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Characterisation of two essential proteins for host cell egress and invasion identified by phenotypic screening in Toxoplasma gondii
Get PDFThe apicomplexan parasite T. gondii is an obligate intracellular parasite that can infect almost all warm-blooded animals, including humans. Egress from host cells is the prerequisite for its dissemination. However, the exact steps that lead to egress are still poorly understood. During replication, the parasites establish an intravacuolar F-actin network that connects individual parasites and is essential for synchronous replication and material exchange between parasites. During egress, this network rapidly disintegrates before parasite motility and egress are activated, indicating a tight regulation of F-actin disassembly and activation of the motility machinery for egress.
To identify novel factors involved in this regulation, a pooled gRNA library, which targets 320 genes predicted to be fitness-conferring according to a recent genome-wide in vitro screen, was transfected into a parasite line that expresses a regulatable Cas9 (sCas9). We successfully identified genes required for egress during the asexual life cycle. Further characterisation of two of these candidates indicated that they are essential for invasion and egress from host cells and that they act at distinct time points during this process. The signalling linking factor (SLF), an essential component of the guanylate cyclase (GC) signalling complex, is essential for the early induction of egress, acting upstream of Ca2+ signalling. The depletion of SLF led to no changes in F-actin upon induction with BIPPO. Whether SLF acts as a symporter is still uncertain. In contrast, the new conoidal protein named conoid gliding protein (CGP) acts at a later step in egress, downstream of Ca2+ signalling, and is necessary for the activation of gliding motility. Upon egress induction, F-actin networks disassemble but without F-actin accumulation at the basal pole. Furthermore, CGP might form a complex at the preconoidal rings, revealed by proximity-dependent biotin identification (BioID). Within this complex, here named gliding initiation complex (GIC), a novel methyltransferase (PCKMT), an actin nucleator formin1 (FRM1) and CGP are the core components. Dispensable protein 1 (DAP1) and indispensable conserved apicomplexan protein 16 (ICAP16) might serve as accessory proteins.
Collectively, this study revealed that SLF and CGP are crucial for the lytic cycle of parasites, and their role in egress broadens our understanding of the egress mechanism. The discovery of a new preconoidal complex incorporating CGP lays a foundation for future mechanistic research establishing their specific function in motility.T. gondii gehört zum Stamm der Apicomplexa und ist ein obligat intrazellulärer Parasit, der fast alle warmblütigen Tiere einschließlich des Menschen infizieren kann. Der Austritt aus der Wirtszelle ist die Voraussetzung für die Verbreitung dieses Parasiten. Die genauen Faktoren, die zum Austritt aus der Wirtszelle führen, sind jedoch noch kaum bekannt. Während der intrazellulären Replikation baut T. gondii ein intravakuoläres F-Aktin-Netzwerk auf, das die Parasiten in der parasitophoren Vakuole miteinander verbindet und für die synchrone Replikation sowie den Materialaustausch zwischen den einzelnen Parasiten unerlässlich ist. Kurz bevor die Parasiten die Wirtszelle aktiv verlassen, zerfällt dieses Aktin-basierte Netzwerk zwischen den einzelnen Parasiten. Anschließend bewegt sich der Parasit aktiv aus der Zelle, wobei diese Motilität auf der Polymerisation von F-Aktin beruht. Diese streng orchestrierte Regulierung von F-Aktin sowohl in der parasitophoren Vakuole als auch im Parasiten selbst, weist darauf hin, dass Aktin eine zentrale Rolle beim Austritt aus der Wirtszelle spielt.
Um neue Faktoren zu identifizieren, die an dieser Regulation beteiligt sind, wurde eine gRNA-Bibliothek erstellt. Diese zielt auf insgesamt 320 Gene ab, welche laut einem kürzlich durchgeführten genomweiten in vitro-Screen als essentielle Gene indetifiziert wurden.Diese gRNA-Bibliothek wurde in eine spezielle Parasitenlinie transfiziert, die eine regulierbare Cas9 Endonuclease (sCas9) exprimiert. Mit diesem Vorgehen wurden erfolgreich Gene identifiziert, die während des asexuellen Lebenszyklus für den Austritt des Parasiten aus der Wirtszelle wichtig sind. Die genauere Charakterisierung von zwei dieser Kandidaten-Gene zeigte, dass diese für die Invasion und den Austritt aus Wirtszellen wesentlich sind. Zudem zeigte sich, dass sie während dieses Prozesses zu unterschiedlichen Zeitpunkten wirken. Der Signalling Linking Factor (SLF) ist ein wesentlicher Bestandteil der GC-Signalkaskade. Dieser ist für die frühe Induktion des Austritts unerlässlich, da er der Ca2+-Signalübertragung vorgeschaltet ist. Ein Knockout von SLF führte zu keinen Veränderungen von F-Aktin nach Induktion mit BIPPO. Ob SLF als Symporter fungiert, ist noch ungewiss. Im Gegensatz dazu zeigte die Charakterisierung des zweiten Gens, dass dieses zu einem späteren Zeitpunkt des Zellaustritts, nach der Ca2+-Signalgebung wirkt und für die Aktivierung der Motilität des Parasiten notwendig ist. Dieses Conoid-Protein wurde als Conoid-Gliding-Protein (CGP) benannt. Bei Induktion des Austritts wird das F-Aktin-Netzwerk zerlegt, dies geschieht jedoch ohne F-Aktin-Akkumulation am Basalpol der Parasiten. Durch proximitätsabhängige Biotinidentifikation (BioID) zeigte sich, dass CGP wahrscheinlich Bestandteil eines Komplexes an den präkonoidalen Ringen ist. Innerhalb dieses Komplexes, der als Gliding Initiation Complex (GIC) benannt wurde, bildet die neuartige Methyltransferase (PCKMT) zusammen mit dem Aktin-Nukleator FRM1 (Formin1) und CGP die Kernkomponenten des Komplexes, während DAP1 (Dispensable Protein 1) und ICAP16 (Indispensable Conserved Apicomplexan Protein 16) wahrscheinlich als akzessorische Proteine dienen.
Zusammenfassend zeigt diese Studie, dass SLF und CGP für den lytischen Zyklus von T. gondii entscheidende Faktoren sind. Ihre zeitliche Regulation beim Austritt des Parasiten aus der Zelle erweitert unser Verständnis des Austrittsmechanismus per se. Die Entdeckung eines neuen präkonoidalen Komplexes, der CGP enthält, bildet die Grundlage für zukünftige Studien, die dessen spezifische Funktion im Rahmen der Motilität des Parasiten aufdecken
Characterization of novel human centromeric interactors and their role in human centromere transcription
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Erwerbsintegration entgegen der Erwartung
Get PDFDie Verfestigung von Arbeitslosigkeit ist für einen erheblichen Teil der Betroffenen oft mit multiplen Problemlagen verbunden (geringe Qualifikation, Krankheit, Alter über 50, Sprachdefizite, Fürsorgepflichten oder Sucht). Die Chancen, wieder Erwerbstätigkeit aufzunehmen, sinken dadurch beträchtlich. Das SGB II verfolgt jedoch die Arbeitsaufnahme als ein normatives Ziel. So ist das Paradigma des „Förderns und Forderns“ den formalisierten und auf Effektivitätsmaximierung ausgerichteten Prozessen der Arbeitsvermittlung inhärent. Die Fachkräfte der Jobcenter werden an Vermittlungskennzahlen gemessen und die betroffenen Langzeitarbeitslosen an ihren Bemühungen, Arbeit zu suchen, zu finden und aufzunehmen. Es besteht ein großes formales Unterstützungsangebot, um Langzeitarbeitslosigkeit schnellstmöglich durch Erwerbsarbeit zu beenden. Trotzdem ist die Zahl der Langzeitarbeitslosen hoch, und die Vermittlungszahlen sind niedrig. Um diesen Sachverhalt zu untersuchen, wurde eine qualitative Studie mit insgesamt 33 Langzeitarbeitslosen durchgeführt, die trotz vorliegender multipler Hemmnisse einen Übergang in bedarfsdeckende Arbeit erreichten. Wie im Folgenden gezeigt wird, nehmen diese Langzeitarbeitslosen die Handlungsofferten der Arbeitsvermittlung oft nicht als realistisch wahr, da sie oft nicht auf ihre spezifischen Belange eingehen. Übergänge in Arbeit hängen deshalb auch nicht ausschließlich vom Erhalten bzw. Wahrnehmen von Informationen über Jobmöglichkeiten ab, sondern vielmehr vom individuellen Erreichen stabiler Lebensumstände die es erlauben, arbeitsmarktbezogene Informationen als sinnvoll bzw. relevant zu erkennen und dann in entsprechende Handlungen zu überführen. Dabei spielt das individuelle Netzwerk vielfach eine wichtige Rolle, deshalb gilt es die individuellen Akteurskonstellationen langzeitarbeitsloser mit multiplen Hemmnissen daraufhin zu analysieren, wie deren Handlungsfähigkeit soweit erweitert werden kann, dass Informationen über potentielle Arbeitsplätze erkennbar und verarbeitbar werden, welche Rolle die Netzwerkkomposition hierbei spielt und in letzter Konsequenz arbeitsmarktbezogene Aktivitäten möglich werden. Der Schwerpunkt liegt hier auf einem relationalen, diachronen Ansatz, der die individuellen Lebensverläufe berücksichtigt.For a significant proportion of those affected, the consolidation of unemployment is often associated with multiple difficulties (low skills, illness, age 50+, language deficits, caring duties or forms of addiction). Thus, the chances of returning to employment decrease considerably. However, the SGB II pursues employment as a normative goal. Thus, the paradigm of ‘Foerdern und Fordern’ (‘Promoting and Demanding’) is inherent in the formalized processes of job placement and is oriented towards maximized effectiveness. Job center professionals are measured according to placement metrics and long-term unemployed according to their efforts to find and take up work. There is a lot of formal support available to end long-term unemployment as quickly as possible through employment. Nevertheless, the numbers of long-term unemployed persons are still high and the numbers of job placement are low. To investigate this situation, a qualitative study has been conducted. It is based on interviews with 33 long-term unemployed people who, despite the existence of multiple barriers, were able to find employment. It can be shown that these long-term unemployed often do not perceive the job placement offers as realistic, as they often do not address their specific needs. Transitions into work are thus not only dependent on obtaining or perceiving information about job opportunities, but rather on achieving individual stable living conditions that allow perceiving and processing job-related information as meaningful or relevant and then translating it into corresponding actions. In this context, the individual's network often plays an important role. Therefore, it is necessary to analyze the individual actor constellations of long-term unemployed people with multiple obstacles in order to expand their capability to the point that they are able to recognize and process information about potential jobs, to understand what role the network composition plays and, ultimately, to make job-related activities possible. The focus here is on a relational, diachronic approach that takes into account the individual life courses
Notch2 signaling in the primary T-cell-dependent immune response in mice
Get PDFCanonical Notch2 signaling, induced upon Dll-1-ligand binding on follicular fibroblasts, has a pivotal role in the differentiation of MZB cells. Over the years, it has been assumed that mainly transitional B cells are the precursors of MZB cells. Recently, our lab revealed a remarkable plasticity between the mature B cell subsets in mice, in which FoB cells can also act as precursors for MZB cells. However, the underlying mechanisms controlling this transdifferentiation process remain rather elusive. Moreover, it is still poorly understood whether Notch2 signaling synergizes with other signaling pathways or whether it predisposes certain FoB cell qualities, in order to facilitate their differentiation into MZB cells.
This current study hypothesized that the Notch2 signal strength regulates MZB cell generation and that there may be a tight cooperation between antigen-induced B cell activation and Notch2 signal induction during this FoB-to-MZB differentiation process. By using a specialized CBF:H2B-Venus Notch reporter mouse strain, B cell populations receiving a Notch signal were examined at steady-state and during an ongoing TD immune response. It was discovered that Venus expression – the proxy for active Notch signaling – progressively increased during B cell development, culminating with the highest Venus expression in splenic MZB cells. These findings implied that Notch signaling is activated in most peripheral B cells, and FoB and transitional cells with the highest Notch signaling activity preferentially mature into MZB cells. The pool of MZB cells exhibited heterogeneous Venus expression, suggesting that Notch signaling is dynamically regulated in the MZ and that some MZB cells lose their Notch signal with time. Upon TD immunization, Venus expression was strongly decreased in most GC B cells, but was still sustained in a portion of LZ-GC cells, where Notch signaling likely supports the switching to IgG1, as well as the positive selection or survival of IgG1+ memory cells. During PC differentiation, Venus expression persisted up until the plasmablast stage, but was turned off in the terminally differentiated PCs. Here, downregulation of Notch signaling may be necessary to enable long-lived PC formation. By analyzing transgenic mice with inducible constitutive activation or conditional ablation of Notch2 in a GC-B-cell-specific manner upon TD immunization, we were able to concomitantly prove the existence of an interplay between B cell activation and upregulation of Notch2 receptor signaling in regulating subsequent cell differentiation decisions. Combined immunization data from three mouse models provided evidence that FoB cells which down modulate Notch2 signaling differentiate into GC B cells, whereas activated FoB cells with high Notch2 receptor expression and enhanced Notch2IC signaling are deviated away from the GC, and initiate MZB and plasmablasts differentiation instead. The newly-generated MZB cells fully resembled wildtype MZB cells with regards to their cell surface phenotype and their splenic localization in the MZ. They were generated as a systematic response to the TD-antigen immunization and seemed to persist as terminally-differentiated MZB cells over a 4-week time period in the spleen. Among them, we found MZB cells with phenotypic signs of prior GC experience, indicating that the murine MZB cell compartment may be qualitatively heterogeneous and may partially be derived from GC B cells. Given that the human marginal zone mostly comprises memory B cells emerging from GC reactions, we now propose that the murine MZB cell compartment resembles the human MZ pool to a greater extent, than previously believed.Der kanonische Notch2-Signalweg spielt bei der Differenzierung von MZB-Zellen eine entscheidende Rolle. Die Aktivierung des Notch2-Rezeptors wird durch die Interaktion von B-Zellen mit Dll-1-Liganden exprimierenden follikulären Fibroblasten induziert. Über die Jahre wurde vermutet, dass hauptsächlich unreife transitionelle B-Zellen die Vorläuferzellen von MZB-Zellen sind. Wir konnten jedoch vor kurzem nachweisen, dass eine gewisse Plastizität zwischen reifen FoB-Zellen und MZB-Zellen besteht. Die zugrundeliegenden Mechanismen, die diesen Transdifferenzierungsprozess regeln, sind jedoch noch weitgehend unbekannt. Darüber hinaus ist es noch unklar, inwieweit Notch2-Signale mit anderen Signalwegen kooperieren, um die MZB-Zell-Differenzierung auszulösen, bzw. ob FoB-Zellen bestimmte Voraussetzung mitbringen müssen, damit sie zu MZB-Zellen differenzieren können.
In dieser Studie wurde die Hypothese aufgestellt, dass die Stärke des Notch2-Signals die Bildung von MZB-Zellen reguliert und dass es bei dem Differenzierungsprozess von FoB- zu MZB-Zellen einen engen Zusammenhang zwischen der Antigen-induzierten B-Zell-Aktivierung und der Induktion von Notch2-Signalen gibt. Um diese Hypothese zu beweisen, wurde mit Hilfe von CBF:H2B-Venus-Notch-Reporter-Mäusen untersucht, welche B-Zellpopulationen Notch-Signale erhalten. Es wurde festgestellt, dass die Venus-Expression - die ein aktives Notch-Signal wiederspiegelt - während der B-Zell-Entwicklung stetig ansteigt und dass diese in MZB-Zellen am höchsten ist. Diese Ergebnisse deuten darauf hin, dass nahezu alle B-Zellen von Zeit zu Zeit ein Notch-Signal erhalten und dass B-Zellen, die das stärkste Notch-Signal erhalten, zu MZB-Zellen differenzieren. Allerdings wies der Pool von MZB-Zellen eine heterogene Venus-Expression auf, was darauf hindeutet, dass der Notch-Signalweg in der MZ dynamisch reguliert wird und einige MZB-Zellen ihr Notch-Signal mit der Zeit verlieren. Außerdem konnte ich zeigen, dass die Venus-Expression in den meisten Keimzentrums-B-Zellen stark verringert ist. Jedoch konnte in einem Teil der „Light-zone“-Keimzentrums-B-Zellen eine hohe Venus-Expression nachgewiesen werden. Vermutlich sind dies Zellen, die positiv selektioniert werden und in diesem Zuge ein Notch-Signal erhalten. Unsere Ergebnisse deuten darauf hin, dass Notch-Signale während der positiven Selektion das „Switching“ zu IgG1 bzw. das Überleben von IgG1+-Gedächtnis-B-zellen unterstützten. Während der PC-Differenzierung blieb die Venus-Expression bis zum Plasmablasten-Stadium erhalten, wurde aber in den terminal differenzierten PC ausgeschaltet. Unsere Ergebnisse deuten darauf hin, dass Notch-Signale zwar die Plasmablasten-Differenzierung treiben, aber während der terminalen PC-Differenzierung abgeschaltet werden müssen. Durch die Analyse von transgenen Mäusen mit induzierbarer konstitutiver Aktivierung oder Inaktivierung von Notch2 im Zuge von TD-Immunreaktionen konnten wir das Zusammenspiel zwischen B-Zell-Aktivierung, Hochregulierung des Notch2-Rezeptors und damit verbundene Zell-Differenzierungsprozessen nachweisen. Die Immunisierungsdaten, die wir in diesen Mäusen erhoben haben, deuteten stark darauf hin, dass FoB-Zellen, in denen die Notch2-Signale abgeschaltet werden, sich zu Keimzentrums-B-Zellen entwickeln, während aktivierte FoB-Zellen, die ein starkes Notch2-Signal erhalten, entweder zu MZB-Zellen oder Plasmablasten heranreifen. Die während der Immunreaktion neu gebildeten MZB-Zellen ähnelten sowohl hinsichtlich ihrer Zelloberflächenmarker-Expression als auch ihrer Lokalisation normalen MZB-Zellen. Die neu gebildeten MZB-Zellen blieben über einen Zeitraum von mindestens 4 Wochen in der MZ der Milz erhalten. Einige der während der Immunreaktion gebildeten MZB-Zellen hatten noch einen Keimzentrums-ähnlichen Phänotyp, was darauf hindeutet, dass sie von Keimzentrums-B-Zellen abstammen. Diese Daten könnten darauf hinweisen, das sowohl das humane als auch murine MZB-Zellkompartment aus einer heterogenen Population aus naiven und Gedächtnis-B-Zellen besteht. Das humane und murine MZB-Zellkompartment wären somit ähnlicher als ursprünglich angenommen
Factors affecting the evolution of plumage colouration, sperm morphology and mating behaviour in parrots of the world
Get PDFSicherheit und Verträglichkeit der pharmakologischen Belastung mit dem selektiven A2A-Adenosin-Rezeptoragonisten Regadenoson in der myokardialen Ischämiediagnostik: Ergebnisse an 5780 Patienten
Get PDFMorbus Pompe
Get PDFDer Morbus Pompe ist eine angeborene, lysosomale Speicherkrankheit. Es liegen Mutationen im Gen der sauren a-Glukosidase vor. Ein Defekt des Enzyms führt u.a. zu Glykogenspeicherung insbesondere in Skelett- und Herzmuskulatur. Klinisch manifestiert sich die Multisystemische Erkrankung v.a. durch progressive Muskelschwäche und Ateminsuffizienz. Diagnostisch ist die Aktivitätsbestimmung der alpha-Glukosidase der wegweisende Schritt. Dies ist mit Hilfe eines Trockenbluttests, aus kultivierten Fibroblasten, Muskelgewebe oder gereinigten Lymphozyten etabliert. Seit 2006 werden an Morbus Pompe erkrankte Patient*innen im Zuge der Enzymersatztherapie mit rekombinant hergestellter Alglucosidasealpha therapiert.
Im Zuge dieser Dissertation wurde versucht eine neue diagnostische Methode mit Hilfe des Seahorse XFp Analysers zu etablierten. Als Proben dienten nicht-invasiv gewonnene Urinzellen, wodurch das bereits etablierte Spektrum mit invasiv gewonnen Proben erweitert werden könnte.
Mit dem Seahorse Gerät kann über biochemische Vorgänge der Stoffwechselweg der Glykolyse als glykolytische Zellfunktion gemessen werden. In Myoblasten von an Morbus Pompe erkranken Patient*innen wurde eine reduzierte Glykolyse gemessen. Die Hypothese war, dass der Enzymdefekt auch zu einer reduzierten glykolytischen Aktivität in Urinzellen von an Morbus Pompe erkrankten Patient*innen führt.
Es wurden Urinproben von 13 Patient*innen und 12 gesunden Proband*innen unterschiedlichen Alters und Geschlechtes genutzt. Das so gewonnene Urinzellgemisch scheint jedoch nicht für die Messungen geeignet. In den Proben konnte überwiegend keine glykolitische Aktivität gemessen werden. Für die Messungen bedarf es zunächst der Kultivierung von glykolytisch aktiven Zellen. Diese Urinzellexpansion erwies sich unter den gegeben Laborbedingungen als langwierig und unergiebig. Nur in ca. einem Zehntel der 104 verwendeten Proben zeigte sich ein Koloniewachtum.
Testweise wurde eine Messung mit geringer Zellanzahl durchgeführt. Die kultivierten Urinepithelzellen stammten aus einer Probe eines an MP erkrankten Patienten. In der Messung zeigte sich das zu erwartende metabolische Profil der glykolytischen Aktivität. Die Messung gibt mit dem erwarteten metabolischen Profil Ausblick auf die Wirksamkeit dieser Methode. Es bedarf einer Optimierung der Urinzellkultivierung um weitere Messungen durchführen zu können