± 0.1 e a dispersão do tamanho de partícula entre 300 e 800 nm.
Em conclusão, é fundamental continuar a investigar a adequabilidade da hidratação do filme lipídico como método de produção em larga escala de lipossomas, analisando criticamente os erros ocorridos no processo e repetindo os ensaios com diferentes formulações, em que sejam avaliados outros ingredientes e proporções. Apesar dos dados serem preliminares, o comportamento dos lipossomas parece melhorar a libertação e estabilidade do acetonido de triamcinolona na forma lipossomal.Corticosteroids have been used for many years to treat several ophthalmic conditions. Triamcinolone acetonide is a corticosteroid used to minimize many inflammatory conditions that affects the eyes and skin. Liposomes are advanced drug delivery systems that usually carry hydrophobic drugs to a specific target, improving pharmacodynamics.
The aim of this work was to produce and characterize triamcinolone acetonide-loaded liposomes for ophthalmic application decorated with SoluPlus and vitamin E-TPGS. This strategy was, on the one hand, to increase the drug solubilization in water and, on the other hand to stabilize the phospholipid bilayer. The liposome production method chosen was the thin film hydration and after all, a design of experiment was carried out to track down the conditions for optimizing the formulations. The samples were submitted to physicochemical characterization methods such as encapsulation efficiency, particle size and dispersion index, calorimetric analysis and finally the in vitro drug release test. The results showed that the addition of the surfactant Soluplus and vitamin E-TPGS rised the drug solubilization and the stability of the liposomal system. It can also be seen that the liposomes have a higher release rate to the outside than the free form, making it to percentages even close to 80%. The encapsulation performance, on the other hand, was not as expected, since it didn't get to 50% and possibly, a homogeneous population was not obtained but instead, a mixed population of MLVs and LUVs, since the dispersion index values were above 0.50 ± 0.1 and the disparity in particle sizes between 300 and 800 nm.
In conclusion, it is important to keep studying the suitability of thin film hydration as a method for large-scale liposome production, critically analyzing errors in the process performed, as well as repeating the tests with different formulations where other ingredients are scanned. Although the data is preliminary, the behavior of the liposomes seems to improve the release and stability of liposomal triamcinolone acetonide
Anti-Ma2-associated paraneoplastic limbic encephalitis in a patient with classical Hodgkin lymphoma
No full textTrabalho Final do Curso de Mestrado Integrado em Medicina, Faculdade de Medicina, Universidade de Lisboa, 2024A encefalite límbica autoimune é uma doença inflamatória mediada por autoanticorpos que afeta preferencialmente os lobos temporais mesiais e que se manifesta através de sintomas neuropsiquiátricos variáveis, incluindo perda da memória de curto-prazo, crises epiléticas, alteração da personalidade, depressão, psicose e défices cognitivos, que podem evoluir para demência. Quando surge no contexto de doença neoplásica, geralmente associada à expressão de anticorpos antineuronais que reconhecem antigénios intracelulares, como a proteína Ma2, designa-se por encefalite límbica paraneoplásica (ELP). A ELP apresenta um mau prognóstico devido ao desenvolvimento de lesões neurológicas irreversíveis e surge, na maioria dos casos, em doentes com tumores sólidos (principalmente carcinoma de pequenas células do pulmão) e, menos frequentemente, em doentes com linfoma de Hodgkin (LH). Por sua vez, os tumores de células germinativas testiculares são as neoplasias primárias mais prevalentes nos doentes com síndromes neurológicas paraneolplásicas (SNPs) associadas ao anticorpo anti-Ma2.
A nevrite ótica/papilite raramente tem uma etiologia paraneoplásica, pelo que, mesmo na presença de uma neoplasia, devem ser excluídas outras causas. Esta síndrome manifesta-se através da diminuição subaguda, indolor e bilateral da acuidade visual, observando-se frequentemente edema da papila bilateral e hemorragias em chama de vela, na fundoscopia. Surge geralmente em doentes com carcinoma de pequenas células do pulmão, com títulos positivos para o anticorpo anti-CV2/CRMP51 e, pontualmente, para outros anticorpos antineuronais, como o anti-Ma2.
Neste trabalho, descrevo o caso de um homem de 68 anos com uma história de 2 meses de evolução de episódios autolimitados e estereotipados de perturbação da consciência com paragem de atividade e automatismos mastigatórios, com duração breve de segundos a minutos, seguidos por um período confusional. Sucedeu-se o aparecimento de um escotoma no campo visual direito que motivou o recurso ao Serviço de Urgência e o consequente internamento, conduzindo ao diagnóstico de nevrite ótica/papilite bilateral. Adicionalmente, a família referiu alterações cognitivas envolvendo a memória de curto-prazo. O doente não apresentava antecedentes pessoais ou familiares de relevo. O eletroencefalograma (EEG) revelou atividade epileptiforme temporal direita, suportando o diagnóstico de crises epiléticas focais com alteração da consciência. A ressonância magnética crânio-encefálica (RM-CE) documentou hipersinal em T2-FLAIR2 e discreta hiperinsuflação temporal mesial bilateral, mais evidente à direita, em relação com uma possível encefalite límbica e/ou crises epiléticas frequentes. A avaliação citoquímica, citológica e microbiológica do líquido cefalorraquidiano (LCR) não apresentou alterações, mas a pesquisa de anticorpos antineuronais permitiu identificar um título positivo baixo do anticorpo anti-Ma2. Após a exclusão de outras causas, estabeleceu-se o diagnóstico presuntivo de ELP associada a anti-Ma2, com nevrite ótica/papilite autoimune/paraneoplásica concomitante.
Procedeu-se à monitorização da evolução da SNP e a uma extensa marcha diagnóstica com o intuito de identificar uma neoplasia oculta, envolvendo, entre outras, reavaliações clínicas, laboratoriais, imagiológicas e de medicina nuclear periódicas. O anticorpo anti-Ma2 foi persistentemente positivo no soro e no LCR e as RM-CEs revelaram repetidamente um padrão imagiológico sugestivo de encefalite límbica. O tratamento com fármacos anticrises epiléticas (FACEs) e imunomoduladores foi sendo ajustado de acordo com a evolução clínica do doente. Contudo, não preveniu a evolução para demência. 5 anos após o início dos sintomas neurológicos e depois de várias tentativas, a biópsia excisional de um gânglio linfático de um conglomerado adenopático supraclavicular esquerdo, identificado nas 18-FDG PET-TCs3, permitiu realizar o diagnóstico anatomopatológico de LH clássico, subtipo esclerose nodular. O doente completou 4 ciclos de quimioterapia (regime ABVD4), com boa tolerância e remissão metabólica completa, embora sem melhoria das manifestações cognitivas ou recuperação da capacidade funcional.
Cerca de 6 anos após o aparecimento do quadro, o paciente apresentou agravamento súbito dos sintomas neurológicos, com aumento da sonolência diurna e desequilíbrio da marcha. Laboratorialmente apresentava hiponatremia grave (114 mEq/L), o EEG detetou atividade epileptiforme focal com origem temporal direita e a RM-CE revelou hipersinal temporomesial bilateral em T2-FLAIR, com efeito tumefativo, mais evidente à esquerda. A hiponatremia foi corrigida, o FACE ajustado e, não sendo possível excluir reativação da encefalite límbica, a imunoterapia foi reforçada, com melhoria clínica e imagiológica.Limbic encephalitis associated with antineuronal antibodies against intracellular antigens, such as anti-Ma2, is typically detected in patients with cancer. Hodgkin lymphoma (HL) is the third most common cause of paraneoplastic limbic encephalitis (PLE), but anti-Ma2 antibody is not classically associated with this tumour.
We report a 68-year-old male patient with a 2-month history of focal impaired awareness seizures and short-term memory loss followed by bilateral papillitis. The EEG disclosed right temporal lobe epileptiform activity and the brain MRI showed T2-FLAIR bilateral medial temporal lobe hyperintensity. Cerebrospinal fluid (CSF) examination was normal but revealed a positive anti-Ma2 antibody. The work-up excluded other alternative causes, and a probable anti-Ma2-associated PLE combined with autoimmune/paraneoplastic anterior optic neuritis was stablished. An extensive and repeated screening for uncover cancer was pursued, along with clinical, neuroimaging, CSF, and immunity status re-evaluations, showing persistent anti-Ma2 antibody in serum and CSF and MRI findings of limbic encephalitis. Immunotherapy and anti-seizure medication were adjusted accordingly to clinical evaluation but were unable to prevent the progression to dementia. At a third attempt of lymph node analysis, the diagnosis of classical HL was made. The patient completed chemotherapy, 5 years after the onset of PLE-related symptoms. Lymphoma remission was achieved, without improvement of the neurological outcome.
This report represents a unique case of anti-Ma2-associated PLE and reversible bilateral papillitis as a complication of an occult HL. Paraneoplastic papillitis/optic neuritis in association with Ma2-autoimmunity and HL was never reported before, and only 3 cases of anti-Ma2-associated PLE and HL have been described. Delayed cancer diagnosis and treatment probably contributed to the failure to prevent cognitive decline. This case illustrates the value of paraneoplastic syndromes as markers of an underlying malignancy and highlights the importance of a close follow-up and a comprehensive and multidisciplinary assessment of these patients