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Verbesserung der Nierenfunktion und Reduktion der Cardiac allograft Vaskulopathie (CAV) bei Herztransplantierten durch Everolimus
Get PDFEvaluierung diagnostischer Möglichkeiten des Sensibilisierungsnachweises von Aeroallergenen in der klinischen Routine
Get PDFCharacterization of a permanent magnet quadrupoles focus of laser-accelerated protons
Get PDFViele Anwendungen von laserbeschleunigten Protonen benötigen diese an einem von der Quelle entfernten Ort. Für das Laser-driven ION (LION) Experiment am Centre for Advanced Laser Applications (CALA) werden Permanentmagnet-Quadrupole verwendet, um die Protonen zu sammeln und sie auf eine Anwendungsplattform an Luft zu transportieren. Da Anwendungsexperimente mit höchstmöglicher Teilchenfluenz angestebt werden, zielt der Aufbau darauf ab, so viele Teilchen wie möglich zu sammeln und sie auf eine möglichst kleine Fläche zu fokussieren. Diese Optimierung erfordert zwei Quadrupol-Paare, von denen eines in der Nähe der Quelle positioniert ist, um eine große Anzahl von Protonen zu sammeln, und das zweite den parallelen Strahl neu fokussiert, idealerweise bis zu seiner Emittanzgrenze. Aufgrund der typischerweise großen Energiebreite von laserbeschleunigten Protonen und des energieselektiven Verhaltens der Quadrupole ergeben sich unregelmäßige Fokusformen. Endliche Positionsgenauigkeit und unbekannte Feldfehler der Elemente erschweren die theoretischen Vorhersagen zusätzlich.
Die vorliegende Arbeit stellt die Ergebnisse umfangreicher Experimente vor, die sich insbesondere auf die Optimierung des mit dem ersten Dublett erzeugten Protonenfokus konzentrierten und die Basis für einen späteren Betrieb als Quadruplett darstellen. Auf der Grundlage eines großen Datensatzes war es möglich, den Einfluss konkreter Parameter wie relative Verdrehung, Längs- und Querposition experimentell zu ermitteln und zu verstehen. Dieses Unterfangen stützte sich auf sorgfältige Verfahren zur Vorabcharakterisierung und Vorjustage. Mit einem einzelnen Quadrupoldublett wurde ein leicht elliptischer Fokus mit einer Halbwertsbreite von (0.7 ± 0.3)mm in horizontaler Richtung und (1.4 ± 0.5)mm in vertikaler Richtung für mittlere kinetische Energien zwischen 12MeV und 22MeV erreicht. Simulationswerkzeuge zur Vorhersage der räumlichen und energetischen Verteilung der Protonen in der Fokusebene werden entwickelt und eingesetzt, um die große Anzahl von Parametern mit potentiell entscheidendem Einfluss aufzuschlüsseln. Begleitend zu diesem Prozess wurde ein einfaches analytisches Modell entwickelt, das beschreibt, wie sich die breite Energieverteilung in der räumlichen Verteilung manifestiert. Obwohl es auf einigen starken Näherungen beruht, erweist es sich als effizient und genau für die Beschreibung der experimentell beobachteten Fluenzbreite und -gradienten entlang von 1D-Lineouts. Darüber hinaus wurden Effekte, welche die Qualität des Protonenspots beeinträchtigen, wie z. B. Streuung im Vakuumaustrittsfenster, mit Monte-Carlo-Simulationen quantitativ bewertet. Auf der Grundlage dieses wesentlich verbesserten Modells und eines großen Datensatzes konnte die Größe der virtuellen Protonenquelle für 400nm bis 600nm dünne Folientargets auf (34 ± 18) μm in horizontaler und (11 ± 7) μm in vertikaler Dimension und innerhalb der Unsicherheit von der Teilchenenergie unabhängig bestimmt werden. Dieses Ergebnis steht in starkem Kontrast zu der Energieabhängigkeit, die für die Protonenbeschleunigung von Mikrometer-Targetfolien gemessen wurde.
Zusätzlich zu diesem wissenschaftlichen Ergebnis werden in dieser Arbeit Faktoren des derzeitigen Aufbaus identifiziert, die die Fluenz und die Fokusgröße begrenzen. Sie liefert daher Anhaltspunkte für die weitere Optimierung den Protonentransportaufbau an LION und ermöglicht einen verbesserten täglichen Betrieb als Grundlage für Anwendungsexperimente. Die entwickelte Methodik und das Verständnis ermöglichen nun eine gezielte Optimierung des zweiten Quadrupoldubletts, das bereits vorbereitet, charakterisiert, implementiert und für erste Tests genutzt wurde. Die Ergebnisse zeigen eine räumlich und energetisch getrennte Doppelfokusstruktur, wobei beide Spots eine Größe von ca. 0.5mm haben, was auf die Notwendigkeit einer anschließenden Untersuchung der Quadruplettausrichtung und des Verhaltens hinweist, da kleinere Größen erwartbar sind.Many applications of laser-accelerated protons demand them at a remote location from the source. For the Laser-driven ION (LION) experiment at the Centre for Advanced Laser Applications permanent magnet quadrupoles are used to collect and focus them to an application platform on air. As the setup envisions application experiments with highest possible particle fluence, it aims at collecting as many particles as possible and focus them on the smallest possible area. This optimization requires two quadrupole doublets, one positioned close to the source to collect a large number of protons and the second to refocus the parallel beam, ideally to its emittance limit. Due to the typically broad energy spread in the laser-accelerated proton bunch and the energy selective behavior of the quadrupoles, irregular focus shapes arise. Finite position accuracy and unknown field errors of elements further complicate theoretical predictions.
The work at hand presents the results of extensive experiments that particularly concentrated on optimizing the proton focus produced with the first doublet and represents the base for a later operation as quadruplet. Based on a large data set it was possible to identify and understand the influence of concrete parameters such as relative rotation, longitudinal and transverse position experimentally. This endeavor relied on careful pre-characterization and pre-alignment procedures. With a single quadrupole doublet a slightly elliptical focal spot with a full-width at half maximum of (0.7 ± 0.3)mm in horizontal direction and (1.4 ± 0.5)mm in vertical direction for setup design energies between 12MeV and 22MeV was achieved. Simulation tools for predicting the spatial and energy distribution of the protons in the focal plane were developed and employed to disentangle the large number of parameters with potentially decisive influence. Accompanying this process, a simple analytical model was developed to describe how the broad energy distribution manifests in the spatial distribution. While it does rely on some strong approximations, it proofs efficient and accurate for describing the experimentally observed fluence extents and gradients along 1D lineouts. In addition, effects that impair the proton spot quality such as scattering in the vacuum exit window were quantitatively assessed with Monte-Carlo simulations. On the basis of this substantially improved model and a large data set, the protons virtual source size for 400nm to 600nm thin foil targets could be estimated to be (34 ± 18) μm in horizontal and (11 ± 7) μm in vertical dimension and, within the uncertainty, independent of the particle energy. This result is in strong contrast to the energy dependence measured for proton acceleration from micrometer thick target foils.
In addition to this scientific result, this thesis work identifies factors of the current setup that limit fluence and proton spot size. It therefore provides guidance for further optimizing the proton transport beamline at LION and facilitates improved daily operation as a basis for application experiments. The developed methodology and understanding now enables targeted optimization of the second quadrupole doublet, which has already been prepared, characterized, implemented and used in first tests. The results show a spatially and energetically separated double focus structure with both spots having a size of around 0.5mm indicating the necessity of a subsequent investigation of the quadruplet alignment and behavior, as smaller sizes can be expected
Therapeutic potential of enhancing mitochondrial Calcium uptake in experimental cardiac arrhythmia models
Get PDFCardiovascular diseases (CVDs) constitute the leading cause of death worldwide and will continue to dominate mortality trends in the future. Despite a general decline of CVD-related deaths, mortality rates attributed to arrhythmia are still on the rise. Common antiarrhythmics display perilous side effects and are often not effective pointing out an urgent need for novel therapeutic approaches. Cardiac contractility and rhythmicity are critically linked to a well-balanced Calcium homeostasis in the myocardium and cardiac arrhythmias are often associated with perturbations in cellular Calcium handling. Mitochondria play a substantial, yet barely acknowledged, role in cellular Calcium handling and are associated with CVDs. In previous experiments, the novel dihydropyrrole carboxylic ester efsevin was identified by its ability to restore rhythmic cardiac contractions in a zebrafish cardiac fibrillation model. This was caused by activation of the voltage-dependent anion channel 2 (VDAC2) in the OMM which consecutively increased mitochondrial Calcium uptake causing enhanced clearance of cytosolic Calcium and thus a reduction of arrhythmogenic Calcium waves. Despite these pronounced effects, experiments in mammalian disease models were still lacking. In the current thesis, we investigated the potential of a pharmacological activation of mitochondrial Calcium uptake for the treatment of cardiac arrhythmia. To this aim, we applied efsevin as well as the flavonoid kaempferol, both enhancing Calcium uptake into mitochondria in different mammalian models of catecholaminergic polymorphic ventricular tachycardia (CPVT).Kardiovaskuläre Erkrankungen (KVEs) stellen heute und voraussichtlich auch in der nahen Zukunft weltweit die Haupttodesursache dar. Dabei steigen insbesondere Todesfälle bedingt durch Arrhythmien weiterhin an. Da gängige Antiarrhythmika gravierende Nebenwirkungen aufweisen und häufig nur begrenzt wirksam sind, besteht besondere Dringlichkeit bei der Entwicklung neuartiger Therapieansätze. Kontraktilität und Rhythmizität des Herzens sind eng mit einer funktionalen Calcium-Homöostase des Myokards verknüpft und so sind Arrhythmien oftmals mit Störungen des zellulären Calcium-Haushaltes assoziiert. Mitochondrien spielen hier eine grundlegende, jedoch bislang stark unterschätzte Rolle. Im vorliegenden Promotionsvorhaben wurde das Potential einer pharmakologischen Aktivierung der mitochondrialen Calcium-Aufnahme zur Behandlung von Arrhythmien untersucht. Hierbei fand einerseits die neuartige synthetische Substanz Efsevin Einsatz, ein Dihydropyrrolcarboxylester, welcher die Aktivität des voltage-dependent anion channels 2 (VDAC2) in der äußeren mitochondrialen Membran verstärkt. Andererseits wurde das Flavonoid Kaempferol als Agonist des mitochondrialen Calcium-Uniporters (MCU) untersucht. In früheren Arbeiten konnte Efsevin die rhythmische Kontraktion des Herzens in einem Zebrafisch-Arrhythmiemodell wiederherstellen. Der antiarrhythmische Effekt von Efsevin konnte hier direkt auf eine gesteigerte Aktivierung des mitochondrialen Calcium-Kanals VDAC2 zurückgeführt werden. Hierdurch ergibt sich eine gesteigerte Aufnahme und somit Abpufferung von zytosolischem Calcium in die Mitochondrien. Zusätzlich resultierte die Applikation von Efsevin in einer Reduktion arrhythmogener Calcium-Wellen in Wildtyp-Kardiomyozyten der Maus. Trotz dieser vielversprechenden Befunde existierten bis dato keine Studien zu KVE-Krankheitsmodellen an Säugetieren, was hier durch die Evaluierung der Wirksamkeit von Efsevin in einem Arrhythmie-Modell der Maus sowie zwei humanen Arrhythmie-Modellen adressiert wurde
Immune dysregulation as a consequence of genetic variants within the JAK-STAT signalling pathway
Get PDFResearch in immunology has been a rapidly evolving field in recent years, largely facilitated by the advent of next-generation sequencing techniques. The opportunity to study the entire coding sequence of the genome has resulted in the discovery of more than 400 well-characterized, monogenic inborn errors of immunity. Research on these rare patients, who mostly present early in life to pediatric hospitals, has informed our understanding of human immunity since it allows to study the function of a mutated gene product in the context of human disease.
Whilst the power of the immune system has evolved to fight infection, fine-tuned regulatory mechanisms gained importance. Keeping the balance between tolerance and protection involves close communication between immune cells and their environment. Such interactions are often mediated by soluble factors, i.e. cytokines.
The work presented in this thesis is centered around two important signalling pathways: Interleukin-2 signalling has long been recognized pivotal for T cell immunity. The discovery of homozygous loss-of-function variants in IL2RB underscores its non-redundant role in preventing autoimmunity by promoting regulatory T cell survival and function. Additionally, a terminal differentiation defect of cytotoxic lymphocytes renders affected patients specifically susceptible to Cytomegalo-virus disease. Additional work on patients with loss- and gain-of-functions in the downstream signalling molecule STAT5B expands the phenotypic spectrum and explores potential treatment op-tions using Janus tyrosine kinase inhibitors.
The second pathway under study is type I interferon signalling. Functional validation of a new biallelic IFNAR1 variant abrogating responses to type I interferon was undertaken in an individual presenting with haemophagocytic lymphohistiocytosis following receipt of live-viral vaccine. Lethal autoinflammation was also seen in patients where homozygous STAT2 variants were found to hamper negative feedback regulation and thus causing unrestrained type I interferon activity. Mechanistic studies on the inflammatory consequences of dysregulated type I interferon responses in STAT2- and IRF9-deficient primary cells and induced pluripotent stem cell derived macrophages offer a molecular explanation for the clinically observed inflammation in these individuals.
By dissecting the molecular mechanisms underlying immune dysregulation in these rare patients with monogenic errors of immunity I am hoping to contribute to improved diagnostic rates and to help pave the way for personalized treatment options in these ‘orphan’ diseases
Purinergic signalling in testicular peritubular cells
Get PDFExtracellular ATP and its metabolites, as part of the purinergic signalling system, act via membrane receptors and fulfil important roles in the body. However, in the testis this signalling system is still poorly examined, but evidence for paracrine communication is increasing. Spermatogenesis takes place in the seminiferous tubules, which are surrounded by smooth-muscle like peritubular cells. The physiologic principles of luminal transport through the testis were so far unknown. The present study, now, indicates that extracellular ATP, acting through P2 receptor-dependent pathways, is a physiological trigger of contractile forces in peritubular cells, resulting in sperm transport.
Adenosine is the final metabolite of ATP, can act via adenosine receptors, and was found to be a pro-inflammatory molecule in the human testis. In human testicular peritubular cells (HTPCs), adenosine receptors as well as the ectonucleotidases CD39 and CD73, which can generate adenosine, are present in situ and in vtro. A malachite green assay, measuring free phosphate, identified both ectonucleotidases as being able to dephosphorylate extracellular ATP into its metabolites. Pharmacological inhibition of CD39 reduced not only the formation of extracellular phosphate, but also decreased pro-inflammatory cytokine levels, which were evoked after ATP exposure. Indeed, adenosine and its analogues elevated pro-inflammatory cytokines. Further studies, including a siRNA-mediated knock-down, identified the adenosine receptor A2B as the main mediator for adenosine-evoked production of pro-inflammatry cytokines in peritubular cells.
HTPCs are primary cells and their use is limited due to availability, heterogeneity and replicative senescence in vitro. Therefore, peritubular cells from the common marmoset monkey, callithrix jacchus, (MKTPCs) were immortalized with a piggyBac transposon containing the human telomerase gene hTERT. The generated iMTKPCs retained their phenotype after immortalization and grew continuously in cell culture without discernible changes. The cells revealed the typical gene expression pattern of MKTPCs and HTPCs. Like HTPCs, iMKTPCs express purinergic receptors and ATP exposure resulted in a comparable increase of pro-inflammatory cytokines. They are therefore a promising tool for future in-depth studies concerning purinergic signalling and a translational model for human peritubular cells.
The results indicated that different parts of the testicular purinergic system are involved in the regulation of various testicular functions. One is coordinating contraction of peritubular cells in the context of sperm transport, another one is involved in the regulation of inflammatory events. If transferable to the in vivo situation, pharmacological interference with receptors and ectonucleotidases of this system might represent new approaches in the treatment of male infertility.Die Reaktion von extrazellulärem ATP und zugehörigen Metaboliten ist Teil der purinergen Signalmechanismen und wird über membranständige Rezeptoren vermittelt. Dieses Signalweg-System ist im Hoden noch immer unzureichend untersucht, es gibt aber zunehmend Anzeichen dafür, dass es in die parakrine Kommunikation von Zellen involviert ist. Die Spermatogenese findet in den Hodenkanälchen statt, welche von glattmuskelzellähnlichen peritubulären Zellen umgeben sind. Bisher ist es aber noch weitestgehend unbekannt, wie Spermien durch das Lumen der Hodenkanälchen transportiert werden. Die vorliegende Studie beschreibt Hinweise auf eine Beteiligung von extrazellulärem ATP, vermittelt durch P2-Rezeptor Signalwege, als physiologischer Auslöser von kontraktilen Kräften in peritubulären Zellen, und einem daraus resultierenden Spermientransport.
Adenosin ist der finale Metabolit von ATP, wirkt über Adenosin-Rezeptoren, und es wurde festgestellt, dass es als ein pro-inflammatorisches Molekül im humanen Hoden agiert. In humanen testikulären peritubulären Zellen (HTPC) sind sowohl die Adenosin-Rezeptoren als auch die Ektonukleotidasen CD39 und CD73, welche Adenosin generieren, in situ und in vitro vorhanden. Anhand des Malachite Green Assays, welcher freie Phosphate nachweist, wurde gezeigt, dass beide Ektonukleotidasen dazu fähig sind, extrazelluläres ATP zu ATP-Metaboliten zu dephosphorylieren. Eine pharmakologische Blockierung von CD39 reduzierte nicht nur die Entstehung von extrazellulärem Phosphat, es verringerte auch proinflammatorische Zytokinlevel, welche nach ATP-Stimulation erhöht waren. Tatsächlich erhöhten sich auch durch Adenosin und analoge Moleküle proinflammatorische Zytokinlevel. Weitere Untersuchungen, wie eine Herunterregulierung mithilfe von siRNA, identifizierten den Rezeptor A2B als hauptverantwortlichen Mediator für Adenosin-abhängige pro-inflammatorische Zytokinproduktion in peritubulären Zellen.
HTPCs sind primäre Zellen und in vitro in ihrem Nutzen aufgrund von Verfügbarkeit, Heterogenität und replikativer Seneszenz eingeschränkt. Daher wurden peritubuläre Zellen des Weißbüschelaffen Callithrix jacchus (MKTPC) mit Hilfe des PiggyBac Transposons und einem darin enthaltenen Gen der humanen Telomerase (hTERT), immortalisiert. Diese erzeugten iMKTPCs behielten ihren Phänotypen nach Immortalisierung bei und konnten in der Zellkultur kontinuierlich und ohne erkennbare Veränderungen kultiviert werden. Die Zellen zeigten typische Expressionsmuster wie sie von MKTPCs und HTPCs bekannt sind. Verglichen mit HTPCs exprimieren iMKTPCs purinerge Rezeptoren, und Stimulation mit ATP erzeugte vergleichbare Erhöhungen von pro-inflammatorischen Zytokinleveln. Siestellen daher ein vielversprechendes Mittel für tiefgreifendere Studien am purinergen System dar und sind ein translationales Modell für humane peritubuläre Zellen.
Die Ergebnisse der vorliegenden Arbeiten zeigen, dass unterschiedliche Teile des purinergen Systems im Hoden an verschiedenen Regulationsmechanismen der Hodenfunktion beteiligt sind. Ein Teil koordiniert Kontraktionsmechanismen von peritubulären Zellen im Rahmen des Spermientransports, ein anderer ist involviert in die Regulation von inflammatorischen Vorgängen. Sofern dies auf die in vivo Situation übertragbar ist, könnte eine pharmakologische Beeinflussung von Rezeptoren und Ektonukleotidasen dieses Systems neue Herangehensweisen bei der Behandlung von männlicher Unfruchtbarkeit repräsentieren
Endolysosomal cation channels and toxic chronic lung disease
Get PDFChronic obstructive pulmonary disease (COPD) is a prevalent disease that affects million people worldwide. Classified as the third most common cause of death globally, it accounts for more than 3 million deaths per year. Smoking constitutes the main risk factor for developing COPD, while other factors include inhalation of environmental pollutants such as exhaust fumes from the industry or vehicles, occupational dusts and fumes, or genetic predispositions. Characteristic for COPD is a chronically inflamed lung and permanent pathological changes of the airways and lung tissue. Consequently, this leads to common symptoms like chronic cough, sputum, and shortness of breath, all of which significantly affect the quality of life. Two common forms of COPD can be described: chronic bronchitis associated with mucus hyper-production, and emphysema resulting from destruction of alveolar tissue, e.g. due to an excess of the macrophage elastase MMP-12. However, treatment options are poor, as no drugs are currently available that can slow down COPD progression or reduce the disease mortality. Thus, it is important and necessary to uncover novel treatment strategies and drug tarets.
In this dissertation, the endolysosomal cation channel TRPML3 was investigated in the context of COPD and emphysema development with the aim to evaluate its potential as therapeutic target. Being located on membranes of intracellular organelles such as early endosomes and lysosomes, TRPML3 is involved in membrane fusion and fission events including endocytosis, trafficking, exocytosis, and autophagy. Here, by the use of the following novel reporter mouse line, Trpml3-IRES-Cre/eR26-τGFP, TRPML3 was found to be mainly expressed in alveolar macrophages (AMΦ) in the lungs. Further studies on lung function, and examination of lung tissues revealed that Trpml3 deficient (Trpml3-/-) mice show a pulmonary emphysema phenotype. This was demonstrated under both basal conditions and toxic conditions, meaning the exposure to cigarette smoke to induce COPD, and the application of a porcine pancreatic elastase to induce emphysema in the lungs. Analysis of bronchoalveolar lavage fluid (BAL-F) obtained from Trpml3-/- mice unveiled increased levels of the AMΦ-specific protease MMP-12, whereas other inflammatory cytokines, proteases and antiproteases, i.e. tissue inhibitor of metalloproteinases (TIMPs), were unchanged. Furthermore, loss of TRPML3 in AMΦ did not affect lysosomal exocytosis, but resulted in impairments in endolysosomal trafficking and endocytosis, being causative for the increased levels of MMP-12 also found in AMΦ cell culture supernatants and likely in BAL-F.
Overall, this work discovered a significant role of TRPML3 in COPD and emphysema development. Mice lacking TRPML3 were unveiled to be particularly susceptible for developing pulmonary emphysema, attributed to the reduced capacity of Trpml3-/- AMΦ to balance the MMP-12 concentration in the lungs properly (Figure 1). Functioning as such a key regulator for MMP-12, TRPML3 may be considered as novel therapeutic target structure for the treatment of COPD
