Tesis Doctorals en Xarxa
Not a member yet
46997 research outputs found
Sort by
Desenvolupament de compostos fotoactius per millorar la resolució espacial en fotofarmacologia i optogenètica
No full textLa llum és una eina versàtil que ofereix una font d’energia no invasiva i fàcilment modulable per controlar, de manera externa, processos biològics. Aquesta estratègia es basa en l’ús de substàncies moleculars fotoactives capaces d’interaccionar amb proteïnes o altres estructures endògenes per modificar-ne l’activitat sota irradiació. El control de l’activitat biològica es pot dur a terme amb alta resolució espacial i temporal, de manera no invasiva, selectiva i, sovint, reversible. Cosa que obre la porta a aplicacions de gran interès, com és el cas de l’estudi dels sistemes neuronals amb una precisió superior a la que permeten la farmacologia i l’electrofisiologia convencionals.
Aquests objectius es poden assolir mitjançant dos grans grups de tècniques que es diferencien segons l’origen de les substàncies fotoactives utilitzades per al control dels processos biològics: l’optogenètica, basada fonamentalment en l’ús de proteïnes fotosensibles naturals (o modificades genèticament), i la fotofarmacologia, en què aquestes substàncies són molècules petites d’origen sintètic. L’objectiu d’aquesta tesi doctoral ha estat explorar noves vies per millorar les prestacions de les tècniques optogenètiques i fotofarmacològiques actuals.
Un dels principals avantatges d’aquestes tècniques és el seu confinament espacial, és a dir, la possibilitat d’induir processos selectivament a la zona irradiada. A la pràctica, però, aquesta resolució espacial es veu restringida per diversos factors, principalment per la dificultat de fotoexcitar selectivament un volum determinat dins d’una mostra biològica. D’una banda, la penetració de la llum es veu limitada per l’absorció i la dispersió causades per les biomolècules dels teixits, fet que dificulta l’accés al material biològic situat a més profunditat en experiments in vivo. De l’altra, quan s’utilitzen lents i objectius per focalitzar la llum, les dimensions del volum focal estan limitades per la difracció, i en el millor dels casos seran de centenars de nanòmetres tant en el pla focal com en l’eix axial de la mostra.
Hi ha diverses estratègies que permeten superar algunes d’aquestes limitacions i millorar així la resolució espacial de la fotoexcitació. Tot i que es van desenvolupar originalment per augmentar la resolució en microscòpia òptica de fluorescència, actualment hi ha interès a aplicar-les en altres camps on el confinament de la llum és rellevant, com és el cas de l’optogenètica i la fotofarmacologia. Dues de les estratègies destacades per a aquest propòsit són l’absorció a dos fotons i l’excitació antagonista amb dos feixos de llum.
Concretament, en aquesta tesi doctoral s’han estudiat tres casos on s’han aplicat aquestes estartègies: (1) El desenvolupament d’una eina fotofarmacològica basada en microscòpia RESOLFT per millorar la resolució espacial en el fotocontrol de receptors ionotròpics de glutamat; (2) El desenvolupament d’una estratègia per fotosensibilitzar el comportament de proteïnes optogenètiques sota excitació a dos fotons; i (3) El desenvolupament d’un nou lligand engabiat no destructiu estilbènic operatiu a dos fotons sota llum NIR per al control de receptors ionotròpics de glutamat.La luz es una herramienta versátil que ofrece una fuente de energía no invasiva y fácilmente modulable para controlar, de forma externa, procesos biológicos. Esta estrategia se basa en el uso de sustancias moleculares fotoactivas capaces de interactuar con proteínas u otras estructuras endógenas para modificar su actividad bajo irradiación. El control de la actividad biológica puede llevarse a cabo con alta resolución espacial y temporal, de manera no invasiva, selectiva y, a menudo, reversible. Esto abre la puerta a aplicaciones de gran interés, como el estudio de los sistemas neuronales con una precisión superior a la que permiten la farmacología y la electrofisiología convencionales.
Estos objetivos pueden alcanzarse mediante dos grandes grupos de técnicas, que se diferencian según el origen de las sustancias fotoactivas utilizadas para el control de los procesos biológicos: la optogenética, basada fundamentalmente en el uso de proteínas fotosensibles naturales (o modificadas genéticamente), y la fotofarmacología, en la que estas sustancias son pequeñas moléculas de origen sintético. El objetivo de esta tesis doctoral ha sido explorar nuevas vías para mejorar el rendimiento de las técnicas optogenéticas y fotofarmacológicas actuales.
Una de las principales ventajas de estas técnicas es su confinamiento espacial, es decir, la posibilidad de inducir procesos selectivamente en la zona irradiada. En la práctica, sin embargo, esta resolución espacial se ve limitada por diversos factores, principalmente por la dificultad de fotoexcitar selectivamente un volumen determinado dentro de una muestra biológica. Por un lado, la penetración de la luz está limitada por la absorción y dispersión causadas por las biomoléculas presentes en los tejidos, lo que dificulta el acceso al material biológico situado a mayor profundidad en experimentos in vivo. Por otro lado, al utilizar lentes y objetivos para focalizar la luz, las dimensiones del volumen focal están limitadas por la difracción y, en el mejor de los casos, serán del orden de cientos de nanómetros tanto en el plano focal como en el eje axial de la muestra.
Existen diversas estrategias que permiten superar algunas de estas limitaciones y, por tanto, mejorar la resolución espacial de la fotoexcitación. Aunque estas estrategias fueron desarrolladas originalmente para aumentar la resolución en microscopía óptica de fluorescencia, actualmente existe un gran interés en aplicarlas en otros campos donde el confinamiento de la luz es relevante, como en optogenética y fotofarmacología. Dos de las estrategias destacadas para este propósito son la absorción a dos fotones y la excitación antagónica con dos haces de luz.
Concretamente, esta tesis doctoral ha estudiado tres casos en los que se han aplicado estas estrategias: (1) El desarrollo de una herramienta fotofarmacológica basada en microscopía RESOLFT para mejorar la resolución espacial en el fotocontrol de receptores ionotrópicos de glutamato; (2) El desarrollo de una estrategia para fotosensibilizar el comportamiento de proteínas optogenéticas bajo excitación a dos fotones; y (3) El desarrollo de un nuevo ligando enjaulado no destructivo de tipo estilbénico, operativo a dos fotones bajo luz NIR, para el control de receptores ionotrópicos de glutamato.Light is a versatile tool that provides a non-invasive and easily tunable energy source for externally controlling biological processes. This strategy relies on the use of photoactive molecular substances capable of interacting with proteins or other endogenous structures to modify their activity upon irradiation. The control of biological activity can be achieved with high spatial and temporal resolution, in a non-invasive, selective, and often reversible manner. This opens the door to applications of great interest, such as the study of neuronal systems with a precision beyond that of conventional pharmacology and electrophysiology.
These objectives can be accomplished using two main groups of techniques, which differ according to the origin of the photoactive substances used to control biological processes: optogenetics, based mainly on the use of natural (or genetically modified) light-sensitive proteins, and photopharmacology, in which these substances are small synthetic molecules. The aim of this PhD has been to explore new approaches to improve the performance of current optogenetic and photopharmacological techniques.
One of the main advantages of these techniques is their spatial confinement, that is, the ability to selectively induce processes in an irradiated area. In practice, however, this spatial resolution is limited by several factors, primarily the difficulty of selectively photoexciting a defined volume within a biological sample. On one hand, light penetration is constrained by absorption and scattering caused by biomolecules in the tissues, which hinders access to deeper biological material in in vivo experiments. On the other hand, when lenses and objectives are used to focus light, the focal volume is limited by diffraction and, at best, reaches dimensions of several hundred nanometers in both the focal plane and the axial direction of the sample.
Various strategies have been developed to overcome some of these limitations and thereby enhance the spatial resolution of photoexcitation. Although they were initially designed to improve resolution in fluorescence optical microscopy, there is growing interest in applying these methods in other fields where precise light confinement is essential, such as optogenetics and photopharmacology. Two key strategies for this purpose are the two-photon absorption phenomenon and the antagonistic excitation with dual light beams.
Specifically, this doctoral thesis explores three cases in which these strategies have been applied: (1) The development of a photopharmacological tool based on RESOLFT microscopy to improve spatial resolution in the photocontrol of ionotropic glutamate receptors; (2) The development of a strategy to photosensitize the behavior of optogenetic proteins under two-photon excitation; and (3) The development of a new non-destructive caged stilbene-based ligand, operative under two-photon absorption using NIR light, for controlling ionotropic glutamate receptors.Universitat Autònoma de Barcelona. Programa de Doctorat en Químic
Multimodal nanodomes for wirelessly controlled nanotherapies with light and magnetic fields
No full textEl càncer és una de les majors causes de mort en el món i el desenvolupament de noves teràpies basades en nanotecnologia no està complint les expectatives per la pobra acumulació i ràpida eliminació de les nanopartícules, per tant, el desenvolupament de noves modalitats terapèutiques que permetin controlar i seguir externament l'evolució de la nanoterapia és necessari. En aquesta tesi es desenvolupa un mètode senzill, escalable i adaptable de fabricació de nanopartícules (~150 nm) carregades amb fàrmacs semicobertes de metall d'uns pocs nanòmetres (nanocúpules). D'una banda, s'estudia la versatilitat de la fabricació amb diferents metalls i la seva aplicació en sistemes biològics. Per exemple, les nanocúpulas de coure amb l'antibiòtic eritromicina van demostrar un comportament sinèrgic reduint la quantitat d'antibiòtic necessària unes 2.5 vegades. En el cas de les nanocúpules d'or, carregades amb l'agent fotodinàmic (indocyanine green), es va demostrar un efecte combinatori de teràpia fototèrmica i fotodinàmica arribant a reduir el creixement del tumor en un factor 3.5. D'altra banda, es van estudiar en profunditat les nanocúpules opto-magnètiques de ferro dissenyades per a tenir una configuració magnètica tipus vòrtex que és crucial per a mantenir una alta estabilitat col·loidal.
La cúpula de ferro proporciona una magnetització forta que permet la manipulació magnètica mitjançant forces magnetoforètiques resultant en una concentració magnètica 2.2 vegades superior que la injecció passiva en tumors de ratolí i al seu torn proporciona contrast T2 en ressonància magnètica nuclear el que permet el seguiment de les nanocúpules de manera no invasiva. A més, la semi-coberta de ferro proporciona un comportament plasmònic esmorteït, maximitzant l'absorció i reduint la dispersió, resultant en alta absorció de la llum a la regió de l'infraroig pròxim que es pot utilitzar per a produir augments locals de la temperatura destruint cèl·lules canceroses. Aquest enfocament de combinació fototèrmica amb la manipulació magnètica va demostrar ser efectiu en models xenograft de ratolí de càncer de mama requerint dosi de fàrmac entre 100-500 vegades menors. També es va explorar com a teràpia combinatòria per a càncer de cap i coll quimio-resistents amb prometedors resultats.
Alternativament, les nanocúpules de ferro es van incorporar en monòcits (THP1@NDs) constituint un vehicle cel·lular capaç de: i) creuar barreres cel·lulars, ii) evadir el sistema immune i iii) ser externament controlat mitjançant llum i camps magnètics. La seva eficàcia es va demostrar en esferoides encapsulats en hidrogels biomimètics que constitueixen un model més realista amb diversos tipus cel·lulars i matriu extracelul·lar. Es va demostrar que en presència d’un gradient magnètic, els THP1@nds eren capaços de penetrar en major número i major profunditat en els hidrogels i juntament amb l'actuació fototèrmica es va aconseguir una reducció de la viabilitat del 50% respecte al control i a l'ús del fàrmac lliure induint preferencialment l'apoptosi. Finalment, es va proposar l'ús de macròfags diferenciats de monòcits per a modular el seu comportament cap a un fenotip pro-inflamatori per a influenciar el microentorn tumoral com a estratègia antitumoral. Els resultats preliminars van indicar la possibilitat de l'activació i repolarització dels macròfags primaris d'origen humà mitjançant nanocúpules de Fe sense càrrega o carregades amb el fàrmac imiquimod, un modificador de la resposta immune.
En conclusió, aquesta tesi ha permès el desenvolupament de noves nano-cúpules opto-magnètiques carregades de fàrmacs pel desenvolupament de noves teràpies combinant llum, camps magnètics i vehicles cel·lulars, amb gran potencial en nanomedicina.El cáncer es una de las mayores causas de muerte en el mundo y el desarrollo de nuevas terapias basadas en nanotecnología no está cumpliendo las expectativas por la pobre acumulación y rápida eliminación de las nanopartículas, por lo tanto, el desarrollo de nuevas modalidades terapéuticas que permitan controlar y seguir externamente la evolución de la nanoterapia es necesario. En esta tesis se desarrolla un método sencillo, escalable y adaptable de fabricación de nanopartículas (~150 nm) cargadas con fármacos semicubiertas de metal de unos pocos nanómetros (nanocúpulas). Por un lado, se estudia la versatilidad de la fabricación con diferentes metales y su aplicación en sistemas biológicos. Por ejemplo, las nanocúpulas de cobre con el antibiótico eritromicina demostraron un comportamiento sinérgico reduciendo la cantidad de antibiótico necesaria unas 2.5 veces. En el caso de las nanocúpulas de oro, cargadas con el agente fotodinámico (indocyanine green), se demostró un efecto combinatorio de terapia fototérmica y fotodínamica llegando a reducir el crecimiento del tumor en un factor 3.5. Por otro lado, se estudiaron en profundidad las nanocúpulas opto-magnéticas de hierro diseñadas para tener una configuración magnética tipo vórtex que es crucial para mantener una alta estabilidad coloidal. La cúpula de hierro proporciona una magnetización fuerte que permite la manipulación magnética mediante fuerzas magnetoforéticas resultando en una concentración magnética 2.2 veces superior que la inyección pasiva en tumores de ratón y a su vez proporciona contraste T2 en resonancia magnética nuclear lo que permite el seguimiento de las nanocúpulas de manera no invasiva. Además, la semi-cubierta de hierro proporciona un comportamiento plasmónico amortiguado, maximizando la absorción y reduciendo la dispersión, resultando en alta absorción de la luz en la región del infrarrojo cercano que se puede utilizar para producir aumentos locales de la temperatura destruyendo células cancerosas. Este enfoque de combinación fototérmica con la manipulación magnética demostró ser efectivo en modelos xenograft de ratón de cáncer de mama requiriendo dosis de fármaco entre 100-500 veces menores. También se exploró como terapia combinatoria para cáncer de cabeza y cuello quimio-resistentes con prometedores resultados. Alternativamente, las nanocúpulas de hierro se incorporaron en monocitos (THP1@NDs) constituyendo un vehículo celular capaz de: i) cruzar barreras celulares, ii) evadir el sistema inmune y iii) ser externamente controlado mediante luz y campos magnéticos. Su eficacia se demostró en esferoides encapsulados en hidrogeles biomiméticos que constituyen un modelo más realista con varios tipos celulares y matriz extracelular. Se demostró que en presencia un gradiente magnético, los THP1@NDs eran capaces de penetrar en mayor número y mayor profundidad en los hidrogeles y junto con la actuación fototérmica se consiguió una reducción de la viabilidad del 50% respecto al control y al uso del fármaco libre induciendo preferencialmente la apoptosis. Por último, se propone el uso de macrófagos diferenciados de monocitos para modular su comportamiento hacia un fenotipo pro-inflamatorio para influenciar el microentorno tumoral como estrategia antitumoral. Los resultados preliminares indicaron la posibilidad de la activación y repolarización de los macrófagos primarios de origen humano mediante nanocúpulas de Fe sin carga o cargadas con el fármaco imiquimod, un modificador de la respuesta inmune.
En conclusión, esta tesis ha permitido el desarrollo de nuevas nanocúpulas opto-magnéticas cargadas de fármacos para el desarrollo de nuevas terapias combinando luz, campos magnéticos y vehículos celulares, con gran potencial en nanomedicina.Cancer is one of the leading causes of death worldwide, and the development of new nanotechnology-based therapies is not meeting expectations due to the poor accumulation and rapid elimination of nanoparticles. Therefore, the development of new therapeutic modalities that allow for external control and monitoring of the evolution of nanotherapies is necessary.
In this thesis, a simple, scalable, and adaptable method for manufacturing drug-loaded nanoparticles (~150 nm) partially covered with a few nanometers of metal (nanodomes) was developed. Firstly, the versatility of the manufacturing strategy with different metals and their application in different biological systems was demonstrated. For example, copper nanodomes with the antibiotic erythromycin showed a synergistic behaviour, reducing the required amount of antibiotic by 2.5-fold. In the case of gold nanodomes loaded with the photodynamic agent (indocyanine green), a combinatory effect of photothermal and photodynamic therapy was demonstrated, reducing tumour growth by a factor of 3.5.
On the other hand, opto-magnetic iron nanodomes, designed to have a vortex magnetic configuration, which was crucial for maintaining high colloidal stability, were studied in depth for nanomedical applications. The iron cap provided strong magnetization, allowing strong magnetic manipulation through magnetophoretic forces, resulting in a magnetic concentration that was 2.2-fold higher than the passive injection in mouse tumours. The metal iron cap also provided intense T2 contrast in nuclear magnetic resonance imaging, allowing non-invasive tracking of the nanodomes. Additionally, the iron semi-cover exhibited a highly damped plasmonic behaviour, maximising the light absorption and reducing the scattering. This combination resulted in high photothermal efficiency in the near-infrared region, which could be applied to produce local mild hyperthermia to boost the drug effects and kill cancer cells. This approach, combining photothermal with magnetic manipulation, was demonstrated to be highly effective in xenograft mouse models of breast cancer, requiring drug doses 100-500 times lower than the free drug paclitaxel. A combinatory therapy for chemo-resistant head and neck cancer was also explored, showing promising results.
Alternatively, to enhance even further the therapeutic efficacy, iron nanodomes loaded with docetaxel were incorporated into monocytes (THP1@NDs), as a cellular vehicle capable of: i) crossing cellular barriers, ii) evading the immune system, and iii) being externally controlled by light and magnetic fields. The therapeutic efficacy was demonstrated in a realistic 3D bioprinted cancer model, featuring an endothelial barrier, cancer spheroids, stromal cells and extracellular matrix. It was shown that, in the presence of a magnetic gradient, the THP1@NDs showed much deeper penetration into the bioprinted matrix. Exploiting the synergistic photothermal action, a 50% reduction in viability was achieved compared to the control, preferentially inducing apoptosis, whereas the free drug did not generate any therapeutic effect.
Finally, cellular vehicles based on macrophages with pro-inflammatory phenotype differentiated from monocytes were proposed to modulate the immune response in the tumour microenvironment, as a strategy to eliminate it. Preliminary results indicated both activation and repolarization of primary human macrophages by both the nanodomes and nanodomes loaded with the drug imiquimod, an immune response modulator.
In conclusion, this thesis has enabled the development of novel drug-loaded optomagnetic nanodomes for the development of new therapies combining light, magnetic fields, and cellular vehicles, with promising nanomedicine potential.Universitat Autònoma de Barcelona. Programa de Doctorat en Ciència de Material
3D biohybrid hydrogels as artificial extracellular matrix for CAR T cell and organoid culture
No full textAquesta tesi descriu el desenvolupament de nous hidrogels biohíbrids formats per poli(òxid d’etilè) – heparina com a matrius extracel·lulars artificials per a aplicacions en immunoteràpia i models de càncer. En particular, explora la millora de la producció ex vivo de productes de cèl·lules CAR T per a la immunoteràpia del càncer i en l’establiment de models d’organoides (tumoroides) tant de càncers hematològics com sòlids. Amb aquests objectius, hem optimitzat no només les propietats mecàniques i estructurals dels hidrògels biohíbrids, sinó també les propietats bioquímiques mitjançant l’addició de biomolècules rellevants a través de diferents estratègies químiques. A més, es va avaluar la introducció d’un mecanisme de gelificació dinàmic en els hidrogels mitjançant enllaços supramoleculars reversibles.
Més concretament, el capítol 2 mostra la preparació i caracterització dels hidrògels biohíbrids desenvolupats i utilitzats en aquesta tesi. Es descriu la síntesi de l’heparina funcionalitzada amb maleimida (Hep) i la seva gelificació amb poli(òxid d’etilè) de 4 braços (PEG) per formar els hidrògels estàndard, juntament amb les diferents modificacions realitzades. Es va seguir un enfocament de caracterització multitècnica per a tots els hidrogels descrits.
Al capítol 3, s’estudien i optimitzen les característiques fisicoquímiques de nous hidrogels PEG-Hep amb propietats similars als ganglis limfàtics per a la producció ex vivo de cèl·lules CAR T. Aquest capítol inclou un dels articles publicats recollits en aquesta tesi.
Al capítol 4, es discuteix la importància de les biomolècules, concretament citocines i molècules d’adhesió, en la modulació de funcions immunitàries mitjançant el comportament de cèl·lules T humanes primàries. En particular, els hidrogels PEG-Hep es funcionalitzen per interaccions electroestàtiques amb citoquines (CCL21, CCL19) i molècules d’adhesió (ICAM-1) per imitar els ganglis limfàtics, i s’avalua el seu impacte en la proliferació de cèl·lules T. Sorprenentment, es va observar que els ions fosfat presents en els medis biològics juguen un paper clau en la interacció entre la citoquina CCL21 i l’heparina.
Al capítol 5, s’avaluen hidrogels amb enllaços supramoleculars per introduir propietats dinàmiques al sistema i obtenir un hidrogel reversible. L’estratègia escollida per assolir aquest objectiu va ser una reacció amfitrió-lligand consistent en derivats de fenilalanina (Phe) units a l’esquelet de l’hidrogel com a lligands i cucurbit[8]uril (CB8) com a amfitrió supramolecular.
Al capítol 6, es discuteixen els avantatges dels hidrogels biohíbrids, que combinen polímers d’origen sintètic i natural, com a matrius extracel·lulars artificials per al cultiu d’organoides i tumoroides. Aquest capítol inclou el segon dels articles publicats recollits en aquesta tesi.
Finalment, al capítol 7, s’avaluen hidrogels biohíbrids per al cultiu de models organoides de càncer hematològic i sòlid. Concretament, s'han estudiat models de càncer colorectal i limfoma fol·licular derivats de pacients utilitzant hidrogels PEG-Hep.
L’últim capítol està dedicat a les conclusions i perspectives futures de la tesi. Addicionalment, s’hi inclou la meva trajectòria científica per explicar les activitats complementàries realitzades durant la tesi, com l’assistència a congressos o la supervisió d’estudiants de màster.
En resum, el treball d’aquesta tesi doctoral contribueix al desenvolupament de biomaterials avançats formats per hidrogels biohíbrids per a aplicacions oncològiques. En particular, s’han explorat hidrogels que imiten el teixit per a dues aplicacions complementàries en camps prometedors i en creixement com són la immunoteràpia i els models de càncer basats en organoides.Esta tesis describe el desarrollo de nuevos hidrogeles biohíbridos compuestos por polietilenglicol (PEG) – heparina como matrices extracelulares artificiales para aplicaciones en inmunoterapia y como modelos de cáncer. En particular, nos centramos en mejorar la producción ex vivo de productos de células CAR T para inmunoterapia contra el cáncer, y en el establecimiento de modelos de organoides tumorales (tumoroides) tanto hematológicos como sólidos. Con estos objetivos, se dirigieron esfuerzos a optimizar no solo las propiedades mecánicas y estructurales de los hidrogeles biohíbridos, sino también las bioquímicas, mediante la incorporación de biomoléculas relevantes a través de diferentes estrategias químicas. Además, se evaluó la introducción de un control dinámico en los hidrogeles mediante enlaces supramoleculares reversibles.
Más concretamente, el capítulo 2 muestra la preparación y caracterización de los hidrogeles biohíbridos desarrollados y utilizados en esta tesis. Se presenta la síntesis de heparina funcionalizada con maleimida (Hep) y su gelificación con polietilenglicol de 4 brazos (PEG) para formar los hidrogeles estándar, junto con las distintas modificaciones realizadas. Se utilizó un enfoque de caracterización multitécnica para todos los hidrogeles descritos.
En el capítulo 3, se estudian y optimizan las características fisicoquímicas de nuevos hidrogeles PEG-Hep con propiedades que imitan los ganglios linfáticos para la producción ex vivo de productos de células CAR T. Este capítulo incluye uno de los artículos publicados recopilados en esta tesis.
En el capítulo 4, se discute la importancia de las biomoléculas, concretamente citoquinas y moléculas de adhesión, en la modulación de funciones inmunitarias mediante el comportamiento de células T humanas primarias. En particular, los hidrogeles PEG-Hep se funcionalizan mediante interacciones electrostáticas con citoquinas (CCL21, CCL19) y moléculas de adhesión (ICAM-1) para imitar los ganglios linfáticos, y se evalúa su impacto en la proliferación de células T. Sorprendentemente, se observó que los iones fosfato presentes en los medios biológicos juegan un papel clave en la interacción entre la citoquina CCL21 y la heparina.
En el capítulo 5, se evalúan hidrogeles con enlaces supramoleculares para introducir propiedades dinámicas en el sistema y obtener un hidrogel reversible. La estrategia elegida para ello fue una reacción anfitrión-ligando compuesta por derivados de fenilalanina (Phe) unidos a la matriz del hidrogel como ligandos y cucurbit[8]urilo (CB8) como anfitrión supramolecular.
En el capítulo 6, se discuten las ventajas de los hidrogeles biohíbridos, que combinan polímeros de origen sintético y natural, como matrices extracelulares artificiales para el cultivo de organoides y tumoroides. Este capítulo incluye el segundo de los artículos publicados recopilados en esta tesis.
Finalmente, en el capítulo 7, se evalúan hidrogeles biohíbridos para el cultivo de modelos organoides de cáncer tanto hematológico como sólido. En concreto, se valoran modelos de cáncer colorrectal y linfoma folicular derivados de pacientes utilizando hidrogeles PEG-Hep.
El último capítulo está dedicado a las conclusiones y a las perspectivas futuras de esta tesis. Además, se incluye mi trayectoria científica para explicar las actividades complementarias realizadas durante la tesis, como la asistencia a congresos o la supervisión de estudiantes de máster.
En resumen, el trabajo de esta tesis doctoral contribuye al desarrollo de biomateriales avanzados compuestos por hidrogeles biohíbridos para aplicaciones oncológicas. En particular, se han explorado hidrogeles que imitan tejidos para dos aplicaciones complementarias en campos prometedores y en expansión como la inmunoterapia y los modelos de cáncer basados en organoides.This thesis describes the development of novel biohybrid hydrogels consisting of poly(ethylene glycol) – heparin as artificial extracellular matrices for applications in immunotherapy and cancer modelling. In particular, we focused on improving the ex vivo manufacture of CAR T cell products for cancer immunotherapy, and the establishment of both hematological and solid cancer organoid (tumoroid) models. With these objectives, efforts were directed to optimizing not only the mechanical and structural properties of the biohybrid hydrogels, but also the biochemical ones by the addition of relevant biomolecules through different chemical strategies. Moreover, we also assessed the introduction of a dynamic control into the hydrogels by a supramolecular reversible crosslinking.
More specifically, chapter 2 shows the preparation and characterization of the biohybrid hydrogels developed and used in this thesis. The synthesis of maleimide functionalized heparin (Hep) and its crosslinking with 4-arm thiolate polyethylene glycol (PEG) to form the standard hydrogels is shown, together with the different modifications performed. A multi-technique characterization approach was followed for all described hydrogels.
In chapter 3, the physicochemical characteristics of novel PEG-Hep hydrogels with lymph-node mimicking features are studied and optimized for the ex vivo manufacturing of CAR T cell products. This chapter includes one of the compiled published articles of this thesis.
In chapter 4, the importance of biomolecules, namely cytokines and adhesion molecules, in the modulation of immune functions through primary human T cell behavior is discussed. In particular, PEG-Hep hydrogels are functionalized by electrostatic interactions with cytokines (CCL21, CCL19) and adhesion molecules (ICAM-1) to mimic the lymph nodes, and their impact on T cell proliferation is assessed. Surprisingly, phosphate ions present in biological buffers and cell media were seen to play a key role in the interaction between the cytokine CCL21 and heparin.
In chapter 5, hydrogels comprising supramolecular crosslinks were assessed to introduce dynamic properties into the system and be able to obtain a reversible hydrogel. The strategy chosen to achieve this goal was a host-guest reaction consisting of phenylalanine derivatives (Phe) linked to the hydrogel backbone as guest molecules and cucurbit[8]uril (CB8) as a supramolecular host.
In chapter 6, the advantages of biohybrid hydrogels, comprising both synthetic and natural origin polymers, as artificial extracellular matrices for organoid and tumoroid culture are discussed. This chapter includes the second of the compiled published articles of this thesis.
Finally, in chapter 7, biohybrid hydrogels are assessed for the culture of both hematological and solid cancer organoid models. Specifically, colorectal and follicular lymphoma cancer models consisting of patient-derived cancer organoids are evaluated using PEG-Hep hydrogels.
The last chapter is dedicated to the conclusions and future perspectives for this thesis. Additionally, my scientific trajectory is included to explain complementary activities performed during this thesis such as conference attendance or master student supervision.
In summary, the work of this PhD thesis contributes to the development of advanced biomaterials consisting of biohybrid hydrogels for oncological applications. In particular, tissue mimicking hydrogels were explored for two complementary applications in promising and growing fields such as immunotherapy and organoid cancer models.Universitat Autònoma de Barcelona. Programa de Doctorat en Ciència de Material
Impact of culture media composition and folate availability on nucleotide metabolism in human cells: Insights into Lesch-Nyhan Disease
No full textEls nucleòtids són el principal repositori d'informació genètica (ADN i ARN), però també són molècules essencials per a funcions estructurals, energètiques i de senyalització cel·lular. Tant les purines com les pirimidines són necessàries per a la supervivència i proliferació cel·lular. Hi ha dues vies de síntesi de purines en cèl·lules eucariotes: la via de novo, que requereix una gran quantitat d’energia, i la via de reutilització, que és menys costosa energèticament i està regulada per les enzims HPRT i APRT. L’àcid fòlic (AF) és un cofactor essencial per a la síntesi de novo de purines. Tanmateix, els medis de cultiu comercials tradicionalment contenen nivells elevats i no fisiològics d’AF (2200 nM o més), cosa que no reflecteix amb precisió la situació in vivo. Curiosament, el medi de cultiu RPMI amb concentracions fisiològiques d’AF (25 nM) produeix una acumulació de ZMP, un nucleòtid intermediari en la via de biosíntesi de novo de purines, en diverses línies cel·lulars. La major expressió del transportador SLC19A1 en una línia cel·lular es correlaciona amb la l’acumulació de ZMP a nivells fisiològics d’AF, o amb el contingut total de purines a nivells alts d’AF, indicant una major dependència de la via de síntesis de novo de purines.
També hem investigat com el cultiu de línies cel·lulars humanes en un nou medi formulat per simular els nivells fisiològics de nutrients (Plasmax-PV) afecta la síntesi de nucleòtids i la mort cel·lular induïda per metotrexat (MTX). En Plasmax-PV, la majoria de les línies cel·lulars no van mostrar alteracions en els nucleòtids; en canvi, les cèl·lules Jurkat van presentar acumulació de ZMP i dUMP, suggerint una alteració en la síntesi de purines i pirimidienes. Cal ressaltar que la deficiència en HPRT confereix una major sensibilitat al tractament amb MTX. La suplementació de Plasmax-PV amb alts nivells d’AF reverteix aquestes alteracions. És destacable que una dosi molt baixa de MTX indueix apoptosi en cèl·lules Jurkat cultivades amb Plasmax-PV de manera més marcada que quan es cultiven amb RPMI estàndard. Suplements de timidina prevenen totalment l’apoptosi induïda per MTX, confirmant una alteració en la síntesi de pirimidines en els limfòcits humans.
La via de síntesi de novo de purines implica una sèrie d’enzims que s’agrupen en un complex multienzimàtic anomenat purinosoma. L’estudi d’aquesta estructura en cèl·lules tumorals i derivades de pacients va revelar que la formació del purinosoma es correlaciona amb una dependència més gran de la síntesi de novo de purines, ja sigui deguda a la deficiència d’enzims de reutilització (com HPRT) o a la disponibilitat limitada de purines al medi.
Les alteracions a les vies de síntesi de nucleòtids estan implicades en malalties metabòliques com la malaltia de Lesch-Nyhan (LND), un trastorn neurològic rar causat per la deficiència de l’enzim HPRT, implicat en la via de reutilització de les purines. Fibroblasts derivats de pacients amb LND van presentar acumulació de ZMP i nivells elevats d’expressió del transportador SLC19A1, canvis només observables quan les cèl·lules es van cultivar en Plasmax-PV.
En resum, els nostres resultats destaquen l’impacte de la composició dels medis de cultiu en estudis in vitro. Mitjançant l’ús de medis fisiològics hem descobert alteracions de nucleòtids en cèl·lules humanes, que estan emmascarades per les formulacions convencionals, i que podria millorar la rellevància translacional dels models experimentals. Per exemple, poden ajudar a optimitzar la dosi de MTX per al tractament de la leucèmia o de l’artritis reumatoide, o en la comprensió de la fisiopatologia de la malaltia de Lesch-Nyhan.Los nucleótidos son el principal repositorio de la información genética (ADN y ARN), pero también son moléculas esenciales para funciones estructurales, energéticas y de señalización celular. Tanto las purinas como las pirimidinas son necesarias para la supervivencia y proliferación celular. Hay dos vías de síntesis de purinas en células eucariotas: la vía de novo, que requiere una gran cantidad de energía, y la de reutilización, que es menos costosa energéticamente y está regulada por las enzimas HPRT y APRT. El ácido fólico (AF) es un cofactor esencial para la síntesis de novo de purinas. Sin embargo, los medios de cultivo comerciales tradicionalmente contienen niveles elevados y no fisiológicos de AF (2200 nM o más), lo cual no refleja con precisión la situación in vivo. Curiosamente, el medio de cultivo RPMI con concentraciones fisiológicas de AF (25 nM) produce una acumulación de ZMP, un nucleótido intermediario en la vía de biosíntesis de novo de purinas, en varias líneas celulares. La mayor expresión del transportador SLC19A1 en una línea celular se correlaciona con la acumulación de ZMP a niveles fisiológicos de AF, o con el contenido total de purinas a niveles altos de AF, indicando una mayor dependencia de la vía de síntesis de novo de purinas.
También hemos investigado cómo el cultivo de líneas celulares humanas en un nuevo medio formulado para simular los niveles fisiológicos de nutrientes (Plasmax-PV) afecta a la síntesis de nucleótidos y la muerte celular inducida por metotrexato (MTX). En Plasmax-PV, la mayoría de las líneas celulares no mostraron alteraciones en los nucleótidos, en cambio, las células Jurkat presentaron acumulación de ZMP y dUMP, sugiriendo una alteración en la síntesis de purinas y pirimidinas. Cabe resaltar que la deficiencia en HPRT confiere una mayor sensibilidad al tratamiento con MTX. La suplementación de Plasmax-PV con altos niveles de AF revierte estas alteraciones. Es destacable que una dosis muy baja de MTX induce apoptosis en las células Jurkat cultivadas con Plasmax-PV de forma más marcada que cuando son cultivadas con RPMI estándar. Suplementos de timidina previenen totalmente la apoptosis inducida por MTX, confirmando una alteración en la síntesis de pirimidinas en los linfocitos humanos.
La vía de síntesis de novo de purinas implica a una serie de enzimas, que se agrupan en un complejo multienzimático llamado purinosoma. El estudio de esta estructura en células tumorales y derivadas de pacientes reveló que la formación del purinosoma se correlaciona con una mayor dependencia en la síntesis de novo de purinas, ya sea debido a la deficiencia de enzimas de reutilización (como HPRT) o a la disponibilidad limitada de purinas en el medio.
Las alteraciones en las vías de síntesis de nucleótidos están implicadas en enfermedades metabólicas como la enfermedad de Lesch-Nyhan (LND), un desorden neurológico raro causado por la deficiencia de la enzima HPRT, implicada en la vía de reutilización de las purinas. Fibroblastos derivados de pacientes con LND presentaron acumulación de ZMP y elevados niveles de expresión del transportador SLC19A1, cambios solo observables cuando las células se cultivaron en Plasmax-PV.
En resumen, nuestros resultados destacan el impacto de la composición de los medios de cultivo en estudios in vitro. Mediante el uso de medios fisiológicos hemos descubierto alteraciones de nucleótidos en células humanas, que están enmascaradas por las formulaciones convencionales, que podrían mejorar la relevancia traslacional de los modelos experimentales. Por ejemplo, pueden ayudar en la optimización de la dosis de MTX para el tratamiento de la leucemia o la artritis reumatoide, o en la comprensión de la fisiopatología de la enfermedad de Lesch-Nyhan.Nucleotides are the primary repositories of genetic information (DNA and RNA), but they are also essential molecules for structural, energetic and cell signaling processes. Both purines and pyrimidines are needed for cell survival and proliferation. There are two different pathways for the synthesis of purines in eukaryotic cells: the de novo pathway, whose energy demand is high, and the salvage pathway, energetically cheaper and regulated by the HPRT and APRT enzymes. Folic acid (FA) is an essential cofactor for the de novo purine synthesis. However, commercial cell culture media traditionally contain non-physiological high levels of FA (2200 nM or more), which do not accurately reflect the in vivo situation. Interestingly, RPMI culture medium containing physiological concentration of FA (25 nM) produces differential accumulation of ZMP, an intermediate nucleotide in the de novo purine biosynthetic pathway, in several human cell lines. Expression of the folate carrier SLC19A1 in a cell line is correlated with ZMP accumulation at physiological levels of FA, or with total purine nucleotide content at high levels of FA.
We also investigated how culturing human cell lines in a new medium formulated to mimic physiological levels of all nutrients (Plasmax-PV) affects nucleotide synthesis and cell death induced by methotrexate (MTX). In Plasmax-PV, most of the cell lines do not show any nucleotide alteration, but Jurkat cells show accumulation of ZMP and dUMP, suggesting a disruption of both purine and pyrimidine biosynthetic pathways. It is noteworthy that HPRT-deficiency confers an increased sensitivity to MTX treatment. Indeed, supplementing Plasmax-PV with high levels of FA reverse these alterations. Importantly, a low dose of MTX induces apoptosis of Jurkat cells cultured in Plasmax-PV in a more remarkable way than in standard RPMI medium. Thymidine supplementation completely blocked MTX-induced apoptosis, confirming an impairment of pyrimidine biosynthesis in human lymphocytes.
The de novo purine synthesis involves a set of enzymes that assemble into a multienzyme complex known as purinosome. Studies of this structure in tumor and patient-derived cells revealed that purinosome formation correlates with increased reliance on the de novo pathway, either due to salvage pathway deficiency (HPRT loss) or limited availability of extracellular purines.
Alterations in nucleotide synthesis pathways are implicated in metabolic diseases such as Lesch-Nyhan disease (LND), a rare neurological disorder caused by the deficiency of HPRT, an enzyme involved in the purine salvage pathway. Fibroblasts derived from LND patients exhibited increased accumulation of ZMP and higher expression of the folate transporter SLC19A1. Notably, these changes were only detected in cells cultured in Plamax-PV.
In summary, our findings highlight the critical impact of the culture medium composition on in vitro studies. By using physiological media, we revealed nucleotide alterations in human cells, masked by conventional formulations, that may improve the translational relevance of experimental models. For instance, they can help in MTX-dose optimization for the treatment of leukemia and rheumatoid arthritis as well as understanding the physiopathology of Lesch-Nyhan disease.Universitat Autònoma de Barcelona. Programa de Doctorat en Bioquímica, Biologia Molecular i Biomedicin
Prehabilitación en pacientes en lista de espera de trasplante renal: abordaje diagnóstico y terapéutico
No full textLa malaltia renal crònica avançada constitueix un important problema de salut global, i el trasplantament renal és el tractament d’elecció per millorar la supervivència i la qualitat de vida. Tanmateix, els pacients en llista d’espera solen presentar intolerància a l’exercici, limitació funcional i comorbiditats com fragilitat, malnutrició i sarcopènia, que afecten negativament els resultats posttrasplantament. En aquest context, és essencial identificar estratègies diagnòstiques i terapèutiques que optimitzin la preparació prequirúrgica. Aquesta tesi, en el marc de la cohort FRAILMar, inclou tres estudis que analitzen biomarcadors d’estat nutricional i qualitat muscular, així com un programa de prehabilitació.
El primer estudi va avaluar l’angle de fase, obtingut per bioimpedància, com a marcador de malnutrició, utilitzant els criteris GLIM com a referència. La prevalença de malnutrició va ser del 34,9%. L’angle de fase mitjà va ser 5,0° (DE 0,9) i un llindar ≤4,85° es va associar significativament amb malnutrició (AUC=0,712; sensibilitat 72,7%; especificitat 65,9%). En l’anàlisi multivariant, un angle baix es va vincular amb més risc de malnutrició (OR=3,8; p=0,042). Aquests resultats donen suport al seu ús com a biomarcador pràctic en l’avaluació nutricional.
El segon estudi va analitzar l’ecogenicitat del recte femoral mitjançant ecografia i la seva relació amb la força del quàdriceps avaluada amb dinamometria. L’ecogenicitat mitjana va ser 86,2 (DE 24,8), amb alta fiabilitat (ICC=0,989). Un punt de tall >70 es va associar amb debilitat muscular (AUC=0,671; p=0,003; sensibilitat 83%; especificitat 57%). Es van observar correlacions amb composició corporal i hidratació, i en l’anàlisi ajustada els valors >70 es van associar a un major risc de debilitat (OR=3,4; p=0,006). Aquest estudi demostra la utilitat de l’ecografia muscular com a complement diagnòstic.
El tercer estudi va ser un assaig clínic aleatoritzat que va comparar prehabilitació amb atenció estàndard. La intervenció va consistir en entrenament aeròbic i de força supervisat durant vuit setmanes, assessorament psicològic i suplementació proteica. El programa va millorar la capacitat d’exercici (ΔWmax=12,8 W; p<0,001), el gruix muscular (Δ1,2 mm; p=0,01), la força de prensió (Δ1,8 kg; p<0,001) i la pressió inspiratòria màxima (Δ17,9 cmH₂O; p<0,001). Als sis mesos, els beneficis es mantenien sense efectes adversos greus.
En conclusió, aquesta tesi aporta evidència sobre el valor de l’angle de fase i l’ecogenicitat com a biomarcadors de malnutrició i debilitat, i demostra que la prehabilitació basada en exercici és segura i eficaç per millorar la capacitat funcional i la fragilitat. Aquests resultats subratllen la importància d’un abordatge integral i multidimensional en la preparació al trasplantament i la necessitat de nous estudis que en confirmin l’impacte en els resultats clínics.La enfermedad renal crónica avanzada constituye un importante problema de salud global y el trasplante renal es el tratamiento de elección para mejorar supervivencia y calidad de vida. Sin embargo, los pacientes en lista de espera suelen presentar intolerancia al ejercicio, limitación funcional y comorbilidades como fragilidad, malnutrición y sarcopenia, que afectan negativamente a los resultados postrasplante. En este contexto, es esencial identificar estrategias diagnósticas y terapéuticas que optimicen la preparación prequirúrgica. Esta tesis, en el marco de la cohorte FRAILMar, incluye tres estudios que analizan biomarcadores de estado nutricional y calidad muscular, así como un programa de prehabilitación.
El primer estudio evaluó el ángulo de fase, obtenido por bioimpedancia, como marcador de malnutrición, tomando como referencia los criterios GLIM. La prevalencia de malnutrición fue del 34,9%. El ángulo de fase medio fue 5,0° (DE 0,9) y un umbral ≤4,85° se asoció significativamente con malnutrición (AUC=0,712; sensibilidad 72,7%; especificidad 65,9%). En el análisis multivariado, un ángulo bajo se vinculó a mayor riesgo de malnutrición (OR=3,8; p=0,042). Estos resultados apoyan su uso como biomarcador práctico en la evaluación nutricional.
El segundo estudio analizó la ecogenicidad del recto femoral mediante ecografía y su relación con la fuerza del cuádriceps evaluado por dinamometría. La ecogenicidad media fue 86,2 (DE 24,8), con elevada fiabilidad (ICC=0,989). Un punto de corte >70 se asoció con debilidad muscular (AUC=0,671; p=0,003; sensibilidad 83%; especificidad 57%). Se observaron correlaciones con composición corporal e hidratación, y en el análisis ajustado los valores >70 se asociaron a mayor riesgo de debilidad (OR=3,4; p=0,006). Este estudio demuestra la utilidad de la ecografía muscular como complemento diagnóstico.
El tercer estudio fue un ensayo clínico aleatorizado que comparó prehabilitación con atención estándar. La intervención consistió en entrenamiento aeróbico y de fuerza supervisado durante ocho semanas, consejo psicológico y suplementación proteica. El programa mejoró la capacidad de ejercicio (ΔWmax=12,8 W; p<0,001), el grosor muscular (Δ1,2 mm; p=0,01), la fuerza de prensión (Δ1,8 kg; p<0,001) y la presión inspiratoria máxima (Δ17,9 cmH₂O; p<0,001). A los seis meses, los beneficios se mantuvieron sin efectos adversos graves.
En conclusión, esta tesis aporta evidencia sobre el valor del ángulo de fase y la ecogenicidad como biomarcadores de malnutrición y debilidad, y demuestra que la prehabilitación basada en ejercicio es segura y eficaz para mejorar capacidad funcional y fragilidad. Estos hallazgos subrayan la importancia de un abordaje integral y multidimensional en la preparación al trasplante y la necesidad de estudios adicionales que confirmen su impacto en los resultados clínicos.Advanced chronic kidney disease represents a major global health problem, and kidney transplantation is the treatment of choice to improve survival and quality of life. However, patients on the waiting list often present with exercise intolerance, functional limitations, and comorbidities such as frailty, malnutrition, and sarcopenia, which negatively affect post-transplant outcomes. In this context, it is essential to identify diagnostic and therapeutic strategies that optimize pre-surgical preparation. This thesis, conducted within the FRAILMar cohort, includes three studies analyzing biomarkers of nutritional status and muscle quality, as well as a prehabilitation program.
The first study evaluated phase angle, obtained by bioelectrical impedance, as a marker of malnutrition, using GLIM criteria as reference. Malnutrition prevalence was 34.9%. Mean phase angle was 5.0° (SD 0.9), and a cutoff ≤4.85° was significantly associated with malnutrition (AUC=0.712; sensitivity 72.7%; specificity 65.9%). In multivariate analysis, low phase angle was linked to higher risk of malnutrition (OR=3.8; p=0,042). These findings support its use as a practical biomarker in nutritional assessment.
The second study analyzed rectus femoris echogenicity by ultrasound and its relationship with quadriceps strength measured by dynamometry. Mean echogenicity was 86.2 (SD 24.8), with high reliability (ICC=0.989). A cutoff >70 was associated with muscle weakness (AUC=0.671; p=0.003; sensitivity 83%; specificity 57%). Correlations were observed with body composition and hydration, and in adjusted analysis values >70 were associated with increased risk of weakness (OR=3.4; p=0.006). This study demonstrates the usefulness of muscle ultrasound as a diagnostic complement.
The third study was a randomized clinical trial comparing prehabilitation with standard care. The intervention included supervised aerobic and resistance training for eight weeks, psychological counseling, and protein supplementation. The program improved exercise capacity (ΔWmax=12.8 W; p<0.001), muscle thickness (Δ1.2 mm; p=0.01), handgrip strength (Δ1.8 kg; p<0.001), and maximal inspiratory pressure (Δ17.9 cmH₂O; p<0.001). At six months, benefits were sustained without serious adverse events.
In conclusion, this thesis provides evidence on the value of phase angle and echogenicity as biomarkers of malnutrition and weakness, and demonstrates that exercise-based prehabilitation is safe and effective in improving functional capacity and frailty. These findings emphasize the importance of a comprehensive, multidimensional approach to transplant preparation and the need for further studies to confirm its impact on clinical outcomes.Universitat Autònoma de Barcelona. Programa de Doctorat en Medicin
Dying in the Relaissance. End-of-life practices in a Caring Democracy
No full textQuan l’Ètica de la Cura es troba amb el final de la vida, tant la cura com la mort tornen al centre de la nostra organització política. L’objectiu d’aquesta tesi doctoral és doble: 1) emmarcar les cures al final de la vida dins l’Ètica de la Cura per analitzar si aquesta aproximació pot aportar-nos una nova visió sobre les pràctiques de mort; 2) imaginar com una democràcia de la cura en acció encararia la mort i el procés de morir.
Començo amb una cartografia de l’Ètica de la Cura feminista i els seus orígens. Exploro què fa que les seves propostes siguin ‘feministes’ i com es van crear estratègies basades en la cura per construir una ètica feminista, que va desembocar en el gir polític liderat per Joan C. Tronto. Contextualitzo la definició de cura de Fisher i Tronto i em centro en la dimensió ètica de la proposta de Tronto, així com en els valors morals essencials per a la seva teoria. Després, defineixo la cura com una idea política i m’endinso en la política de la cura. Descric les cinc fases de la cura descrites per Tronto que permeten assolir el doble objectiu de democratitzar la cura i cuidar la democràcia. L’Ètica de la Cura no és només una teoria ètica o política; és una nova cosmovisió que inclou l’ètica, la política, l’epistemologia i l’ontologia i gira al voltant de la noció del sentit de la vida.
A continuació, presento una modesta panoràmica de la història cultural de la mort a Europa, que incorpora una reflexió sobre com s’han negociat les imatges de la mort al llarg del temps i l’espai. Analitzo l’aproximació majoritària a la mort durant el segle XX i les seves conseqüències. Tot seguit, descric la filosofia pal·liativa com una alternativa que acaba absorbida pel model mèdic hegemònic. Després d’introduir el concepte de final de vida, exposo les incerteses morals i epistèmiques que sorgeixen de la necessitat mèdica de delimitar el període previ a la mort, fet que, al seu torn, afecta el tipus de cures ofertes i al bé o dany resultant d’aquesta presa de decisions. Posteriorment, defenso que l'aproximació mèdica a la mort, el procés de morir i el final de vida és massa limitat i que cal tornar a resocialitzar-los de la manera més justa, lliure i solidària.
Per assolir aquest objectiu, explico en quin sentit l’Ètica de la Cura pot ser l’alternativa que ens cal, tot analitzant dos temes: d’una banda, els canvis en els patrons demogràfics i la necessitat de retornar la mort a la comunitat a través de la salut pública; de l’altra, la negociació de noves formes acceptables de morir, com l’avançament voluntari de la mort. A la llum dels determinants socials de la mort i les desigualtats de gènere existents, justifico de quines maneres l’ètica de la cura pot servir-nos de brúixola per redreçar-los. A més, defenso que l’eutanàsia i el suïcidi assistit poden ser considerats pràctiques relacionals de cura. Descric la multidireccionalitat de les xarxes de cura que es generen en aquestes pràctiques a través de l’estudi de cas de la llei espanyola 3/2021. A continuació, defenso que l’autonomia i la llibertat han de ser enteses de manera relacional i destaco la importància de saber qui defineix el patiment insuportable. Finalment, proposo un model expressiu-col·laboratiu de mortalitat, que inclou una redefinició de la cura, en el context d’una democràcia de la cura per projectar com podríem cuidar col·lectivament de la mort i el final de la vida a la Relaissance.Cuando las Éticas del Cuidado se cruzan con el final de la vida, tanto el cuidado como la muerte vuelven al centro de nuestra organización política. El objetivo de esta tesis doctoral es doble: 1) enmarcar el cuidado al final de la vida dentro las Éticas del Cuidado para analizar si dicha aproximación puede aportarnos una nueva visión sobre las prácticas relacionadas con la muerte; 2) imaginar cómo una democracia del cuidado en acción atendería la muerte y el proceso de morir.
Empiezo con una cartografía de las Éticas del Cuidado feministas y sus orígenes. Exploro porqqué sus propuestas son ‘feministas’ y cómo se crearon estrategias basadas en el cuidado para construir una ética feminista, lo cual desembocó en el giro político capitaneado por Joan C. Tronto. Contextualizo la definición de cuidado de Fisher y Tronto y me centro en la dimensión ética de la propuesta de Tronto, así como en los valores morales esenciales en su teoría. A continuación, defino el cuidado como una idea política y abordo las políticas del cuidado. Allí, describo las cinco fases del cuidado descritas por Tronto que permiten lograr el doble objetivo de democratizar el cuidado y cuidar de la democracia. Las Éticas del Cuidado no son solo una teoría ética o política; son una nueva cosmovisión que incluye ética, política, epistemología y ontología, y que gira alrededore del concepto del sentido de la vida.
Tras ello, presento una modesta panorámica de la historia cultural de la muerte en Europa, que incorpora una reflexión sobre cómo se han negociado las imágenes de la muerte a lo largo del tiempo y el espacio. Analizo la aproximación mayoritaria a la muerte durante el siglo XX y las consecuencias que de ella derivan. Describo la filosofía paliativa como una alternativa que queda absorbida por el modelo médico hegemónico. Tras introducir el concepto de final de vida, expongo las incertidumbres epistémicas y morales surgidas de la necesidad médica de delimitar el periodo previo a la muerte lo que, a su vez, afecta al tipo de cuidado ofrecido y al bien o al daño resultante de la toma de decisiones. Posteriormente, defiendo que la aproximación médica a la muerte, el proceso de morir y el final de la vida es demasiado limitado y que debemos resocializarlos de la forma más justa, libre y solidaria.
Para lograr dicho objetivo, explico en qué sentido las Éticas del Cuidado pueden ser la alternativa adecuada mediante dos temas: por un lado, los cambios en los patrones demográficos y la necesidad de devolver la muerte a la comunidad desde la salud pública; por el otro, la negociación de nuevas formas aceptables de morir, como avanzar voluntariamente la muerte. A la luz de los determinantes sociales de la muerte y las desigualdades de género existentes, justifico de qué modo las Éticas del Cuidado pueden ser una brújula para abordarlos. Además, defiendo que la eutanasia y el suicidio asistido pueden entenderse como prácticas relacionales de cuidado. Describo la multidireccionalidad de la redes de cuidado que se generan en dichas prácticas mediante el estudio de caso de la ley española 3/2021. A continuación, defiendo que la autonomía y la libertad deben entenderse de forma relacional así como la importancia de quién define el sufrimiento insoportable. Finalente, propongo un modelo expresivo-colaborativo de mortalidad, que incluye una redefinición del cuidado, en el contexto de una democracia del cuidado para proyectar cómo podríamos cuidar colectivamente de la muerte y el final de la vida en la Relaissance.When Care Ethics meets the end of life, both care and death are brought back from the margins of our political imagination and organization. The aim of this doctoral dissertation is twofold: 1) to frame current end-of-life care under a Care Ethics lens to see whether this approach could bring light to death and dying practices; and 2) to imagine how a caring democracy in action would conceive of death and dying.
I begin with a cartography of feminist Care Ethics, including its different attributed origins. I explore what makes their proposals ‘feminist’ and how care-based strategies were developed to build a feminist ethics, which resulted in the political turn in Care Ethics led by Joan C. Tronto. I contextualize Fisher and Tronto’s definition of care and, then, focus on the ethical dimension of Tronto’s Care Ethics and the moral values that she considers essential for this framework. I continue by framing care as a political idea and consider the politics of care. I describe the four phases of care depicted by Tronto that will help achieving a double objective of democratizing care and caring for democracy. Care Ethics is not just an ethical or a political theory but a whole new worldview that entails ethics, politics, epistemology and ontology and revolves around a central yet seldom-mentioned notion of meaning in life.
Afterwards, I present a modest overview of the cultural history of death and dying in Europe, which includes a reflection on how images of death have been negotiated throughout time and space. I look at the mainstream approach to death in the 20th century and the consequences of this view. I explore the medical paradigm and the birth of bioethics in the second half of the twentieth century. Next, I describe palliative philosophy as an alternative framework that ends up mostly absorbed into the mainstream medical model. After introducing the concept of end of life, I discuss the inherent epistemic and moral uncertainties arising from the medical need for classification driving efforts to delimit the period before dying that is considered to be end of life, which in turn affects what kind of care is provided and when, as well as the good or harm that may come from those decisions. Next, I zoom out again to portray the medical approach to death, dying an end-of-life care as too narrow a path. I defend the need to resocialize death, dying and end-of-life care in a fair, free and solidaristic manner.
To this aim, I explain why Care Ethics can be the alternative we are looking for. I focus on two main topics: on the one hand, changes in demographic patterns and the need to bring death back to the community through public health; and on the other, the negotiation of new acceptable ways of dying, such as voluntarily hastening death. In light of the identified, existing social determinants of dying and gender inequalities, I justify the ways in which Care Ethics can serve as a compass for us in the face of unfair caring distribution. Then, I defend that euthanasia and assisted suicide can be considered relational practices of care. I dive deep into an empirical case study of Spanish Law 3/2021 to depict the multidirectionality of caring networks within these practices. After that, I consider how autonomy and freedom must be understood relationally and how defining ‘unbearable suffering’ plays a key role. Finally, I propose an expressive-collaborative model of mortality, which includes a redefinition of care, within the context of a caring democracy to envision how death and dying could be collectively cared for in the Relaissance.Universitat Autònoma de Barcelona. Programa de Doctorat en Filosofi
Paper-based electronic sensors towards sustainable point-of-care diagnostics
No full textLa digitalització, impulsada per la ràpida evolució de les tecnologies electròniques, ha transformat profundament les societats actuals. Tot i això, també ha contribuït a una problemàtica global: el creixement anual de la quantitat generada de residus de dispositius elèctrics i electrònics (e-waste). L’e-waste és un tipus de residu complex, comportant riscs per a la salut i el medi ambient i la pèrdua de materials valuosos quan es manipula inadequadament. En l’àmbit mèdic en particular, cada dia es llencen proves electròniques de diagnòstic en el punt d’atenció (PoC), contribuint a la generació d’e-waste. La implementació de l’economia circular en el disseny i fabricació de dispositius electrònics ajudaria a atenuar aquest problema. Entre les possibles vies de fi de vida circulars que pot tenir un producte, la biodegradació converteix la matèria orgànica en molècules simples, les quals poden transformar-se de nou en molècules complexes mitjançant processos de biosíntesi. En aquest context, aquesta tesi presenta el desenvolupament de sensors d’un sol ús, impresos i autoalimentats que estarien pensats per a proves de diagnòstic PoC utilitzant materials biodegradables. Tenint la sostenibilitat en ment, es van prioritzar tecnologies d’impressió per a la fabricació de dispositius, ja que presenten un menor consum d’energia, generació de residus i cost en comparació amb les tècniques convencionals de microfabricació. Primer, les diferències entre tres tècniques d’impressió (impressió per injecció de tinta, serigrafia i direct ink writing (DIW)) van ser avaluades utilitzant tintes conductores comercials. Tenint en compte la decisió d’utilitzar substrats de paper per al desenvolupament de dispositius sensors per la seva biodegradabilitat, fou rellevant comprendre bé la influència d’aquests substrats sobre les capes impreses. A continuació, es van desenvolupar tintes aquoses binàries i ternàries per a DIW combinant materials conductors i nanofibres de cel·lulosa per a la seva utilització en la fabricació de l’elèctrode de treball d’un sensor amperomètric. Els compòsits desenvolupats van ser caracteritzats elèctricament i electroquímicament i aquell que presentava un millor balanç entre rendiment i biodegradabilitat potencial va ser seleccionat. El compòsit escollit va ser imprès sobre paper i utilitzat en la detecció amperomètrica de glucosa. Paral·lelament, el biopolímer ι-carragenina fou utilitzat en el desenvolupament de múltiples dispositius electroquímics d’emmagatzematge d’energia (EESDs) sostenibles. Aquest biopolímer s’utilitzà en la fabricació de membranes d’electròlit sòlid (utilitzant un solvent eutèctic profund biobasat com a conductor iònic) per a EESDs i en la formulació de tintes conductores aquoses. La llista d’EESDs fabricats inclou supercondensadors sostenibles, bateries serigrafiades sobre paper i bateries sense substrat. Finalment, es van desenvolupar sensors de glucosa autoalimentats combinant els materials usats en els EESDs i els sensors amperomètrics. Aquests sensors estaven basats en bio-cel·les de combustible que utilitzaven l’oxidació de la glucosa per generar energia, de tal manera que l’operació de les cel·les de combustible depenia de la concentració de glucosa. Les cel·les de combustible foren serigrafiades sobre paper i s’evità l’ús d’elements conductors metàl·lics i polímers no biodegradables en la seva fabricació. La resposta d’aquests dispositius en connectar-hi una resistència es va estudiar per demostrar-ne la compatibilitat amb un circuit electrònic minimalista per a la transducció de senyal. En resum, aquesta tesi demostra que dispositius electrònics PoC i EESDs alternatius, amb un impacte mediambiental baix i un final de vida transitori són possibles.La digitalización, impulsada por la rápida evolución de las tecnologías electrónicas, ha transformado profundamente las sociedades actuales. Sin embargo, también contribuye a una problemática global: el crecimiento anual de la cantidad generada de residuos de dispositivos eléctricos y electrónicos (e-waste). El e-waste es un tipo de residuo complejo, conllevando riesgos para la salud y el medioambiente y la pérdida de materiales valiosos cuando se maneja inadecuadamente. En el ámbito médico en particular, pruebas electrónicas de diagnóstico en el punto de atención (PoC) se desechan cada día, contribuyendo a la generación de e-waste. La implementación de la economía circular en el diseño y fabricación de dispositivos electrónicos ayudaría a atenuar este problema. Entre las posibles vías de fin de vida circulares que puede tener un producto, la biodegradación convierte la materia orgánica en moléculas simples, las cuales pueden transformarse de nuevo en moléculas complejas mediante procesos de biosíntesis. En este contexto, esta tesis presenta el desarrollo de sensores desechables, impresos y autoalimentados que estarían pensados para pruebas de diagnóstico PoC utilizando materiales biodegradables. Con la sostenibilidad en mente, se priorizaron tecnologías de impresión en la fabricación de dispositivos, ya que presentan un menor consumo de energía, generación de residuos y coste comparado con técnicas convencionales de microfabricación. Primero, las diferencias entre tres técnicas de impresión (impresión por inyección de tinta, serigrafía y direct ink writing (DIW)) fueron evaluadas utilizando tintas conductoras comerciales. Debido a la decisión de utilizar sustratos de papel para el desarrollo de dispositivos sensores por su biodegradabilidad, fue relevante comprender bien la influencia de estos sobre las capas impresas. A continuación, se desarrollaron tintas acuosas binarias y ternarias para DIW combinando materiales conductores y nanofibras de celulosa para su utilización en la fabricación del electrodo de trabajo de un sensor amperométrico. Los diferentes compósitos desarrollados fueron caracterizados eléctrica y electroquímicamente y aquel con un mejor balance entre desempeño y biodegradabilidad potencial fue seleccionado. El compósito escogido fue impreso sobre papel y utilizado en la detección amperométrica de glucosa. Paralelamente, el biopolímero ι-carragenano fue utilizado en el desarrollo de múltiples dispositivos electroquímicos de almacenaje de energía (EESDs) sostenibles. Este biopolímero se utilizó en la fabricación de membranas de electrolito sólido (usando un solvente eutéctico profundo biobasado como conductor iónico) para EESDs y en la formulación de tintas conductoras acuosas. El listado de EESDs fabricados incluye supercondensadores sostenibles, baterías serigrafiadas sobre papel y baterías sin sustrato. Finalmente, se combinaron los materiales usados en los EESDs y sensores amperométricos para el desarrollo de sensores de glucosa autoalimentados. Estos sensores estaban basados en bio-celdas de combustible que utilizaban la oxidación de la glucosa para generar energía de tal modo que la operación de las celdas de combustible dependía de la concentración de glucosa. Las celdas de combustible estaban serigrafiadas sobre papel y se evitó el uso de elementos conductores metálicos y polímeros no biodegradables en su fabricación. La respuesta de estos dispositivos al conectar una resistencia se estudió para demostrar su compatibilidad con un circuito electrónico minimalista para la transducción de señal. En resumen, esta tesis demuestra que dispositivos electrónicos PoC i EESDs alternativos, con un impacto medioambiental bajo y un final de vida transitorio son posibles.Digitalization, driven by rapid progress in electronic technologies, has profoundly transformed current societies. Nevertheless, it has also derived in a global concern: the annual increase in the amount of waste from electrical and electronic devices (e-waste) generated. Due to the complexity of e-waste, it poses health and environmental risks when improperly managed, apart from leading to the loss of valuable materials. Particularly, in the medical field, electronic point-of-care (PoC) diagnostic tests are discarded every day, contributing to the generation of e-waste. The implementation of circular economy in the design and fabrication of electronic devices would help mitigate this issue. Among the different possible circular end-of-life routes, biodegradation allows organic matter to be converted into simple molecules, which can be converted back into organic molecules through biosynthesis processes. This thesis presents the development of printed disposable self-powered sensors for PoC diagnosis based on biodegradable materials. With a focus on sustainability, printing technologies were selected for device fabrication due to their low energy consumption, waste generation, and cost compared to conventional microfabrication. First, the differences between three printing technologies (inkjet printing, screen printing, and direct ink writing (DIW)) were evaluated utilizing commercial conductive inks. The influence of different paper substrates on the properties of printed films was also studied. Owing to their biodegradability, paper substrates were chosen as materials for the development of sensing devices, so it was relevant to understand how they may affect printed patterns. Secondly, aqueous binary and ternary inks for DIW were formulated combining different conductive fillers and cellulose nanofibers (CNF) for their utilization as a working electrode of an amperometric sensor. Electrical and electrochemical characterization was performed with the developed composites and the ones offering the best balance between performance and biodegradability potential were selected. Amperometric detection of glucose was demonstrated utilizing the selected composite printed on paper substrates. Parallelly, several sustainable electrochemical energy storage devices (EESDs) based on the biopolymer ι-carrageenan were developed. This biopolymer was utilized in the fabrication of solid electrolyte membranes, containing a bio-based deep eutectic solvent as ionic conductor, for EESDs and in the formulation of aqueous electrically conductive inks. The list of EESDs fabricated include sustainable supercapacitors, batteries screen-printed on paper substrates, and self-standing casted batteries. Finally, the materials utilized in the development of EESDs and amperometric sensors were combined for the development of self-powered glucose sensors. These sensors were based on biofuel cells that utilized the oxidation of glucose to generate power, so the performance of fuel cells was dependent on glucose concentration. The developed fuel cells, screen-printed on paper substrates, were fabricated avoiding the use of metallic conductive elements and non-biodegradable polymers. The response of the fuel cells when connected to a resistor was studied and the results were used to demonstrate their compatibility with a minimalistic electronic circuit for signal transduction. All in all, this thesis demonstrates that alternative electronic PoC devices and EESDs with a low environmental impact and a transient end-of-life are possible.Universitat Autònoma de Barcelona. Programa de Doctorat en Ciència de Material
De la francofobia a la francofilia: la trayectoria militar, política y diplomática de Manuel de Sentmenat (1651-1703)
No full textManuel de Sentmenat i Lanuza fou un destacat servidor de la Monarquia Hispànica, amb una dilatada i distingida trajectòria militar, política i diplomàtica. Durant bona part de la seva vida combaté els francesos, demostrant una gran capacitat de servei i lleialtat, qualitats que li permeteren ascendir en el cursus honorum, accedir a la noblesa titulada i esdevenir el primer marquès de Castelldosrius. Tanmateix, el rumb de la seva carrera canvià completament quan fou nomenat ambaixador ordinari de la Monarquia Hispànica. Després de la mort de Carles II, fou l’encarregat de trametre el testament del monarca a Lluís XIV i es convertí en el primer vassall hispànic a reconèixer Felip V i a jurar fidelitat a la nova dinastia. A partir d’aquell moment, la seva anterior francofòbia desaparegué, i esdevingué una figura emblemàtica del canvi dinàstic i un servidor clau de les Dues Corones. El diplomàtic català esdevingué protegit de Lluís XIV, fou distingit amb la Grandea d’Espanya malgrat el seu modest patrimoni, i fou nomenat virrei del Perú, càrrec des del qual havia d’afavorir els interessos comercials francesos al Nou Món.Manuel de Sentmenat y Lanuza fue un destacado servidor de la monarquía hispánica súbdito hispánico con una dilatada y distinguida trayectoria militar, política y diplomática. Durante buena parte de su vida combatió a los franceses, demostrando una gran capacidad de servicio y lealtad, que le permitieron escalar en el cursus honorum, accediendo a la nobleza titulada y convertirse en el I marqués de Castelldosrius. Sin embargo, el rumbo de su trayectoria cambió por completo cuando fue nombrado embajador ordinario de la monarquía hispánica. Tras la muerte de Carlos II, fue el encargado de remitir el testamento de Carlos II a Luis XIV y se convirtió en el primer vasallo español en reconocer a Felipe V y jurar lealtad a la nueva dinastía. Desde ese momento, su anterior francofobia desapareció, convirtiéndose en una figura emblemática del cambió dinástico y en un servidor clave de las Dos Coronas. El diplomático catalán se convirtió en un protegido de Luis XIV, siendo distinguido con la Grandeza de España, a pesar de su modesto patrimonio, y fue nombrado virrey del Perú, desde donde habría de favorecer los intereses comerciales galos en el Nuevo Mundo.Manuel de Sentmenat y Lanuza was a prominent servant of the Spanish Monarchy with a long and distinguished military, political, and diplomatic career. For the biggest part of his life, he fought against the French, demonstrating remarkable dedication and loyalty—qualities that enabled him to rise through the cursus honorum, attain titled nobility, and become the first Marquis of Castelldosrius. However, the course of his career changed completely when he was appointed ordinary ambassador of the Spanish Monarchy. Following the death of Charles II, he was tasked with delivering the monarch’s will to Louis XIV and became the first Spanish subject to recognize Philip V and swear allegiance to the new dynasty. From that moment on, his previous Francophobia vanished, and he became an emblematic figure of the dynastic change and a key servant of the Two Crowns. The Catalan diplomat became a protégé of Louis XIV, was granted the rank of Grandee of Spain despite his modest personal wealth, and was appointed Viceroy of Peru, a position from which he was expected to advance French commercial interests in the New World.Universitat Pompeu Fabra. Doctorat en Històri
NREM Alterations Accompany Dysregulation of Synaptic Proteome Dynamics in Syngap1 Heterozygous Mice
No full textLes alteracions del son són una característica molt comuna dels trastorns causats per mutacions en el gen SYNGAP1, encara que els mecanismes moleculars subjacents encara es desconeixen. En els últims anys, diversos estudis han demostrat una gran influència del son sobre el proteoma i fosfoproteoma sinàptics. Per aquest motiu, en aquest treball hem investigat com els estats de son/vigília i el ritme circadiari afecten el proteoma sinàptic en ratolins heterozigots per a Syngap1 (HET).
Mitjançant anàlisis per immunoblot de preparacions enriquides en sinapsis corticals hem identificat una sèrie de canvis en el proteoma sinàptic, especialment en cinases i fosfatases implicades en la senyalització per calci, mediats tant pel son-vigília com pel ritme circadiari en ratolins WT. Aquests ratolins també presenten una reducció en proteïnes estructurals de la post-sinapsi i de receptors NMDA després d'una privació aguda de son. Contràriament, aquestes dinàmiques estan alterades en els ratolins HET, especialment en resposta a la privació de son, observant-se només una conservació parcial dels canvis mediats pel ritme circadiari. Aquesta desregulació probablement es deu a mecanismes post-transcripcionals, ja que els ratolins HET presenten una expressió conservada dels gens del rellotge circadiari i d'un grup de gens l'expressió dels quals esta controlada per l'activitat neuronal.
D'altra banda, l’anàlisi del son mitjançant EEG mostra que la seva arquitectura global i la seva regulació circadiària està preservada en ratolins HET. No obstant, sí que hem trobat diferències subtils a en la microestructura del son, caracteritzades per episodis de son NREM més estables a causa d'una reducció en els microdespertars. A més, aquests ratolins presenten un augment del poder en les freqüències en el rang delta i una disminució del poder en les freqüències sigma durant el son NREM. L'augment de delta es deu a una major incidència, amplitud i durada de les ones lentes. Malgrat això, la seva regulació temporal deguda a la necessitat de dormir es troba preservada. D'altra banda, la reducció del poder sigma es deu a una marcada disminució en la densitat, durada i coherència dels fusos del son, acompanyada per una afectació en l'agrupació temporal d'aquests esdeveniments. En conjunt, les nostres dades assenyalen al son NREM com l'estat més afectat en els ratolins HET.
Finalment, hem estudiat mitjançant espectrometria de masses els canvis diaris en el proteoma sinàptic. Mentre que el 10% d'aquest presenta una regulació rítmica en WTs, aproximadament la meitat d'aquests canvis es perden en HETs. A més, aquests animals presenten un conjunt de proteïnes cícliques que no es troben en els WTs, la qual cosa indica una reorganització patològica més que no pas una simple pèrdua dels ritmes moleculars normals. Cal destacar que la majoria de les proteïnes rítmiques conservades tenen el seu pic durant la fase de foscor, mentre que la majoria de les oscil·lacions perdudes o guanyades piquen durant la fase de llum, coincidint amb els períodes de major densitat de vigília i son NREM respectivament.
En conjunt, aquestes troballes demostren que la deficiència de Syngap1 altera la interacció normal entre el son i l'homeòstasi del proteoma sinàptic, probablement a causa de les alteracions en la microestructura i oscil·lacions tàlem-corticals característiques del son NREM. Donat el paper crític de la funció sinàptica i el son en la consolidació de la memòria, aquestes alteracions podrien estar contribuint als dèficits cognitius i conductuals associats als trastorns causats per mutacions en SYNGAP1. Els nostres resultats suggereixen que estratègies terapèutiques orientades a restaurar les oscil·lacions característiques del son NREM podrien ser beneficioses per a mitigar les conseqüències de la deficiència de SYNGAP1.Las alteraciones del sueño son una característica muy común de los trastornos causados por mutaciones en el gen SYNGAP1, aunque los mecanismos moleculares subyacentes aún se desconocen. En los últimos años, varios estudios han demostrado una gran influencia del sueño sobre el proteoma y fosfoproteoma sináptico. Por este motivo, en este trabajo hemos investigado como los estados de sueño/vigilia y el ritmo circadiano afectan al proteoma sináptico en ratones heterocigotos para Syngap1 (HET).
Mediante análisis por inmunoblot de preparaciones enriquecidas en sinapsis corticales, hemos identificado una serie de cambios en el proteoma sináptico, especialmente en quinasas y fosfatasas implicadas en la señalización por calcio, mediados tanto por el sueño-vigilia como por el ritmo circadiano en ratones WT. Estos ratones también presentan una reducción en proteínas estructurales de la post-sinapsis y de receptores NMDA tras una privación aguda de sueño. En contraste, estas dinámicas están alteradas en los ratones HET, especialmente en respuesta a la privación de sueño, observándose solo una conservación parcial de los cambios mediados por el ritmo circadiano. Esta desregulación probablemente se debe a mecanismos post-transcripcionales, ya que los ratones HET presenta una expresión génica conservada de los genes del reloj circadiano y de un grupo de genes cuya expresión esta controlada por la actividad neuronal.
Por otro lado, nuestro análisis del sueño mediante EEG muestra que la arquitectura global del sueño y su regulación circadiana en ratones HET está preservada. Sin embargo, sí que hemos encontrado diferencias sutiles a en la microestructura del sueño, caracterizadas por episodios de sueño NREM más estables debido a una reducción en los microdespertares. Además, estos ratones presentan un aumento del poder en las frecuencias en el rango delta y una disminución del poder en las frecuencias sigma durante el sueño NREM. El aumento de delta se debe a una mayor incidencia, amplitud y duración de las ondas lentas. A pesar de esto, su regulación temporal debida a la necesidad de dormir se encuentra preservada. Por otro lado, la reducción del poder sigma se debe a una marcada disminución en la densidad, duración y coherencia de los husos del sueño, acompañada por una afectación en la agrupación temporal de estos eventos. En conjunto, nuestros datos señalan al sueño NREM como el estado más afectado en los ratones HET.
Por último, hemos estudiado mediante espectrometría de masas los cambios diarios en el proteoma sináptico. Mientras que el 10% de este presenta una regulación rítmica en WTs, aproximadamente la mitad de estos cambios se pierden en HETs. Además, estos animales presentan un conjunto de proteínas cíclicas que no está presente en los WTs, lo que indica una reorganización patológica más que una simple pérdida de los ritmos moleculares normales. Cabe destacar que la mayoría de las proteínas rítmicas conservadas tienen su pico durante la fase de oscuridad, mientras que la mayoría de las oscilaciones perdidas o ganadas pican durante la fase de luz, coincidiendo con los periodos de mayor densidad de vigilia y sueño NREM respectivamente.
En conjunto, estos hallazgos demuestran que la deficiencia de Syngap1 altera la interacción normal entre el sueño y la homeostasis del proteoma sináptico, probablemente debido a las alteraciones en la microestructura y oscilaciones tálamo-corticales características del sueño NREM. Dado el papel crítico de la función sináptica y el sueño en la consolidación de la memoria, estas alteraciones podrían estar contribuyendo en algunos de los déficits cognitivos y conductuales asociados a los trastornos causados por mutaciones en SYNGAP1. Nuestros resultados sugieren que estrategias terapéuticas orientadas a restaurar las oscilaciones características del sueño NREM podrían ser beneficiosas para mitigar las consecuencias de la deficiencia de SYNGAP1.Sleep disturbances are a prominent feature of SYNGAP1-related disorders, yet the molecular mechanisms underlying them remain unclear. In recent years, a few studies have shown the extensive impact of sleep on the synaptic proteome and phosphoproteome. Here, we investigated the regulation of the synaptic proteome across sleep-wake states and circadian rhythms in Syngap1 heterozygous (HET) mice.
Using immunoblot analysis of purified cortical synapses, we found that wild-type (WT) mice exhibit robust state- and circadian-dependent modulation of key synaptic proteins, particularly kinases and phosphatases involved in calcium signalling, along with a downregulation of core scaffolding PSD proteins and NMDA receptors after acute sleep deprivation. In contrast, these dynamics are lost in HET mice, especially in response to sleep deprivation, with only a partial preservation of circadian influences. This dysregulation likely stems from post-transcriptional mechanisms rather than upstream transcriptional defects since transcriptomic profiling demonstrated that rhythmic expression of core clock genes and activity-dependent genes remained intact in the HETs.
EEG analyses revealed that global sleep architecture was preserved in HET mice, with similar total sleep time and maintained circadian regulation of sleep-wake patterns. However, subtle differences emerged at the level of sleep microarchitecture, characterized by more stable NREM bouts due to a reduction in microarousals. Additionally, HET mice showed increased delta and decreased sigma power during NREM sleep. The delta increase resulted from elevated incidence, amplitude, and duration of slow waves, although their regulation by sleep pressure was preserved. The reduction in sigma power was due to a striking decrease in spindle density, duration, and coherence. Moreover, we found impaired clustering at the infraslow timescale of spindles in HETs. Taken together, this data points to NREM sleep as the most affected state in HET mice.
Mass spectrometry analysis revealed extensive remodelling of the synaptic cycling proteome in Syngap1 deficiency. While 10% of the WT synaptic proteome exhibited rhythmic regulation, approximately half of these changes were lost in HET mice. Interestingly, a new set of cyclic proteins was found in HETs, indicating a pathological reorganization rather than a simple loss of these molecular rhythms. Notably, most preserved rhythmic proteins peaked during the dark phase, whereas most lost and gained oscillations occurred during the light phase, coinciding with the periods of highest wakefulness and NREM density, respectively.
Together, these findings demonstrate that Syngap1 heterozygosity disrupts the normal interplay between sleep and synaptic proteome homeostasis. Deficits in NREM sleep microarchitecture and alterations in thalamocortical oscillations likely contribute to synaptic dysregulation. Given the critical roles of synaptic function and sleep in memory consolidation, these disturbances may underlie some of the cognitive and behavioural impairments associated with SYNGAP1-related disorders. Our results suggest that therapeutic strategies aimed at restoring oscillations characteristic of NREM sleep would be beneficial in mitigating the consequences of SYNGAP1 heterozygosity.Universitat Autònoma de Barcelona. Programa de Doctorat en Neurocièncie
Exploring the hidden layer of gene regulation: identity and functions of nuclear RNA molecule in plants
No full textEn les plantes, els petits ARN (sRNA) exerceixen un paper fonamental en la regulació de l'expressió gènica i en el manteniment de la integritat del genoma. No obstant això, les vies de processament i els orígens cel·lulars de molts sRNA endògens continuen sent poc caracteritzats. Aquesta tesi investiga la biogènesi, el processament i la localització compartimental dels transcrits productors de sRNA en Arabidopsis thaliana, amb un enfoc especial en DICER-LIKE 3 (DCL3), l’enzim nuclear principalment responsable de generar sRNA de 24 nucleòtids implicats en la silenciació gènica transcripcional (TGS). Per identificar directament els substrats endògens de DCL3, vaig establir un protocol rigorós de coimmunoprecipitació combinat amb seqüenciació profunda dels sRNA units a una forma catalíticament inactiva de DCL3 (DCL3ci). Aquest enfoc va permetre analitzar i caracteritzar, per primera vegada de manera directa, els substrats de DCL3. Tal com s’esperava, la majoria dels transcrits associats a DCL3 provenen d’elements transposables (TEs) i depenen en gran mesura de l’ARN POLIMERASA IV (Pol IV) i de l’ARN-DEPENDENT ARN POLIMERASA 2 (RDR2). Es van observar patrons d’interacció diferenciats entre les superfamílies de TE, la qual cosa reflecteix diferències en l’origen o l’estructura dels precursors. A més, vam caracteritzar un conjunt divers de substrats no canònics, incloent-hi precursors estructurats com ara loci transcrits per l’ARN polimerasa II, ARN no codificants independents de RDR2 i miARN joves. Aquests precursors generen sRNA funcionals de 24-nt capaços de carregar-se en proteïnes ARGONAUTE (AGO), suggerint la seva participació en la silenciació gènica a través de mecanismes no canònics dependents de DCL3. De manera destacada, MIR168a va emergir com el locus amb més interacció amb DCL3ci. Donat que miR168a regula AGO1, l’efector central de la silenciació gènica post-transcripcional (PTGS), aquesta associació inesperada suggereix una possible interacció entre TGS i PTGS. En paral·lel, vaig establir un enfoc transcriptòmic mitjançant la classificació de nuclis activada per fluorescència (FANS) per enriquir ARN nuclear, permetent un perfilat precís de l’ARN del compartiment nuclear. Aquesta anàlisi va revelar centenars de loci enriquits, incloent-hi ARN nuclears derivats de llocs d’empalmament (splice junctions) i ARN llargs no codificants antisentit (aslncRNA). A més, entre els ARN nuclears enriquits vam recuperar substrats units a DCL3, cosa que indica punts específics de convergència entre la localització dels transcrits i l’accessibilitat a DCL3. Aquest treball aporta avenços conceptuals i tècnics per a la identificació dels substrats endògens de DCL3 i amplia la nostra comprensió de la biogènesi dels sRNA més enllà dels paradigmes canònics de silenciació.En las plantas, los pequeños ARN (sRNA) desempeñan un papel crucial en la regulación de la expresión génica y en el mantenimiento de la integridad del genoma. Sin embargo, las vías de procesamiento y los orígenes celulares de muchos sRNA endógenos siguen estando poco caracterizados. Esta tesis investiga la biogénesis, el procesamiento y la localización compartimental de los transcritos productores de sRNA en Arabidopsis thaliana, centrándose particularmente en DICER-LIKE 3 (DCL3), la enzima nuclear responsable principalmente de generar sRNA de 24 nucleótidos implicados en la silenciación génica transcripcional (TGS). Para identificar directamente los sustratos endógenos de DCL3, establecí un protocolo riguroso de co-inmunoprecipitación acoplado a secuenciación profunda de sRNA unidos a una forma catalíticamente inactiva de DCL3 (DCL3ci). Este enfoque permitió analizar y caracterizar, por primera vez de manera directa, los sustratos de DCL3. Como era de esperar, la mayoría de los transcritos asociados a DCL3 provienen de elementos transponibles (TEs) y dependen en gran medida de la ARN POLIMERASA IV (Pol IV) y de la ARN-DEPENDIENTE ARN POLIMERASA 2 (RDR2). Se observaron patrones de interacción distintos entre superfamilias de TE, lo que refleja diferencias en el origen o la estructura de los precursores. Además, caracterizamos un conjunto diverso de sustratos no canónicos, incluidos precursores estructurados como loci transcritos por la ARN Polimerasa II, ARN no codificantes independientes de RDR2 y miRNA jóvenes. Estos precursores generan sRNA funcionales de 24-nt capaces de cargarse en proteínas ARGONAUTE (AGO), lo que sugiere su participación en la silenciación génica a través de mecanismos no canónicos dependientes de DCL3. De manera notable, MIR168a surgió como el locus con mayor interacción con DCL3ci. Dado que miR168a regula AGO1, el efector central de la silenciación génica post-transcripcional (PTGS), esta asociación inesperada sugiere un posible crosstalk entre TGS y PTGS. En paralelo, desarrollé un enfoque transcriptómico basado en la clasificación de núcleos activada por fluorescencia (FANS) para enriquecer ARN nuclear, lo que permitió un perfilado preciso del ARN procedente del compartimento nuclear. Este análisis reveló cientos de loci enriquecidos, incluidos ARN nucleares derivados de uniones de empalme (splice junctions) y ARN largos no codificantes antisentido (aslncRNA). Asimismo, recuperamos entre los ARN nucleares enriquecidos algunos sustratos asociados a DCL3, lo que indica puntos específicos de convergencia entre la localización de los transcritos y la accesibilidad a DCL3. Este trabajo aporta avances conceptuales y técnicos para la identificación de sustratos endógenos de DCL3 y amplía nuestra comprensión de la biogénesis de sRNA más allá de los paradigmas canónicos de silenciación.In plants, small RNAs (sRNAs) play a critical role in regulating gene expression and maintaining genome integrity. However, the processing routes and cellular origins of many endogenous sRNAs remain poorly characterized. This thesis investigates the biogenesis, processing, and compartmental localization of sRNA-producing transcripts in Arabidopsis thaliana, focusing particularly on the nuclear DICER-LIKE 3 (DCL3), the enzyme primarily responsible for generating 24-nucleotide small RNAs involved in Transcriptional Gene Silencing (TGS). To directly identify endogenous DCL3 substrates, I established a stringent co-immunoprecipitation protocol coupled with deep sequencing of sRNAs bound to a catalytically inactive form of DCL3 (DCL3ci). This approach allowed me to analyze and characterize, for the first time, the DCL3 substrate in a direct manner. As expected, most DCL3-associated transcripts arise from transposable elements (TEs), largely dependent on RNA POLYMERASE IV (Pol IV) and RNA-DEPENDENT RNA POLYMERASE 2 (RDR2). Distinct interaction patterns were observed across TE superfamilies, reflecting differences in precursor origin or structure. In addition, we characterized a diverse set of non-canonical substrates, including structured precursors such as RNA Polymerase II-transcribed loci, RDR2-independent non-coding RNAs, and young miRNAs. These precursors generate functional 24-nt sRNAs capable of ARGONAUTE (AGO) protein loading, suggesting their participation in gene silencing via non-canonical DCL3-dependent mechanisms. Strikingly, MIR168a emerged as the strongest DCL3ci-interacting locus. Given that miR168a regulates AGO1, the central effector of post-transcriptional gene silencing (PTGS), this unexpected association suggests a potential crosstalk between TGS and PTGS. In parallel, I established a transcriptomic approach using fluorescence-activated nuclei sorting (FANS) to enrich nuclear RNA, enabling precise RNA profiling from the nuclear compartment. This analysis uncovered hundreds of enriched loci, including nuclear RNA derived from splicing junctions and antisense long non-coding RNAs (aslncRNAs). We also recovered among nuclear-enriched RNA, DCL3-bound substrates, indicating specific points of convergence between transcript localization and DCL3 accessibility. This work introduces both conceptual and technical advances for the identification of endogenous DCL3 substrates and broadens our understanding of sRNA biogenesis beyond canonical silencing paradigms.Universitat Autònoma de Barcelona. Programa de Doctorat en Biologia i Biotecnologia Vegeta