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Single-molecule fluorescence studies of transport initiation in the maltose importer MalEFGK2
Get PDFATP-binding cassette (ABC) transporters are essential membrane proteins that mediate active import and export processes in all kingdoms of life. MalEFGK2 is an important multi-domain protein responsible for maltodextrin import in E. coli. The protein complex uses a series of conformational changes for transport driven by ATP hydrolysis. First, the periplasmic substrate binding protein (SBP) MalE binds substrates with high affinity and delivers them to the transmembrane domains (TMDs) MalF and MalG. Two cytoplasmic nucleotide binding domains (NBDs) MalK2 trigger the required conformational changes from the outward-open (maltose uptake) to inward-open (maltose release) states of the TMDs using ATP binding and hydrolysis. While the system is well characterised from a functional and a structural viewpoint, the precise coordination of conformational dynamics, kinetics, and transport regulation is not fully understood.
In this thesis, new biophysical approaches and assays (single-molecule Förster resonance energy transfer (smFRET), fluorescence correlation spectroscopy (FCS), fluorescence quenching, and combinations thereof) were established to study conformational changes and interactions between protein domains within MalEFGK2. First, I designed new smFRET assays to monitor intramolecular conformational states of MalE, in which the fluorescent labels do not inhibit the biochemical activity of MalEFGK2. The established library of protein variants was also used as basis for fluorophore characterisation, development and refinement of new methods, and comparison of smFRET in structural biology (see Chapter 5.1). Next, contact-induced fluorescent quenching of dye molecules was established to sense the conformational state of MalE using single-color fluorescence assays. The use of such assays will be the observation of correlated movement in MalEFGK2 with reduced experimental complexity (see Chapter 5.2). Finally, fluorescence assays based on smFRET and fluorophore quenching were designed to monitor the initial step of transport, i.e. docking of MalE to the TMDs. For this, the interaction of MalE with anodisc-reconstituted MalFGK2 and the isolated MaF-P2 loop was studied based on an smFRET assay, where open and closed states of the binding protein and the docking state can be discerned. The presented results exclude and falsify a mechanism in which the P2 loop causes a pre-activation state of MalE, but give indices that binding to the complete TMD docking interface causes a change in MalE’s opening degree before substrate binding and transport (see Chapter 5.3).
Since the precise coordination of conformational motion in the different transporter domains (MalE: open/closed; TMDs: outward-/inward-open) in relation to the presence of distinct ligands and ATP are not fully understood, I hypothesise that the presented methods to visualise correlated movement, e.g. substrate binding and docking simultaneously, will prove useful in the future. They can serve as a starting point for complicated studies of the entire transporter complex and related transporter systems, also in more native-like environments, to directly visualise protein-protein interactions, triggering of conformational dynamics, and the correlated movement of the protein domains.Transportproteine mit ATP-bindender Kassette (ABC-Transporter) sind wichtige Membranproteine, die in allen Organismen aktiven Import und Export von Substraten vermitteln. MalEFGK2 ist ein Mehrdomänenprotein, das für den Import von Maltodextrinen in E. coli verantwortlich ist. Der Proteinkomplex nutzt eine Abfolge von konformellen Änderungen für den ATP-abhängigen Transport. Zuerst bindet das Substratbindeprotein (SBP) MalE im Periplasma die Substrate mit hoher Affinität und transferiert diese zu den Transmembrandomänen (TMDs) MalF und MalG. Die beiden Nukleotidbindedomänen (NBDs) MalK2 im Zytoplasma sorgen für die notwendigen Konformationsänderungen von einem nach außen geöffneten (Maltoseaufnahme) zu einem nach innen geöffneten (Maltosefreisetzung) Zustand der TMDs unter ATP-Bindung und -Hydrolyse. Obwohl das System hinsichtlich seiner Funktion und Struktur gut beschrieben ist, konnte die genaue Koordination von konformellen Änderungen, Transportkinetik und -regulation noch nicht vollständig aufgeklärt werden.
In der vorliegenden Doktorarbeit wurden neue biophysikalische Ansätze und Verfahren entwickelt (Einzelmolekül Förster Resonanz Energietransfer (smFRET), Fluoreszenzkorrelationsspektroskopie (FCS), Fluoreszenzlöschung und deren Kombination), um konformelle Änderungen und Interaktionen zwischen den Proteindomänen in MalEFGK2 zu untersuchen. Erstes Ziel war die Etablierung neuer smFRET-Methoden, um die intramolekularen Konformationsänderungen von MalE zu analysieren, ohne dass die erforderlichen Fluoreszenzmoleküle die biochemische Aktivität von MalFGK2 beeinflussen. Die erstellte Bibliothek von Proteinvarianten diente weiterhin als Grundlage für die Charakterisierung von Fluorophoren, die Entwicklung und Verfeinerung neuer Methoden und dem Vergleich von smFRET mit anderen strukturbiologische Methoden (siehe Kapitel 5.1). Als Nächstes wurde die kontaktinduzierte Fluoreszenzlöschung von Farbstoffmolekülen an MalE erprobt, um dessen Konformationszustand mithilfe von einzelnen Fluorophoren zu erfassen. Der Einsatz dieser Methode ermöglicht die Beobachtung der korrelierten Bewegungen von MalEFGK2 bei reduziertem experimentellen Aufwand (siehe Kapitel 5.2). Schließlich wurden Fluoreszenzassays auf der Grundlage von smFRET und Fluoreszenzlöschung entwickelt, um den ersten Schritt des Transports, d. h. das Andocken von MalE an die TMDs, sichtbar zu machen. Dazu wurde die Wechselwirkung von MalE mit Nanodisc-rekonstituiertem MalFGK2 sowie der isolierten MaF-P2-Schleife mittels smFRET untersucht, bei dem sowohl offene und geschlossene Zustände des Bindungsproteins als auch der Andockzustand unterschieden werden können. Die vorgestellten Ergebnisse schließen einen Mechanismus aus, bei dem eine Voraktivierung von MalE durch die P2-Schleife erfolgt, geben jedoch Hinweise darauf, dass sich MalE bei Bindung an die komplette TMD-Oberfläche teilweise schließt, selbst wenn noch keine Substratbindung und kein Transport erfolgen (siehe Kapitel 5.3).
Da die genaue Koordination der Konformationsbewegung in den verschiedenen Transporterdomänen (MalE: offen/geschlossen; TMDs: nach außen/nach innen geöffnet) in Bezug auf die Anwesenheit verschiedener Liganden und ATP noch nicht vollständig verstanden ist, können sich die vorgestellten Methoden zur Visualisierung korrelierter Bewegungen (z. B. Substratbindung und Andocken) in Zukunft als nützlich erweisen. Sie können als Ausgangspunkt für anspruchsvolle Studien des gesamten Transporterkomplexes und verwandter Transportersysteme in deren natürlichen Umgebungen dienen, um Protein-Protein-Wechselwirkungen, die Auslösemechanismen der Konformationsänderungen und die korrelierten Bewegungen der Proteindomänen sichtbar zu machen
Cosmology with clusters of galaxies in the eROSITA era
Get PDFThe nature of dark matter and dark energy is one of the most intriguing scientific questions of this century. Tiny density perturbations in the early Universe evolved under the action of gravity, growing into the structures we see nowadays, such as galaxies and clusters. Such growth throughout cosmic time depends on the nature and abundance of these mysterious dark components. Clusters of galaxies provide a great tool for studying the cosmological evolution of the Universe. Galaxy clusters are the most massive virialized objects in the Universe, they reside in the nodes of the cosmic web, and are a direct tracer of the large scale structure of the Universe. Their abundance as a function of mass and redshift (the halo mass function) provides a stringent test for different cosmological models and tight constraints on the total amount of matter and the amplitude of the density perturbations in the Universe, but it also depends on the nature of dark energy. The eROSITA X-ray telescope will provide the largest X-ray-selected sample of galaxy clusters ever, with the potential of studying dark matter and dark energy with unprecedented precision. A detailed understanding of the sources detected by eROSITA and the uncertainties in the data is fundamental to reach this goal. The first aim of this thesis is to produce and study a digital twin of the first eROSITA all-sky survey (eRASS1), to characterize the source catalog and test the science pipelines. We use state of the art models to predict the X-ray emission from clusters of galaxies and AGN, and model the X-ray background using real data as a starting point. With this setup, we run an X-ray software simulator to produce mock detected photons, accounting for technical details such as the instrument response and the observation strategy. We run the eROSITA Standard Analysis Software System (eSASS), which produces a source catalog with very similar properties to the one obtained from real data. We match the input and output catalogs with an accurate algorithm based on the origin of each photon. We detect all the brightest clusters and AGN in the simulation. The fraction of detected sources primarily depends on flux and exposure time. Secondary effects, such as the source size and the central emissivity, are relevant for clusters. We provide a detailed study of the trade-off between completeness and purity. We find that progressive thresholds of detection likelihood get rid of the background fluctuations in the source catalog, while cuts in extension likelihood are necessary to remove bright point sources contaminating the cluster sample. We discuss different selections according to a given science goal. For example, the inclusion of the majority of sources in the sample is best, if one wants to find interesting objects to study the astrophysics of faint clusters and groups. Instead, a more secure cluster sample with low contamination is required for a cosmological experiment.
Once the cluster sample is selected, accurate halo mass function models are key to reaching precise constraints on cosmological models. The second aim of this thesis is to calibrate a model of the mass function that also includes variables related to the dynamical state of dark matter halos. We use the dark matter-only MultiDark suite of simulations and the high-mass objects hosting clusters of galaxies therein. We measure the mean relations of concentration, offset parameter (Xoff ), and spin as a function of dark matter halo mass and redshift. We investigate the distributions around the mean relations. We confirm the recent discovery of the concentration upturn at high masses and provide a model that predicts the concentration for different values of mass and redshift with one single equation. We find that the concentration of low-mass halos shows a faster redshift evolution compared to high-mass halos, especially in the high-concentration regime. We find that the offset parameter is systematically smaller at low redshift, in agreement with the relaxation of structures at recent times. The individual models are combined into a comprehensive framework, which predicts the mass function as a function of spin and offset. Our model recovers the fiducial mass function with great accuracy at redshift 0 and accounts for redshift evolution up to z ∼ 1.5.
The generalized mass function framework allows marginalizing over selection effects related to the dynamical state of dark matter halos in a cluster count experiment. However, a link between observations and theoretical models is lacking. The third goal of this thesis is to study the dynamical state of clusters detected by eROSITA using the offset between the X-ray and the optical centers. We aim to connect the offset measured in eROSITA observations to predictions by hydrodynamical simulations and N-body models, assessing the astrophysical effects affecting the displacements. We measure the offset for clusters observed in the eROSITA Final Equatorial-Depth Survey (eFEDS) and eRASS1. We focus on a subsample of 87 massive eFEDS clusters at low redshift. We compare the displacements in this sample to those predicted by the TNG and the Magneticum simulations. We link the observations to the offset parameter Xoff measured for dark matter halos in N-body simulations, using the hydrodynamical simulations as a bridge. We find that on average the eFEDS clusters show a smaller offset compared to eRASS1 because the latter contains a larger fraction of massive and disturbed structures. The offset measured in the eFEDS subsample is in agreement with the predictions from TNG and Magneticum, and the distribution of the offset parameter from dark matter only simulations. However, the tails of the distributions are different. Baryonic effects cause a decrement (increment) in the low (high) offset regime compared to the Xoff distribution from dark matter-only simulations. Finally, we find a correlation between the offset predicted by hydro simulations and Xoff measured in their parent dark matter-only run and calibrate a relation between them, which allows us to recover the full Xoff distribution with excellent precision.
The work developed in this thesis is essential to characterize the real eRASS1 sample, hat will soon be available to the public. The development of the innovative mass function framework and its link to data with the offset between different definitions of the cluster center will allow the minimization of uncertainties in cluster count experiments due to selection effects related to the cluster dynamical state
Einfluss der Prozessierung und Gestaltung von Katalysatordispersionen auf die Reversal-Toleranz von PEMFC Anoden
Get PDFIm Normalbetrieb der Brennstoffzelle wird Wasserstoff auf der Oberfläche des HOR-Katalysator beim Standardpotential von 0 V gespalten und liefert so die Protonen für die Rekombination mit Sauerstoff zu Wasser auf der Kathodenseite. Im Reversal-Betrieb kann dagegen die Kohlenstoffkorrosion, oder die thermodynamisch erschwerte Elektrolysereaktion von Wasser zu Protonen und Sauerstoff ablaufen. Diese hat im Vergleich zu der Kohlenstoffkorrosion keine Material- und Zellschädigung zur Folge. Zur Limitierung des Potentialanstiegs und der Materialdegradation durch Kohlenstoffkorrosion kann die Zelle ihren Bedarf durch die Elektrolyse von Wasser decken, welche mittels Einsatzes von OER-Katalysatoren thermodynamisch begünstigt wird. Im Rahmen dieser Arbeit sollen die Einflüsse durch Prozessierung und Anpassungen des Ionomer-Gehalts auf die Stabilität der Anode hinsichtlich ihrer Toleranz gegen Wasserstoffverarmung (Reversal-Betrieb) untersucht werden. Die durch seriennahe Prozesse gefertigten Anoden sollen mittels elektrochemischer Beanspruchung in RDE- und Einzelzelltests, sowie durch diverse Ex Situ Charakterisierungsmethoden bewertet werden. Im Zentrum der Arbeit steht die Korrelation der Prozessierung und des Ionomer-Gehaltes der Anoden zur Reversal-Toleranz, wobei die Optimierung des Wassermanagements der Anodenelektrode die initiale Absicht widerspiegelt
Herausforderungen im ambulanten Suchthilfesystem
Get PDFHintergrund: Um die Public Health Last, die durch den Konsum psychotroper Substanzen entsteht, zu verringern, ist neben (universeller und indizierter) Prävention eine adäquate Betreuung und Behandlung von Menschen mit bereits verfestigten Konsumproblemen entscheidend. Hierbei nimmt das ambulante Suchthilfesystem eine wichtige Rolle ein. Um Trends bezüglich der Inanspruchnahme ambulanter Suchthilfe-leistungen besser zu verstehen und die zu Grunde liegenden Entwicklungen erkennen zu können, ist eine Aufschlüsselung dieser Trends in die zugrunde liegenden Alters-, Perioden- und Kohorteneffekte erforderlich. Dies trägt zur bedarfsgerechten Weiter-entwicklung der bestehenden Versorgungsangebote bei. In diesem Zusammenhang stellt das Altern der Kohorte der Babyboomer das Suchthilfesystem annahmegemäß vor neue Herausforderungen, denn diese erlebten eine konsumfreudige Sozialisierung im Hinblick auf psychoaktive Substanzen und bilden heute aufgrund ihrer Kohortengröße eine wichtige Gruppe im Suchthilfesystem.
Ziele: Die vorliegende Dissertation verfolgt das übergeordnete Ziel, Alters-, Perioden- und Kohorteneffekte hinsichtlich der Inanspruchnahme ambulanter Suchthilfeleistungen unter besonderer Berücksichtigung der Kohorte der Babyboomer zu untersuchen. Hierfür werden die folgenden beiden untergeordneten Ziele in jeweils einem englisch-sprachigen Fachartikel adressiert:
1.) Eine Identifikation spezifischer Charakteristika der Babyboomer hinsichtlich des primären Betreuungsanlasses sowie substanzbezogener Komorbidität im Vergleich zu einer früher und später geborenen Kohorte
2.) Eine Aufschlüsselung der voneinander unabhängigen Alters-, Perioden- und Kohorteneffekte in der Entwicklung der Inanspruchnahme von ambulanten Suchthilfeleistungen aufgrund von Störungen durch den Konsum von Alkohol und illegalen Substanzen
Methodik: Beide Untersuchungen werden mit Daten der ambulanten Berliner Suchthilfestatistik durchgeführt, die ein querschnittlich angelegtes Monitoringsystem darstellt. Die Dokumentation der Daten erfolgt anhand des bundesweit einheitlich eingesetzten Deutschen Kerndatensatzes zur Dokumentation in der Suchtkrankenhilfe (KDS) durch die Betreuenden. Der Erhebungszeitraum umfasst jeweils die Periode zwischen 2008 und 2016, da in dieser Zeit dieselbe Version des KDS Anwendung fand. Zur Beantwortung der ersten Forschungsfrage werden die Babyboomer jeweils mit einer früheren (Substichprobe 1: N = 6.524) und einer späteren Kohorte (Substichprobe 2: N = 15 .677) in den sich überschneidenden Altersgruppen verglichen. Zur Analyse der zweiten Forschungsfrage wird ausgehend von der Anzahl betreuter Personen mit Störungen durch den Konsum von Alkohol (n = 46.706, 18-81 Jahre) bzw. illegalen Substanzen (n = 51.113, 18-70 Jahre) und Informationen zur Berliner Wohnbevölkerung (n = 25.297.254 für 18-81-Jährige bzw. n = 22.378.614 für 18-70-Jährige) eine Inanspruchnahmerate für ambulante Suchthilfeleistungen ermittelt und bezüglich der Alters-, Perioden- und Kohorteneffekte analysiert.
Ergebnisse: Die erste Publikation hat die nachfolgenden Unterschiede zwischen den Babyboomern und den beiden Vergleichskohorten herausgearbeitet. Störungen durch den Konsum von Alkohol sind bei den Babyboomern von geringerer Bedeutung als in der früheren Kohorte, während Störungen durch den Konsum illegaler Substanzen größere Relevanz besitzen. Babyboomer weisen zudem eine höhere Anzahl komorbider Störungen durch den Konsum psychotroper Substanzen auf als die frühere Kohorte. Im Vergleich zur späteren Kohorte zeigen die Unterschiede jeweils in die entgegengesetzte Richtung. Die zweite Publikation belegt, dass Periodeneffekte im Vergleich zu Alters- und Kohorteneffekten relativ gering ausfallen. Die höchsten Inanspruchnahmeraten bei Störungen durch den Konsum von Alkohol finden sich bei 18- bis 19-Jährigen sowie bei 39- bis 59-Jährigen, wohingegen die Inanspruchnahmerate bei Störungen durch den Konsum illegaler Substanzen mit zunehmendem Alter abnimmt. In den Geburtskohorten von 1951 bis 1986 ist die Inanspruchnahmerate bei Störungen durch den Konsum von Alkohol höher als in den anderen Geburtskohorten. Bei Störungen durch den Konsum illegaler Substanzen nimmt die Inanspruchnahmerate in den Geburtskohorten zwischen 1954 und 1973 zunächst zu und danach in derselben Größenordnung wieder ab.
Schlussfolgerungen: Das ambulante Suchthilfesystem steht vor einem anhaltenden Wandel hin zu mehr Störungen durch den Konsum illegaler Substanzen und komorbider Störungen durch den Konsum psychotroper Substanzen. Mit der steigenden Lebenserwartung und der Alterung der Babyboomer wird die Klientel in höheren Altersgruppen, die bisher in der ambulanten Suchthilfe unterrepräsentiert war, weiter an Relevanz gewinnen. Dies erfordert eine Anpassung der Angebote der ambulanten Suchthilfe an die Bedürfnisse der genannten Gruppen. Der Anstieg der Inanspruch-nahmerate bei Störungen durch den Konsum von Alkohol insbesondere im mittleren Lebensalter legt nahe, dass der Störungsbeginn der Hilfesuchenden schon einige Jahre zurückliegt. Um eine Verstetigung und Intensivierung der Störungen durch den Konsum von Alkohol über längere Zeiträume hinweg zu vermeiden, sollte daher die Hilfeinanspruchnahme in frühen Phasen der Abhängigkeitsentwicklung gezielt gefördert werden. Die deutlich erhöhten Inanspruchnahmeraten in der Kohorte der Babyboomer und den darauffolgenden Geburtskohorten legen nahe, dass ein erhöhter Substanzmissbrauch im Jugend- und jungen Erwachsenenalter zu einer erhöhten Nachfrage an Suchthilfeleistungen im höheren Alter führt und unterstreichen die steigende Nachfrage an Suchthilfeleistungen
Investigation of childhood trauma as a transdiagnostic risk factor using multimodal machine learning
Get PDFPatienten mit Rezidiv einer Harnröhrenstriktur nach einer offenen Harnröhrenrekonstruktion mit Graft: Kann man anhand von einem Cysturethrogramm vorhersagen, ob das Rezidiv mit einer Urethrotomie nach Sachse gut behandelbar ist?
Get PDFGenerierung medizinischer Evidenz durch Integration und Analyse von Daten aus verschiedenen Quellen
Get PDFSonographische Nachuntersuchung der Vena jugularis interna nach venenerhaltender, chirurgischer Implantation eines Port-a-Cath® oder Hickman-Katheters®
Get PDFIntroduction: Hickman Catheter® or Port-a-Cath® are subcutaneously tunneled central venous long-term catheters (catheters) commonly used in pediatrics. This study followed up on children who had a catheter implanted in the internal jugular vein (IJV) using vessel sparing surgical venous cut-down (surgical exposure and opening of a vein). The aim of the study was to describe the condition of the IJV. The results obtained should be compared with the results from the literature, in particular with the results after implantation of a catheter using the Seldinger technique (sonographic-assisted puncture of the vein with insertion of a catheter with the aid of an elastic guide probe).
Material and methods: Patients of up to and including 18 years of age with unilateral surgical catheter placement and removal at the time of the study were included. Surgery and Doppler sonographic follow-up examinations were performed at the Department of Pediatric Surgery at the Dr. von Hauner Children’s Hospital, Ludwig-Maximilians-University of Munich. In the course of the follow-up, the IJV was examined for two possible outcomes: relevant and non-relevant vascular changes. A vascular change (venous occlusion, stenosis, dilatation, endothelial vascular lesion) was considered relevant if it caused a Doppler sonographic change in the blood flow pattern.
Results: There were 100 patients followed up, 58 of whom were boys. Age ranged from 33 days to 18 years (mean, M: 6 years). In 93 patients (93%) the catheter was implanted for chemotherapy or stem cell transplantation, in only 7 patients (7%) for parenteral nutrition (PN). The catheter remained in place for 25 days to 3.8 years (M: 271 days). The follow-up interval ranged from same-day follow-up to 13 years after catheter removal (M: 54 months). All catheters (100%) were safely placed in the IJV, with no surgery-associated complications. Surgical time varied between 20 and 115 minutes (M: 56 minutes). Twenty-two patients (22%) showed relevant venous change, of which 13 patients (13%) with high-grade stenosis or lesion and 9 patients (9%) with venous occlusion.
Discussion: Our data shows that venous cut-down is associated with a longer operation time (56 minutes versus 19 minutes using the Seldinger technique) on the one hand, but on the other hand with successful implantation (100% versus 90.3-91.6% using the Seldinger technique) without operation-associated complications (such as pneumothorax, hemopericardium, catheter malposition). Since a correct position and immediate accessibility of the catheter is indispensable for most indications for a Hickman Catheter® or Port-a-Cath®, this represents the main advantage of venous cut-down over the Seldinger technique. However, relevant venous changes occur almost twice as often after venous cut-down as after the Seldinger technique (22% versus 12%). The difference is even more pronounced in the occlusion rate, which is 3 times higher after venous cut-down than using the Seldinger technique (9% versus 3%).
Despite the occurrence of relevant venous changes after venous cut-down in almost a quarter of patients, only catheter-associated sepsis and tumor-associated thrombosis correlated significantly with the development of relevant venous changes in the statistical analysis. However, due to the small number of cases, the results should be evaluated with caution. Some occurrences should nevertheless be highlighted, even if no statistically significant correlation could be described. For example, the dwell time of the catheter seems to have an effect on the development of relevant venous changes. Patients with a catheter indwelling time of > 365 days showed almost twice as many relevant venous changes as patients with an indwelling time of < 1 year. It becomes even clearer when the patients are examined separately with regard to PN and chemotherapy or stem cell therapy. Here, relevant venous changes occur in 43% (after PN) compared to 20% (after chemo- or stem cell therapy) of the cases. This also corresponds to the results of other publications. Since the catheter is usually used for several years in the case of PN, this also supports the hypothesis of a correlation between long indwelling time and the development of relevant venous changes.
In summary, venous cut-down can be seen as a safe method without surgery-associated risks. Therefore, this method appears superior to the Seldinger technique when the indication is an upcoming chemotherapy or stem cell therapy. In these cases, safe placement of the catheter, which is immediately accessible, should be seen as a priority. However, if the indication for the long-term catheter is PN and, as in the case of short bowel syndrome, it is usually needed for many years, it seems advisable to use the less traumatizing Seldinger technique. This allows for multiple punctures of the vein over the course of a lifetime