22455 research outputs found
Sort by
Podoptose- eine bisher unbekannte Ursache für akutes Nierenversagen
Get PDFEs ist bekannt, dass murine-double-minute-2 (MDM2) einen protektiven Effekt auf die Homöostase und somit das Langzeitüberleben von Podozyten hat, indem es vor Podoptose (p53-overactivation-cell-death) schützt. Allerdings ist wenig über die Rolle von MDM2 in Tubulusepithelzellen (TECs) bekannt. Um die Bedeutung von MDM2 in murinen Nieren zu erforschen, habe ich TEC-spezifische Pax8rtTA-Cre;Mdm2flox/flox Mäuse (Mdm2 KO) mit Doxycyclin bis zu 17 Tagen behandelt. Die erfolgreiche TEC-spezifische Mdm2 Deletion und die damit verbundene Überexpression von p53 konnte mittels real-time PCR und immunhistologischer Färbungen bestätigt werden. Der Verlust von MDM2 in TECs führte zu einem akuten Nierenversagen, welches mit einer Erhöhung der mRNA Expressionwerte bekannter Tubulusschädigungmarker, wie KIM-1 und L-Fabp, einer Abnahme der glomerulären Filtrationsrate sowie einer Zunahme der Serumharnstoffmenge assoziiert war. Histologisch konnte man Veränderungen in der Zellpolarität, vermehrt Tubulusdilatation und Auffälligkeiten innerhalb der Lumina der Tubuli feststellen. Die Elektronenmikroskopie zeigte Veränderungen in Form von einer Vakuolenbildung.
Um die Relevanz der Interaktion von MDM2 und des Transkriptionsfaktor p53 in diesem Kontext zu untersuchen, habe ich einen TEC-spezifischen Doppelknockout von MDM2 und p53 (Mdm2/p53 dKO) generiert. Die Deletion von p53 führte zu einer signifikanten Verminderung der Schädigungsmarker KIM-1 und L-Fabp, Tubulusnekrose, Casts, Tubulusdilatation und eine verbesserte Nierenfunktion und Überlebensrate im Vergleich zu Mdm2 KO Mäusen mit vorhandenem p53 Wildtypallel. D.h., dass die Deletion von p53 in Mdm2/p53 dKO Mäusen vor akutem Nierenversagen schützt.
Eine Lectinfärbung der Nierenschnitte von Mdm2 KO Mäusen zeigte, dass überwiegend proximale und nicht distale TECs im Rahmen des akuten Nierenversagens betroffen sind. Um die Zelltodform der proximalen TECs zu identifzieren, habe ich TECs mit verschiedenen Zelltodinhibitoren (Z-VAD, Necrostatin-1, Dabrafenib, Cyclosporin A und Ferrostatin) in vitro kultiviert. Dabei verbesserte sich signifikant die Zellviabilität der TECs bei Einsatz der Inhibitoren von RIPK1, RIPK3 sowie der mitochondrialen Permibilitäts-Transitions-Pore (Necrostatin-1, Dabrafenib und Cyclosporin-A), aber nicht bei dem Apoptoseinhibitor Z-VAD. Allerdings führte die in vivo Behandlung der Mdm2 KO Mäuse mit Z-VAD und Necrostatin-1 nicht zu einer verbesserten Nierenfunktion im Vergleich zu DMSO-behandelten Tieren. Wohingegen Dabrafenib zu einer signifikant verbesserten Nierenfunktion beitrug, obwohl histologisch eine veränderte Zellmorphologie der TECs sowie verstopfte Tubuluslumina zu beobachtet waren. Aufgrund der verbesserten Nierenfunktion der Mdm2 KO Mäuse nach Dabrafenib Behandlung, generierte ich eine Mauslinie mit selektivem Ripk3 Knockout in TECs (Pax8rtTA-Cre;Ripk3 KO), um mehr über die Rolle von RIPK3 während des akuten Nierenversagens herauszufinden. Wie zu erwarten, zeigten Pax8rtTA-Cre;Ripk3 KO Mäuse eine verbesserte Nierenfunktion und weniger Tubulusschaden im Vergleich zu Mdm2 KO Tieren.
Schlussfolgernd kann ich sagen, dass erstens MDM2 für das Überleben und die Homöostase der TECs und somit der Nierenfunktion essentiell ist. Zudem führt die p53 Überexpression zu vermehrter Podoptose, wobei ich davon ausgehe, dass u.a. das Molekül RIPK3 eine wichtige Rolle in der Signaltransduktion spielt. Weiterführende Untersuchungen sind notwendig, um eine Interaktion von RIPK3 und Podoptose zu bestätigen.Murine-double-minute-2 (MDM2) is known for its protective effects in homeostasis and consequently for the survival of podocytes in preventing podoptosis (p53-overactivation-cell-death). However, research on the role of MDM2 in tubular epithelial cells (TECs) is limited. In order to investigate the effects of MDM2 in murine kidneys, I treated TEC-specific Pax8rtTA-Cre;Mdm2flox/flox mice (Mdm2 KO) with doxycycline for up to 17 days. The successful TEC specific loss of MDM2 and consequently the overexpression of p53 has been confirmed by real-time PCR and immunohistological staining. Deficiency of MDM2 in TECs contributed to acute kidney injury and failure, which was associated with an increase in the mRNA expression levels of well-known tubular injury markers such as KIM-1 und L-Fabp, a decline in the glomerular filtration rate (GFR) and an elevation of serum urea. In addition, I observed histological abnormalities including changes in cell polarity, augmented tubular dilatation and transformation within the tubular lumen as well as abnormal vacuoles by electron microscopy.
To further investigate the interaction between MDM2 and the transcriptional factor p53, I generated TEC specific MDM2 and p53 double knockout mice (Mdm2/p53 dKO). Deletion of both MDM2 and p53 prevented mice from tubular injury as indicated by reduced mRNA expression levels of KIM-1 und L-Fabp, less tubular necrosis, casts and tubular dilatation, and ameliorated kidney function as compared with Mdm2 KO mice with an existing p53 wild type allele. Mdm2/p53 dKO mice also had a higher survival rate indicating that the deletion of p53 in Mdm2/p53 dKO mice protects from acute kidney injury and failure.
Lectin staining of kidney sections from Mdm2 KO mice showed that proximal but not distal TECs were predominantly affected. In order to identify the form of cell death in proximal TECs, I cultured TECs in the presence or absence of different cell death inhibitors including Z-VAD, necrostatin-1, dabrafenib, cyclosporin A und ferrostatin in vitro. Treating TECs with necrostatin-1 (RIPK1 inhibitor), dabrafenib (RIPK3 inhibitor) and cyclosporin-A (mitochondrial permeability transition pore inhibitor) significantly improved the viability of TECs, while the apoptosis inhibitor Z-VAD had no effect. However, blocking RIPK1 and apoptosis with necrostatin-1 and Z-VAD, respectively, in vivo did not prevent Mdm2 KO mice from kidney injury as compared with DMSO-treated mice (control). Interestingly, dabrafenib treatment improved kidney function in Mdm2 KO mice, although I observed morphological changes in TECs and clogged tubular lumen. Due to the improved kidney function in these mice after dabrafenib treatment, I generated another mouse line with a selective knockout of RIPK3 in TECs (Pax8rtTA-Cre;Ripk3 KO) to investigate the role of RIPK3 during acute kidney injury and failure. As expected, Pax8rtTA-Cre;Ripk3 KO mice showed reduced tubular injury and an improved kidney function as compared with Mdm2 KO animals.
In conclusion, the data of this thesis indicate that MDM2 is essential for the homeostasis of TECs and therefore for maintaining kidney function. Moreover, overexpression of p53 leads to increased podoptosis in TECs, wherein RIPK3 plays an important role in signal transduction. Further investigations are needed to unravel the interaction between RIPK3 and podoptosis
COPD und körperliche Aktivität – Beurteilung anhand spezifischer Parameter und Korrelation mit klinischen Befunden
Get PDF
Mikrostruktur transkallosaler motorischer Fasern, interhemisphärische Inhibition und handmotorische Funktion bei Kindern mit Periventrikulärer Leukomalazie
Get PDFDetektion von Imaging Biomarkern zur Erstellung eines prädiktiven Radiomics-Profils zur Charakterisierung des Prostatakarzinoms
Get PDFStress-induced martensitic transformations in Co49Ni21Ga30 high-temperature shape memory alloy single crystals
Get PDFThe role of the chromatin remodeling protein HMGN5 in COPD pathogenesis
Get PDFThere is rising evidence that epigenetic alterations are involved in Chronic Obstructive Pulmonary Disease (COPD). Spontaneous emphysema development in high mobility group nucleosome binding domain 5 (HMGN5) deficient mice and enhanced emphysematous changes after elastase treatment in these mice compared to wild-type mice have been previously detected. HMGN5 binds to the nucleosome core particle of chromatin, competing with linker-histone H1. Upon chromatin binding, HMGN5 thus alters chromatin structure affecting cellular transcription, differentiation and DNA-repair. This work seeks to explore the involvement of HMGN5 in the development and progression of emphysema.
Human lung samples from COPD patients and healthy donors were assessed for HMGN5 expression and immunofluorescence staining performed to identify the cellular localization of HMGN5. To assess underlying molecular mechanisms siRNA knock-down of HMGN5 in the human alveolar-type-II (AT II)-like cell line A549 was undertaken. Cells were additionally exposed to cigarette smoke extract (CSE) and assessed for cell death by Annexin V-staining, cell proliferation by woundhealing and WST-1 assay and cell cycle by propidium iodide (PI)-staining and transfection of Fluorescence Ubiquitin Cell Cycle Indicator (FUCCI). Expression of cell death and cell cycle associated genes was measured by qPCR.
RNA sequencing data from COPD patient lung samples revealed reduced HMGN5 expression compared to healthy individuals and immunofluorescent analysis demonstrated that HMGN5 is located in bronchial epithelial cells and AT II cells in the human lung. In addition, in vitro studies demonstrated that siRNA-mediated downregulation of HMGN5 caused A549 cells to be more susceptible to induced cell death. Cell cycle analysis of HMGN5 deficient cells revealed more cells in the early cell cycle stages compared to control cells but additional exposure to CSE did not affect this. Proliferation and migration of HMGN5 deficient cells was slightly impaired.
Taken together, this human data suggests that reduced expression of the epigenetic modulator HMGN5 is associated with emphysema development, via increased apoptosis and impaired cell cycle progression. This novel link between epigenetic regulation and emphysema, brings forth a new therapeutic target for impeding emphysema development in COPD.Es gibt immer mehr Hinweise darauf, dass epigenetische Veränderungen bei COPD eine Rolle spielen. Wir konnten bereits spontane Emphysementwicklung bei „high mobility group nucleosome binding domain 5“ (HMGN5) defizienten Mäusen, sowie verstärkte emphysematöse Veränderungen in diesen Mäusen verglichen mit Wild-Typ Mäusen nach Verabreichung von Elastase feststellen. HMGN5 bindet an das Nukleosom und konkurriert dabei mit dem Linker-Histon H1. Nachdem HMGN5 an Chromatin angedockt ist, verändert es die Chromatinstruktur und beeinflusst die zelluläre Transkription, Differenzierung und DNA-Reparatur. Die vorliegende Arbeit soll die Beteiligung von HMGN5 an der Entwicklung und Progression des Emphysems untersuchen.
Humane Lungenproben von COPD-Patienten und gesunden Spendern wurden auf HMGN5-Expression untersucht. Eine Immunfluoreszenzfärbung wurde durchgeführt, um die zelluläre Lokalisation von HMGN5 in der Lunge zu identifizieren. Um die zugrunde liegenden molekularen Mechanismen zu erforschen, wurde HMGN5 in der humanen Alveolarepithel-Typ-II (AT II)-Zelllinie A549 durch siRNA herunterreguliert. Die Zellen wurden zusätzlich einem Zigarettenrauch-Extrakt (CSE) ausgesetzt und auf Zelltod durch Annexin V-Färbung, Zellproliferation durch Wundheilungs- und WST-1-Assay und Zellzyklus durch Propidiumiodid (PI)-Färbung und Fluoreszenz-Ubiquitin Cell Cycle Indicator (FUCCI) untersucht. Die Expression von Zelltod- und Zellzyklus-assoziierten Genen wurde mithilfe quantitativer Polymerase-Kettenreaktion (qPCR) gemessen.
Die RNA-Sequenzierung der Lungenproben von COPD Patienten zeigte eine verminderte HMGN5-Expression im Vergleich zu gesunden Individuen. Die Immunofluoreszenzfärbung veranschaulichte, dass sich HMGN5 in bronchialen Epithelzellen und AT II-Zellen der menschlichen Lunge befindet. Darüber hinaus zeigten In-vitro-Versuche, dass eine verminderte Expression von HMGN5 in A549-Zellen eine erhöhte Anfälligkeit für induzierten Zelltod zur Folge hat. Die Analyse des Zellzyklus von HMGN5-defizienten Zellen ergab, dass sich verglichen mit den Kontrollzellen mehr Zellen in den frühen Zellzyklusphasen befinden. Die zusätzliche Behandlung mit CSE hatte hier keinen Effekt. Die Proliferation und Migration von HMGN5-defizienten Zellen zeigte sich geringfügig beeinträchtigt.
Zusammenfassend deuten diese Daten darauf hin, dass der epigenetische Modulator HMGN5 durch Beeinflussung der Apoptose und des Zellzykluses mit der Entwicklung des Emphysems assoziiert ist. Dieser Zusammenhang zwischen epigenetischer Regulation und Emphysem zeigt einen neuen therapeutischen Ansatzpunkt zur Verhinderung der Emphysementwicklung bei COPD auf
Vier Jahrgänge Ovarialkarzinom an der LMU München: Auf der Suche nach pathogenetischen Faktoren sowie prognostischen Biomarkern
Get PDFCalibration & optimization procedures for an ultrafast DEPFET based electron detector (EDET)
Get PDFHLL und MPSD entwickeln einen neuartigen Elektronen-Detektor, der mit einer bis-lang unerreichten Bildfrequenz von 80 kHz, schnell ablaufende biologische und chemi-sche Prozesse aufzeichnen wird. Maßgefertigt für die Fokalebene eines Transmissi-onselektronenmikroskops, sollen verschiedenste Proben bei unterschiedlichen Vergrö-ßerungen abgebildet und ihre Dynamik erfasst werden. Aufgrund seiner exzellenten Zeitauflösung eignet sich dieser Detektor hervorragend dazu, Filme von Streuungs- oder Schattenbildern aufzuzeichnen. Die zu beobachtenden, schnellen dynamischen Prozesse laufen in eigens dafür entwickelten Gefäßen, den „environmental cells“ ab. Der Sensor selbst basiert auf der DEPFET Technologie. Jeder Pixel besteht aus einem MOSFET mit eingebauter Verstärkung für das Ladungssignal. Abgesehen von einer hohen Ladungssammlungskapazität zeichnet sich dieser durch eine zweistufige Ver-stärkung aus: ein hoher Verstärkungsfaktor für niedrige Signalamplituden und ein redu-zierter für starke Signale. Auf diese Weise liefert der Detektor eine hohe Auflösung auch für kleine Signale bei gleichzeitiger Erhaltung eines großen dynamischen Berei-ches.
Aufgrund von Prozessvariationen weichen die individuellen Pixel-Antwortsfunktionen mehr oder weniger stark voneinander ab. Für einen Detektor, bestehend aus über 1 Million Pixeln, stellt dies eine große Herausforderung für eine effiziente Pixelkalibrierung dar. Zur Erreichung der bestmöglichen Signalqualität muss auch die hohe Zahl von Bias- und Timing-Parametern für die Ausleseelektronik optimiert werden.
In der vorliegenden Arbeit werden die entwickelten Algorithmen und Prozeduren zur Kalibrierung und Optimierung der Detektoren vorgestellt. Ihre Anwendung auf ein Proto-typ-Testsystem wird beschrieben, wo sie sich als effizient, effektiv und als übertragbar auf ein großes Modul erwiesen.A novel electron detector, with an unprecedented frame rate of 80 kHz envisages the observation of the fast dynamics occurring in chemical and biological processes. As-sembled into the focal plane of a transmission electron microscope (TEM), the detector will record magnified projections of the inserted sample. Due to its outstanding time res-olution, the detector is well suited to record movies (scattering or shadow image se-quences) of fast processes, taking place in a specific developed specimen capsule (liq-uid cell). The sensor itself is based on the DEPFET technology, consisting of a MOSFET structure with built-in internal amplification for the charge signal. It offers an extensive charge storing capacity with a two-tier linear response: high amplification of weak signals in the first stage and a lower gain for strong signals. By this means, the detector conserves high energy resolution at low signal charge in combination with a high dynamic range.
To create a homogeneous flat-field response, calibration of all detector channels is mandatory, as due to process variations the individual pixel response functions vary within a certain range. For a 1 megapixel sensor, this presents a major challenge to the selected calibration technique. Bias- and timing parameters of the readout electronics need to be adjusted and optimized to provide for an optimal signal quality. Furthermore, the readout electronics significantly affects the quality of the recorded data and must be optimized.
In the scope of this thesis, suitable procedures and algorithms were developed using a prototype test system, which have to be applied to the final large sensor modules