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Behandlung des caninen Hämangiosarkoms der Milz mit autologer Tumorvakzine auf Basis von ungeprimten monozytären dendritischen Zellen – eine randomisierte placebokontrollierte Doppelblindstudie
Get PDFExpression and functional analysis of minor satellite RNA during mitosis in mouse embryonic stem cells
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Kultivierung der humanen Milbe Demodex spp. und Untersuchung Seborrhoe-modifizierender Substanzen
Get PDFHintergrund: Als fester und komplexer Bestandteil des menschlichen Mikrobioms kann die Haarbalgmilbe, Demodex spp., neben der kommensalen Koexistenz mit ihrem Wirt, auch eine pathophysiologisch relevante Rolle in der Entstehung von Hauterkrankungen spielen. Sie kann hierbei vor allem zur Entwicklung der chronisch-entzündlichen Hauterkrankung Rosacea beitragen. Trotz ihrer prominenten Rolle ist die Demodex-Milbe bis heute wenig erforscht. Ein Grund hierfür ist unter anderem, dass bisher noch kein funktionierendes ex-vivo-, also wirtsunabhängiges Kultivierungsmodell etabliert werden konnte. Dies könnte ermöglichen, Fragestellungen im Hinblick auf die Physiologie und Therapie der Rosacea dahingehend voranzutreiben.
Fragestellung: Ziel der hier beschriebenen Experimente war es daher, ein ex-vivo-Kultivierungsmodell zu etablieren. Des Weiteren sollte die Wirkung von Substanzen, welche die Talgproduktion beeinflussen, auf die Milbenpopulationsdichte und damit Reproduktion der Milbe und mögliche Therapieansätze untersucht werden.
Material und Methoden: Hierzu wurden Hautproben aus dem Gesichtsbereich im sogenannten “human organotypic skin explant culture“ (hOSEC)-Modell kultiviert. In einer weiteren Modellreihe wurden dem Modell zusätzlich die beiden sebostatisch wirkenden Substanzen Retinol und Isotretinoin sowie die beiden seborrhoisch wirkenden Substanzen Testosteron und Trenbolon zugesetzt und untersucht. Die Ergebnisse wurden schlussendlich lichtmikroskopisch evaluiert.
Ergebnisse: So konnten nach 90 Tagen der Inkubation in den Hautproben lebende Milben in allen Lebensstadien nachgewiesen werden. Die Behandlung mit den die Talgproduktion beeinflussenden Substanzen zeigte nach dreißigtägiger Inkubation jeweils eine signifikante Minderung der Milbenpopulationsdichte im Vergleich zur unbehandelten Negativkontrolle.
Diskussion: Mit dem hier beschriebenen hOSEC-Modell konnten zum ersten Mal erfolgreich Demodex-Milben fernab des lebenden Wirts über mehrere Generationen kultiviert werden. Fernerhin könnte die sebostatische Wirkung von Retinoiden einen Hinweis auf den pathogenetischen Mechanismus der klinisch eingesetzten Therapieoption bei Rosacea liefern. Die hier beschriebenen Methoden könnten in Zukunft neue Wege zur Erforschung der Demodex-Milbe und Rosacea eröffnen.Background: As most complex commensal and integral part of the human microbiome, Demodex spp. mites can contribute to the pathogenesis of clinically relevant skin conditions such as the chronic inflammatory disease rosacea. Although their pathophysiological role is recognized, few is known about Demodex mites. Up until now, no reliable ex-vivo, i.e. host independent culture model does exist.
Objectives: The goal of this study was to establish an ex-vivo cultivation system for Demodex mites. Furthermore, an objective was set to investigate the impact of sebogenesis-modifying substances on mite density that is, mite reproduction and possible therapy approaches for future treatment of skin diseases caused by Demodex mites. Specifically, the sebostatic acting drugs retinol and isotretinoin, as well as two seborrheic acting drugs testosterone and trenbolone, were used in this case.
Methods: Skin samples of the face region were obtained to be cultivated in a so called human organotypic skin explant culture (hOSEC). In a parallel test series, sebogenesis-modifying drugs were supplemented to the hOSEC model. Mite survival and density was quantified microscopically.
Results: Mites were proved to be alive after 90 days of incubation. All stages of the life cycle of the Demodex mites were identified. Treatment with both sebostatic-acting and seborrhea inducting drugs each lead to a significant decrease of mite density in comparison to the negative control.
Conclusion: The cultivation model described below proved to be the first successful one in terms of cultivating Demodex spp. over multiple generations without their living host. Additionally, the sebostatic effect of retinoids could be one of its key mechanisms in the treatment of rosacea which shows a high rate of positive outcomes. The outcomes described below may be expected to boost new research concerning Demodex mites and help to comprehend human´s most intricate commensal
Characterization of ADAM10 as a vulnerability and novel potential therapy target of acute leukemia
Get PDFThe interaction of leukemic cells with their surrounding bone marrow (BM) microenvironment is crucial for leukemia formation and maintenance. Especially dormant leukemia stem cells (LSCs) reside in this protective niche, allowing them to evade chemotherapy. As LSCs are main drivers of relapse development in leukemia patients, it is of high clinical relevance to efficiently eradicate them. We aimed at identifying surface molecules which can be targeted to disrupt the interaction between leukemic cells and the BM microenvironment, thereby releasing leukemia cells from their niche and re-sensitizing them towards chemotherapeutic agents. We employed our recently established pipeline for functional in vivo CRISPR/Cas9 knockout (KO) screens to test a customized surface molecule library comprising candidates from the lab’s own previous proteome and secretome analysis of LSC-resembling cells, complemented with candidates from the literature. While performing screens in two B-ALL patient-derived xenograft (PDX) models, we discovered both commonly depleted genes, including the positive controls CXCR4 and ITGB1, but also PDX model specific dropouts. We selected ADAM10 as our candidate gene because it was depleted in both tested PDX models and showed increased expression in primary leukemia cells from patients of diverse subgroups of acute leukemias, which correlated with poorer overall survival in these patients.
We confirmed ADAM10 as a broad vulnerability in numerous ALL and AML PDX models in vivo, independently from underlying driver mutations and genetic alterations. In contrast, in vitro most PDX models were insensitive to loss of ADAM10. We could confirm the specificity of the observed phenotype of the KO through in vivo reconstitution assays, which further elucidated ADAM10’s catalytically active metalloproteinase domain to be mainly responsible for its role in leukemic cells. Multi-omics analysis revealed that ADAM10 KO affected diverse biological processes, such as cell cycle, cell death, metabolism including OXPHOS as well as membrane and adhesion associated processes. Proof-of-concept experiments functionally confirmed the effect on the first two pathways. Additional functional characterization of PDX cells subjected to chemical inhibition or genetic KO of ADAM10 found the early engraftment and homing capacity, the frequency of leukemia-initiating cells and the CFU potential to be diminished upon ADAM10 reduction or loss, respectively. Moreover, performing in vivo and in vitro chemotherapy trials in ALL and AML PDX models, using a mixture of PDX cells with and without ADAM10 KO competitively growing within the same mouse, we showed that loss of ADAM10 sensitized the cells towards routinely used chemotherapeutic agents.
In summary, we propose ADAM10 as a potential novel target for the treatment of leukemia patients in the future
Evidenz-basierte Belastungseinschätzung des Forced Swim Test in der Ratte
Get PDFDer Forced Swim Test ist ein seit über 40 Jahren eingesetzter Test zur Bestimmung der antidepressiven Wirkung von Substanzen. Weltweit konnte bis vor einigen Jahren ein zunehmender Anstieg veröffentlichter Studien, die den FST verwendet haben, verzeichnet werden. Der FST basiert auf der Analyse des Schwimmverhaltens in einer unausweichbaren Situation. Durch Gabe von Antidepressiva kommt es während des Testverlaufs zu einer Verhaltensänderung. Aufgrund der limitierten Therapieoptionen für Patienten mit einer depressiven Störung und der häufigen Rückfallraten sind Verfahren, die zur Entwicklung neuer Therapeutika führen können, von hoher Relevanz. In den vergangenen Jahren sind Diskussionen aufgekommen, die eine starke Belastung und Gefährdung der Tiere in dem Test vermuten. Dies könnte eine mögliche Folge auf die frühere Bezeichnung des passiven Verhaltens als „Verzweiflungsverhalten“ sein.
Im europäischen Raum erfordert die Richtlinie 2010/63/EU eine Klassifikation der Belastung der Tiere im Versuch bereits bei der Antragstellung. Für den Forced Swim Test lag bis zum aktuellen Zeitpunkt keine evidenz-basierte Belastungseinschätzung vor. Um diese Lücke zu schließen, wurde für die Belastungseinschätzung von Ratten ein multimodaler Ansatz bestehend aus speziesspezifischen (Wühlverhalten, Nest Score, Nestbauverhalten), verhaltensbiologischen (Explorationsverhalten, Saccharinpräferenz), biochemischen (fäkale Kortikosteronmetaboliten) und physiologischen Parametern (innere Körpertemperatur, Körpergewicht, Körpergewichtsveränderung, Futter- und Wasseraufnahme) gewählt, um so viele Dimensionen einer potentiellen Belastung wie möglich aufzeigen zu können.
Die Belastungsparameter wurden in drei separaten Versuchsansätzen untersucht. Die vier bzw. fünf Vergleichsgruppen bestanden aus einer FST-Gruppe, einer FST + Imipramin-Gruppe, einer FST + Kochsalzlösung-Gruppe, einer Handling-Gruppe sowie bei der Bestimmung der FCM zusätzlich einer Gruppe zur Kontrolle der circadianen Variation. Bei dem untersuchten Schwimmprotokoll handelt es sich um ein sehr gängiges, zweitägiges Protokoll für die Spezies Ratte. Die Tiere wurden am ersten Tag 15 min und am zweiten Tag fünf Minuten in 25 °C temperierten Wasser getestet.
Im ersten Versuch wurden die fäkalen Kortikosteronkonzentrationen ermittelt (n=18 pro Gruppe und Geschlecht). Im zweiten Versuchsansatz wurde das Wühlverhalten der Ratten sowie die rektale Körpertemperatur unmittelbar nach der Testung untersucht (n=12 pro Gruppe und Geschlecht). Der letzte Versuchsansatz umfasste die Parameter Saccharinpräferenz, Latenz bis zur Interaktion mit dem Nestmaterial-Test, den Nest Score sowie die Analyse des Verhaltens im Open Field (n=12 pro Gruppe und Geschlecht). Die Zeit zum Wiedererlangen einer physiologischen Körpertemperatur wurde in einem zusätzlichen Experiment in weiblichen Ratten untersucht (n=5).
Der einzig messbare Effekt des FST auf die Tiere in dieser Studie war eine moderate, aber nur sehr kurz anhaltende Hypothermie. Die Ratten, die zusätzlich zweifach mit Imipramin, einem trizyklischen Antidepressivum, behandelt wurden, wiesen transiente nachteilige Effekte auf das Körpergewicht und die Futteraufnahme sowie eine Erhöhung von Kortikosteron-Derivaten im Kot auf. Langanhaltende Effekte des FST auf die Belastung der Tiere konnten in dieser Studie nicht nachgewiesen werden. Die weiteren Parameter zur Belastungseinschätzung haben keine signifikanten Abweichungen in den FST-Gruppen im Vergleich zu den Kontrollgruppen gezeigt. Dies bedeutet entweder, dass der FST neben der Hypothermie keine Belastung verursacht oder dass die verwendeten Parameter nicht sensitiv genug waren. Die Analyse des Wühlverhaltens sowie des Nestbauverhalten erwiesen sich in dieser Studie aufgrund einer starken beobachteten Variabilität als nicht aussagekräftige Parameter.
Eine Verwendung wärmeren Wassers oder eine Verkürzung der Testzeit können mögliche Refinement-Optionen für den FST darstellen, müssen aber weiter untersucht werden. Zukünftige detailliertere Untersuchungen zu der akuten Belastung während des und unmittelbar nach dem FST könnten zudem weitere Schlussfolgerungen zu dem Schweregrad des Tests ermöglichen.The Forced Swim Test has been used for over 40 years to determine the antidepressant effect of substances. Until a few years ago, an increasing number of published studies using the FST were recorded worldwide. The FST is based on the analysis of swimming behavior in an inescapable situation. The administration of antidepressants leads to a behavioral change during the course of the test. Due to the limited treatment options for patients suffering from a depressive disorder and the frequent relapse rates, procedures that can lead to the development of new therapeutic agents are highly relevant. In recent years, discussions have arisen that assume that the test is highly stressful and dangerous for the animals. This could be a possible consequence of the earlier designation of passive behavior as "despair behavior".
In Europe, Directive 2010/63/EU requires a severity classification of the experiment already at the time of application. For the Forced Swim Test, no evidence-based stress assessment has been available to date. In order to close this gap, a multimodal approach comprising species-specific (burrowing, nest score, nest building behavior), behavioral (exploratory behavior, saccharin preference), biochemical (fecal corticosterone metabolites) and physiological parameters (inner body temperature, body weight, body weight change, food and water intake) was chosen for the severity assessment of rats in order to be able to identify as many dimensions of possible suffering as possible.
The severity parameters were examined in three separate test approaches. The four resp. five comparison groups consisted of an FST group, an FST + imipramine group, an FST + saline solution group, a handling group and, for analysis of the FCM, an additional group to control for circadian variation. The swimming protocol investigated is a very common, two-day protocol for the rat species. The animals were tested in water at 25 °C for 15 minutes on the first day and five minutes on the second day. In the first experiment, the fecal corticosterone concentrations were determined (n=18 per group and sex). In the second experiment, burrowing behavior and rectal body temperature immediately after testing were examined (n=12 per group and sex). The last experimental approach comprised the parameters saccharin preference, latency until interaction with nest material test, nest score and the analysis of behavior in the open field (n=12 per group and sex). The time to regain a physiological inner body temperature was investigated in an additional experiment in female rats (n=5).
The only measurable effect of FST on the animals in this study was a moderate but very short- lasting hypothermia. The rats that were additionally treated twice with imipramine, a tricyclic antidepressant, showed transient adverse effects on body weight and food intake as well as an increase in corticosterone derivatives in the feces. Long-lasting effects of the FST on the burden of the animals could not be demonstrated in this study. The other parameters for severity assessment showed no significant differences in the FST groups compared to the control groups. This means either that the FST does not cause stress in addition to hypothermia or that the parameters used were not sensitive enough. The analysis of burrowing behavior and nest-building behavior did not prove to be reliable parameters in this study due to the high variability observed.
Using warmer water or shortening the test time may represent possible refinement options for the FST, but need to be further investigated. In the future, more detailed studies on acute stress during and immediately after the FST could also allow further conclusions to be drawn about the severity classification of the test
