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Generation and characterization of CD19 CAR T cells with CTLA-4/CD28 fusion receptor
Get PDFAdoptive transfer of CD19 specific T cells with a chimeric antigen receptor (CAR) has revolutionized anti-cancer therapy for patients with advanced B-precursor acute lymphoblastic leukemia (ALL). Unprecedented response rates up to 90% have been observed in clinical trials and resulted in FDA approvals. Nevertheless, 50% of the patients treated with anti-CD19 CAR T cells suffer from relapse within 24 months. This emphasizes the need to elucidate mechanisms that lead to success or failure of CAR T cell therapy and provide a potential strategy to overcome possible escape mechanisms.
In this study, the immune checkpoint profiles of leukemic cell lines and CAR T cells were analyzed before and after activation. A significant increase in mean surface expression of inhibitory surface markers like PD-L1, TIM-3 and CTLA-4 was observed in CD19 specific CAR T cells after target cell recognition. Next, we detected that overexpression of CTLA-4 on CAR T cells leads to diminished activation and proliferation potential upon antigen stimulation.
To circumvent the suppressing effect of CTLA-4, CAR T cells with a CTLA-4/CD28 fusion receptor were designed. The fusion receptor contains the extracellular and transmembrane domain of CTLA-4 fused to the intracellular domain of CD28, which is meant to turn the inhibitory CTLA-4 signal into CD28-mediated T cell stimulation. First generation CAR T cells with (19_3z_CTLA_28) and without (19_3z) fusion receptor and second generation CAR T cells (19_3z_BB) were successfully generated via retroviral transduction and characterized by flow cytometry. High viability and expansion as well as a favorable stem-cell/central memory like phenotype were observed. In vitro functionality assays of 19_3z_CTLA_28 revealed strong CD19-dependent activation, proliferation and killing capacities as well as high IFN-γ and TNF-α secretion upon target cell contact. Inclusion of the fusion receptor did not impair activation capability of conventional first generation CAR T cells. Comparably high killing capacities were detected for all tested CAR T cell constructs. CAR T cells with fusion receptor showed slightly increased cytokine secretion in presence of CD80/CD86 on target cells.
To assess long-term anti-tumor efficacy, CAR T cells with and without fusion receptor were stimulated repetitively with CD19+ CD80+ CD86+ target cells over a time period of 19 days. Upon serial stimulation, 19_3z_CTLA_28 showed stable killing potency as well as significantly higher killing percentages compared to conventional first generation CAR T cells. In vivo functionality of CAR T cells with a CTLA-4/CD28 fusion receptor will have to be addressed in future studies.
The incorporation of fusion receptors into CAR T cells could be a promising strategy to optimize CAR T cell therapy for treatment of advanced pediatric leukemia and relapse-prone patients.Der adoptive Transfer von CD19-spezifischen T-Zellen mit chimärem Antigenrezeptor (CAR) hat die Therapie der fortgeschrittenen B-Vorläufer ALL revolutioniert. Hohe initiale Ansprechraten bis zu 90% resultierten in der Zulassung in den USA und in Europa. Nichtsdestotrotz erleiden 50% der mit anti- CD19 CAR-T-Zellen behandelten Patienten innerhalb von 24 Monaten einen Rückfall. Dies unterstreicht die Notwendigkeit, Mechanismen aufzuklären, die zum Erfolg oder Misserfolg der CAR- T-Zelltherapie führen, sowie eine mögliche Strategie zur Überwindung dieser Mechanismen bereitzustellen.
In diesem Projekt wurden die Immuncheckpoint-Profile von Leukämiezelllinien und CAR-T-Zellen vor und nach Aktivierung analysiert. Eine signifikante Zunahme der Expression inhibitorischer Oberflächenmarker wie PD-L1, TIM-3 und CTLA-4 wurde auf CD19-spezifischen CAR-T-Zellen nach Erkennung der Zielzellen beobachtet. Es konnte gezeigt werden, dass eine Überexpression von CTLA-4 auf CAR-T-Zellen, nach Antigenstimulation, zu einem verminderten Aktivierungs- und Proliferationspotential führt.
Um den hemmenden Effekt von CTLA-4 zu umgehen, wurden CAR-T-Zellen mit einem CTLA-4/CD28 Fusionsrezeptor entwickelt. Dieser Rezeptor enthält eine extrazelluläre CTLA-4- und eine intrazelluläre CD28-Domäne, wodurch das inhibitorische CTLA-4-Signal in eine CD28-vermittelte T-Zell-Stimulation umgewandelt werden soll. Erst-Generations CAR-T-Zellen mit (19_3z_CTLA_28) und ohne (19_3z) Fusionsrezeptor sowie Zweit-Generations CAR-T-Zellen (19_3z_BB) wurden mittels retroviraler Transduktion erfolgreich generiert und durchflusszytometrisch charakterisiert. Hohe Viabilität, gute Expansionsfähigkeit und ein mehrheitlich Stammzell-/Gedächtniszell-Phänotyp wurden beobachtet. In vitro Funktionalitätstests des 19_3z_CTLA_28 zeigten eine starke CD19-abhängige Aktivierung, Proliferation und Zytotoxizität sowie eine hohe IFN-γ und TNF-α Sekretion bei Zielzellenkontakt. Der Einbau des Fusionsrezeptors beeinträchtigte nicht die Aktivierungsfähigkeit konventioneller CAR-T- Zellen der ersten Generation. Vergleichbar hohe Zytotoxizität wurde für alle getesteten CAR-T- Zellkonstrukte nachgewiesen. In Gegenwart von CD80/CD86 auf Zielzellen zeigten CAR T-Zellen mit Fusionsrezeptor eine leicht erhöhte Zytokinausschüttung.
Zur Beurteilung der langfristigen anti-Tumor Effektivität wurden CAR-T-Zellen mit und ohne Fusionsrezeptor über einen Zeitraum von 16 Tagen wiederholt mit CD19+ CD80+ CD86+ Zielzellen stimuliert. Bei wiederholter Stimulation zeigte 19_3z_CTLA_28 eine stabile sowie signifikant höhere Zytotoxizität im Vergleich zu konventionellen CAR-T-Zellen der ersten Generation. Die in vivo Funktionalität von CAR-T-Zellen mit CTLA 4/CD28 Fusionsrezeptor wird in zukünftigen Studien untersucht werden müssen. Der Einbau von Fusionsrezeptoren in CAR-T-Zellen könnte eine vielversprechende Strategie zur Optimierung der CAR-T-Zelltherapie bei der Behandlung von fortgeschrittener pädiatrischer Leukämie und Hochrisiko-Patienten darstellen
Population-level neural coding for higher cognition
Get PDFHigher cognition encompasses advanced mental processes that enable complex thinking, decision-making, problem-solving, and abstract reasoning. These functions involve integrating information from multiple sensory modalities and organizing action plans based on the abstraction of past information. The neural activity underlying these functions is often complex, and the contribution of single neurons in supporting population-level representations of cognitive variables is not yet clear.
In this thesis, I investigated the neural mechanisms underlying higher cognition in higher-order brain regions with single-neuron resolution in human and non-human primates performing working memory tasks. I aimed to understand how representations are arranged and how neurons contribute to the population code.
In the first manuscript, I investigated the population-level neural coding for the maintenance of numbers in working memory within the parietal association cortex. By analyzing intra-operative intracranial micro-electrode array recording data, I uncovered distinct representations for numbers in both symbolic and nonsymbolic formats.
In the second manuscript, I delved deeper into the neuronal organizing principles of population coding to address the ongoing debate surrounding memory maintenance mechanisms. I unveiled sparse structures in the neuronal implementation of representations and identified biologically meaningful components that can be directly communicated to downstream neurons. These components were linked to subpopulations of neurons with distinct physiological properties and temporal dynamics, enabling the active maintenance of working memory while resisting distraction. Lastly, using an artificial neural network model, I demonstrated that the sparse implementation of temporally modulated working memory representations is preferred in recurrently connected neural populations such as the prefrontal cortex.
In summary, this thesis provides a comprehensive investigation of higher cognition in higher-order brain regions, focusing on working memory tasks involving numerical stimuli. By examining neural population coding and unveiling sparse structures in the neuronal implementation of representations, our findings contribute to a deeper understanding of the mechanisms underlying working memory and higher cognitive functions
What authoritarian populists really want
Get PDFQualitative interview data collected in Germany and analyzed alongside and in support of populism and violent extremism research, shows that while elite authoritarian populists (EAPs) claim to represent “average voters” and the “disenfranchised,” they are very much elites who benefit from the establishment, who look down upon those groups, and are leveraging those groups’ grievances and democratic institutions, including civil society, for self-aggrandizement and anti-democratic aims. In comparing the role of cultural versus economic grievance narratives in political communications and extremism, the data indicate that cultural narratives are more ubiquitous and potent; EAPs weaponize grievances by turning them into “us versus them” disinformation which is then used as a bridge between elite political and cultural aspirations and working- and middle-class economic grievances. EAPs use fear and outrage-inducing culture- and victimhood-related disinformation, particularly pertaining to gender roles and non-white immigrants, in a mix of civic engagement, in-person, online, and hard-copy communications (in which social media is secondary to traditional media and in-person communications) and which undermine democratic values and institutions and creates a permissive environment for intolerance, extremism, and violent extremism. The data did not support the hypothesis that civic and community engagement are in and of themselves effective tools for reducing the pull factors of political extremism and radicalization for those already radicalized but did provide some evidence of them as effective tools for countering extremism’s effects on society and for inoculating non-extremists when used in intentionally pro-democratic context
Ergebnisse nach Extracorporeal Life Support (ECLS)-Therapie im therapierefraktären kardiogenen Schock
Get PDFSocial media Zindabad
Get PDFDie vorliegende Dissertation ist eine vergleichende Studie von vier digitalen sozialen Plattformen, namentlich Facebook, Twitter, Spotify und SoundCloud, und deren Nutzung in Deutschland und Pakistan.
Der Theorie der digitalen Gesellschaft von Armin Nassehi folgend, wird herausgearbeitet, dass die erste, zweite und dritte Entdeckung der Gesellschaft nicht nur in Deutschland, sondern die Auswirkungen der Französischen Revolution inklusive Aufklärung, die 68er-Revolution sowie die digitale Revolution auch in einem Schwellenland wie Pakistan stattgefunden und dieses entsprechend geprägt haben. Nach dem Semiometrie-Modell Steiners werden Wahrnehmungsevaluationen einer jeden Plattform erstellt, die wiederum als Grundlage für die Befragung von Untersuchungsgruppen in beiden Ländern in 2016/2017 sowie in 2021 Verwendung finden. So wird in einer Langzeitbetrachtung durch Erhebung empirischer Daten der Nutzung der vier sozialen Plattformen nachgegangen und der Fragestellung, ob sich diese maßgeblich zwischen Deutschen und Pakistanis unterscheidet. Zwar lassen sich keine Unterschiede, die auf religiösen, moralischen oder kulturellen Motiven beruhen, in der Nutzung beider Gruppen feststellen, dennoch unterscheiden sich die Gruppen in Zielrichtung, Intensität und Aktivität auf den Plattformen. Durch den Wahlkampf und die Amtszeit Donald Trumps und allen voran den damit verbundenen Erkenntnissen bezüglich des Cambridge-Analytica-Skandals, kann auf Facebook eine enorme Verschiebung der Wahrnehmung und Veränderung der Nutzung in beiden Gruppen nachgewiesen werden, wenn auch diese in Deutschland wesentlich drastischer ausfällt als in Pakistan.
Auf Twitter lässt sich in der Langzeitbeobachtung ein erheblicher Trump-Effekt nachweisen, der auf deutscher Seite zu einem hohen Zulauf zu der Plattform führt, während er auf pakistanischer Seite die Nutzung deutlich intensiviert. Während die deutsche Befragtengruppe sich vorrangig über die neusten Eskapaden des ehemaligen US-Präsidenten aus erster Hand informieren möchte, nutzen die Pakistanis Twitter insbesondere auf Grund ihrer langen Kolonialgeschichte und der Militärdiktaturen als primäres News Outlet.
Für die Nutzung von Spotify wie auch SoundCloud ist nach der semiometrischen Wahrnehmungsbefragung sowie der Befragung durch Fragebogen festzuhalten: Musik ist nicht facebookisierbar. Obwohl beide Plattformen sich stark an den Anwendungen und Funktionen Facebooks orientieren, kann nachgewiesen werden, dass Musik einen solch intimen Teil der Privatheit der Nutzer in beiden Gruppen darstellt, dass das Teilen dieser auf den untersuchten Plattformen nicht erfolgt. Spotify überzeugt die Nutzer durch seine Simplizität, führt aber in beiden Gruppen zu einer Verlagerung des Musikhörens ins Passive. SoundCloud wiederum wird bei den Nutzern als aktives Musikmedium verstanden, um noch unbekannte Künstler zu entdecken.
Obwohl beide Gruppen sich der Datenverarbeitung und der Datenskandale auf allen Plattformen durchaus bewusst sind, überwiegt die Funktionalität, sodass die Accounts trotz datenschutzrechtlicher Mängel nicht gelöscht werden. Dennoch ist in beiden Befragtengruppen nachweisbar, dass sich inzwischen Bewegungen formieren, die eine Regulierung der Plattformen – ohne ein Verbot durchsetzen zu wollen – fordern
Synthese und Strukturaufklärung von Queuosin-Derivaten
Get PDFIm Rahmen der Arbeit wurden die Strukturen der Queuosin-Modifikationen Galactosyl-Queuosin (GalQ), Mannosyl-Queuosin (ManQ) und Glutamyl-Queuosin (GluQ) untersucht und aufgeklärt. Hierzu wurden chemische Totalsynthesen dieser Derivate entwickelt und die synthetischen Standards über LC-MS-Koinjektion mit den natürlichen Verbindungen verglichen.In this work, the structures of the queuosin modifications galactosyl-queuosin (GalQ), mannosyl-queuosin (ManQ) and glutamyl-queuosin (GluQ) were investigated and elucidated. For this purpose, total chemical syntheses of these derivatives were developed and the synthetic standards were compared to the natural compounds via LC-MS co-injection
Individualized rupture risk assessment and analysis of mechanotransduction in the abdominal aortic aneurysm
Get PDFDiscovery of new cinnamic acid amides as novel antifibrotic drugs
Get PDFFibrosis is a common hallmark of most fatal chronic diseases in the industrialized world. Among pulmonary disease, progressive fibrosis is the pivotal pathomechanism of the Idiopathic Pulmonary Fibrosis (IPF), a devastating progressive interstitial lung disease with a median patient survival time of 3-5 years. Approved pharmacotherapies only slow down, but do not stop disease progression. Thus, new antifibrotic therapeutic strategies are urgently needed. Like most fibrotic diseases, IPF pathogenesis is characterized by the deposition of excessive amounts of fibrotic extracellular matrix of activated myofibroblasts resulting in increasing loss of lung function.
A phenotypic high-content ECM deposition assay was developed measuring fibrotic ECM deposition by primary human lung fibroblasts (phLFs) derived from IPF patients upon transforming growth factor beta 1 (TGFβ1) and drug treatment. To identify antifibrotic compounds, 1509 small molecule compounds were screened for inhibition of TGFβ1-induced ECM deposition. Using a deep learning model 31 hit compounds were identified. Here, for the compound Tranilast a low-potent inhibitory activity on TGFβ1-induced fibroblast-myofibroblast-transdifferentiation and ECM deposition was found. By structure-activity-relationship studies of Tranilast derivatives, a group of novel cinnamic acid amides, in particular N-(2-butoxyphenyl)-3-(phenyl)acrylamides and N-(2-benzoxyphenyl)-3-(phenyl)acrylamides (N23Ps), with high potency for the inhibition of TGFβ1-dependent αSMA induction and ECM deposition was discovered. N23Ps induced strong morphological changes in phLFs, possibly due to a regulation of cytoskeletal proteins as seen in transcriptome-wide microarray analysis. Furthermore, proteomics and transcriptomics analysis showed N23Ps to inhibit specific fibrotic signatures in TGFβ1-treated phLFs as well as in a human ex-vivo injury and early 3D fibrosis model based on human precision cut lung slice tissue cultures. RNA interference rescue experiments showed an inhibition of TGFβ1 signaling by N23Ps to be SMURF2-dependent.
In conclusion, a novel group of cinnamic acid amides was discovered that inhibit TGFβ1-induced profibrotic behavior of myofibroblasts in a SMURF2-dependent way.Fibrotische Gewebeveränderungen stellen ein gemeinsames Merkmal der häufigsten letalen Erkrankungen in der industrialisierten Welt dar. Unter den Lungenerkrankungen ist hier allen voran die Idiopathische Lungenfibrose (IPF) durch einen fortschreitende fibrotischen Umbau des Lungenparenchyms charakterisiert. Zugelassene antifibrotische Pharmakotherapien verlangsamen das Progress der Erkrankung, können diesen jedoch nicht aufhalten. IPF-Patienten überleben im Median 3-5 Jahre nach Diagnosestellung. Hieraus ergibt sich ein dringender Bedarf an neuen antifibrotischen Wirkstoffen und Therapien. Wie in anderen fibrotischen Erkrankungen, ist die Pathogenese der IPF durch die pulmonale Deposition erhöhter Mengen von extrazellulärer Matrix (EZM), größtenteils durch aktivierte Myofibroblasten charakterisiert.
Es wurde ein phänotypisches immunocytochemisches, sogenanntes high-content, Hochdurchsatz-Assay zur Messung von fibrotischer EZM-Deposition durch mit transforming growth factor β 1 (TGFβ1) und Wirkstoffen behandelten primäre humane Lungenfibroblasten (phLFs) entwickelt, welche aus Lungengewebe von IPF-Patienten isoliert wurden. 1509 niedermolekulare Wirkstoffe wurden auf eine Inhibition TGFβ1-stimulierter Extrazellulärmatrix-Deposition durch phLFs gescreent. Mithilfe einer Deeplearning-basierten Immunofluoreszenzanalyse des Assays konnten 31 antifibrotische Wirkstoffkandidaten identifiziert werden. Der Wirkstoff Tranilast wies eine niederpotente Inhibition von TGFβ1-induzierter Fibroblasten-Myofibroblasten-Transdifferenzierung sowie TGFβ1-induzierter Extrazellulärmatrix-Deposition auf. Durch die Untersuchung der Struktur-Wirkungsbeziehung von Tranilast-Derivaten, konnte eine neue Gruppe hochpotenter Inhibitoren von TGFβ1-induzierter Fibroblasten-Myofibroblasten-Transdifferenzierung sowie TGFβ1-induzierter Extrazellulärmatrix-Deposition, bestehend aus den Zimtsäureamiden der N-(2-butoxyphenyl)-3-(phenyl)acrylamid- and N-(2-benzoxyphenyl)-3-(phenyl)acrylamid-Gruppe (N23Ps), entdeckt werden. Im Folgenden konnte gezeigt werden, dass N23Ps eine starke Morphologie-Änderung in den pHLFs induzieren, wahrscheinlich aufgrund einer Regulation zytoskeletaler Proteine. Anschließende Transkriptom- und Proteomanalysen zeigten, dass N23Ps spezifische fibrotische Signaturen in TGFβ1-behandelten pHLFs sowie in einem humanen ex-vivo Model für frühe lungenfibrotischen Veränderungen, basierend auf Gewebekulturen von humanen precision cut lung slices (hPCLS), inhibieren. RNA-Interferenz-Experimente zeigten, dass die Inhibition von TGFβ1-Signalwegen durch N23Ps von der Ubiquitin-Protein-Ligase SMURF2 abhängig ist.
Zusammenfassend wurde eine neue Gruppe an Zimtsäureamiden entdeckt, welche TGFβ1-induzierte profibrotische Myofibroblastenaktivität SMURF2-abhängig hemmt
